СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ИНСУЛИНОРЕЗИСТЕНТНОСТИ Российский патент 2017 года по МПК A61K35/74 A61P3/10 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины. Настоящее изобретение относится к бактериям из таксономической группы Eubacterium halli et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel., необязательно используемым в фармацевтических, пищевых или кормовых композициях, для применения их в качестве лекарственного средства, в частности для профилактики и/или лечения инсулинорезистентности и/или осложнений, связанных с инсулинорезистентностью, таких как метаболический синдром, дислипидемия и сахарный диабет 2 типа.

Предпосылки создания изобретения

Ожирение является, прежде всего, следствием вредных пищевых и физических привычек, развивающихся на неблагоприятном генетическом фоне. Ожирение является основным фактором риска для развития различных широко распространенных медицинских состояний, таких как метаболический синдром, сахарный диабет 2 типа, заболевания сердечно-сосудистой системы. Как метаболически активный орган желудок человека содержит плотное и разнообразное сообщество микроорганизмов, в котором доминируют тысячи разных бактериальных видов. Имеется все больше подтверждений роли микробиоты кишечника в метаболизме организма-хозяина.

Филогенетическая группа, которая охватывает подавляющее большинство микробиоты кишечника, включает грамотрицательные микроорганизмы Bacteroidetes, Proteobacteria и Verrucomicrobia, а также грамположительные Firmicutes и Actinobacteria. Ранее было показано, что кишечная микробиота вносит вклад в развитие в ожирение у мышей, вызванное диетой. Согласно этим данным, по всей видимости, микробиота в толстой кишке у мышей с ожирением характеризуется сниженной плотностью заселения микробов и обогащением их видами, утилизирующими углеводы и липиды. Предположительно короткоцепочечные жирные кислоты, ацетат, пропионат и бутират, продуцируемые специфическими бактериями кишки, могут служить в качестве сигнала, который напрямую влияет на печеночную и периферическую чувствительность к инсулину в организме хозяина. С другой стороны, проведенные в последнее время исследования показали, что меньшее разнообразие кишечной микробиоты у мышей ассоциируется с эндотоксемией, индуцируемой хроническим воспалением, последующим развитием инсулинорезистентности.

Показано, что у людей измененная микробиота толстой кишки коррелирует с ожирением, хотя нет общего мнения относительно специфических бактериальных групп среди разных видов и отсутствуют доказательство их провоцирующей заболевание роли. Поскольку метаболически здоровые и нездоровые фенотипы ожирения существуют и при наличии инсулинорезистентности и без нее, то различные опубликованные к настоящему времени материалы относительно взаимосвязи между составом микробиоты кишечника и ожирением у человека страдают недостатками, определяемыми гетерогенностью фенотипов ожирения, различными отягощающими факторами (например, диета, лечение) и появлением все новых методов анализа микробиоты кишечника. Это особенно справедливо для мелкой микробиоты кишечника, которая относительно недоступна для анализа, но которая влияет на большую площадь поверхности. Было показано, что микробная флора в тонком кишечнике менее разнообразна, чем в толстой кишке, причем она заметно обогащена бактериями, принадлежащими к Lactobacillales и Veillonella spp. (Booijnk et al. 2010 Env Microbiol 12: 3213-27). Таким образом, в данной области очевидна потребность в других лекарственных средствах, которые могли бы применяться при лечении и/или профилактике инсулионрезистентности и сахарного диабета 2 типа и преимущественно средств, которые пациент может легко использовать, не нарушая привычного образа жизни, например таких, которые были бы представлены в виде пищевых продуктов, подходящих для ежедневного приема.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к Eubacterium hallii et rel. и/или к Alcaligenes faecalis et rel., применяемых для профилактики и/или лечения инсулинорезистентности и/или состояний, связанных с инсулинорезистентностью, таких как метаболический синдром, дислипидемия и сахарный диабет 2 типа, а также инсулинорезистентности, возникающей при эндокринных заболеваниях (например, у индивидуумов с сахарным диабетом 1 типа, страдающих ожирением, при болезни Кушинга и при липодистрофических синдромах).

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической, пищевой или кормовой композиции, включающей Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel., для целей их использования при профилактике и/или лечении инсулинорезистентности и/или родственных состояний, таких как метаболический синдром дислипидемия и сахарный диабет 2 типа, а также инсулинорезистентности, возникающей при эндокринных заболеваниях (например, у индивидуумов с сахарным диабетом 1 типа, страдающих ожирением, при болезни Кушинга и при липодистрофических синдромах).

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения инсулинорезистентности и/или родственных состояний у субъекта, при наличии такой необходимости, где указанный способ включает стадию повышения уровня Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. в тонком кишечнике. Уровень присутствующих в тонком кишечнике бактерий Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. может быть повышен по способу, выбранному из группы, состоящей из введения указанному субъекту эффективного количества Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. и введения эффективного количества соединения, способного повысить в тонком кишечнике уровень Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической, пищевой или кормовой композиции, включающей Alcaligenes faecalis et rel. Указанная композиция может представлять собой напиток. Указанная фармацевтическая, пищевая или кормовая композиция, включающая Alcaligenes faecalis et rel., может применяться в качестве лекарственного средства.

Определения

В контексте настоящего описания термин "инсулинорезистентность" употребляется в общепринятом в данной области значении. Инсулинорезистентность представляет собой физиологическое состояние, при котором природный гормон инсулин становится менее эффективным по снижению уровня сахаров в крови. Это может привести к тому, что уровень глюкозы в крови может выйти за пределы нормального диапазона и вызвать неблагоприятные эффекты на здоровье, такие как метаболический синдром, дислипидемия и впоследствии сахарный диабет 2 типа. Термин "осложнения, связанные с инсулинорезистентностью" и "состояния, связанные с инсулинорезистентностью" в контексте настоящего описания включают, без ограничения, метаболический синдром, дислипидемию и сахарный диабет 2 типа, а также инсулинорезистентность, возникающую при эндокринных заболеваниях (например, у индивидуумов с сахарным диабетом 1 типа, страдающих ожирением, при болезни Кушинга и при липодистрофических синдромах).

Добавление сочетания "et rel." после обозначения родовой группы бактерий (2 уровень в названии группы) означает "и родственные", т.е. указывает на то, что включаются все родственные представители этой филогенетической группы, а именно те представители, которые указаны в таблице 3 в WO 2011/043654 (где указанная работа включена в настоящее описание в качестве ссылки), в колонке, озаглавленной как "уровень 3". Эта информация, включающая приведенные там генные последовательности 16S рРНК, может использоваться для разработки специфических ПЦР праймеров или ЛЦР (LCR) зондов для выявления одного или большего числа представителей этих групп. В ряде работ добавляемое словосочетание "et rel." заменяется на "подобный", чтобы указать на тот факт, что данная группа включает более чем один родственный вид. Однако это, скорее, не совсем четкое обозначение и в этой связи все термины с добавлением "et rel." определяются в таблице 3 из WO 2011/043654, где указанный материал был также опубликован в Rajilic-Stojaniovic et al. (2007. Environ. Microbiol. 9(9):2125-2136).

В контексте настоящего изобретения рассматриваемый субъект может представлять собой животное или человека. Предпочтительно указанным субъектом является человек. Термин "здоровый субъект", используемый в тексте настоящего описания, не страдает от инсулинорезистентности и/или сахарного диабета и предпочтительно не имеет нарушений или заболеваний в области желудочно-кишечного тракта, и более предпочтительно не имеет любых других известных медицинских состояний или заболеваний. Предпочтительно описываемый здесь "здоровый субъект" характеризуется индексом массы тела (BMI) в диапазоне значений от 18,5 до 24,9 мг/м².

В контексте настоящего описания уровень бактерий из таксона Eubacterium halli et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel., присутствующих в образце, например в образце, взятом из кишечника (таком, как дуоденальный образец или фекальный образец), повышается в том случае, когда он становится значительно больше, чем уровень одной или нескольких других из числа указанных бактерий в контрольном образце, например в контрольном образце из кишечника (таком, как дуоденальный образец или фекальный образец). Считается также, что он повышается, когда уровень бактерий из таксона Eubacterium halli et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. в образце превосходит по меньшей мере на 5%, например на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% уровень бактерий из таксономической группы Eubacterium halli et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. в контрольном образце. В тексте настоящего описания термин "контрольный образец" относится к образцу, взятому у субъекта, который проходит лечение, проводимое путем введения бактерий из таксона Eubacterium halli et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel., перед введением указанных бактерий из таксономической группы Eubacterium halli et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel., необязательно в эффективном количестве.

В контексте настоящего описания термин "эффективное количество" относится к количеству, которое является достаточным для достижения желательного терапевтического и/или профилактического эффекта, например представляет собой количество, которое приводит к лечению и/или профилактике инсулинорезистентности и/или родственных осложнений, таких как дислипидемия и сахарный диабет 2 типа, а также инсулинорезистентности, возникающей при эндокринных заболеваниях (например, у индивидуумов с сахарным диабетом 1 типа, страдающих ожирением, при болезни Кушинга и при липодистрофических синдромах). В контексте терапевтического или профилактического применения количество вводимых субъекту бактерий будет зависеть от вида и серьезности заболевания или состояния и от показателей, характеризующих самого субъекта, таких как общее состояние здоровья, возраст, пол, масса тела и толерантность к лекарственным средствам. Указанное количество будет также зависеть от стадии развития заболевания или состояния, их тяжести и типа. Любой специалист со средним уровнем знаний в данной области может определить подходящую дозировку, зависящую от этих и других факторов. Рассматриваемые бактерии могут также вводиться в сочетании с одним или несколькими дополнительными фармацевтическими средствами. В частности, применяемая в контексте бактерий фраза "терапевтически эффективное количество" обозначает уровни бактерий, которые ведут к улучшению физиологических эффектов заболевания или состояния, ассоциированного с инсулинорезистентностью и/или родственными осложнениями типа дислипидемии и сахарного диабета 2 типа, а также с инсулинорезистентностью, возникающей при эндокринных заболеваниях (например, у индивидуумов с сахарным диабетом 1 типа, страдающих ожирением, при болезни Кушинга и при липодистрофических синдромах). Любой специалист со средним уровнем знаний в данной области может определить, в каком случае следует проводить лечение или профилактику такого заболевания или состояния.

В данном документе и в прилагаемой к нему формуле изобретения глагол "включать" и различные его формы используется в неограничительном смысле и означает, что следующие за ним позиции включаются, но при этом позиции, которые конкретно не названы, не исключаются из определения. Кроме того, глагол "состоять" может быть заменен сочетанием "состоять по существу”, которое означает, что композиция по настоящему изобретению может включать один или несколько дополнительных компонентов, кроме тех, что были конкретно указаны, и эти один или несколько дополнительных компонентов не меняют уникальных характеристик, свойственных настоящему изобретению.

Дополнительно ссылка на какой-либо элемент посредством использования для этого неопределенного артикля "a" или "an" не исключает возможность того, что присутствует более чем один такой элемент, если из контекста явно не следует, что должен быть один и только один такой элемент. Таким образом, неопределенный артикль "a" или "an" обычно следует понимать как "по меньшей мере один".

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения выявили причинную роль мелкой микробиоты тонкого кишечника в развитии инсулинорезистентности и дислипидемии. У 18 здоровых мужчин со свежим диагностированным метаболическим синдромом взяли образцы биопсии из тонкого кишечника, с последующим промыванием кишечника полиэтиленгликолем через дуоденальный зонд, и далее распределили их случайным образом на группы, в которых проводили аллогенную или аутологичную фекальную трансплантацию. Аллогенную фекальную трансплантацию проводили в группе из 9 человек, где фекальный материал был получен от здорового и худого донора.

Группа с аутологичной трансплантацией включала 9 других человек, которым трансплантировали их собственный фекальный материал.

Было показано, что субъекты из так называемой аллогенной группы характеризовались иной макробиотой в сигмовидной кишке, нежели это было показано для аутологичной группы, как следовало из результатов анализа с использованием филогенетического микрочипа (чип для использования в кишечном тракте человека (the Human Intestinal Tract Chip), HITChip) (Rajilic-Stojanovic. 2009. Environ. Microbiol. 11(7):1736-1751). Уровень TG-обогащенных липопротеинов в состоянии натощак (соотношение TG/ApoB) значительно снижался у субъектов в аллогенной группе, тогда как вовсе не менялся после инфузии аутологичных фекалий. Хотя вес исследуемых субъектов оставался стабильным, через 6 недель после трансплантации фекалий, было обнаружено улучшение как с точки зрения периферической (Rd), так и печеночной чувствительности к инсулину (супрессия EGP) через 6 недель у испытуемых в аллогенной группе, тогда как никаких заметных изменений не наблюдалось в группе, получавшей аутологичный материал.

Авторы настоящего изобретения идентифицировали изменения кишечной микробиоты, наблюдавшиеся между субъектами в группах аллогенной и аутологичной трансплантации фекального материала. Сравнение микробиоты в тонком кишечнике, наблюдаемой на базовом уровне и через 6 недель в группе с аллогенной трансплантацией, показало повышение уровня бактерий, относящихся к обитателям повздошной кишки Alcaligenes faecalis, а также к продуценту бутирата Eubacterium halli. Следует особо отметить, что уровень указанного продуцента бутирата снижался почти в два раза после инфузии в группе аутологичного введения. Бактерии, относящиеся к Eubacterium hallii et rel., включают относительно быстро растущих анаэробов. Они обладают способностью метаболизировать лактат в бутират в ходе процесса, зависимого от ацетата (Munoz-Tamayo et al 2011 FEMS Microbiol Ecolo 76: 615-624). Лактат и ацетат относятся к метаболитам, обильно представленным в верхнем отделе кишечника, который заселен другими стрептококками и лактобациллами, способными продуцировать эти соединения (Booijink et al 2010, vide supra). Однако один определенный аспект настоящего изобретения относится к субстратам, лактату и ацетату, включенным в композицию, содержащую бактерии, относящиеся к таксону Eubacterium hallii et rel. Бактерии, относящиеся к Alcaligenes faecalis (входящие в таксон Alcaligenes faecalis et rel.), представляют собой факультативные анаэробные бактерии, которые способны разлагать широкий диапазон субстратов, причем они обладают уникальной способностью продуцировать закись азота и оксид азота в низкокислородных условиях в присутствии аммиака (Anderson et al 1993 Appl Environ Microbiol 95: 3525-33). Так как в верхнем отделе кишечника создаются такие условия, то вполне вероятно, что Alacaligenes faecalis продуцирует оксид азота. Авторы предположили, что оксид азота может действовать как терапевтическое средство при лечении пациентов с диабетом 2 типа и с метаболическим синдромом (Ahanchi et al 2008. Am J Physiol Heart Circ Physiol 295: H2388-98). Тогда как поступление закиси азота посредством его продукции кишечными бактериями не было описано.

Таким образом, настоящее изобретение относится к бактериям из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или к бактериям из таксона Alcaligenes faecalis et rel., применяемым при профилактике и/или лечении осложнений, связанных с инсулинорезистентностью, таких как метаболический синдром, дислипидемия и сахарный диабет 2 типа, а также с инсулинорезистентностью, возникающей при эндокринных заболеваниях (например, у индивидуумов с сахарным диабетом 1 типа, страдающих ожирением, при болезни Кушинга и при липодистрофических синдромах). В другом варианте настоящее изобретение относится к бактериям из таксона Eubacteiium hallii et rel. и/или к бактериям из таксона Alcaligenes faecalis et rel., применяемым при профилактике и/или лечении клинического состояния у млекопитающего, такого как человек, которое возникает в результате того, что эндогенный гормон инсулин становится менее эффективным по снижению уровня сахаров в крови, с последующим изменением профилей холестерина в плазме крови. Неограничивающие примеры таких клинических состояний включают метаболический синдром, дислипидемию и сахарный диабет 2 типа, а также инсулинорезистентность, возникающую при эндокринных заболеваниях (например, у индивидуумов с сахарным диабетом 1 типа, страдающих ожирением, при болезни Кушинга и при липодистрофических синдромах). Бактерии, относящиеся к одному из этих таксонов, могут использоваться сами по себе как лекарственное средство для достижения указанных целей, или бактерии из таксона Eubacteiium hallii et rel. и бактерии из таксона Alcaligenes faecalis et rel. могут использоваться в сочетании как лекарственное средство. Кроме того, может использоваться сочетание бактерий из любого одного таксона или бактерий из этих таксонов, взятых вместе, с используемыми в настоящее время в клинической практике терапевтическим агентами (например, такими как бигуаниды, производные сульфонуреума, агонисты PPAR-гамма (гамма-рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами), ингибиторы DPPIV (дипептилпептидазы IV), а также инъецируемые формы препаратов типа агониста GLP1 (глюкагоноподобный пептид-1) и/или экзогенный инсулин быстрого/длительного действия).

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической, пищевой или кормовой композиции, включающей Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel., применяемой при профилактике и/или лечении инсулинорезистентности и/или родственных осложнений типа дислипидемии и сахарного диабета 2 типа. Указанная фармацевтическая, пищевая или кормовая композиция предпочтительно включает эффективное количество Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. Предпочтительно указанная фармацевтическая, пищевая или кормовая композиция включает в целом от примерно 10⁶ до примерно 10¹², предпочтительно от примерно 10⁸ до примерно 10¹², бактерий из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерий из таксона Alcaligenes faecalis et rel. Предпочтительно указанные бактерии присутствуют в композиции в количестве, равном дневной дозе.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической, пищевой или кормовой композиции, включающей Alcaligenes faecalis et rel., необязательно применяемой в качестве лекарственного средства. Указанная композиция может включать носитель, такой как инертный носитель.

Предпочтительно описываемая здесь композиция пригодна для энтерального или перорального введения. Композиция для энтерального или перорального введения может представлять собой пищевую композицию, кормовую композицию или фармацевтическую композицию. Такая пищевая композиция, кормовая композиция или фармацевтическая композиция не включает фекальные композиции или композиции, полученные из фекальных композиций. Рассматриваемая фармацевтическая композиция обычно будет включать носитель, такой как фармацевтический носитель, в дополнение к бактериям из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактериям из таксона Alcaligenes faecalis et rel. Указанный носитель представляет собой предпочтительно инертный носитель. Предпочтительная форма носителя зависит от предполагаемого способа варианта (терапевтического) применения. Фармацевтический носитель может быть представлен совместимым, нетоксичным веществом, подходящим для доставки бактерий из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерий из таксона Alcaligenes faecalis et rel. в желудочно-кишечный тракт субъекта. Так, например, в качестве носителя может использоваться стерильная вода или инертные твердые вещества, применяемые обычно с добавлением фармацевтически приемлемых адъюванта, забуферивающего вещества, средства, способствующего диспергированию, и т.п. Рассматриваемая композиция может представлять собой либо жидкость, например это может быть стабилизированная суспензия бактерий из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерий из таксона Alcaligenes faecalis et rel., либо разные варианты твердой формы, такие как порошок лиофилизированных бактерий из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерий из таксона Alcaligenes faecalis et rel. В случае лиофилизации может быть применен криопротектор, такой как лактоза, трегалоза или гликоген. Так, например, в случае перорального введения бактерии из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерии из таксона Alcaligenes faecalis et rel. могут быть использованы в виде твердых дозированных форм, таких как капсулы, таблетки и порошки, или в виде жидких дозированных форм, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Бактерии из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерии из таксона Alcaligenes faecalis et rel. могут быть включены в состав капсул, таких как желатиновые капсулы, вместе с неактивными ингредиентами и порошкообразными носителями, такими как, например, глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, крахмал, целлюлоза или производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота, натрий-сахарин, тальк, карбонат магния и т.п.

Предпочтительная композиция по настоящему изобретению представляет собой такую композицию, которая пригодна для ее потребления субъектом, который представляет собой предпочтительно человека или животное, отличное от человека. Такие композиции могут быть представлены в форме пищевой добавки или пищи или пищевой композиции (в целом обозначаемые здесь как "пищевая композиция"), которые, помимо бактерий из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерий из таксона Alcaligenes faecalis et rel., также содержат подходящую пищевую основу. Альтернативно такая композиция может быть представлена в форме кормовой добавки или кормового вещества, или кормовой композиции (в целом обозначаемые здесь как "кормовая композиция"). Пища или пищевая композиция, или корм или кормовая композиция в контексте настоящего изобретения обозначает жидкость, пригодную для применения человеком или животным, отличным от человека, например это может быть питье или напиток. Пища или пищевая композиция или кормовая композиция может также иметь вид твердой, полутвердой или жидкой пищи, или пищевой композиции, и в частности может также представлять молочный продукт, такой как ферментированный молочный продукт, включающий, без ограничения, йогурт, напиток на основе йогурта или пахту. Указанные пища или пищевая композиция, или кормовая композиция могут быть получены по способу, который по сути уже известен, например, путем добавления в соответствующем количестве бактерий из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерий из таксона Alcaligenes faecalis et rel. к подходящей пище, пищевой основе или кормовой основе. Аналогично указанный способ может включать использование указанных бактерий в инкапсулированной форме, как было описано выше, поскольку в этом случае они могут проходить через желудок с низким значением pH. Этот способ может быть предпочтительным, поскольку в этом случае снижается уровень следовых количеств бутирата, связанных с ростом бактерий, относящихся к таксону Eubacterium hallii et rel., и которые могут придавать неприятный запах пище или пищевой композиции. В другом варианте осуществления настоящего изобретения бактерии из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерии из таксона Alcaligenes faecalis et rel. могут вводиться в пищу, пищевую композицию или кормовую композицию или использоваться для их получения, например, путем ферментации. При таком варианте бактерии из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерии из таксона Alcaligenes faecalis et rel. могут использоваться по способу, который по сути уже известен, для получения таких ферментированных пищевых продуктов или пищевых композиций, или кормовых композиций, например, по уже известному способу получения ферментированных молочных продуктов с использованием молочнокислых бактерий. В рамках таких способов бактерии из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерии из таксона Alcaligenes faecalis et rel. могут использоваться в дополнение к обычно используемому микроорганизму, и/или они могут замещать один или несколько обычно используемых микроорганизмов или их часть.

Предпочтительно указанные выше композиции будут содержать бактерии из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерии из таксона Alcaligenes faecalis et rel. в количествах, которые удобны для введения (перорального), как было указано выше, например, в виде одной или нескольких доз в день или в неделю. В частности, препарат может содержать стандартную дозу бактерий из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерий из таксона Alcaligenes faecalis et rel.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения инсулинорезистентности и/или связанных к нею осложнений типа дислипидемии и сахарного диабета 2 типа у субъекта, при наличии у него такой необходимости, где указанный способ включает стадию повышения уровня Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. в тонком кишечнике.

Уровень указанных бактерий из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерий из таксона Alcaligenes faecalis et rel. может быть определен посредством анализа уровня последовательностей нуклеиновых кислот, аминокислотных последовательностей и/или метаболитов, специфичных для указанных, одной или нескольких, бактерий, и, предпочтительно, уровня последовательностей нуклеиновых кислот, специфичных для указанных одной или нескольких бактерий.

Уровень одной или нескольких бактерий предпочтительно может быть определен при оценке уровня специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в исследуемом образце, взятом из тонкого кишечника, где указанные последовательности нуклеиновых кислот представляют собой предпочтительно генные последовательности 16S рРНК бактерий из таксона Eubacterium hallii et rel. и/или бактерий из таксона Alcaligenes faecalis et rel., более предпочтительно один или несколько вариабельных участков из генных последовательностей указанной 16S рРНК, например один или несколько вариабельных участков V1 и/или V6 из генных последовательностей указанной 16S рРНК.

Уровень бактерий Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. в тонком кишечнике может быть повышен по способу, выбранному из группы, состоящей из введения эффективного количества Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. рассматриваемому субъекту и введения эффективного количества соединения, способного повысить уровень Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. в тонком кишечнике. Соединения, способные повысить уровень Eubacterium hallii et rel. в тонком кишечнике, включают, без ограничения, лактат и ацетат. Альтернативно Eubacterium hallii et rel. может быть введен в сочетании с бактериями, продуцирующими молочную кислоту, такими как Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, могут присутствовать в ферментированном пищевом продукте, таком как йогурт или напиток на основе йогурта, которые хорошо известны, и к указанному продукту могут быть добавлены бактерии Eubacterium hallii et rel. Соединения, способные повысить уровень Alcaligenes faecalis et rel. в тонком кишечнике, могут включать, без ограничения, субстраты, позволяющие получать закись азота и оксид азота в низкокислородных условиях в присутствии аммиака.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения бактерии из таксона Eubacterium hallii et rel.представляют собой бактерии Eubacterium hallii штамм L2-7. Штамм L2-7 (DSM 17630) Eubacterium hallii доступен от компании Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSMZ). Бактерии из таксона Alcaligenes faecalis et rel. могут, например, культивироваться по методу, описанному в Annamalai et al. (Ann Microbiol. 2011 December; 61(4): 801-807).

Любой специалист со средним уровнем знаний в данной области сможет легко подобрать эффективное количество соединения, способного повышать уровень Eubacterium hallii et rel. и/или Alcaligenes faecalis et rel. в тонком кишечнике с использованием стандартных способов, которые уже хорошо известны.

Все ссылки на патентные публикации и научные статьи, приведенные в данном описании, полностью включены в него в качестве ссылок.

Следует понимать, что представленное выше описание имеет своей целью проиллюстрировать некоторые варианты осуществления настоящего изобретения, но оно никоим образом не ограничивает область настоящего изобретения. На основе приведенного в данном описании материала для специалиста в данной области будут очевидны многие другие варианты, которые охватываются областью притязаний настоящего изобретения, включая суть настоящего изобретения и очевидные сочетания известных методик и описанных в настоящем изобретении.

Примеры

Пример 1

Способы. Проводили рандомизированное контролируемое испытание с двойной слепой меткой, в рамках которого у субъектов с ожирением оценивали эффект однократной аллогенной инфузии фекальной микробной флоры (от худого донора) на метаболизм глюкозы, применительно к составу кишечной микробиоты.

Субъекты. По показателям метаболического синдрома, таким как окружность талии >102 см и уровень глюкозы натощак >5,6 ммоль/1,17, проводили скрининг среди лиц с ожирением мужского пола, относящихся к белой расе. В испытание не включали субъектов с холецистэктомией и/или лиц, подвергавшихся какой-либо лекарственной терапии и/или применявших пробиотики и/или антибиотики за последние три месяца. Все лица, включенные в испытание, дали свое письменное согласие. Протокол испытания, утвержденный экспертным советом Института (Institutional Review Board), проводили в соответствии с принципами Хельсинкской Декларации (Declaration of Helsinki) (1996). Испытание было зарегистрировано в Голландском каталоге испытаний (Dutch Trial Register) (NTR1776).

Скрининг худых доноров

По объявлению в газете были найдены худые мужчины белой расы (индекс массы тела (BM)I<23 кг/м²) для включения в испытание. Они заполнили анкету, касающуюся ритма опорожнения кишечника, поездок, которые они совершали, наличия сопутствующих заболеваний и применения лекарственной терапии. Провели скрининг лиц, включенных в испытание, на наличие инфекционных заболеваний с использованием адаптированной версии анкеты, разработанной Голландской службой переливания крови (Dutch Blood Transfusion service) (Sanquin)(Langeveld et al. 2008. J Clin Endocrinol Metab;93(3):845-851). Кровь исследовали на наличие антител к вирусу иммунодефицита человека; Т-лимфотропному вирусу человека; вирусу гепатита A, B и C; цитомегаловирусу, вирусу Эпштейна-Барра, стронгилоидоза и амебиаза. Доноров также исключали, если при скрининге их фекалий выявлялись паразитарные формы (например, Blastocystis hominis или Dietamoeba fragilis), Clostridium difficile и другие возможные патогенные бактерии (Shigella, Campylobacter, Yersinia, Salmonella).

Протокол проведения эксперимента

Метаболизм глюкозы оценивали на базовом уровне и в ходе двустадийного эугликемического гиперинсулинемического «клэмп»-теста для определения эндогенной продукции глюкозы (EGP), печеночной и периферической чувствительности к инсулину (Rate of disposal, Rd) с использованием [6,6 2H2]-глюкозы. Регистрировали вес тела и анализировали состав тела с использованием биоимпеданс диагностики. Показатель затраты энергии в покое (REE) и дыхательный коэффициент определяли по методу непрямой калориметрии (Langeveld, J Clin Endocrinol Metab 2008;93(3):845-851).

Участникам испытания разрешили придерживаться их обычной диеты, но попросили вести дневник по питанию с еженедельным вводом онлайн (www.dieetinzicht.nl) для отслеживания количества потребляемых калорий. После ночного голодания испытуемые и доноры принесли свежеполученный утренний кал для анализа; исследуемых субъектов распределили случайным образом в двойном слепом режиме по группам, в которых проводят аллогенную (от худых доноров мужского пола с индексом массы тела <23 кг/м²) или аутологичную (их собственный кал) микробную инфузию в кишку путем гастродуоденальной инфузии (см. процедуру). Вначале исследуемых субъектов подвергали гастродуоденоскопии, отбирали образцы биопсии из тонкого кишечника (в зоне тощей кишки) рядом со связкой Трейтца. Биопсийные образцы собирали в стерильные пробирки, быстро замораживали в жидком азоте и обрабатывали по описанному ранее методу (Langeveld et al., supra). Вводили дуоденальный зонд и проводили промывание кишечника раствором макрогола в течение 5 часов для очищения от фекального загрязнения после инфузии кишечной микрофлоры. Биопсию под контролем гастродуоденоскопии и эугликемический гиперинсулинемический «клэмп»-тест повторяли через 6 недель после трансплантации.

Эуглиемический гиперинсулинемический «клэмп»-тест

После 12-часового голодания вводили катетер в латеральную подкожную вену руки для инфузии меченной стабильным изотопом [6,6-2H2]глюкозы (Cambridge Isotopes, Andover, MA), инсулина и глюкозы. Второй катетер вводили ретроградно в вену контралатеральной руки и держали в терморегулируемой (60ºC) прозрачной пластиковой коробке для отбора образцов венозной крови, превращенной в артериальную. Проводили инфузию 0,9% NaCI со скоростью течения 50 мл/час, чтобы поддерживать в спокойном состоянии катетеры. В момент времени t=0 час (0800) отбирали образцы крови для определения фонового обогащения. Затем начинали примированную непрерывную инфузию меченной изотопом [6,6-2H2]-глюкозы (первая фаза 8,8 мкмоль/кг; непрерывная инфузия 0,11 мкмоль/кг/мин) и продолжали инфузию до окончания «клэмп»-теста. После завершения 2-часового периода установления равновесия отбирали образцы крови для изотопного анализа и образцы для определения глюкорегуляторных гормонов, свободных жирных кислот (СЖК (FFA)) и инкретинов. После этого (t=2,0 часа) проводили 2-стадийный эугликемический гиперинсулинемический «клэмп»-тест: 1 стадия теста включала инфузию инсулина со скоростью 20 мЕд/м²/мин (Актрапид (Actrapid) 200 МЕ/мл; компания Ново Нордиск Фарма BV, Нидерланды (Novo Nordisk Farma BV, Alphen aan den Rijn, Netherlands)) для оценки печеночной чувствительности к инсулину. Начинали инфузию 20% глюкозы для поддержания концентрации глюкозы в плазме крови на уровне 5 ммоль/л. Концентрации глюкозы в плазме измеряли каждые 5 минут у кровати с использованием глюкометра Бекмана (Beckman). Через 2 часа (t=4 часа) с 5-минутными интервалами отбирали образцы крови для измерения концентраций глюкозы и изотопного анализа. Другой образец крови отбирали для определения уровня глюкорегуляторных гормонов и свободных жирных кислот. После этого повышали скорость инфузии инсулина до значения 60 мЕд/м²/мин (стадия 2) для оценки периферической чувствительности к инсулину. Еще через 2 часа (t=6 час) повторяли отбор крови для анализа.

Состав крови определяли на базовом уровне и через 6 недель по методу биоэлектрического импедансного анализа (Maltron BF906; Maltron, Rayleigh, UK). Потребление кислорода (VO₂) и продукцию СО₂ (VCO₂) измеряли постоянно, в течение последних 20 минут на базовом уровне и в ходе эугликемического гиперинсулинемического «клэмп»-теста путем непрямой калориметрии с использованием вентилируемой вытяжки (Sensormedics model 2900; Sensormedics, Anaheim, CA). Показатель затраты энергии в покое (REE), уровни окисления углеводов (СНО) и окисления свободных жирных кислот (FAO) рассчитывали исходя из значений потребления кислорода и продукции диоксида углерода. Скорость появления (Ra) и скорость исчезновения глюкозы (Rd) рассчитывали с использованием модифицированной формы уравнений Стила (Steele) для измерений в нестационарном состоянии, как было описано ранее. Рассчитывали эндогенную продукцию глюкозы (EGP) для 38 образцов на основе разницы между появлением глюкозы Ra и скоростью инфузии глюкозы. Как периферическую (Rd), так и печеночную чувствительность к инсулину (по супрессии EGP) рассчитывали и выражали как среднее значение в виде диапазона.

Анализ кишечной микробиоты

Выделение ДНК

ДНК выделяли и очищали по методу, включающему использование повторной разбивки материала смешанными шариками в колонке, как было описано ранее (Zoetendal, Syst Appl Microbiol 2001;24(3):405-410). Для выделения ДНК из образцов биопсии авторы использовали другой протокол разбивки шариками (Nadkarni et al. 2002. Microbiology 2002;148(Pt 1):257-266). Вкратце, процедура состояла в том, что 0,5 грамм (сырой вес) фекалий суспендировали в лизирующем буфере (500 мМ NaCI, 50 мМ Трис-HCI, pH 8, 50 мМ ЭДТА, 4% ДСН), в котором содержались циркониевые шарики и стеклянные шарики. Пробирку встряхивали на Fastprep (установленном на отметке 5,5) в течение 3 мин при температуре 4ºC и затем проводили инкубацию при температуре 95ºC в течение 15 минут. ДНК в супернатанте осаждали при добавлении ацетата аммония и изопропанола, промывали 70% этанолом и затем обрабатывали протеиназой K и РНКазой, не содержащей ДНКазы. В конце процедуры ДНК очищали на QIAamp «спин» колонке (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Определяли концентрацию ДНК с использованием спектрофотометра NanoDrop 1000 (Nanodrop® Technologies, Wilmington, DE).

Определение профиля микробиоты с использованием чипов HITChip

Использовали чипы HITChip для определения филогенетического профиля микробиоты в фекалиях и образцах биопсии из тонкого кишечника, как было описано ранее (Rajilic-Stovanojic. 2009, supra). Вкратце, процедура состояла в том, что на основе 10 нг ДНК проводили амплификацию генных последовательностей 16S рРНК с использованием праймеров T7prom-Bact-27-for и Uni-1492-rev, после чего проводили транскрипцию in vitro и мечение Cy3 и Cy5 соответственно фекальных образцов. Праймер Prok-1369-rev использовали в качестве обратного праймера для биопсийных образцов, поскольку Uni-1492-rev в основном направлен на присутствующую в очень высоких количествах человеческую ДНК, что приводит к снижению эффективной амплификации генной последовательности 16S рРНК для бактериального гена (данные не приведены). Эквимолярные смеси меченных Cy3/Cy5 мишеней для 16S рРНК фрагментировали и далее подвергали гибридизации на микроносителях при температуре 62,5ºC в течение 16 часов в ротационной печи (Agilent Technologies, Amstelveen, The Netherlands), после чего слайды промывали и сушили. Образцы группировали в виде дуплексов (техническая репликация). После сканирования слайдов полученные данные выгружали из микроносителей с использованием программного обеспечения Agilent Feature Extraction, версии 7.5-9.1 (http://www.agilent.com). Затем данные анализа микроносителей нормализовали с использованием минимаксной стратегии и далее анализировали набор R-скриптов (http://vww.r-project.org/) в сочетании с использованием соответствующей базы данных, работающей под контролем системы управления базами данных MySQL (http://www.mysql.com). Иерархическую кластеризацию профилей зондов проводили с использованием метода оценки интервала корреляций и полного сцепления.

Процедура трансплантации фекалий

В день проведения инфузии пациент и донор приносили свежий кал (примерно 200 грамм, полученный в течение 6 часов перед планируемым использованием). Образцы фекалий (аллогенные или аутологичные) отбирали до и после обработки для оценки влияния процедуры обработки на состав присутствующих в образце микробов. Полученный кал заливали 500 мл стерильного солевого раствора (0,9% NaCl), переносили в блендер и перемешивали в течение 10 минут. Затем гомогенизированный раствор дважды фильтровали через чистое металлическое сито. После этого полученный фильтрат переносили в стерильную стеклянную бутыль объемом 1000 мл и хранили при комнатной температуре до завершения промывки кишечника у пациента. В итоге полученный из фекалий микробный раствор постепенно вводили через дуоденальную трубку, примерно в течение 30 минут.

Биохимия

Получали образцы плазмы натощак для определения уровней общего холестерина, холестерина ЛПНП (LDLc), холестерина ЛПВП (HDLc) и триглицеридов (ТГ (TG)) с использованием коммерчески доступных ферментативных наборов для тестирования (Randox, USA and Daiichi, Japan). Все анализы проводили с использованием автоматического анализатора Cobas Mira (Horiba, France). ЛПС-связывающий белок (ЛПБ (LBP)) и C-реактивный белок (СРБ (CRP)) определяли с использованием коммерчески доступного набора для ИФТФА (ELISA) (HyCult, USA and Roche, Switzerland). Концентрации короткоцепочечных жирных кислот в фекалиях, включающи[ ацетат, бутират и пропионат, определяли по описанной ранее методике (Wolever et al. 2000. Br J Nutr;84(1):57-61).

Анализ реакции кишечной микробиоты и слизистой организма-хозяина

Отбирали образцы утреннего стула на базовом уровне и через 6 недель соответственно как у доноров, так и у испытуемых субъектов для определения состава микробиоты. Образцы собирали в два пластиковых контейнера, сразу же замораживали при температуре -20ºC и затем в течение недели переносили в условия с температурой -80ºC. Состав микробиоты в образцах биопсии из тонкого кишечника и в фекальных образцах анализировали с использованием чипа для кишечного тракта человека (Human Intestinal Tract Chip (HITChip)), на специально изготовленном микроносителе Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), содержащем примерно 5500 олигонуклеотидных зондов, которые охватывают свыше 1000 фенотипов кишечника (Rajilic-Stojanovic et al. 2009, vide supra). Количественную оценку общего числа бактерий и метаногенов проводили по методу количественной ПЦР на основе генной последовательности 16S рРНК с использованием той же ДНК, которую брали для HITChip анализа. Полученные с использованием экспрессионных биочипов Human HT-12 v3 данные по транскриптому из биоптата тонкого кишечника (lllumina, San Diego, USA) выгружали на Gene Expression Omnibus (registrationnumber: GSE30854). Более подробно анализ кишечной микробиоты и анализ биочипов приведен в приложении к данному описанию.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SPSS, версия 16. Полученные данные выражали в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (нормальное распределение) или среднего значения (несимметричное распределение). Для сравнения данных между группами использовали параметрический t-критерий Стьюдента (нормальное распределение) или критерий знаковых рангов Уилкоксона (несимметричное распределение). Все приведенные значения P являются двусторонними. Экспрессионный анализ для HITChip и llumina биочипов проводили с использованием линейного смешанного метода и метода решающих деревьев, а также анализа канонических корреляций (CCA). Статистическую обработку данных проводили на программном обеспечении Microsoft Office Excel или R для статистического анализа (http://r-project.org/).

Статистический анализ HITChip и llumina биочипов

Экспрессионный анализ на HITChip и llumina биочипов проводили с использованием пакета прикладных программ NLME (Pinheiro and Bates. Mixed-effect models in S and S-plus. Springer; 2000). Строили линейную смешанную модель для оценки влияния времени (0 или 6 недель), режима обработки (аутологичный или аллогенный вариант), а также создавали модель для оценки перекрестного воздействия двух основных эффектов. Примененный в эксперименте формат повторных измерений дополняли включением специфичного для пациента случайного эффекта. Для каждой измеряемой единицы (ген или бактерии) рассчитывали различия с использованием пакета программ multcomp и полученные при этом значения величины p корректировали, проводя множественные сравнения с использованием пакета программ q-value (Bretz. HTWP. Multiple Comparisons Using R. CRC Press, Boca Raton, 2010; Storey J.A. A direct approach to false discovery rates. Journal of the Royal Statistical Society Series B (statistical methodology) 2010;64(3):479-498). Индивидуальную временную стабильность фекальной микробиоты у пациентов в обеих группах определяли, рассчитывая корреляцию Пирсона на олигонуклеотидном уровне между образцами, отобранными во время трансплантации и через 6 недель соответственно.

В образцах из тощей кишки, бактериальные группы, ассоциированные с разницей между аллогенными и аутологичными группами, определяли по методу решающих деревьев на основе данных об изменении бактериального состава до трансплантации и через 6 недель после трансплантации в качестве ковариантов. Затем использовали усреднение по бутстрепу (бэггинг) (Breiman. Bagging predictors. Machine Learning 1996;24(2)) в сочетании с анализом избыточности с получением жесткой оценки исследуемых бактериальных групп, определяющих различие, для оценки p-величины расхождения и для визуализации. Ассоциацию между генной экспрессией и образцами из тощей кишки оценивали с использованием анализа канонических корреляций разреженных матриц (CCA разреженных матриц). Для снижения эффекта слишком близкой подгонки исследовали набор коррелируемых генов, состоящий из десяти генов, для которых наиболее выражено различие в экспрессии. Данные по микробиоте включали данные по HITCHip на шести таксонах, для которых было показано, что они вносят существенный вклад в различие между аутологичными и аллогенными образцами в образцах из тощей кишки. В рамках CCA анализа регуляризацию параметров вначале оценивали по методу перекрестной проверки с исключением. Затем эту модель повторяли применительно ко всем данными и рассчитывали корреляции с каноническими вариантами.

Результаты

Базовые характеристики

Были скринированы 44 мужчины с ожирением на наличие у них признаков метаболического синдрома и 20 из них были включены в испытание. Два субъекта были исключены из анализа в связи с приемом антибиотика в ходе испытания, не связанным с введением микробного трансплантата. Таким образом, в итоге анализы были проведены для восемнадцати субъектов.

Влияние трансплантации фекалий на чувствительность к инсулину, уровни фекальных SCFA и LBP

Семь здоровых худых доноров, один из которых неоднократно был донором, использовали для аллогенной трансплантации девяти субъектам с ожирением, имеющим метаболический синдром. Субъектам с ожирением вводили инфузией равные количества фекалий из аллогенного или аутологичного источника фекальной микробиоты (190±33 и 187±47 грамм, ns). Кроме того, не отличалось время обработки материалf от момента получения фекалий до инфузии (5,8±0,8 и 6,1±1,2 часа в аллогенной и аутологичной группах соответственно). Ни у одного из субъектов с ожирением не выявлялось никаких побочных реакций в ходе испытания и не развивался синдром раздраженного кишечника в соответствии с римскими критериями III.

Вес тела оставался стабильным, как следовало из его значений на базовом уровне и через 6 недель (показатели для аллогенной группы 122,7+19 до 122,5±19 кг, в сравнении с показателями для аутологичной группы: 113,2±20 до 113,4±20 кг, ns). В обеих группах после микробной фекальной инфузии не было отмечено какого-либо эффекта на калорийность потребляемой пищи, показатели затраты энергии в покое или уровень окисления углеводов/жирных кислот (данные не приведены). Отмечалось заметное улучшение периферической чувствительности к инсулину через 6 недель после аллогенной трансплантации фекалий (медианное значение Rd: от 26,2 до 45,3 мкмоль/кг⋅мин, p<0,05), тогда как в группе аутологичной обработки не наблюдалось заметных изменений (медианное значение Rd: от 21,0 до 19,5 мкмоль/кг⋅мин, ns). Наблюдалась тенденция к улучшению печеночной чувствительности к инсулину, выраженная в супрессии EGP относительно базового уровня (медианное значение супрессии EGP: от 51,5 до 61,6%, p=0,08), тогда как никакого эффекта не было выявлено в группе аутологичного введения (медианное значение супрессии EGP: от 53,8 до 52,4%, ns). В обеих группах не наблюдалось изменений в глюкореуляторных гормонах ни на базовом уровне, ни в ходе гиперинсулинемии (данные приведены на файле).

Худые доноры характеризовались повышенным уровнем бутирата и пропионата в сравнении с участниками, страдающими ожирением, признак, который также наблюдался при аллогенной инфузии фекалий. Кроме того?авторы наблюдали значительное снижение уровня липополисахарид-связывающего белка (ЛСБ (LBP)) через 6 недель после трансплантации материала от худого донора (медианное значение ЛСБ (LBP): от 19,9 до 18,6 мкг/мл (p<0,05 и медианное значение СРБ (CRP): от 1,5 до 1,6 мг/л, ns), тогда как никаких значительных изменений не наблюдалось в аутологичной группе (медианное значение ЛСБ (LBP): от 23,0 до 22,3 мкг/мл и медианное значение СРБ (CRP): от 3,1 до 2,5 мг/л, ns).

Эффект фекального трансплантата на микробиоту кишки в фекалиях

Фекальная микробиота у субъектов с ожирением характеризовалась меньшим разнообразием микрофлоры кишки, более высоким содержанием Bacteroidetes и меньшим содержанием бактерий из кластера XlVa Clostridium, в сравнении с худыми донорами (данные не приведены). Для оценки влияния микробной трансплантации авторы сравнивали фекальную микробиоту на базовом уровне и через 6 недель. Общее число фекальных бактерий не менялось после инфузии фекальных микеробов. Через 6 недель анализ видоспецифичного уровня демонстрировал четкое разделение образцов, относящихся к аллогенной и аутологичной группам. В целом, происходило значительное повышение одиннадцати бактериальных групп (в 1,5-2,5 раза) при аллогенной инфузии фекальных микробов, которое существенно влияло на распределение по группам. Указанные группы включали бактерии, относящиеся к известному продуценту бутирата Roseburia intestinalis, Oxalobacte formigenes трансформирующему оксалат, к разным представителям Ruminococci и другим Firmicutes.

Эффект фекального трансплантата на кишечную микробиоту в тонком кишечнике

Общее число бактерий в тонком кишечнике не менялось после инфузии фекальных микробов. Через шесть недель был детектирован набор из семи бактерий, в значительной мере ассоциированных с разницей между аллогенной и аутологичной группами по анализу биоптатов из тонкого кишечника (Таблица 1). Дополнительно проведенные анализы продемонстрировали значительную ассоциацию (r=0,8, p<0,01) между концентрациями Eubacterium hallii в тонком кишечнике и улучшением чувствительности к инсулину (Rd) у испытуемых людей с метаболическим синдромом через 6 недель после трансплантации фекалий от худых доноров. Кроме того, была обнаружена выраженная корреляция (r=0,6, p<0,05) между концентрациями Alcaligenes faecalis и улучшением чувствительности к инсулину (Rd) у испытуемых субъектов с метаболическим синдромом через 6 недель после трансплантации фекалий от худого донора. А именно: уровень E. hallii снижался в аутологичной группе почти в два раза после инфузии. Другие бактерии, уровень которых специфически повышался в аутологичной группе, в сравнении с аллогенной группой включали обитателей повздошной кишки, таких как Lachnobacillus bovis, Streptococcus bovis и Prevotella ruminicola. Уровень Corynebacterium spp. снижался в аллогенной группе, но повышался в аутологичной группе. И, наконец, бактерии, относящиеся к грамотрицательным Escherichia coli, демонстрировали почти двукратное снижение в аллогенной группе и 2-кратное повышение в аутологичной группе (Таблица 1).

Таблица 1
Изменение в микробиоте слизистой тощей кишки после инфузии аллогенного фекального трансплантата (n=9 на группу) Филогенетическая группа Бактериальная группа Аллогенная группа
Кратность изменения после/перед транспланта-цией Аутологичная группа
Кратность изменения после/перед трансплантацией Firmicutes Eubacterium hallii et rel. 1,09 0,61 Proteobacteria Alcaligenes faecalis et rel. 1,18 0,97 Firmicutes Streptococcus bovis et rel. 0,89 1,23 Firmicutes Lachnobacillus dovis et rel. 0,63 0,98 Actinobacteria Corinebacterium spp. 0,87 1,34 Proteobacteria Escherichia coli et rel. 0,58 2,21 Bacteroidetes Prevotella ruminicola et rel. 0,99 1,01

Пример 2

Штамм Eubacterium hallii L2-7, описанный Barcenilla et al (2000, Appl. Environ. Microbiol., Apr;66(4): 1654-61; DSM 17630; который был получен из лаборатории Исследовательского Института в Шотландии от проф. Harry Flint (Rowett 5 Research Institute, Aberdeen, Scotland, UK)), растили в 2 бутылях объемом по 500 мл, каждая, в среде Вилькинса-Шальгрена (Wilkins-Chalgren) (1976, Antimicrob. Agents Chemother. 10. 926-928) в анаэробных условиях, до плотности примерно 2×10⁹ клеток на 1 мл. После этого культуры центрифугировали (10000 об/мин в течение 15 минут при 4ºC), промывали два раза анаэробным ФБР (20 мМ, pH 7, как описано подробно на сайте http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphate_buffered_saline) и ресуспендировали в 20 мл 10% глицерина в 20 мМ ФБР с добавкой 20 мМ глюкозы и 20 мМ мальтодекстрина и все при температуре -80ºС в аликвотах по 100 мкл, содержащих примерно 10¹¹ клеток на 1 мл. Все манипуляции выполняли в анаэробных условиях.

Пример 3

8-недельные самцы мышей db/db, фенотип C57BL6, а также самцы мышей C57BL6 были получены из Лаборатории Джексона (Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) и оставлены для акклиматизации в AMC виварии (ARIA) в течение 2 недель до начала эксперимента. Мыши содержались в условиях постоянного 12-часового светотемнового цикла, с контролируемыми показателями температуры и влажности, и имели свободный доступ к пище (стандартный корм) и воде. Вес тела животных измеряли один раз в неделю. Начиная с 10-недельного возраста, вводили перорально E. hallii в количестве 10⁶, 10⁸ или 10¹⁰ КОЕ в 100 мкл концентрированной глюкозы, в качестве носителя (20 мМ). Раствор вводили каждое утро через ротовой зонд с использованием шприца 21 размера, в течение 14 дней (n=8 на группу). В качестве контроля использовали вариант введения только носителя. Мышам db/db вводили через рот культуру Е. Hallii (n=8 на группу) в течение 2 недель с повышением вводимых доз (10×E10/100 мкл, 10×E8/100 мкл и 10×E6/100 мкл) или растворители (солевой раствор + глицерин) соответственно. По методу, описанному в примере 1, оценивали эффект их введения на липидный профиль (измеряли уровни общего холестерина, ЛПНП, ЛПВП и TG в образцах плазмы крови, взятой натощак, как было описано в примере 1), уровень глюкозы в плазме крови натощак и уровни инсулина для оценки резистентности к инсулину (тест HOMA), а также влияние на уровень глюкозы после принятия пищи (оральный тест на толерантность к глюкозе). Количество короткоцепочечных жирных кислот - ацетата, бутирата и пропионата - в периферической и портальной крови определяли на масс-спектрометре (см. Vrieze et al., Gastroenterology 2012, June 20, Epub ahead of print). Кроме того, после умерщвления мышей в образцах из тонкого кишечника и фекалий определяли концентрации E. hallii.

В описанном эксперименте авторы обнаружили выраженное влияние кратковременного перорального введения E. hallii L2-7 в тонкий кишечник на нормализацию инсулинорезистентности (определяемой по расчету показателя HOMA и по постпрандиальному метаболизму глюкозы, оценивая AUC на кривой, описывающей пероральную толерантность к глюкозе), а также на липидный профиль натощак у мышей db/db.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и касается профилактики и/или лечения инсулинорезистентности. Для этого вводят эффективное количество Eubacterium hallii в виде фармацевтической, пищевой или кормовой композиции. Способ обеспечивает эффективную коррекцию инсулинорезистентности за счет повышения уровня Eubacterium hallii в тонком кишечнике. 9 з.п. ф-лы, 3 пр., 1 табл.

1. Способ профилактики и/или лечения инсулинорезистентности и/или осложнений, связанных с инсулинорезистентностью, у субъекта, при наличии у него такой необходимости, отличающийся тем, что указанный способ включает стадию повышения уровня Eubacterium hallii в тонком кишечнике.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что уровень Eubacterium hallii в тонком кишечнике повышают по методу, выбранному из группы, состоящей из введения эффективного количества Eubacterium hallii указанному субъекту и введения эффективного количества соединения, способного повысить уровень Eubacterium hallii в тонком кишечнике.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что содержит введение эффективного количества Eubacterium hallii указанному субъекту.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные осложнения, связанные с инсулинорезистентностью, выбраны из метаболического синдрома, дислипидемии, сахарного диабета 2 типа и/или инсулинорезистентности, возникающей при эндокринных заболеваниях (например, у индивидуумов с сахарным диабетом 1 типа, страдающих ожирением, при болезни Кушинга и при липодистрофических синдромах).

5. Способ по п. 2, где эффективное количество Eubacterium hallii представляет собой количество от примерно 10⁶ до примерно 10¹² бактерий из таксона Eubacterium hallii.

6. Способ по п. 2, где эффективное количество Eubacterium hallii вводится указанному субъекту в виде фармацевтической, пищевой или кормовой композиции.

7. Способ по п. 2, где эффективное количество Eubactenum hallii вводится указанному субъекту в лиофилизированной форме.

8. Способ по п. 2, где эффективное количество Eubactenum hallii сформулировано для перорального введения.

9. Способ по п. 6, где эффективное количество Eubactenum hallii содержится в фармацевтической, пищевой или кормовой композиции в суточной разовой дозе.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где Eubactenum hallii представляет собой Eubacterium hallii штамм L2-7.