Штамм бактерий @ @ 24-продуцент эндонуклеазы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/22 C12N15/00 

Изобретение относится к микробио логической промышленности, а именно к новому штамму микроорганизмов, в .маетности Serratia marcescens 2k продуценту неспецифической внеклеточной эндонуклеазы (.К.ф. S-l..) который используется в экспериментал ных исследованиях по изучению противоопухловых и противовирусных свойств эндонуклеазы, в ветиринарии в качест ве лечебного препарата против вирусных заболеваний насекомых, для получения 5 дезоксирибомононуклеотидов и др, . .

Известны штаммы Serratia гаагсевcens - продуценты эндонуклеазы, пигментный би-211 АТСС 9986 Г 1 3 ,

Активность фермента невелика и составляет ООО-бООО виск. ед/мл.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является штамм Serratia marcescens - беспигментный продуцент нуклеазы 2 .

Активность фермента равна 5060 тыс. виск. ед/млбелка или 7,5 мкм расщепленного субстрата ДНК в 1 мин/ /мл.

Недостатком известного штамма является низкая активность продуциру емого фермента.

Цель изобретения - получение штамма Serratia marcescens , отличающегося от известных более высоким уровнем эндонуклеазной активности.

Штамм получают методом рассева на мясо-пептонном агаре пигментного шtaммa Serratia marcescens Вй-211. АТСС 9986 с последующим отбором колоний с наибольшей ДНКазнойактивность

Для получения эндонуклеазы штамм Serratia marcescens выращивают на среде следующего состава, г/л:

Глицерин 5,0

Цитрат аммония 5,0

Двузамещенный . . ,

фосфат калия 10,0

Сернокислый магний0,5

Хлористый на- .

трий 0,5

Сернокислое

железо0,5

Гидролизат

казеина 1,0

Дрожжевой

экстракт 3,0

рН срёды 7,6.

Штамм Serratia marcescens имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки. Клетки палочковидные размером 1,,,81,0д(, одиночные, парные или соединенные в цепочку, грамотрицательные подвижные.

Культуральные признаки и физиологические свойства. На МПа через 2 ч роста колонии блестящие, около 1,5 2,0 мм в диаметре, бесцветные, гладкие. Профиль колонии выпуклый, края ровные. На картофеле дает блестящий белый налет. Желатин разжижает медленно, молоко свертывает, но не пептонизирует.

Из глюкозы, сахарозы, мальтозы, ксилозы, сорбита, инозита, маннита образует кислоту. На лактозе кислота не образуется. Утилизирует цитрат натрия в качестве единственного источника углерода, сероводород. Индол не образует. Реакция Фогес-Проскауера слабо положительная. Реакция с метилрот положительная.

Нитраты восстанавливает до нитритов.

Оптимальная температура роста 28-30°С, рН среды 7,,6.

Нуклеазная активность через 8 ч выращивания на качалке (180-200 об/ /мин) при оптимальной температуре достигает 80000-90000 виск. ед/мл или 21-25 мкМ/мл/мин. Нуклеазную активность определяют вискозиметри(иеским методом и по продуктам гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в НСВСд.

Реакционная смесь объемом 1 мл

содержит 1 мг дик; 0,07 м трас-нее

буфера рН 8,5; 0,007 М 0,1 мл культуральной жидкости. Реакционную смесь инкубируют 15-30 мин при . Реакцию останавливают добавлением 4 -ного раствора охлажденной HCtQ/j. в объеме, равном объему реакционной смеси..

Кислотонерастворимый материал удаляют центрифугированием на холоду при бОООд-20-30 мин. В надосадочной жидкости после разведения в 20 раз измеряют оптическое поглощение при 2бО нм на спектрофотометре СФ-16. За единицу активности принимают количество фермента, которое дает увеличение оптической плотности в опытных образцах по сравнению с контрольными (реакционная смесь без фермента/ на одну опт. ед. за час инкубации в 310257 пересчете на 1 мл культуральной жидкости ( А2боед/мл/ч. В качестве субстрата используютпрепараты высокополимерной ДНК, выделенной из тимуса теленка по методу Кэя в модификации Бенинга или коммерческие препараты высокополимерной ДНК. 5 5 Сравнительная характеристика активности внеклеточной эндонуклеазы штаммов Serratia marcecens известных и предлагаемого в качестве проду центов нуклеазы на известной питательной среде для получения нуклеазы представлена в таблице.

Штамм бактерий Serratia mafcescens 2 (коллекция Центрального музея прокшшленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ В-2379) - продуцент эндонуклеазы. i (Л

Известный Serratia marcescens k (пигментный ) 1 Serratia marcescens Вй-211 АТСС 9986 i 000-6000 (пигментный) Serratia raarcescens (беспиг50000-60000ментный) Предлагаемый Serratia marcescens 2k ((беспиг80000-90000ментный) Пример . Получение штаммас повышенной эндонуклеазной активностью. Исходный пигментообразующий штамм Вй-211 АТСС 9986 выращивают на мясопептонйом агаре в течение 1 сут при :28°С. Выросшие клетки смывают 0,5%-ным физиологическим раствором и рассеивают на чашке Петри с мясо-пепто ным. агаром из расчета 200-300 микроб ных клеток на чашку. Посевы выдерживают в термостате в течение 2-3 сут,при 28°С. Все беспигментные коло нии, выросшие на чашках, отсевают в пробирки с НПа. Посевы хранягт при комнатной температуре. Сравнительное изучение эндонуклеазной активности полученных беспи -. ментных штаммов и исходного пигменто 20-960 1.0-1,5 lit,0-16,5 500-9950 21,0-25,0 3000-15000 образующего штамма показывает, что эндонуклеазная активность беспигментных штаммов в раз выше активности исходного штамма. Наибольшей эндонуклеазной активностью обладает беспигментный штамм Serratia marcescens 24. П р и м е р 2 . Использование штамма в качестве продуцента эндонуклеазы. .Подготовка посевного материала. Культуру Serratia maroescens 2 выращивают в течение 1 сут в пробирках со скошенной средой вышеуказанного состава, смывают 0,5%-ным физиологическим раствором и засевают в две колбы с 200 мл жидкой среды в каждой из расчета 1 мл инокулянта на 100 мл среды, выращивают на качалке I 200 об./мин в 12 ч. Полученный таким образом посевной ма териал Засевают в ферментер FEM-30 с 18 л среды. Выращивание проводят в оптимальных для образований нуклеазы условия Исходный рН среды 7,6 Температура С 28 Аэрация, л воздуха/л среды/мин 1:1 Перемешивание в течение, ч Зб Через Зб ч ферментации активност нуклеазы в культуральной жидкости д стигает 80-90 тыс. виск. ед/мл или 2t-25 мкМ расщепленной ДНК на 1 мл а минуту. Культуральную жидкость на сыщают сульфатом аммония до 20. Выпавший при С осадок вместе с бак териальными клетками отделяют центри фугированием и отбрасывают. Надосадочную жидкость повторно насыщают сульфатом аммония до 90%, оставляют при °С на 10-18 ч. Затем осадок отделяют при бООООа на рефрижераторной центрифуге, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, подвергают диализу и очистке на ДЭАЭ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе. На всех этапах определяют нуклеазную активность вискозиметрическим методом и по продуктам гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в , определяемым пО поглощению при 2бО нм Полученный штамм отличается от исходного ВЙ-2П АТСС 9986 отсутствием пигмента, большими размерами клеток, более медленным разжижением желатина, слабой реакцией Фогес-Про-. скауера, положительной реакцией с метилрот. Нуклеазная активность штамма 24 в 20 раз превышает активность исходного ив 1,5 раза штамма kk. Использование предлагаемого штамма Serratia marcescens 2k в качестве продуцента эндонуклеазы позволяет повысить нуклеазную активность за период одной ферментации на 60 по сравнению с культивированием на той же среде известного штамма Serratia marcescens t, что удешевляет процесс получения сульфатаммонийной фракции фермента на «О.