Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области противораковой терапии или других терапий, требующих лечения, которое провоцирует местное или системное воспаление, и обеспечивает средства и композиции для предотвращения и/или уменьшения ятрогенного воспаления, тем самым снижая нежелательные явления.
Предпосылки создания изобретения и предшествующий уровень техники
Острый миелоидный лейкоз (AML) относительно редкий, но потенциально смертельный рак крови. AML характеризуется аномальной пролиферацией злокачественных низкодифференцированных миелоидных клеток в костном мозге и периферической крови (Saultz and Garzon, 2016). Стандартная терапия AML основана на традиционной химиотерапии с трансплантацией стволовых клеток или без нее. Подходящие пациенты сначала проходят индукционную фазу с интенсивной химиотерапией. Если достигается полная ремиссия, осуществляют консолидирующую терапию для углубления ответа и достижения длительной ремиссии. Стандартные индукционные и консолидирующие терапии включают один или несколько циклов интенсивной химиотерапии и/или трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) в зависимости от профилей риска у пациента (Döhner, Weisdorf and D, 2015). Различные фазы лечения AML требуют длительного пребывания в больнице в защищенной среде и нескольких курсов лечения антибиотиками из-за высокого риска опасных для жизни инфекционных осложнений (Mayer et al., 2015).
Было продемонстрировано, что такие методы лечения резко меняют состав микробиоты кишечника человека (Galloway-Pena et al., 2016; Galloway-Peña et al., 2017). Индуцированный так называемый дисбактериоз характеризуется уменьшением общего микробного разнообразия, разрушением полезных бактерий, которые поддерживают защитные силы хозяина, и увеличением доминирования видов бактерий, обычно субдоминирующих, включая некоторые патогены и патобионты, а также бактерии с множественной лекарственной резистентностью (MDR) (Jandhyala et al., 2015; Montassier et al., 2015). Таким образом, химиотерапия и лечение антибиотиками нарушают мутуалистические взаимные отношения между хозяином и микроорганизмами и вызывают патологические состояния, включая неконтролируемые местные иммунные реакции и потенциально системное воспаление (Palm, Zoete и Flavell, 2015).
Недавние исследования показали, что высокое микробное разнообразие кишечника связано с улучшением клинических исходов и снижением инфекционных осложнений у пациентов (Galloway-Pena et al., 2016; Galloway-Peña et al., 2017; Malard et al., 2018). Значительное уменьшение микробного разнообразия в течение курса индукционной химиотерапии наблюдали в образцах стула от пациентов с AML. Кроме того, известно, что индукционная химиотерапия имеет критические последствия для эпителия желудочно-кишечного тракта, приводя к колиту с сильной болью в животе, диарее, гематохезии с признаками воспаления кишечника (Hogan et al., 2002; Camera et al., 2003)., Системный воспалительный статус пациентов с AML значительно повышается после индукционной химиотерапии, как показали измерения с двумя сывороточными маркерами воспаления: уровни С-реактивного белка (CRP) и ферритина (Khitam AW Ali, Alaa F Alwan, 2015). Таким образом, последствия лечения AML для кишечника могут помешать оптимальному уходу за пациентом: усиление инфекционных осложнений (например, сепсис), плохой пищевой статус, более длительная госпитализация, прерывание или отсроченные курсы консолидации из-за токсичности лечения (Elting et al., 2003).
Существует потребность в разработке терапевтических решений для облегчения воспаления кишечника, вызванного противораковым лечением у пациентов с AML.
Разработка таких стратегий, как перенос фекальной микробиоты (FMT) для восстановления разнообразных микробных сообществ, утраченных во время лечения заболевания, и, следовательно, для подавления или уменьшения связанных с лечением осложнений у пациентов с AML, может предложить новые терапевтические возможности (Khanna, 2018; Malard et al., 2018) Khanna 2017). Целью несравнительного проспективного клинического исследования, описанного в Примере 1, было использование аутологичного FMT (AFMT) у пациентов с AML, получавших интенсивную химиотерапию и антибиотики, для восстановления разнообразия их кишечной микробиоты и уменьшения индуцированного лечением носительства MDRB. К удивлению, авторы изобретения также показали, что FMT у пациентов с AML приводит к уменьшению воспаления, особенно местного воспаления кишечника. Описание клинического протокола этого исследования (названного ODYSSEE) было опубликовано Mohty et al. ["Prevention of Dysbiosis Complications with Autologous Fecal Microbiota Transplantation (auto-FMT) in Acute Myeloid Leukemia (AML) Patients Undergoing lntensive Treatment (ODYSSEE study): First Results of a Prospective Multicenter Trial", Blood, 7 December 2017 eA17-12-07]. В этом документе не раскрыты ни метод получения образцов фекальной микробиоты, ни результаты исследования.
В ряде публикаций раскрыто использование FMT при лечении дисбактериоза кишечника, вызванного химиотерапией. Например, Wang et al: "P038 Fecal Microbiota Transplant (Fmt) For Immunocheckpoint Inhibitor-Induced Colitis (ICI-C) in 50 Year Old Female with Bladder Cancer", Inflammatory Bowel Diseases, vol.24, no. 51, 18 January 2018 (2018-01-18), page S13, Le Bastard et al: раскрывает "Fecal microbiota transplantation reverses antibiotic and chemotherapy-induced gut dysbiosis in mice", Scientific Reports, vol. 8, no. 1, 18 April 201 8 (201 8-04-1 8), и Cui et al: "Faecal microbiota transplantation protects against radiation-induced toxicity", EMBO Molecular medicine (online), vol. 9, no. 4,27 February 2017 (2017-02-27), pages 448-461.
Принимая во внимание продолжающуюся распространенность рака сегодня, в частности AML, существует потребность в обеспечении надежных, воспроизводимых и эффективных терапевтических решений, которые дополняют или увеличивают эффективность или уменьшают побочные эффекты существующих методов лечения AML. Конечно, такие терапевтические решения должны подходить для применения у пациентов, в частности, в уязвимой популяции, например, у больных раком.
В частности, существует потребность в терапевтических решениях, отвечающих текущим фармацевтическим требованиям, что касается безопасности и эффективности. Существует потребность в том, чтобы такие терапевтические продукты можно было получать с использованием способов, соответствующих Надлежащей производственной практике (GMP).
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к применению композиции фекальной микробиоты для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у нуждающегося в этом индивидуума.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, композицию микробиоты получена способом, включающим следующие стадии:
(i) сбор образца стула и помещения его в анаэробные условия максимум через 5 минут после сбора;
(ii) все еще в анаэробных условиях, смешивание образца с водным солевым раствором, включающим по меньшей мере, криопротектор и/или объемообразующий агент; и
(iii) фильтрование разбавленного образца.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, композиция фекальной микробиоты включает микробиоту из по меньшей мере двух, или по меньшей мере трех, или по меньшей мере четырех образцов стула от одного и того же индивидуума.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, композиция фекальной микробиоты включает микробиоту, полученную из по меньшей мере одного образца стула от нуждающегося в лечении индивидуума для уменьшения воспаления.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, композицию фекальной микробиоты используют для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления кишечника у нуждающегося в этом индивидуума.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, композицию фекальной микробиоты используют для предотвращения и/или уменьшения воспаления, вызванного противораковой терапией, включая химиотерапию.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, предотвращение и/или уменьшение указанного воспаления осуществляют путем осуществления по меньшей мере одного FMT через 1-30 дней после окончания противораковой терапии. Желательно, чтобы можно было осуществить два FMT с интервалом в 1-7 дней.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, композиция фекальной микробиоты приводит к снижению уровня неоптерина в кишечнике и/или снижению CRP и/или ферритина в сыворотке пациента, подлежащего лечению.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, введение композиции фекальной микробиоты приводит к увеличению доли полезных бактерий и снижению доли вредных бактерий в желудочно-кишечном тракте подлежащего лечению индивидуума.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, доля некоторых или всех следующих 15 родов увеличивается по сравнению с уровнем после окончания противораковой терапии: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum и Butyrivibrio.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, вводимая композиция фекальной микробиоты включает микробиоту из следующих 15 родов: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum и Butyrivibrio.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, указанный подлежащий лечению индивидуум представляет собой пациента, больного раком.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, указанный подлежащий лечению индивидуум имеет гематологическое заболевание.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, указанный подлежащий лечению индивидуум имеет острый лейкоз.
Описание чертежей
Фиг. 1: График процедур исследования Odyssee
Фиг. 2: Динамика биохимических и иммунологических параметров в популяции пациентов, получивших лечение (n=25). (a) Системный уровень: IL-6, CRP и ферритин. (b) Локальный уровень: неоптерин, IgA.
Фиг. 3: Динамика биохимических и иммунологических параметров для получившей лечение популяции (n=25) (a) sCD14 (b) TAS (c) TNFα.
Фиг. 4: Характеристика фекальной микробиоты при диагностике AML, до и после введения AFMT для популяции в соответствии с протоколом (n=20). (a) Видовое разнообразие. (b) Индекс Симпсона на уровне видов. (c) Индекс Брея-Кертиса на уровне видов. (d) Общее количество генов в микробном сообществе.
Фиг. 5: Доля полезных (a) и вредных (b) бактерий в микробиоте пациентов на протокол (n=20).
Фиг. 6: Относительная распространенность выбранных 15 родов, генерирующих бутират (названных “butycore”), а именно Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum и Butyrivibrio, у пациентов в исследовании ODYSSEE после каждого посещения больницы, V1, V2, V3 и V4.
Фиг. 7: Кривые выживаемости для получавших лечение пациентов. (a) Общая кривая выживаемости. (b) Кривая выживаемости без лейкоза (LFS).
Фиг. 8: График процедур исследования OSIRIS.
Фиг. 9: Динамика биохимических и иммунологических параметров для наблюдаемых пациентов OSIRIS (n=42) (a) Зонулин. (b) Неоптерин.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
В настоящем описании используются следующие общие определения:
Микробиота кишечника
“Микробиота кишечника” (ранее называемая кишечной флорой или микрофлорой) означает популяцию микроорганизмов (бактерий, архей, грибов, вирусов), живущих в кишечнике любого организма, относящегося к миру животных (человек, животное, насекомое и т.д.). Хотя каждый индивидуум имеет уникальную композицию микробиоты, от 60 до 80 видов бактерий являются общими для более чем 50% отобранной человеческой популяции, в общей сложности 400-500 различных видов бактерий/субъект.
Микробиота кишечника выполняет сходные основные физиологические функции у всех субъектов и оказывает прямое влияние на здоровье субъекта:
• способствует перевариванию некоторых продуктов, которые желудок и тонкий кишечник не могут переваривать (в основном, неперевариваемые волокна);
• способствует выработке некоторых витаминов (B и K);
• защищает от агрессии со стороны других микроорганизмов, сохраняя целостность слизистой оболочки кишечника;
• играет важную роль в развитии правильной иммунной системы;
• здоровая, разнообразная и сбалансированная микробиота кишечника является ключом к правильному функционированию кишечника.
Принимая во внимание основную роль микробиоты кишечника в нормальном функционировании организма и различных функциях, которые она выполняет, в настоящее время она считается “органом”. Однако это “приобретенный” орган, поскольку колонизация кишечника микроорганизмами начинается сразу после рождения и постоянно развивается в течение всей жизни и является результатом различных воздействий окружающей среды (способ родоразрешения, диета, ятрогенные стрессовые факторы...).
Хотя общая композиция доминирующей кишечной микробиоты у большинства здоровых людей схожа (4 основных типа, т.е., Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria и Proteobacteria), композиция на уровне видов очень индивидуальна и в значительной степени определяется генетикой, окружающей средой, диетой и историей болезни субъекта.
Дисбиоз
Хотя он может адаптироваться к изменениям и обладает высокой способностью к восстановлению, в некоторых конкретных ситуациях может возникнуть потеря баланса в композиции микробиоты кишечника. Это называется “дисбиозом”, отклонением от того, что считают “здоровой” микробиотой с точки зрения численности и разнообразия основных бактериальных групп (т.е. нарушение равновесия между потенциально “вредными” и “полезными” бактериями в кишечнике), приводящим к нарушению симбиотических отношений между хозяином и его микробиотой. Дисбиоз может быть связан с проблемами со здоровьем, такими как функциональные расстройства кишечника, воспалительные заболевания кишечника, аллергия, ожирение и диабет. Это также может быть следствием медицинского лечения, такого как цитотоксическое лечение (например, химиотерапия) или лечение антибиотиками, и может спровоцировать побочные эффекты, такие как боль в животе и диарея. Индуцированный лечением дисбиоз также может способствовать серьезным побочным эффектам, таким как инфекции и сепсис.
Противораковая терапия
Под “противораковой терапией” в настоящей заявке подразумевают любой вид лечения, используемый для борьбы с раком, такой как химиотерапия, биологическая терапия (включая иммунотерапию), лучевая терапия и хирургия.
Противораковая химиотерапия
“Химиотерапия” определяется в настоящей заявке как лечение рака одним или несколькими "химиотерапевтическими средствами". Химиотерапевтические средства представляют собой химические молекулы, которые действуют, убивая быстро делящиеся клетки, что является одним из основных свойств большинства раковых клеток. Химиотерапевтические средства включают:
- алкилирующие агенты, такие как азотистые иприты (мехлорэтамин, циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, ифосфамид, бусульфан и т.д.), нитрозомочевины (N-нитрозо-N-метилмочевина (MNU), кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), семустин (MeCCNU) и т.д.), тетразины (дакарбазин, митозоломид, темозоломиди т.д.), азиридины (тиотепа, митомицин, диазиквон (AZQ) и т.д.), и неклассические алкилирующие агенты (например, прокарбазин и гексаметилмеламин);
- веретенные яды, такие как мебендазол, колхицин;
- ингибиторы митоза (включая таксаны (паклитаксел (Taxol ®), доцетаксел (Taxotère®)) и алкалоиды барвинка (например: винкристин, винбластин, винорелбин, виндезин)),
- цитотоксические/противоопухолевые антибиотики: такие как антрациклины (например, доксорубицин, даунорубицин, адриамицин, идарубицин, эпирубицин и митоксантрон, валрубицин), стрептомицины (например, актиномицин, блеомицин, митомицин, пликамицин)
- антиметаболиты (такие как пиримидиновые аналоги (например: аналоги фторпиримидинов, 5-фторурацил (5-FU), флоксуридин (FUDR), цитозинарабинозид (Цитарабин), гемцитабин (Gemzar®), капецитабин; аналоги пурина (например, азатиоприн) меркаптопурин, тиогуанин, флударабин, пентостатин, кладрибин, капецитабин, клофарабин); аналоги фолиевой кислоты (например: метотрексат, фолиевая кислота, пеметрексед, аминоптерин, ралтитрексед, триметоприм, пириметамин),
- ингибиторы топоизомеразы (например: камптотецины: иринотекан, топотекан, амсакрин, этопозид, этопозид фосфат, тенипозид);
- ингибиторы ДНК-метилтрансферазы: 2'-дезокси-5-азацитидин (DAC), 5-азацитидин, 5-аза-2'-дезоксицитидин, 1-[бета]-D- арабинофуранозил-5-азацитозин, дигидро-5-азацитидин;
- разрушающие сосуды средства, такие как производные флавонуксусной кислоты, 5,6-диметилксантенон-4-уксусная кислота (DMXAA) и флавонуксусная кислота (FAA);
- другие химиотерапевтические лекарственные средства, такие как апрепитант, бортезомиб (Velcade®, Millenium Pharmaceuticals), иматиниба мезилат (Gleevec®), кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), тамоксифен, гефитиниб, эрлотиниб, карбоксиамидотриазол, эфапроксирал, тирапазамин, кситрин, тималфазин, винфлунин.
Противораковые биологические терапии
Противораковые “биологические терапии” включают использование живых организмов, веществ, полученных из живых организмов, или лабораторных версий таких веществ для лечения рака путем прямого воздействия на раковые клетки или путем стимуляции иммунной системы организма для действия против раковых клеток (“иммунотерапия”). Биологические терапии включают моноклональные антитела (Mabs), в том числе антитела, нацеленные на поверхность раковых клеток (например, ритуксимаб и алемтузумаб); антитела, нацеленные на иммунную контрольную точку, такие как анти-CTLA4 Mabs (например, ипилимумаб), анти-PD1 Mabs, анти-PD-L1 Mabs (такие как Атезолизумаб или Дурвалумаб), анти-PD-L2 Mabs, анти-Tim3 Mabs, анти-ICOS Mabs и т.д.; нацеленные на факторы роста (например: бевацизумаб, цетуксимаб, панитумумаб и трастузумаб); иммуноконъюгаты (например: 90Y-ибритумомаб тиуксетан, 131I-тозитумомаб и адо-трастузумаб эмтанзин). Другие биологические терапии включают цитокины (включая интерфероны, такие как IFNα; интерлейкины, такие как IL-2, IL-11, G-CSM, GM-CSF), терапевтические вакцины (например: Sipuleucel-T (Provenge®)), бактериальную бациллу Кальмета-Герена, убивающие рак вирусы, генную терапию и адаптивный перенос Т-клеток.
Противораковая иммунотерапия
“Иммунотерапия” в настоящей заявке означает любую терапию, которая действует посредством модуляции иммунной системы пациента, с использованием биологических терапий, как описано выше, или любого другого средства.
Рак, лечение и т.д.
Как используется в настоящей заявке, “рак” означает все типы рака. В частности, злокачественные опухоли могут быть солидными или несолидными. Неограничивающими примерами рака являются карциномы или аденокарциномы, такие как рак молочной железы, предстательной железы, яичников, легких, поджелудочной железы или толстой кишки, саркомы, лимфомы, миеломы, меланомы, лейкозы, герминогенный рак и бластомы.
Другие определения будут указаны ниже при необходимости.
Как описано в экспериментальной части ниже, авторы изобретения продемонстрировали, что пациенты с AML, получающие трансплантат фекальной микробиоты (FMT) после индукционной химиотерапии в сочетании с антибиотиками, не только получали пользу от восстановления разнообразия микробиоты кишечника и снижения индуцированного лечением носительства MDRB, но у них также уменьшалось воспаление как на системном, так и на местном уровнях в кишечнике. Этот неожиданный результат имеет огромное значение, поскольку несколько побочных эффектов противоракового лечения связаны с воспалением.
Следовательно, в соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение относится к использованию композиции фекальной микробиоты для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у нуждающегося в этом индивидуума.
В настоящем тексте индивидуум, нуждающийся в FMT для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления, представляет собой человека или отличное от человека животное.
В настоящем тексте “композиция фекальной микробиоты” означает композицию, которая включает фекальный материал с живыми фекальными бактериями, в частности композицию, подходящую для трансплантации фекальной микробиоты (FMT). В соответствии с конкретным вариантом осуществления, композиция фекальной микробиоты включает всю микробиоту, присутствующую в образце кала или пуле такой микробиоты, полученном из различных образцов.
Авторы изобретения показали, что FMT снижает индуцированное лечением или ятрогенное системное воспаление, о чем свидетельствует снижение уровня CRP и/или уровня ферритина. Это снижение очень полезно для пациентов, поскольку системное воспаление известно как причина или фактор риска некоторых тяжелых побочных эффектов (например, сепсиса), связанных с тяжелыми видами лечения, такими как лечения рака. Соответственно, авторы изобретения не наблюдали сепсиса у пациентов с AML в течение по меньшей мере 40 дней после получения FMT в соответствии с изобретением. Таким образом, настоящее изобретение более конкретно относится к использованию композиции фекальной микробиоты для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением системного воспаления и связанных с ним осложнений, таких как сепсис.
Авторы изобретения также продемонстрировали, что FMT снижает локальное воспаление кишечника, о чем свидетельствует снижение уровня неоптерина в кале. В соответствии с конкретным вариантом осуществления, композицию фекальной микробиоты таким образом используют для предотвращения и/или уменьшения воспаления кишечника и связанных с этим желудочно-кишечных симптомов, таких как, например, колит и диарея.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения, композицию фекальной микробиоты, используемую для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления, получают способом, включающим следующие стадии:
(i) сбор образца стула и помещения его в анаэробные условия максимум через 5 минут после сбора;
(ii) все еще в анаэробных условиях, смешивание образца с водным солевым раствором, включающим по меньшей мере, криопротектор и/или объемообразующий агент; и
(iii) фильтрование разбавленного образца, например, при приблизительно 265 мкм.
Согласно предпочтительному варианту осуществления водный раствор, используемый на стадии (ii), содержит мальтодекстрин и/или трегалозу, при этом конечная концентрация (масс/об) мальтодекстрина находится в диапазоне 5-15% и/или конечная концентрация (масс/об) трегалозы находится в диапазоне 5%-15%.
К описанному выше способу можно добавить дополнительные необязательные стадии, такие как:
(ia) контроль образца кала, например:
- осуществление микробиологического тестирования образца, чтобы избежать введения индивидууму патобионтов и/или бактерий с множественной лекарственной резистентностью (MDRB);
- визуальная оценка отсутствия мочи и крови в исходном материале;
- Бристольская шкала формы кала исходного материала;
- визуальная оценка однородности и цвета продукта, а также проверка жизнеспособности бактерий, присутствующих в образце (по культуре фекалий).
(iv) объединение нескольких продуктов стадии (iii): смешивание двух или более указанных продуктов и гомогенизация смеси;
(va) замораживание продукта стадии (iii) или (iv) при -80°C; после размораживания жидкий инокулят можно вводить посредством клизмы;
(vb) лиофилизация продукта стадии (iii) или (iv) с использованием обычных материалов для лиофилизации и протоколов. Лиофилизат инокулята пригоден для введения либо посредством клизмы в жидком растворе, либо перорально в кишечнорастворимых капсулах.
(vc) помещение лиофилизированного материала со стадии (vb) в подходящие капсулы для перорального введения.
(vi) проверка жизнеспособности и разнообразия бактерий в продукте, полученном на стадиях (iii), (iv), (va), (vb) или (vc), и/или отсутствия патобионтов и MDRB в указанном продукте.
Композиция фекальной микробиоты, используемая в соответствии с настоящим изобретением, может включать микробиоту от одного донора или от нескольких доноров. Например, несколько разбавленных и отфильтрованных образцов могут быть смешаны на стадии (iv) описанного выше способа. Специалист в данной области выберет, в зависимости от ситуации, предпочтительнее ли пациенту получить FMT от одного донора (например, от самого пациента или от родственника пациента) или FMT от нескольких доноров.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления, композиция фекальной микробиоты включает микробиоту, полученную из образца кала нуждающегося в лечении индивидуума для уменьшения воспаления. Этот вариант осуществления включает аутологичный FMT (AFMT) (т.е. композиция получена из фекального материала только этого индивидуума), а также FMT от нескольких доноров, если микробиота индивидуума объединена с микробиотой по меньшей мере одного другого индивидуума.
Когда аутологичный FMT осуществляют в рамках настоящего изобретения, предпочтительно, когда сбор кала у пациента осуществляют до начала лечения, которое будет индуцировать воспаления и/или дисбиоз, как показано в Примере 1 ниже.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления, композиция фекальной микробиоты включает по меньшей мере 90% родов, присутствующих в используемом образце(образцах). В частности, в случае AFMT композиция фекальной микробиоты включает по меньшей мере 90% родов, присутствующих в образце, полученном от индивидуума до индуцирующего воспаление лечения.
Противораковые лечения обычно вызывают системное и/или местное воспаление, которое может быть причиной дискомфорта, а иногда и серьезных побочных эффектов (которые, в свою очередь, могут привести к прекращению лечения). В соответствии с конкретным вариантом осуществления, настоящее изобретение, таким образом, относится к использованию композиции фекальной микробиоты, как описано выше, для предотвращения и/или уменьшения воспаления, вызванного противораковой терапией, возможно в сочетании с антибактериальной терапией и/или трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (HSCT).
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к использованию композиции фекальной микробиоты, как описано выше, для предотвращения и/или уменьшения воспаления, вызванного противоопухолевым средством, возможно в сочетании с антибактериальной терапией и/или трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (HSCT). “Противоопухолевые средства” в настоящей заявке означают любое лечение рака, кроме хирургического. Они включают химиотерапию, биологическую терапию, включая иммунотерапию, и лучевую терапию.
В соответствии с еще одним конкретным вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к использованию композиции фекальной микробиоты, как описано выше, для предотвращения и/или уменьшения воспаления, вызванного химиотерапией, возможно в сочетании с антибактериальной терапией и/или трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (HSCT).
При осуществлении изобретения композицию фекальной микробиоты можно вводить для трансплантации фекальной микробиоты (FMT) до, во время и/или после противораковой терапии, например до, во время и/или после химиотерапии первой линии, например до, во время и/или после индукционной химиотерапии (такой, как химиотерапия "7+3" с цитарабином и антрациклиновым антибиотиком или даунорубицином).
В рамках настоящего изобретения можно предусмотреть несколько схем введения. В соответствии с конкретным вариантом осуществления, проиллюстрированным в Примере 1 ниже, по меньшей мере один FMT осуществляют в течение от 1 до 30 дней после завершения противораковой терапии, более конкретно через 20-30 дней после завершения индукционной химиотерапии (что соответствует, для этих пациентов, завершению антибактериальной терапии).
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления, также проиллюстрированным в Примере 1 ниже, по меньшей мере два FMT осуществляют с интервалом от 1 до 7 дней.
Настоящее изобретение также относится к применению композиции фекальной микробиоты, как описано выше, для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у индивидуума, получающего противораковое лечение, при этом композицию фекальной микробиоты вводят каждый день, например в пероральных капсулах, при диагностике рака, до, во время и/или после указанного противоракового лечения. В соответствии с конкретным вариантом осуществления, ежедневный прием пероральных капсул, содержащих композицию фекальной микробиоты, начинают в начале индукционной химиотерапии и продолжают в течение по меньшей мере от 3 до 6 месяцев.
Как уже было указано, авторы изобретения продемонстрировали, что FMT приводит к уменьшению ятрогенного воспаления кишечника у получающих лечение пациентов, о чем свидетельствует снижение уровня неоптерина в собранных образцах кала. В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения, FMT с композицией фекальной микробиоты, как описано выше, приводит к снижению уровня неоптерина в кишечнике, которое можно измерить в образцах кала от пролеченного индивидуума. Более конкретно, уровень неоптерина снижается по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 40%.
Авторы изобретения также продемонстрировали, что FMT приводит к уменьшению ятрогенного системного воспаления у получавших лечение пациентов, о чем свидетельствует снижение уровней CRP и/или ферритина в сыворотке пациентов. В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения, FMT с композицией фекальной микробиоты, как описано выше, приводит к снижению CRP и/или ферритина в сыворотке получающего лечение индивидуума. Более конкретно, уровень CRP в сыворотке снижается по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 40%, и/или уровень ферритина в сыворотке снижается по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 40%.
Другим аспектом настоящего изобретения является использование композиции фекальной микробиоты, как описано выше, для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у индивидуума, при этом FMT с указанной композицией фекальной микробиоты приводит к увеличению доли полезных бактерий и снижению доли вредных бактерий в желудочно-кишечном тракте.
В контексте настоящего изобретения “полезные бактерии” включают бактерии, принадлежащие к семействам Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bifidobacteriaceae, Streptococcaceae, Akkermansiaceae, Lactobacillaceae, Eubacteriaceae, Erysipelotrichaceae, Eggerthellaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Oscillospiraceae, Rikenellaceae и Odoribacteraceae, а “вредные бактерии” включают бактерии, принадлежащие к семействам Bacteroidaceae и Enterococcaceae. В соответствии с изобретением, считается, что композиция фекальной микробиоты приводит к увеличению доли полезных бактерий и снижению доли вредных бактерий в желудочно-кишечном тракте, если в период от 2 дней до 3 недель после FMT с указанной композицией суммарное количество перечисленных выше полезных бактерий больше, чем измеренное непосредственно перед FMT, а суммарное количество вредных бактерий, перечисленных выше, меньше, чем измеренное непосредственно перед FMT.
Данные заявителя (см. Примеры ниже) подтверждают, что настоящее изобретение особенно полезно для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у пациентов, страдающих раком.
Настоящее изобретение также полезно для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у пациентов, страдающих гематологическим заболеванием, таким как острый лейкоз (например, острый миелоидный лейкоз - AML), аутоиммунная цитопения и идиопатическая аплазия костного мозга.
Кроме того, данные заявителя в приведенных ниже Примерах раскрывают потенциал микробиотерапии в комбинации с другими лечениями против заболеваний крови, особенно злокачественных.
В частности, лечение FMT продуктом связано со снижением воспалительного состояния у пациентов (Пример 1) в отличие от пациентов, которых не лечили при помощи FMT (Пример 2). Воспаление и воспалительный синдром связаны с увеличением числа сопутствующих заболеваний и отрицательной оценкой пациентов. Действительно, воспалительные маркеры крови, такие как CRP и сывороточный ферритин, имеют прогностическую ценность для возникновения системной инфекцией у пациентов, перенесших HSCT (Hong et al., 2015). Интересно, что до лечения (т.е. до подготовки к HSCT) CRP является прогностическим фактором для клинических исходов алло-HSCT: более высокие уровни CRP коррелируют с большей инфекционной токсичностью 3-4 степени, токсичностью для печени, более длительным пребыванием в больнице с HCT, большей вероятностью aGVHD, большей безрецидивной смертностью и низкой общей выживаемостью (Artz et al., 2008). Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, повторный FMT во время лечения лейкемического пациента во время курсов химиотерапии снижает воспалительный статус и уровни CRP, тем самым предотвращая токсичность алло-HSCT и связанную с этим заболеваемость/смертность (у тех пациентов, которые являются кандидатами на алло-HSCT). Кроме того, положительное влияние на местное воспаление кишечника оказывает положительный эффект на качество жизни пациента, например, за счет уменьшения желудочно-кишечных расстройств, таких как боль в животе и/или диарея.
Напротив, приведенные авторами изобретения данные в Примере 2 показывают вредное влияние длительного лечения антибактериальной терапией, продемонстрированное в протоколе OSIRIS с 96 AE (нежелательными явлениями), связанными с желудочно-кишечным трактом, зарегистрированными у пациентов, за которыми наблюдали. Эти пациенты не получали FMT. Такой результат подчеркивает необходимость комбинированного лечения для уменьшения воспаления кишечника и связанных с ним осложнений.
Недавно было показано, что микробиота кишечника может модулировать ответ на терапию рака (химиотерапию, лучевую терапию и иммунотерапию) и предрасположенность к токсическим побочным эффектам (Roy и Trinchieri, 2017; Routy et al., 2018). Таким образом, предлагается восстановление кишечной микробиоты с увеличением разнообразия для повышения эффективности и снижения токсичности (Alexander et al., 2017). Более того, было показано, что большое разнообразие микробиоты кишечника играет ключевую роль в общей выживаемости после алло-HSCT и в исходе для пациентов с GvHD (Taur et al., 2014). В целом, эти аргументы свидетельствуют о полезном влиянии “здоровой” и разнообразной микробиоты на клинические исходы пациентов с раком и особенно с гематологическими злокачественными новообразованиями и убедительно подтверждают обоснованность использования микробиотерапии в качестве адъювантной терапии на протяжении всего курса лечения пациентов.
Доли полезных и вредных бактерий в микробиоте ODYSSEE пациентов явно изменялись после IC, со значительным уменьшением полезных и увеличением вредных, соответственно, что коррелирует с повышением маркеров воспаления, определяемых в крови и фекалиях. Действительно, среди полезных бактерий авторы изобретения обнаружили особую группу из 15 исключительно полезных бактериальных родов: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum и Butyrivibrio. Эту совокупность родов авторы изобретения назвали “butycore”.
Как описано в Примере 1, авторы изобретения сопоставили наличие вышеуказанных 15 родов со снижением воспаления кишечника, о чем свидетельствуют уровни маркеров воспаления (фекальных и плазматических) неоптерина и плазматического CRP у пациентов. Следовательно, присутствие этих 15 родов в образце кала, вводимом в FMT, желательно для максимизации противовоспалительной способности указанного образца.
Таким образом, изобретение включает введение образцов фекальной микробиоты, в которых присутствуют некоторые или все из последних 15 полезных родов.
Среди вредных бактерий идентифицировали некоторые семейства, включающие провоспалительные бактерии, такие как Escherichia или Klebsiella. Некоторые из этих провоспалительных бактерий могут быть резистентными к различным лекарственным средствам, например, Enterococcus (Steck et al., 2011; Strickertsson et al., 2013), что подтверждает рациональность снижения носительства этих микробов у пациентов. Примечательно, что у 32% пациентов, участвовавших в протоколе OSIRIS, после курса антибиотиков в фекалиях были обнаружены бактерии с мультилекарственной резистентностью (данные не показаны). Восстановление разнообразия и соотношения полезных/вредных бактерий после FMT связано с уменьшением воспаления на местном и системном уровне в исследовании ODYSSEE, подчеркивая потенциальный благоприятный противовоспалительный эффект FMT на хозяина.
Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, введение композиции фекальной микробиоты пациенту увеличивает относительную распространенность указанных выше 15 родов и/или снижает численность вредных провоспалительных бактерий.
В частности, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, композиция фекальной микробиоты включает Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella. Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum и Butyrivibrio.
Как правило, как показано выше, с терапевтической точки зрения присутствие этих 15 родов в композиции фекальной микробиоты является преимуществом при лечении воспаления кишечника, особенно связанного с дисбиозом кишечника.
Обеспечение онкологических пациентов композицией фекальной микробиоты бычно может регулировать воспаление кишечника и лучше усиливать действие других противораковых методов лечения.
Описанный в настоящей заявке FMT продукт предлагает широкий спектр активностей, которые создают специфическую и позитивную интерактивную петлю между микробиотой кишечника, метаболизмом кишечника, эпителием кишечника и системным кровообращением. Следовательно, эта положительная петля является решающим шагом в иммунном процессе для борьбы с раковыми клетками, особенно с клетками рака крови, такими как миелоидные бласты, присутствующие у пациентов с AML.
Как правило, вызываемые дисбиозом последствия, такие как инфекции и желудочно-кишечные симптомы, такие как колит, диарея, боль в животе, вздутие живота, уменьшаются при введении композиции фекальной микробиоты. Предпочтительно, композиция фекальной микробиоты, вводимая пациенту, содержит некоторые или более предпочтительно все из бутират-продуцирующих родов бактерий, указанных выше. В сответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, композицию фекальной микробиоты, вводимую пациенту, получают из по меньшей мере одного, или по меньшей мере двух, или по меньшей мере трех, или по меньшей мере четырех образцов кала одного и того же пациента. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, образец FMT получают в соответствии со следующими стадиями:
(i) сбор образца стула и помещения его в анаэробные условия максимум через 5 минут после сбора;
(ii) все еще в анаэробных условиях, смешивание образца с водным солевым раствором, включающим по меньшей мере, криопротектор и/или объемообразующий агент; и
(iii) фильтрование разбавленного образца, например, при приблизительно 265 мкм.
(iv) объединение нескольких продуктов стадии (iii): смешивание двух или более указанных продуктов и гомогенизация смеси.
Таким образом, пациент может получить композицию микробиоты, полученную как минимум из двух объединенных фекальных инокулятов (т.е. продуктов стадии (iii)). Например, пациент может сдать один или несколько образцов кала в течение одного, двух или трех дня подряд до начала противораковой терапии. Эти образцы кала используют для получения инокулята (продукта стадии iii), который затем объединяют (стадия (iv) выше) и затем вводят в виде одного или двух (или более) гомогенных FMT продуктов после противораковой терапии (например, химиотерапии или иммунотерапии). Если предусморено одно или несколько дальнейших введений противораковой терапии, следующие образцы кала могут быть собраны после того, как кишечная микробиота будет в достаточной степени восстановлена у индивидуума, обычно примерно через одну неделю (или меньше, если микробиота была восстановлена до этого) после предыдущего лечения FMT. Таким образом, процедура может повторяться столько раз, сколько необходимо, и до тех пор, пока осуществляют противораковую терапию.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, образцы кала могут быть взяты у здорового донора (который не является пациентом). В этом случае вместо аутологичного FMT осуществляют аллогенный FMT. В этом случае доноров подвергают скринингу, чтобы образцы от доноров подходили для использования в лечении пациента, например, чтобы образцы не содержали патогенных бактерий или вирусов. В случае аллогенного FMT фекальные инокуляты (т.е., продукты стадии (iii), от разных доноров могут быть объединены, как описано выше. Таким образом, для аллогенных образцов FMT можно использовать образцы от одного, двух, трех, четырех или более доноров. Предпочтительно использование по меньшей мере четырех доноров, если используют объединенный аллогенный продукт.
Бактериальное разнообразие трансплантированных продуктов настолько велико, насколько возможно, и существует гомогенность между различными дозами продуктов (гомогенность внутри партии), трансплантируемых одному и тому же субъекту. Также существует гомогенность между различными получаемыми партиями (гомогенность между партиями). Жизнеспособность бактерий также сохраняется. Поддержание высокого разнообразия кишечной микробиоты, как продемонстрировано введением описанных в настоящей заявке композиций фекальной микробиоты, имеет положительные эффекты, описанные выше.
Авторы изобретения отметили, что в отдельном клиническом исследовании (ULYSSE, данные не показаны) композиция микробиоты кишечника 12 пациентов, страдающих AML и не получавших FMT, подвергается отрицательному влиянию после первого курса химиотерапии и остается в дальнейшем негативно измененной, имея низкое видовое микробное богатство и микробную композицию, сильно отличающуюся от их исходной микробиоты (низкое сходство по Брею-Кертису).
Данные ULYSSE, которые можно рассматривать как своего рода отрицательную группу исследования ODYSSEE (но в другой когорте), демонстрируют, что противовоспалительный эффект, наблюдаемый в Примере 1, непосредственно связан с введением FMT продукта, как описано выше.
Другие характеристики изобретения также станут очевидными в ходе последующего описания биологических анализов, которые были осуществлены в рамках изобретения и которые обеспечивают ему необходимое экспериментальное подтверждение, не ограничивая его объем.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Восстановление разнообразия кишечной микробиоты у пациентов с острым миелоидным лейкозом (AML), проходящих интенсивную химиотерапию при помощи аутологичного переноса фекальной микробиоты (FMT): результаты исследования Odyssée
Пациенты и методы
Пациенты и план исследования
В общей сложности 62 пациента в возрасте от 24 до 69 лет с диагнозом впервые обнаруженного AML прошли скрининговое обследование в 7 французских медицинских центрах с июня 2016 года по июль 2017 года и наблюдались до июня 2018 года (ClinicalTrials Identifier NCT02928523). Пациенты с острым промиелоцитарным лейкозом и/или страдающие другими тяжелыми заболеваниями, включая расстройства пищеварения (воспалительное заболевание кишечника, тяжелый колит...), или которые получали антибактериальную терапию за 4 дня до включения в исследование, исключались из этого испытания (Таблица 1). Оценивали бактериологическую безопасность в кале, собранном сразу после включения, и выявление MDR бактерий, бактериальных патогенов, Clostridium difficile, паразитов, норовирусов и/или ротавирусов приводило к исключению пациентов. Наконец, когорта лечения включала 25 пациентов, соответствующих всем критериям включения (Таблица 2).
Отбор пациентов для исследования
- Пациенты согласны сдавать образцы кала и следовать рекомендациям протокола;
- Подписание информированного и письменного согласия.
- Известная аллергия или непереносимость трегалозы или мальтодекстрина;
- Беременность (положительный анализ мочи или крови у женщины детородного возраста);
- Тяжелое заболевание с ожидаемой продолжительностью жизни <3 месяцев;
- Другой текущий протокол вмешательства, который может помешать исследованию;
- Непригодность для сбора аутологичного стула при поступлении:
- Пациенты, отказывающиеся дать согласие;
- Антибактериальная терапия на момент включения в исследование ≥ 4 дней;
- Сопутствующий или предыдущий диагноз существенного воспалительного заболевания кишечника (UC, CD) или другого прогрессирующего заболевания пищеварительной системы, требующего лечения или дальнейшего медицинского обследования;
- Наличие тяжелого колита любой этиологии на момент поступления или тяжелых нарушений пищеварения (острая или хроническая диарея) в течение 3 месяцев до включения;
- Наличие крови в фекалиях, собранных на момент включения;
- Пациент, который недавно прошел колоноскопию (в течение 3 месяцев до включения);
- Обнаружение MDRB, патогенных бактерий, паразитов, норовируса и/или ротавируса во время скрининга аутологичного стула, собранного сразу после визита включения;
- Непригодность для трансплантации инокулята: стойкий мукозит, колит или геморрой, наличие крови в более чем 1 образце кала пациента в течение 3 недель, предшествующих трансплантации;
- Неосуществимость процедуры инокуляции: отказ пациента, техническое или биологическое несоответствие инокулята;
- Отсутствие эффективных методов контрацепции для женщин детородного возраста;
- Кормление грудью;
- Невозможность дать информированное согласие.
Причины отсева при скрининге (n=37)
Сразу после включения пациентов и до начала индукционной химиотерапии (IC) и любой антибактериальной терапии собирали кал и кровь (Визит V1, день 0) (схему исследования см. на Фиг. 1). Бактериологический, биохимический и метагеномный анализы осуществляли на образцах кала, а иммунологические и биохимические анализы осуществляли на образцах плазмы. Фекалии изготавливали и хранили как продукты AFMT в соответствии с Надлежащей производственной практикой (GMP) для будущего лечения пациентов. Затем пациента госпитализировали для начала процедур IC и держали под клиническим и биологическим наблюдением в соответствии со стандартными процедурами гематологических отделений. После восстановления кроветворения кал и кровь собирали в течение 2 дней до отмены антибиотиков для биохимических, бактериологических, метагеномических и иммунологических анализов (визит V2). AFMT осуществляли через 24 часа после отмены антибиотиков (после завершения IC и перед началом консолидационной химиотерапии), после ректальной клизмы накануне вечером и/или за 1 час до процедуры. Пациенты получали 2 инокулята по 150 мл, содержащих 30 г фекалий, с интервалом в один день, с использованием ректального зонда, введенного в их прямую кишку, и находились под наблюдением в течение всего процесса трансплантации и до выписки из больницы. Перед началом консолидационной химиотерапии кал и кровь собирали для тех же анализов, что и раньше (визит V3), а в конце госпитализации брали последний образец кала (визит V4). Качество жизни пациентов оценивали при каждом визите (V1-V4) с использованием анкеты EQ-5D-5L, оценивающей подвижность, уход за собой, обычную активность, боль/дискомфорт, тревогу и депрессию. Наконец, через 6 месяцев (визит V5) и 1 год (визит V6) были представлены клиническая информация и оценка безопасности.
Среди 25 получавших лечение пациентов 4 пациента получали AFMT после первой консолидирующей химиотерапии, а не раньше, из-за состояния пациента (AFMT было невозможен из-за колита или геморроя), и у одного пациента наблюдали одно отклонение от протокола: 20 пациентов, таким образом, считались соответствующими протоколу. Все Чертежи и Таблицы должны представлять данные, полученные от этих пациентов, если не указано иное.
Получение инокулята AFMT
Кал собирали при зачислении пациента в исследование, до начала IC. Кал обрабатывали в течение 72 часов с криозащитным разбавителем, как описано в WO 2016/170285 (A1) и WO 2017/103550 (A1) в запатентованном устройстве (аналогичном описанному в WO 2016/170290 (A1)) в условиях GMP, фильтровали, кондиционировали и хранили замороженными при -80°C до трансплантации. Точнее, первый визуальный осмотр подтвердил отсутствие мочи и крови, а также оценку текстуры на основе Бристольской шкалы стула. Затем фекалии взвешивали для определения необходимого количества криозащитного разбавителя. Затем в устройство добавляли разбавитель и осторожно перемешивали для обеспечения гомогенизации суспензии. Суспензию фильтровали, когда в результате смешивания она могла проходить через сито. Все эти действия осуществляли в герметично закрытом устройстве, гарантирующем отсутствие контакта воздуха с микробиотой. Затем суспензию собирали через нижнее отверстие устройства и кондиционировали через закрытые системы и трубки в криорезистентном пластиковом пакете с несколькими соединениями, обеспечивающими возможность поступления и выхода продукта отдельными путями. В конце этой стадии собирали образцы для использования в качестве контроля качества (QC). Продукт в завершение хранили при -80°C. Наконец, осуществляли микробиологические исследования (производимые на свежем кале в соответствии с рекомендациями Агентства здравоохранения) и оценку жизнеспособности методом проточной цитометрии до выпуска продукта.
Параллельно с этим осуществляли тщательный микробиологический скрининг (см. Раздел Микробиологические анализы и Таблицу 3) и получали разрешение на выпуск исследуемого лекарственного средства (IMP) после периода карантина.
Перечень скрининговых тестов, осуществляемых с фекалиями, для выпуска партии
Giardia intestinalis,
Cryptosporidium,
Microsporidies,
Dientamoeba fragilis,
Blastocystis hominis
Микробиологические анализы
Определение C. difficile, Salmonella sp., Shigella sp. и MDR бактерий (устойчивые к метициллину Staphylococcus aureus, устойчивые к ванкомицину и гликопептидам Enterococci; бактерии, продуцирующие бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL) и бактерии, продуцирующие карбапенемазы) осуществляли в образцах кала, собранных во время первых трех визитов, с использованием ПЦР и культивирования на специальных средах для посева, соответственно. Образцы кала, собранные во время первого визита, проверяли на паразиты, вирусы и патогенные бактерии для подтверждения безопасности кала для AFMT использования. Паразитов выявляли при помощи ПЦР (Microsporidia, Dientamoeba fragilis) или микроскопии (Strongyloides stercoralis, Cyclospora sp., Isospora sp., Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis, Cryptosporidium sp., Blastocystis hominis) после концентрирования кала. Норовирусы и ротавирусы идентифицировали при помощи ПЦР и иммунохроматографии, соответственно, а патогенные бактерии выявляли при помощи ПЦР (Campylobacter) и культуры (Listeria sp., Vibrio sp., Yersinia sp.).
Биохимические и иммунологические анализы
Биохимические и иммунологические анализы осуществляли на различных образцах крови и кала, собранных во время первых трех визитов. Неоптерин и секреторный IgA (sIgA) измеряли в супернатантах фекалий с использованием наборов Neopterin ELISA (IBL International) и IgA Secretory Human ELISA (EUROBIO), соответственно. Общий антиоксидантный статус (TAS) измеряли из образцов плазмы с использованием набора Hitachi 912 (RANDOX Laboratories), CRP и ферритин измеряли из образцов плазмы/сыворотки в различных медицинских центрах в соответствии с их собственными внутренними процедурами. Иммунологические маркеры измеряли из образцов плазмы: IL6 и TNFα (набор Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (EMD Millipore)); растворимый CD14 (sCD14) (набор Human CD14 Quantikine ELISA (R&D System).
Выделение ДНК и метагеномное секвенирование
Геномную ДНК выделяли из образцов кала, собранных во время первых четырех визитов, с использованием набора NucleoSpin Soil (Macherey Nagel). Библиотеку секвенирования составляли для каждого образца ДНК с использованием набора TruSeq (Illumina) в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем библиотеки секвенировали в 2 прогонах со спаренными концами (2×125 п.о.) HiSeq2500 (Illumina).
Методы биоинформатики
После обработки качественных данных с использованием Trimmomatic (Bolger, Lohse и Usadel, 2014) деконтаминацию последовательности хозяина осуществляли с использованием Bowtie2 (Langmead, Ben и Salzberg, 2013). Таким образом, от 936060 до 37212124 пар считываний (среднее значение: 34811750 пар считываний) получали из разных образцов. Для беспристрастного сравнения количество последовательностей в каждом образце было случайным образом нормализовано к одной и той же глубине секвенирования, т.е. 1500000 последовательностей со спаренными концами на образец. Затем осуществляли таксономическое профилирование при помощи Kraken v.0.10.5-beta (Wood 2014) и геномной базы данных RefSeq (Выпуск от июня 2015 г., http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). Измерение медианных индексов α- и β-разнообразия осуществляли в R Statistical Software после 10 подвыборок (R Core Team 2015, version 3.4.4, http://www.R-project.org) с использованием пакетов vegan и phyloseq. Долю полезных бактерий определяли как сумму относительной распространенности (на основании таксономического профилирования микробиоты) полезных микробных семейств: Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bifidobacteriaceae, Streptococcaceae, Akkermansiaceae, Lactobacillaceae, Eubacteriaceae, Erysipelotrichaceae, Eggerthellaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae и Oscillospiraceae. Аналогичным образом, долю вредных бактерий определяли как сумму распространенности семейств Bacteroidaceae и Enterococcaceae.
Генный анализ и анализ антибиорезистентности осуществляли путем картирования генов при помощи Bowtie 2 с использованием баз данных Integrated Gene Catalogue (IGC) (Li et al., 2014) и MEGARes (https://megares.meglab.org/), соответственно.
Статистические анализы
Соотношения V3/V1 и V2/V1 следующих параметров сравнивали при помощи двустороннего парного t-критерия:
- Индексы богатства для видов и генов
- Индекс Симпсона для видов
Парный тест Вилкоксона применяли к следующим параметрам:
- Число копий с резистентностью к антибиотикам
- Полезные-вредные бактерии (%)
- Индекс Брея-Кертиса
- CRP, Ферритин, Неоптерин, IL-6, sCD14, IgA, TNFα, TAS
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристики пациентов
Всего 62 пациента с AML подвергали скринингу в данном исследовании в 7 различных центрах, 25 лечили при помощи AFMT, и 20 рассматривали как популяцию согласно протоколу, на которой осуществляли следующие анализы. Исходные характеристики получавших лечение пациентов и пациентов согласно протоколу перечислены в Таблице 4. В популяции пациентов согласно протоколу было больше мужчин, чем женщин (соотношение 3:1), и средний возраст составлял 50 лет. Большинство пациентов (80% как получавших лечение, так и пациентов по протоколу) считали пациентами с промежуточным риском AML, в то время как 3 и 2 пациента из получавшей лечение популяции относились к благоприятной и неблагоприятной группе риска, соответственно. Все пациенты получали интенсивную индукционную химиотерапию (классический режим “3+7” или эквивалент).
Исходные демографические и клинические характеристики получавших лечение пациентов и пациентов по протоколу
Результаты оценки безопасности
Среднее время удерживания AFMT продукта было больше ожидаемого (189,50 мин и 173,33 мин для первого и второго AFMT, соответственно, вместо рекомендованных 120 минут), что свидетельствует о выполнимости процедуры клизмы и отсутствии дискомфорта для пациентов.
Во время AFMT лечения не наблюдали никаких вредных изменений в жизненно важных функциях получавших лечение пациентов (частота сердечных сокращений, артериальное давление). Затем в течение первых 24 часов после AFMT было зарегистрировано 5 нежелательных явлений (AE) у 4 получавших лечение пациентов (16%). (Таблица 5).
В течение этого периода у получавшей лечение популяции не было зарегистрировано никаких серьезных нежелательных явлений (SAE).
AE через 24-часа после AFMT посредством SOC у получавших лечение пациентов (n=25)
После первых 24 часов после AFMT и до конца 1-летнего периода наблюдения было зарегистрировано 415 AE у 24 из 25 получавших лечение пациентов (96%) (Таблица 6). Среди них 2 были связаны с процедурой клизмы и 1 с продуктом AFMT. Все остальные AE соответствовали профилям пациентов с лейкозом. Наиболее частыми AE были нарушения со стороны крови и лимфатической системы (n=58; 14%), нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта (n=78; 19%), общие расстройства и состояния в месте введения (n=39; 9%) и инфекционные и паразитарные заболевания (n=88; 21%). Большая часть AE возникла между моментом включения в исследование и AFMT (V1-V2) (частота случаев 27,06%) и между визитом V3 и визитом V4 (частота случаев 15,07%) (дополнительный чертеж S2). Кроме того, у 15 пациентов (15%) было зарегистрировано 30 серьезных нежелательных явлений (SAE) (Таблица 7), большинство из которых были инфекционные и паразитарные заболевания (n=13; 43%). Что касается AE, большая часть SAE возникла между моментом включения в исследование и AFMT (V1-V2) (частота случаев 1,57%) и между визитом V3 и визитом V4 (частота случаев 0,90%). Ни одно из этих SAE не произошло в течение первого месяца после AFMT, и только одно было заявлено исследователем как возможно связанное с AFMT лечением. У пациента наблюдали гипертермию и желудочно-кишечные симптомы через 93 дня после второго AFMT, и ему был поставлен диагноз сепсис, вызванный Escherichia coli. История болезни субъекта включает колонизацию E. coli с множественной лекарственной резистентностью в фекалиях после госпитализации для проведения консолидированной химиотерапии, т.е. через 22 дня после второго AFMT. После антибактериальной терапии пациент полностью выздоровел. Эта бактерия с множественной лекарственной резистентностью не была обнаружена в фекалиях, собранных в начале консолидационной химиотерапии. Это SAE произошло через 3 месяца после AFMT, поэтому возникает вопрос о его связи с проводимым лечением.
AE после первых 24 часов после AFTM посредством SOC у получавших лечение пациентов (n=25)
SAE после первых 24 часов после AFMT посредством SOC у получавших лечение пациентов (n=25)
Сообщали о четырех случаях смерти среди 25 получавших лечение пациентов (16%) (те же результаты у популяции по протоколу: 4 смерти среди 20 пациентов (20%)) (Таблица 8). Среднее время до смерти после второго AFMT составило 182,5 дней (диапазон: 113-225 дней). Один пациент умер от полиорганной недостаточности через 34 дня после HSCT (143 дня после АСМТ). Другой пациент испытал полиорганную недостаточность в контексте инфекций во время аплазии после аллотрансплантации (113 дней после AFMT). Сообщалось о сердечном приступе после тромбоэмболии легочной артерии, возможно, связанном с хронической фибрилляцией предсердий и артериальной гипертензией в анамнезе. Смерть наступила через 225 дней после AFMT. Четвертая смерть (через 222 дня после AFMT) произошла из-за резистентной желудочно-кишечной GvHD IV степени, усугубленной септицемией, вызываемой Klebsiella pneumoniae и Stenotrophomonas maltophilia, продуцирующими ESBL, присутствием мультирезистентных Enterobacter cloacae в моче, реактивацией цитомегаловируса, виремией вируса герпеса человека 6 и контекстом острого энцефалита. Все случаи смерти были сочтены исследователем на месте и подтверждены Советом по контролю данных и безопасности (DMSB) как не связанные с AFMT лечением.
Клинические результаты у получавших лечение пациентов (n=25)
Качество жизни пациентов по протоколу оценивали на протяжении всего периода клинического испытания. Полученные данные показали, что результаты анкетирования после AFMT (V3) были аналогичными или имели тенденцию к улучшению по сравнению с результатами при V2 до AFMT (особенно такие параметры, как уход за собой, повседневная деятельность и беспокойство и депрессия), что подчеркивает отсутствие негативного влияния AFMT на общее состояние здоровья пациентов (Таблица 9). Аналогичным образом, никаких существенных отклонений ИМТ не наблюдали на протяжении всего периода исследования для получавших лечение пациентов, но средняя масса тела имела тенденцию к увеличению между V2 и V3 (от 26,89 до 27,26), что говорит об отсутствии проблем с пищеварением у получавших лечение пациентов.
Описательная статистика на основании вопросника по качеству жизни получавших лечение пациентов
Безопасность AFMT оценивали путем измерения параметров воспаления как местно в кишечнике, так и системно в плазме при 3 первых визитах. В системном подходе измеряли воспалительные белки и цитокины в плазме, такие как C-реактивный белок (CRP), ферритин, IL-6, TNFα и sCD14 (Фиг. 2 и 3). Наблюдали существенное повышение уровня CRP при V2 (V1: 11,80 ± 18,25 мг/л; V2: 24,40 ± 23,92 мг/л; p=0,04) и возвращение к исходному уровню при V3 (V3: 10,16 ± 22,07 мг/л; V2 vs V3: p= 0,02). Уровни ферритина претерпевали такие же изменения, с повышение при V2 и возвращением к исходному уровню при V3. Дополнительные тенденции наблюдались при количественной оценке других параметров воспаления, показывающих отсутствие значительного увеличения IL-6, TNFα и sCD14 после AFMT лечения (Фиг. 3). Также измеряли общий антиоксидантный статус (TAS) в плазме как маркер окислительного стресса, который может быть индуцирован изменениями микробиоты кишечника. В предыдущих исследованиях сообщалось, что окислительный стресс тесно связан с возникновением и развитием рака (Wu et al., 2017), а также с дисбиозом кишечника. Окислительный стресс, возникающий во время воспаления, является фактором, усиливающим дисбиоз, за счет значительного уменьшения микробного разнообразия в кишечнике и за счет стимулирования роста определенных бактериальных таксонов (Weiss and Hennet, 2017). Наблюдали снижение уровней TAS между V1 и V2 (V1: 1,33 ± 0,09 ммоль/л; V2: 1,31 ± 0,19 ммоль/л) и значительное увеличение после AFMT (V3: 1,59 ± 0,58 ммоль/л; p=0,006), что может быть связано с восстановлением микробиоты кишечника
Местный иммунитет и воспаление в кишечнике оценивали путем измерения фекального неоптерина и секреторного IgA. Неоптерин продуцируется и высвобождается из активированных макрофагов, стимулированных различными индукторами, такими как IFNγ, TNFα и бактериальные компоненты (Nancey et al., 2013), и отражает степень клеточно-опосредованного иммунного ответа и, следовательно, уровни воспаления кишечника. Наблюдали значительное увеличение средних уровней неоптерина в кале после IC (V1: 2,79 ± 4,02 нг/г кала по сравнению с V2: 32,70 ± 40,15 нг/г кала; p=0,0006), что подчеркивает ожидаемый воспалительный статус кишечника у пациентов после IC и антибиотерапии. Уровни значительно снижались и возвращались к исходному уровню после AFMT (V3: 5,41 ± 7,42 нг/г кала; p=0,001). Эти варьирования соответствуют варьированиям CRP. В качестве зеркала местного иммунитета, также измеряли уровни секреторного IgA в кале, и наблюдали аналогичные тенденции (V1: 1,95 ± 2,05 мг/г кала; V2: 2,75 ± 1,81 мг/г кала; V3: 2,39 ± 2,15 мг/г кала). Взятые вместе, эти данные четко указывают на отсутствие какой-либо вредной воспалительной реакции, как локально, так и системно после AFMT
Эволюция композиции микробиоты кишечника
Затем исследовали влияние IC и последующего AFMT лечения на филогенетическое богатство и разнообразие фекальной микробиоты у пациентов по протоколу. Авторы изобретения продемонстрировали, что IC вызывает резкий сдвиг в микробных сообществах со статистически значимым снижением индексов α-разнообразия между V1 и V2 на уровне видов: измеренное уменьшение на 39,3% среднего богатства (от 960,45 до 589,71 вида; p <0,001) (Фиг. 4a) и измеренное уменьшение на 42,3% среднего индекса Симпсона (0,85-0,50; p <0,001) (Фиг. 4b и Фиг. 5). После AFMT обработки видовое богатство (957,70 видов; p <0,001) и индекс Симпсона (0,86; p <0,001) возвращались к исходному уровню без статистической разницы между значениями при V1 и V3. Таким образом, микробиота кишечника при V3 после AFMT восстанавливается до более чем 90% в популяции по протоколу на основе как богатства, так и индекса Симпсона на уровне видов (p <0,001). Эта модификация микробных сообществ также наблюдается при измерениях β-разнообразия (Фиг. 4c и Фиг. 5). Действительно, индекс несходства Брея-Кертиса (BC) демонстрирует индукцию микробного дисбиоза после IC (средний BC V1-V2: 0,76) и восстановление микробных сообществ после AFMT обработки, состав которых ближе к исходным сообществам на уровне видов (средний BC V1-V3: 0,40). (Фиг. 5)
Затем была измерена доля полезных и вредных бактерий в микробиоте пациентов по протоколу между V1 и V3 (Фиг. 5a и 5b). Доля полезных бактерий значительно снижалась между V1 и V2 (среднее значение V1: 5,54%; V2: 2,43%; p <0,01), а затем увеличивалась, возвращаясь к исходному уровню при V3 после AFMT (среднее значение V3: 6,82%). Напротив, доля вредных бактерий значительно увеличилась при V2 (среднее значение V1: 10,95%; V2: 32,29%; p <0,5) и уменьшалась, возвращаясь к исходному состоянию при V3 после AFMT (среднее значение V3: 10,65%).
Для оценки функционального богатства микробиоты кишечника в течение курса лечения общее количество генов в микробиоте кишечника пациентов по протоколу оценивали путем картирования прочтений на основании базы данных IGC. Результаты показывают, что среднее количество генов значительно снижается на 78% (с 531500,20 до 21361,50 общего количества генов; p <0,001) после IC и значительно увеличивается после AFMT (424374,15 генов), таким образом, более 70% исходного богатства генов восстанавливается для популяции на протокол (p=0,025) (Фиг. 4d, Фиг. 5).
Определение уточненного перечня продуцентов масляной кислоты, связанных с уменьшением воспаления, на основании клинических данных:
На основании перечня из 34 бутират-продуцирующих родов, составленном из литературы, авторы настоящего изобретения осуществили анализ на корреляцию между уровнем каждого рода и фекальным неоптерином (маркером воспаления) у пациентов в исследовании ODYSSEE, чтобы определить уточненный перечень продуцентов бутирата (так называемый butycore). Корреляции Спирмена и тесты корреляции Спирмена рассчитывали при помощи R (тест корреляции функций из пакета статистики). Для этих анализов не применялась поправка на множественные тесты.
Результаты:
Был составлен перечень из 15 родов, продуцирующих бутират, которые в значительной степени коррелируют с фекальным неоптерином и имеют установленную относительную распространенность >0,1% в исследовании ODYSSEE. Этот перечень состоит из родов Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum и Butyrivibrio (см. Таблицу 10).
Пятнадцать бутират-продуцирующих родов на основании анализа корреляции и обработки данных относительной распространенности
В испытании ODYSSEE 15 бутират-продуцирующих родов отрицательно коррелируют с фекальным и плазменным неоптерином и CRP. Относительная распространенность снижается при V2 после химиотерапии и IC и восстанавливается до исходного уровня при V3 после AFMT лечения. У большей части пациентов большинство 15 родов присутствуют при V1 (исходный), большинство родов элиминировано при V2, и они восстанавливаются благодаря FMT при V3, который показывает butycore подобный измеренному при V1 (Фиг. 6).
Деколонизация MDRB
Присутствие C.difficile и MDRB в кале пациентов оценивали между V1 и V3 при помощи анализа генов резистентности в метагеномном наборе данных.
Полные прочтения секвенирования картировали на базе данных генов антибиотикорезистентности MEGARes. Было замечено, что IC и связанное с ним лечение антибиотиками вызывало значительное увеличение среднего числа прочтений, картированных относительно генов антибиотикорезистентности при V2 (от 167546 до 371465 прочтений, p <0,01) для пациентов по протоколу. Затем значительное сокращение на 43% от среднего числа картированных прочтений наблюдали при V3 после AFMT (211127 прочтений, p <0,001).
Клинические результаты
Клинические результаты представлены в таблице 2. Среднее время наблюдения для умерших пациентов составило 7,13 месяца (диапазон 4,8-8,5 месяцев). Через 6 месяцев общая выживаемость (OS) составила 88% (3 смерти) (Фиг. 8). Среди принимавших лечение пациентов полная ремиссия достигалась у 21 (84%) на основании гематологического ответа, и у 1 (4%) достигалась частичная ремиссия. Показатель выживаемости в течение 1 года составил 84% (4 смерти) для популяции, получавшей лечение (Фиг. 8). В общей сложности 17 пациентов (68%) все еще находились в полной ремиссии через 12 месяцев, а 1 пациент (4%) находился в частичной ремиссии. Кроме того, через год у 3 (12%) принимавших лечение пациентов наблюдалось прогрессирование лейкоза.
Пример 2: Результаты клинического испытания Osiris, показывающие, что ятрогенный дисбиоз и воспаление кишечника не нормализуются в отсутствие FMT
Пациенты и методы
Пациенты и план исследования
Скринировали в общей сложности 62 пациентов с подозрением на инфекцию кости и суставов (BJI) из 5 французских медининских центров, начиная с января 2017 года и до сентября 2017 года, и их наблюдали вплоть до марта 2018 года (ClinicalTrials Identifier NCT03011502). Пациентов подразделяли на 3 следующие категории: нативная (n=27, средний возраст=56), остеосинтез (n=13, средний возраст=52) и протезирование (n=22, средний возраст=66) BJI.
Отбор пациентов для OSIRIS исследования
- Возраст больше 18 лет
- У субъекта подозревается имплантированная или нативная BJI, и он подходит для лечения антибиотиками
-субъект подписал форму информированного согласия
- Тяжелое заболевание с ожидаемой продолжительностью жизни <3 месяцев
- Любая антибактериальная терапия в течение 14 дней перед включением
- Опекунство, попечительство над пациентами
- Пациент не аффилирован в систему здравоохранения
- Пациент под властью закона
Сразу после включения пациентов и до начала антибактериальной терапии собирали кал и кровь (Визит V1, день 0) (схему исследования см. на Фиг. 8). Бактериологический, биохимический и метагеномный анализы осуществляли на образцах кала, а иммунологические и биохимические анализы осуществляли на образцах плазмы. После завершения антибактериальной терапии кал и кровь собирали для биохимических, бактериологических, метагеномных анализов (Визит V3). Через две недели после завершения антибактериальной терапии кал и кровь собирали для тех же анализов, как и раньше (Визит V4). Качество жизни пациентов оценивали при каждом визите (V1-V4) с использованием EQ-5D-5L анкеты (оценивая подвижность, уход за собой, повседневную деятельность, боли/дискомфорт, беспокойство и депрессию). В завершение, через 6 месяцев после включения (Визит V5) представляли клиническую информацию и оценку безопасности.
Микробиологические анализы
Определение C. difficile, Salmonella sp., Shigella sp. и MDR бактерий (устойчивые к метициллину Staphylococcus aureus, устойчивые к ванкомицину и гликопептидам Enterococci; бактерии, продуцирующие бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL) и бактерии, продуцирующие карбапенемазы) осуществляли в образцах кала, собранных во время первых пяти визитов, с использованием ПЦР и культивирования на специальных средах для посева, соответственно.
Биохимические анализы
Биохимические анализы осуществляли на образцах кала, собранных во время визитов V1, V3 и V4. Неоптерин и секреторный IgA (sIgA) измеряли в супернатантах фекалий с использованием наборов Neopterin ELISA (IBL International) и IgA Secretory Human ELISA (EUROBIO), соответственно. CRP измеряли из образцов плазмы в различных медицинских центрах в соответствии с их собственными внутренними процедурами.
Выделение ДНК и метагеномное секвенирование
Геномную ДНК выделяли из образцов кала, собранных во время первых четырех визитов, с использованием набора NucleoSpin Soil (Macherey Nagel). Библиотеку секвенирования составляли для каждого образца ДНК с использованием набора TruSeq (Illumina) в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем библиотеки секвенировали в 2 прогонах со спаренными концами (2×125 п.о.) HiSeq2500 (Illumina).
Методы биоинформатики
После обработки качественных данных с использованием Trimmomatic (Bolger, Lohse и Usadel, 2014) контаминацию последовательности хозяина осуществляли с использованием Bowtie2 (Langmead, Ben и Salzberg, 2013). Для беспристрастного сравнения количество последовательностей в каждом образце было случайным образом нормализовано к одной и той же глубине секвенирования, т.е. 1500000 последовательностей со спаренными концами на образец. Затем осуществляли таксономическое профилирование при помощи Kraken v.0.10.5-beta (Wood 2014) и геномной базы данных RefSeq (Выпуск от июня 2015 г., http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). Измерение медианных индексов α- и β-разнообразия осуществляли в R Statistical Software после 10 подвыборок (R Core Team 2015, version 3.4.4, http://www.R-project.org) с использованием пакетов vegan и phyloseq. Генный анализ и анализ антибиорезистентности осуществляли посредством картирования генов при помощи Bowtie 2 с использованием баз данных (IGC) (Li et al., 2014) и MEGARes (https://megares.meglab.org/), соответственно.
Статистические анализы
Парные t-критерии
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристики пациентов
В этом исследовании скринировали в общей сложности 62 BJI пациента в 5 различных центрах, 42 рассматривались как намерение лечить популяцию, на которой были осуществлены некоторые анализы. Исходные характеристики всех и пациентов по протоколу перечислены в Таблице 12. Среди пациентов по протоколу было больше мужчин, чем женщит (соотношение 2:1), и средний возраст был 59 лет.
Исходные демографические и клинические характеристики. ИМТ: индекс массы тела
Затем оценивали местный иммунитет и воспаление в кишечнике, измеряя фекальный зонулин, кальпротектин, неоптерин и секреторный IgA. Наблюдали значительное увеличение среднего уровня неоптерина в кале после антибактериальной терапии (V1: 97,7 нг/г кала по сравнению с 504 нг/г кала после лечения; p <0,001), что подчеркивает ожидаемый воспалительный статус кишечника пациентов после антибиотикотерапии. Уровни не вернулись к исходному уровню через две недели после окончания антибиотикотерапии (285,4 нг/г кала; p=0,02). Эти изменения соответствуют концентрациям зонулина.
Взятые вместе, эти данные ясно указывают на наличие вредной воспалительной реакции локально после антибиотикотерапии. Следует отметить, что почти 70% пациентов из протокола OSIRIS, не получавших FMT лечения, страдали желудочно-кишечными симптомами. У 9 из 42 пациентов, находящихся под наблюдением, наблюдались тяжелые симптомы диареи.
Эволюция состава микробиоты кишечника
Индекс несходства Брея-Кертиса (BC), измеренный на уровне видов (данные не показаны), демонстрирует индукцию микробного дисбиоза после лечения антимикробными препаратами (средний BC V1-V3: 0,321) и отсутствие восстановления исходного микробного сообщества через два недель (средний BC V1-V4: 0,367).
В исследовании OSIRIS относительная распространенность 15 бутират-продуцирующих родов, обсужденных выше, также отрицательно коррелирует с фекальным неоптерином, и относительная растространенность butycore снижается после антимикробного лечения.
Пример 3: Бактериальный профиль образца стула, используемого для получения состава фекальной микробиоты, сохраняется в конечном продукте.
Инокулят, полученный, как описано в WO 2016/170285 A1, в запатентованном устройстве (аналогичном описанному в WO 2016/170290 A1) обеспечивает превосходное сохранение всех семейств и родов бактерий, принадлежащих к собранной микробиоте человека. Кроме того, закрытый процесс предотвращает заражение другими бактериями из окружающей среды.
Четыре свежих стула и инокулята, полученные в соответствии с описанным выше способом, были проанализированы с использованием 16S рДНК анализа. Все образцы хранили при -80°C и ДНК экстрагировали с использованием набора NucleoSpin® Soil Kit (Macherey Nagel). Библиотеки 16S рДНК были созданы при помощи набора MyTag HS Mix (Bioline) с использованием праймеров, нацеленных на область V3-V4. Секвенирование осуществляли для получения 80000-90000 пар прочтений (160000-180000 прочтений) на библиотеку. Секвенирование библиотек 16S рДНК осуществляли с помощью секвенатора MiSeq V3 2×300 п.о. (Illumina).
Микробиота была проанализирована на всех таксономических уровнях, и результаты для основных семейств и родов представлены в Таблице 13 и Таблице 14.
Эти анализы демонстрируют, что этот способ позволяет сохранить все бактерии, присутствующие в исходном стуле, с близкими относительными количествами; обычно более 90% родов, наблюдаемых в начальном стуле, сохраняется в замороженном продукте.
Относительная распространенность (в %) основных семейств, идентифицированных в 4 образцах стула (идентифицированный SF) и соответствующем инокуляте (идентифицированный IN)
Относительная распространенность (в %) основных родов, идентифицированных в 4 образцах стула (идентифицированный SF) и соответствующем инокуляте (идентифицированный IN)
Выделено красным: не обнаружен (значение <0,001%)
Кроме того, инокуляты, полученные описанным способом, использовали для инокуляции аксенических мышей. Свежую микробиоту, использованную для приготовления замороженных образцов, также инокулировали аксеническим мышам. Данные, представленные в WO 2016/170285 (A1), показывают, что отличная консистенция была обнаружена между родами, наблюдаемыми у мышей, инокулированных свежим стулом, и мышей, инокулированных обработанным стулом. В частности, род Facelibacterium, который, как известно, очень чувствителен к аэробным условиям, колонизировал кишечник мышей на одинаковом уровне для обеих групп, тогда как в контрольной группе, инокулированной NaCl-обработанной микробиотой, колонизация Faecalibacterium не происходила. Напротив, род Bacteroides разросся в NaCl-группе, где он был обнаружен на аналогичном уровне у инокулированных как свежим, так и обработанным стулом мышей. Был сделан вывод, что способ, описанный в WO 2016/170285 (A1), обеспечивает возможность превосходного восстановления основных родов, присутствующих в собранном стуле.
Ссылки
Alexander, J. L. et al. (2017) ‘Gut microbiota modulation of chemotherapy efficacy and toxicity’, Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. Nature Publishing Group, 14(6), pp. 356-365. doi: 10.1038/nrgastro.2017.20.
Artz, A. S. et al. (2008) ‘Pre-treatment C-reactive Protein (CRP) is a Predictor for Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation Outcomes’, Biology of blood and marrow transplantation: journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation, 14(11), p. 1209. doi: 10.1016/j.bbmt.2008.08.004.Pre-treatment.
Bolger, A. M., Lohse, M. and Usadel, B. (2014) ‘Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data’, Bioinformatics, 30(15), pp. 2114-2120. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170.
Camera, A. et al. (2003) ‘Intestinal toxicity during induction chemotherapy with cytarabine-based regimens in adult acute myeloid leukemia’, Hematology Journal, 4(5), pp. 346-350. doi: 10.1038/sj.thj.6200304.
Derrien, M., Belzer, C. and de Vos, W. M. (2017) ‘Akkermansia muciniphila and its role in regulating host functions’, Microbial Pathogenesis. Elsevier Ltd, 106, pp. 171-181. doi: 10.1016/j.micpath.2016.02.005.
Döhner, H., Weisdorf, D. J. and D, B. C. (2015) ‘Acute Myeloid Leukemia’, The New England Journal of Medicine, 373(12), pp. 1136-52. doi: 10.1056/NEJMra1406184.
Elting, L. S. et al. (2003) ‘The burdens of cancer therapy: Clinical and economic outcomes of chemotherapy-induced mucositis’, Cancer, 98(7), pp. 1531-1539. doi: 10.1002/cncr.11671.
Galloway-Pena, J. R. et al. (2016) ‘The role of the gastrointestinal microbiome in infectious complications during induction chemotherapy for acute myeloid leukemia’, Cancer, 122(14), pp. 2186-2196. doi: 10.1002/cncr.30039.
Galloway-Peña, J. R. et al. (2017) ‘Characterization of oral and gut microbiome temporal variability in hospitalized cancer patients’, Genome Medicine. Genome Medicine, 9(1), pp. 1-14. doi: 10.1186/s13073-017-0409-1.
Hogan, W. J. et al. (2002) ‘Neutropenic colitis after treatment of acute myelogenous leukemia with idarubicin and cytosine arabinoside’, Mayo Clinic Proceedings, 77(8), pp. 760-762. doi: 10.4065/77.8.760.
Hong, J. et al. (2015) ‘Pre-treatment blood inflammatory markers as predictors of systemic infection during induction chemotherapy: results of an exploratory study in patients with acute myeloid leukemia’, Supportive Care in Cancer, 24(1), pp. 187-194. doi: 10.1007/s00520-015-2762-1.
Iida, N. et al. (2013) ‘Commensal bacteria control cancer response to therapy by modulating the tumor microenvironment’, Science, 342(6161), pp. 967-970. doi: 10.1126/science.1240527.
Jandhyala, S. M. et al. (2015) ‘Role of the normal gut microbiota’, World Journal of Gastroenterology, 21(29), pp. 8836-8847. doi: 10.3748/wjg.v21.i29.8787.
Jenq, R. R. et al. (2015) ‘Intestinal Blautia is associated with reduced death from graft-versus-host disease’, Biol Blood Marrow Transplant., 21(8), pp. 1373-1383. doi: 10.1016/j.cogdev.2010.08.003.Personal.
Khanna, S. (2018) ‘Microbiota Replacement Therapies: Innovation in Gastrointestinal Care’, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 103(1), pp. 102-111. doi: 10.1002/cpt.923.
Khitam AW Ali, Alaa F Alwan, H. A. M. (2015) ‘C-Reactive protein and iron status in Iraqi patients with acute myeloid leukemia before and after treatment’, Iraqi J. Hematology.
Langmead, Ben and Salzberg, S. (2013) ‘Fast gapped-read alignment with Bowtie2’, Nature methods, 9(4), pp. 357-359. doi: 10.1038/nmeth.1923.Fast.
Lehouritis, P. et al. (2015) ‘Local bacteria affect the efficacy of chemotherapeutic drugs’, Scientific Reports. Nature Publishing Group, 5, pp. 1-12. doi: 10.1038/srep14554.
Li, J. et al. (2014) ‘An integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome’, Nature Biotechnology, 32(8), pp. 834-841. doi: 10.1038/nbt.2942.
Malard, F. et al. (2018) ‘High gastrointestinal microbial diversity and clinical outcome in graft-versus-host disease patients’, Bone Marrow Transplantation. Springer US. doi: 10.1038/s41409-018-0254-x.
Mayer, K. et al. (2015) ‘Comparison of antibiotic prophylaxis with cotrimoxazole/colistin (COT/COL) versus ciprofloxacin (CIP) in patients with acute myeloid leukemia’, Supportive Care in Cancer, 23(5), pp. 1321-1329. doi: 10.1007/s00520-015-2621-0.
Montassier, E. et al. (2015) ‘Alimentary Pharmacology and Therapeutics Chemotherapy-driven dysbiosis in the intestinal microbiome’, (July). doi: 10.1111/apt.13302.
Nancey, S. et al. (2013) ‘Neopterin is a novel reliable fecal marker as accurate as calprotectin for predicting endoscopic disease activity in patients with inflammatory bowel diseases’, Inflammatory Bowel Diseases, 19(4), pp. 1043-1052. doi: 10.1097/MIB.0b013e3182807577.
Palm, N. W., Zoete, M. R. De and Flavell, R. A. (2015) ‘Immune - microbiota interactions in health and disease’, Clinical Immunology, 159, pp. 122-127. doi: 10.1016/j.clim.2015.05.014.
Routy, B. et al. (2018) ‘Gut microbiome influences efficacy of PD-1{\textendash}based immunotherapy against epithelial tumors’, Science, 359(6371), pp. 91-97. doi: 10.1126/science.aan3706.
Roy, S. and Trinchieri, G. (2017) ‘Microbiota: A key orchestrator of cancer therapy’, Nature Reviews Cancer. Nature Publishing Group, 17(5), pp. 271-285. doi: 10.1038/nrc.2017.13.
Saultz, J. and Garzon, R. (2016) ‘Acute Myeloid Leukemia: A Concise Review’, Journal of Clinical Medicine, 5(3), p. 33. doi: 10.3390/jcm5030033.
Sokol, H. et al. (2008) ‘Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients’, Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(43), pp. 16731-16736. doi: 10.1073/pnas.0804812105.
Steck, N. et al. (2011) ‘Enterococcus faecalis metalloprotease compromises epithelial barrier and contributes to intestinal inflammation’, Gastroenterology. Elsevier Inc., 141(3), pp. 959-971. doi: 10.1053/j.gastro.2011.05.035.
Strickertsson, J. A. B. et al. (2013) ‘Enterococcus faecalis Infection Causes Inflammation, Intracellular Oxphos-Independent ROS Production, and DNA Damage in Human Gastric Cancer Cells’, PLoS ONE, 8(4). doi: 10.1371/journal.pone.0063147.
Taur, Y. et al. (2014) ‘The effects of intestinal tract bacterial diversity on mortality following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation’, Transplantation, 124(7), pp. 1174-1182. doi: 10.1182/blood-2014-02-554725.The.
Weiss, G. A. and Hennet, T. (2017) ‘Mechanisms and consequences of intestinal dysbiosis’, Cellular and Molecular Life Sciences. Springer International Publishing, 74(16), pp. 2959-2977. doi: 10.1007/s00018-017-2509-x.
Wu, R. et al. (2017) ‘Significance of serum total oxidant/antioxidant status in patients with colorectal cancer’, PLoS ONE, 12(1), pp. 1-13. doi: 10.1371/journal.pone.0170003.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ прогнозирования эффективности терапии язвенного колита | 2024 |
|
RU2824983C1 |
| СПОСОБЫ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ БЛОКАДНОЙ ТЕРАПИИ ИММУННЫХ КОНТРОЛЬНЫХ ТОЧЕК ПОСРЕДСТВОМ МОДУЛЯЦИИ МИКРОБИОМА | 2017 |
|
RU2793582C2 |
| СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ИНСУЛИНОРЕЗИСТЕНТНОСТИ | 2012 |
|
RU2613322C2 |
| Фармацевтическая композиция, содержащая никотиновую кислоту и/или никотинамид, и/или триптофан, для положительного воздействия на кишечную микробиоту | 2013 |
|
RU2657797C2 |
| ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ | 2017 |
|
RU2758387C2 |
| ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ | 2017 |
|
RU2823233C2 |
| Способ оценки проницаемости эпителиального барьера кишечника у больных, получающих лечение гемодиализом | 2023 |
|
RU2817667C1 |
| Способ выделения и сохранения тотальной микробиоты кишечника человека для трансплантации | 2019 |
|
RU2727444C1 |
| СПОСОБ КОРРЕКЦИИ СОСТАВА МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ | 2022 |
|
RU2801611C1 |
| Способ определения ответа пациента с диагнозом меланома кожи на анти-PD1-терапию | 2020 |
|
RU2771080C2 |
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к применению композиции фекальной микробиоты для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у пациента, имеющего рак и/или гематологическое заболевание и способу предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у пациента, имеющего рак и/или гематологическое заболевание. Применение композиции фекальной микробиоты для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у пациента, имеющего рак и/или гематологическое заболевание, при этом композиция фекальной микробиоты получена способом, включающим следующие стадии: (i) сбор образца стула и помещение его в анаэробные условия максимум через 5 минут после сбора; (ii) все еще в анаэробных условиях, смешивание образца с водным солевым раствором, включающим криопротектор и/или объемообразующий агент; и (iii) фильтрование разбавленного образца, при этом индуцированное лечением воспаление вызвано противораковой терапией и/или трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (HSCT), где доля некоторых или всех следующих 15 родов увеличивается по сравнению с уровнем до переноса фекальной микробиоты FMT: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum и Butyrivibrio, и где перенос фекальной микробиоты (FMT) с указанной композицией фекальной микробиоты приводит к снижению уровня неоптерина в кишечнике и/или снижению уровня CRP в сыворотке и/или ферритина в сыворотке. Способ предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у пациента, имеющего рак и/или гематологическое заболевание, включающий введение композиции фекальной микробиоты, при этом композиция фекальной микробиоты получена вышеописанным способом. Вышеописанная группа изобретений позволяет получить композицию фекальной микробиоты с помощью надежного и воспроизводимого процесса, который соответствует надлежащей производственной практике (GMP) и отвечает современным фармацевтическим требованиям с точки зрения безопасности и эффективности, полученная композиция обладает улучшенной и оптимальной противовоспалительной способностью. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 9 ил., 14 табл., 3 пр.
1. Применение композиции фекальной микробиоты для предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у пациента, имеющего рак и/или гематологическое заболевание, при этом композиция фекальной микробиоты получена способом, включающим следующие стадии:
(i) сбор образца стула и помещение его в анаэробные условия максимум через 5 минут после сбора;
(ii) все еще в анаэробных условиях, смешивание образца с водным солевым раствором, включающим криопротектор и/или объемообразующий агент; и
(iii) фильтрование разбавленного образца,
при этом индуцированное лечением воспаление вызвано противораковой терапией и/или трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (HSCT),
где доля некоторых или всех следующих 15 родов увеличивается по сравнению с уровнем до переноса фекальной микробиоты FMT: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum и Butyrivibrio, и
где перенос фекальной микробиоты (FMT) с указанной композицией фекальной микробиоты приводит к снижению уровня неоптерина в кишечнике и/или снижению уровня CRP в сыворотке и/или ферритина в сыворотке.
2. Применение по п. 1, где противораковую терапию сочетают с антибактериальной терапией.
3. Применение по п. 1 или 2, где на стадии (ii) водный солевой раствор включает криопротектор и объемообразующий агент.
4. Применение по любому из пп. 1-3, где композиция фекальной микробиоты включает микробиоту из одного или нескольких образцов кала от пациента.
5. Применение по п. 4, где композиция фекальной микробиоты включает 90% или более видов, присутствующих в образце от пациента.
6. Применение по любому из пп. 1-5, где воспаление представляет собой индуцированное лечением воспаление кишечника у пациента, имеющего рак и/или гематологическое заболевание.
7. Применение по любому из пп. 1-6, где перенос фекальной микробиоты (FMT) осуществляют через 1-30 дней после окончания противораковой терапии.
8. Применение по любому из пп. 1-7, где два FMT осуществляют с интервалом 1-7 дней.
9. Применение по любому из пп. 1-8, где FMT с указанной композицией фекальной микробиоты приводит к увеличению доли полезных бактерий и снижению доли вредных бактерий в желудочно-кишечном тракте.
10. Применение по любому из пп. 1-9, где вводимая композиция фекальной микробиоты включает некоторые или все следующие 15 родов: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum и Butyrivibrio.
11. Применение по любому из пп. 1-10, где указанный пациент имеет гематологическое заболевание, выбранное из острого лейкоза, аутоиммунной цитопении и идиопатической аплазии костного мозга.
12. Применение по любому из пп. 1-11, где гематологическое заболевание представляет собой острый лейкоз.
13. Способ предотвращения и/или уменьшения индуцированного лечением воспаления у пациента, имеющего рак и/или гематологическое заболевание, включающий введение композиции фекальной микробиоты, при этом композиция фекальной микробиоты получена способом, включающим следующие стадии:
(i) сбор образца стула и помещение его в анаэробные условия максимум через 5 минут после сбора;
(ii) все еще в анаэробных условиях, смешивание образца с водным солевым раствором, включающим криопротектор и/или объемообразующий агент; и
(iii) фильтрование разбавленного образца,
при этом индуцированное лечением воспаление вызвано противораковой терапией и/или трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (HSCT),
где доля некоторых или всех следующих 15 родов увеличивается по сравнению с уровнем до переноса фекальной микробиоты FMT: Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum и Butyrivibrio, и
где перенос фекальной микробиоты (FMT) с указанной композицией фекальной микробиоты приводит к снижению уровня неоптерина в кишечнике и/или снижению уровня CRP в сыворотке и/или ферритина в сыворотке.
14. Способ по п. 13, где противораковую терапию сочетают с антибактериальной терапией.
| WO 2016170285 А1, 27.10.2016 | |||
| MOHAMAD MOHTY et al., "Prevention of Dysbiosis Complications with Autologous Fecal Microbiota Transplantation (auto-FMT) in Acute Myeloid Leukemia (AML) Patients Undergoing Intensive Treatment (ODYSSEE study): First Results of a Prospective Multicenter Trial", Blood, (20171207) | |||
| QUENTIN LE BASTARD et al., "Fecal |
