Способ получения гепарина Советский патент 1983 года по МПК A61K31/727 

1§

Изобретение относится к медицине кой промышленности и касается производства гепарина, который используется в медицине в качестве антикоагулирующего средства,

Известен способ получения герарина путем обработки животного сырья раствором поваренной соли с последующим его выделением известным путем { 1.

Однако известный способ трудоемкий, длительный и не обеспечивает высокой чистоты целевого продукта.

Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта и упрощение способа.

Цель достигается тем, что при осуществлении способа получения гепарина путем обработки животного сырья раствором поваренной соли с последующим его выделением известным рутем, в качестве сырья используют освобожденные от слизи кишки и обработку проводят твердой поваренной солью -или еераствором в нейтральной среде при 1б-25с.

С целью консервирования и обезвоживания кишок животных особенно пригодны растворы повас.Ш1Ной соли с содержанием ее от 0,5 МГ до количества молей насыщения предпочтительно от 3 моль до количества молей насыщения. Под количеством молей насыщения подразумевается количество молей, которое содержит концентрированный водный раствор при комнатной температуре (резки на скотобойне) растворенной поваренной соли. Концентрированный водный расвор поваренной соли является примерно 26,4%-ным его получают путём посыпания кишок животных поваренной солью.

Кишки животных после удаления слизи обрабатывают от 2 ч до 3 дней растворами поваренной соли. В большинстве случаев обработка кишок животных завершается уже через 3-24 ч После удаления консервированных и обезвоженных кишок животных из раствора поваренной соли получаю кишечный рассол, обладающий высоким .содержанием гепарина.

,Пример. 1. В 1500-литровой мешалке перемешивают в течение получаса при комнатной температуре 600 л рассола с 600 л метанола. Затем продолжают перемешивание еще полчаса и оставляют на 1 ч. Затем декантируют верхнюю жидкость во второй сосуд и дают выпасть осадку соли. Полученную суспензию оставляют на 2 дня. После этого снова декантируют, верхнюю жидкость выб-расывают и осадок отделяют центрифугированией После сушки в вакууме получают 1,68 кг продукта, имею:

щего активность 11 USP-ед/мг. Он содержит еще около 60% поваренной соли.

Пример 2. 3л рассола под-кисляют при перемешивании уксусной кислотой до рН 3,1-3,2 (около 50 мл Через несколько часов декантируют и остаток центрифугируют. Осадок выбрасывают и очищенные растворы нейтрализуют едким натрием и затем медленно при перемешивании смешивают с выпавшей поваренной солью. Эту суспензию оставляют на несколько часов, декантируют верхнюю жидкость и центрифугируют- осадок. Осадок высушивают в вакууме и получают 3,76 г продукта с активностью 23 USP-ед/мг.

Пример 3.3л рассола разбавляют 14 л воды. Затем добавляют 50 г кизельгура и раствор 7 г безетониум хлорида в 100 мл воды. Через несколько часов жидкость декантируют и остаток отсасывают. После промывки водой еще влажный осадок экстрагируют три раза 200 мл 2 М раствора поваренной соли. Объединенные экстракты осаж,цают 2 об.ч. метанола. Выделенный и высушенный отаток весит 560 мг и имеет активность 163 иЗР-ед/мг.

Пример 4. 3л рассола доводят до рН 3,1-3,2 добавлением уксусной кислоты при перемешивании. Через несколько часов раствор декантируют и остаток центрифугируют. Объединенные растворы разбавляют водой до 15,5 л и добавляют 40 г кизельгура и 7 г бензентониум хлорида. Через несколько часов осадок ; выделяют как в примере 3 и перера: батывают далее. Получают 796 мл проI дукта с активностью 105 :иЗР ед/мг.

П р и м е р 5. 3 -л рассола разбавляют 13 л воды. Затем раствор

: подкисляют уКСуСНОЙ КИСЛОТОЙ ДО

рН 3,2 (около 50 мл). Через несколько часов выделяется осадок, который после декантации прозрачной жидкости центрифугируют,, После сушки получают 16,6 г неочищенного гепарина с активностью 5,5 и5Р--ед/мг.

Пример 6. 10 л рассола разбавляют 50 л воды. Егютвор пропускают с помвщью Hacocci через фильтр в виде ионообменной колонки диаметром 26 и длиной 380 мм (около 3 л/ч). Применяют ионообменную микропористую средней основности в хлорированной форме (леватит СА 9249). Могут также прцМеняться другие анионообменные смолы, например смола Довекс 1-Х-1.

Затем смолу удаляют из колонки, промывают 2 раза 500 мл 0,9 М раствора поваренной соли и зшюируют 400 мл 2 М раствора поваренной соли 5 ч при и перемешивании. Этот раствор осаждают 1,5 ч объема метанола. Выделенный и высушенный осадок весит 1,5 г и имеет активность 152 USP-ед/мг. Пример 7. Аликвоту неочи щенного гепарина из примера 1,,соо ветствующей активностью 425 OOUSP|ей/мг или 38,65 г, экстрагируют 3 раза 200 мл 2 М раствора поварен ной соли, причем каждый раз t дово дят до 60с. Объединенные экстракты разбавляют водой до содержания в растворе хлорионов 0,9 моль/л. Затем добавляют 200 мл анионообменной смолы леватит СА 9249 в хлорированной форме и перемшпивают 1 ч. Смолу отсасывают и промывают 200 мл 0,9 М раствора повдренной соли. Пос ле этого ионообменную смолу элюиру ют 5 ч 2 М раствором поваренной соли при , отсасывают и промывают 2 М раствором поваренной соли. Элюированный раствор объединяют с промывным раствором и осаждают 1,5 объемом метанола. Осадок центрифугируют, сначала промывают 50 м водного метанола (1:1,5 по объему) и получают 1,91 г геиарината натрия с активностью 102 USP-ед/мг. Пример 8. 15 г полученно го согласно примеру 7 гепарината на рия с активностью 200 ИЗР-ед/мг растворяют в 200 мл 2 М раствора пова;ренной соли. Раствор отсасывают на нутче и остаток сначала промыва ют 30 мл 2м раствора поваренной с ли и затем 250 мл полностью обессо ленной воды. Объединенные растворы полностью обессоленной водой доводят до молярное ти 0,9 (по хлорид.|и6ну).. Затем аналогично примеру 7 очистку повторяют с 1л леватита СА 9249. Объединенный элюат и промывной раствор перерабатывают как указано После промывки и сушки осадка получают 11,1 г гепарината натрия с активностью 254 USP-ед/мг. Пример 9. 600 л рассола обрабатывают 600 л метанола в реакторе с мешалкой вместимостью 1500 л при перемешивании при комнат ной температуре в течение получаса Перемешивают еще в течение получаса, после чего смесь выдерживают примерно 1ч. Декантируют верхний мутный слой во вторую емкость и выпавший солевойостаток сливают обратно. Полученную суспензию выдерживают два дня. Затем ее снова декантируют, верхний отстой отбрасывают и остаток отделяют центрифуги эованием. После сушки под разрежением полу чают 1,44 М кг продукта, обладающего активностью около 10 iIJSP-ед/мг Продукт еще содержит.примерно 45% поваренной соли. Лликвотное количество полученного таким образом неочищенного гепарина fcooTBCTCTBeHно ойоло 425000 lUSP-едили 42,5 г) трижды экстрагируют, каждый раз применяя по 200 мл 2 М раствора поваренной соли, причем по мере надобности перемешивают 1 ч, при . Объединенные экстракты разбавляют водой до тех пор, пока раствор не будет содержать около 0.,9 моль/л ионов хлорида. Затем прибавляют 200 мл анионообменной cifcjttiLe wo-ti4 СА 9249) в форме хлорида и перемешивают 1,4. Затем отфильтровывают под разрежением и промывают примерно 200 мл 0,9 М раствора поваренной соли. Ионообменную смолу затем перемешивают 5 ч с 2 М раствором поваренной соли при 40С, отфильтровывают под разрежением и промывают 2 М раствором поваренной соли. Вымываемый раствор объединяют с промывочной водой и высаждают 1,5-кратным объеме метанола. Остаток отделяют «на центрифуге, сначала промывают примерно 50 мл воды - метанола Cl+lf5 об.чг), затем примерно 50 МП метанола и высушивают. . Получают 198 г Na-гепарината с 19505р-ед/мг, 15,5 г гепарината натрия 200 ед.USP/мг), полученное го указанным способом, растворяют , в 200 мл 2 М раствора поваренной соли. Раствор отсасывают через нутч-фильтр и остаток промывают сначала 300 мл 2 М раствора поваренной соли, затем примерно 250 мл полностью деминерализованной воды до молярности хлорид-иона . 0,9. Повторяют очистку действием 1 л lewatit СА 9249; сОгласно описанному. . Объединенные вымываемый и промы врчный раствор обрабатывак)Т соглас-но описанному. После промывюл и сушки осадок содержит 11,2 г гепарината натрия, обладающего активностью 251 USP-ед/мг. Пример 10. 30 л рассола разбавляют 120 л воды до молярности хлорида около 0,85 М, затем подкисляют уксусной кислотой (около 50 мл) до рН 3,2. Через несколько часов выпадает остаток, который отделяют центрифугированием после декантации прозрачного верхнего отстоя. После сушки получают 111 г- неочищенного гепарина активностью 6,5 УЗР-ед/мг. Аликвотное количество полученного таким образом неочищенного гепарина (соответственно около 425000 jliSP- ед или 65,5 г) очищают сначала аналогично примеру 1. . После Первой стадии очистки через ионообменную смолу получают 196г гепарината натрия с 198 ед USP/мг. 15 г гепарината натрия, полученного описанным способом, активностью около 200 ед OSP/мг растворяют в 200 мл 2 М раствора хлорида кальция. Раствор отделяют фильтрацией через нутч-фильтр и остаток промывают сначала 30 мл 2 н. раствора хлористого кальция, затем примерно 250 мл полностью деминерализованной воды. Объединенные растворы промывают полностью деминирализованной воды до молярности хлорида 0,9. Согласно описанному перемешивают с 1 л Lewatit СЛ 9249. Вымываемый и промывочный растворы обр батывают вместо раствора поваренной соли раствором 2 н. СаСЕ Объединенные вымываемый И промывочный растворы обрабатывают соглас но описанному. После промывки и сушки осадка получают 10,7 г гепарината кальция с активностью 260 USP-ед/мг, Предложенный способ позволяет увеличить чистоту целевого продукта, получаемый гепарин обладает высокой активностью (250-290 IJSPед/мг) по сравнению с известным способом (140-170 USP-ед/мг), а также упростить и сократить обработку животного сырья (при низких температурах продолжительность обработки 24 при повышенных до б ч) кроме того, после обработки животное сырье может быть пригодным для использования при производстве колбасных изделий.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПАРИНА путем обработки животного сырья раствором поваренной соли с последующим его выделением известным путем,о т л и чающийся тем, что, с целью повышения чистоггы целевого продукта и упрощения способа, в качестве сырья используют освобожденные от слизи кишки.и обработку проводят твердой поваре;нной солью нли ее раст вором в нейтральной, среде при 1625 С.