Антимикробная комбинация в отношении устойчивых к карбапенемам грамотрицательных бактерий вида pseudomonas aeruginosa, продуцирующих металло-β-лактамазу Российский патент 2017 года по МПК A61K31/41 A61K31/663 

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической микробиологии, и может быть использовано для преодоления устойчивости к карбапенемам у грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих металло-β-лактамазу (МβЛ).

В настоящее время у пациентов, находящихся на стационарном лечении, увеличивается доля грамотрицательных аэробных бактерий как возбудителей инфекций [1]. Это Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Klebsiela spp., Stenotrophomonas maltophilia и др. Эти микроорганизмы, как правило, обладают низкой чувствительностью к различным классам антибиотиков, а также способностью приобретать резистентность в процессе лечения, что представляет существенные проблемы при проведении антибактериальной терапии, а именно, резко ограничивает арсенал применяемых для лечения больных антибактериальных препаратов, в том числе карбапенемов. Устойчивость среди Enterobacteriaceae обусловлена комбинацией нескольких механизмов, например, гиперпродукцией бета-лактамаз и снижением проницаемости внешней мембраны микробной клетки (обычно это связано с утратой пориновых белков).

Известна композиция и способы лечения, включающие цефтаролин [2], представляющий собой новый парентеральный цефалоспорин с широким спектром активности против клинически важных внебольничных и внутрибольничных грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. Однако, полученный авторами синергидный эффект применения композиции цефтаролина и антимикробных препаратов не описан в отношении резистентных грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих МβЛ.

Известна композиция [3], содержащая халконы в качестве усилителей антимикробных средств, действие которой направлено на предотвращение образования и разрушение сформированных микробных биопленок в полости рта. Синергидный эффект действия композиции халконов и антимикробных агентов авторы оценивали в средствах гигиены полости рта местного действия. Кроме того, авторы не оценивали данный эффект в отношении резистентных грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих МβЛ.

Известна лекарственная композиция в отношении Acinetobacter baumannii и ее применение [4]. Лекарственная композиция состоит из меропенема и сульбактама с весовым соотношением меропенема к сульбактаму 1:2-4. Дизайн исследования воспроизведен методом «шахматной доски». Показан эффект композиции только в отношении сериновых бета-лактамаз.

Известно изобретение ингибиторов металло-β-лактамазы на основе малеиновой кислоты, которое является наиболее близким к заявляемому изобретению по достижению технического результата и выбрано в качестве прототипа [5]. Изобретение демонстрирует эффект подавления МβЛ грамотрицательных бактерий и усиления действия бета-лактамных антибиотиков в отношении резистентных к карбапенемам штаммов грамотрицательных бактерий. В изобретении описаны способы синтеза различных производных малеиновой кислоты, показан их ингибирующий эффект в отношении МβЛ, а также восстановление действия бета-лактамных антибиотиков в отношении устойчивых к ним микроорганизмов.

Недостатком прототипа является недостаточная информативность об эффективности данного ингибитора при различных дозах ферментов, от которых зависит уровень устойчивости микроорганизмов, что является очень важным при практическом использовании ингибитора. Можно сказать, что недостаток прототипа - это его ингибирующий эффект минимальных доз (1 нм и 1,5 нм) фермента МβЛ в присутствии нитроцефина (хромогенного цефалоспорина), чувствительного к данному ферменту.

Заявляемое изобретение свободно от указанных недостатков.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение информативности об эффективности непосредственно используемого ингибитора при различных дозах ферментов, от которых зависит уровень устойчивости микроорганизмов. Заявленный способ позволяет получение таких антимикробных комбинаций карбапенемов и бисфосфонатов, эффективность которых оценивают как количественно в отношении высоких доз стандартного реактива МβЛ, так и в отношении ранее чувствительных к карбапенемам штаммов грамотрицательных микроорганизмов при моделировании приобретения ими различных уровней резистентности к карбапенемам.

Указанный технический результат достигается тем, что клодроновая или этидроновая кислоты из группы бисфосфонатов ингибируют стандартный реактив - металло-β-лактамазу P. aeruginosa рекомбинантную, экспрессированную в Escherichia coli. Достигнутый результат позволяет выявить антимикробный эффект комбинаций клодроновой / этидроновой кислот с карбапенемами (имипенемом / меропенемом) в отношении чувствительных к карбапенемам референс-штаммов грамотрицательных бактерий (Pseudomonas aeruginosa / далее: P. aeruginosal АТСС 27853, Acinetobacter baumannii / далее: A. baumannii / АТСС ВАА-747, Klebsiella pneumonia / далее: K. pneumonia / АТСС 70603), при этом резистентных к карбапенемам в присутствии стандартного реактива МβЛ, инактивирующего эти антибиотики. Предложенное техническое решение позволяет моделировать приобретение различных уровней резистентности к карбапенемам в присутствии высокой дозы стандартного реактива МβЛ чувствительными ранее штаммами грамотрицательных микроорганизмов, а также оценить эффективность ингибирования МβЛ антимикробными комбинациями карбапенемов и бисфосфонатов.

Далее для достижения технического результата оценивают эффективность антимикробных комбинаций карбапенемов (имипенема или меропенема) в сочетании с клодроновой / этидроновой кислотами методом «шахматной доски», используя микроразведения в бульоне в полистироловых 96-луночных планшетах [6].

Заявленное изобретение было апробировано в лабораторных условия в режиме реального времени на двух базах - Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» и Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова».

В исследовании используют антибиотики имипенем и меропенем, разведенные стандартным титрованием в бульоне Мюллера-Хинтона [7] от 512 мкг/мл до 2 мкг/мл.

Исходный концентрат клодроновой кислоты для приготовления раствора для внутривенного введения с содержанием 60 мг/мл титруют в среде Мюллера-Хинтона методом последовательных двукратных разведений.

Этидроновую кислоту из исходного 20% концентрата разводят до 2% раствора в стерильной дистиллированной воде, далее готовят двукратные разведения в среде Мюллера-Хинтона.

Стандартную упаковку реактива фермента МβЛ, содержащую 1469 единиц активности, разводят в 13,12 мл стерильной дистиллированной воды, получая содержание 112 единиц активности МβЛ в 1 мл раствора. Для определения активности фермента в отношении карбапенемов используют титрование микрометодом. Установлено, что 5 мкл фермента с активностью 0,283 ед./мкл инактивируют 100 мкл антибиотика с концентрацией 512 мкг/мл.

В ячейки, содержащие по 92,5 мкл разведения соответствующего антибиотика, вносят по 92,5 мкл разведения клодроновой или этидроновой кислоты, затем добавляют 5 мкл разведения стандартного реактива фермента МβЛ с активностью 0,283 ед./мкл. Таким образом, объем смеси составляет 190 мкл.

Для получения инокулюма тест-штаммов P. aeruginosa АТСС 27853, A. baumannii АТСС ВАА-747, К. pneumoniae АТСС 70603 готовят исходную суспензию суточной культуры соответствующего микроба по стандарту 0,5 McFarland, далее суспензию разводят в 31 раз в бульоне Мюллера-Хинтона, при этом полученная взвесь содержит 5×10⁶ КОЕ/мл. Далее во все ячейки вносят по 10 мкл микробной взвеси. Таким образом, в каждой ячейке конечная микробная нагрузка соответствующего тест-штамма составляет 5×10⁴ КОЕ в 200 мкл. Всегда присутствует контроль тест-культуры и контроль среды.

Значение минимальной подавляющей концентрации (далее: МПК) тестируемого препарата оценивают в первой ячейке, содержимое которой прозрачное, где отсутствует видимый рост тест-штамма.

В предварительных исследованиях показано приобретение ранее чувствительными к карбапенемам штаммами грамотрицательных микроорганизмов высокого уровня резистентности к этой группе антибиотиков в присутствии стандартного реактива МβЛ.

В табл. 1 представлены результаты инактивации антибиотика меропенема в присутствии стандартного реактива МβЛ в отношении тест-культуры P. aeruginosa АТСС 27853. Фермент в ячейках 1-3 полностью инактивирует антибиотик, при этом в ячейках наблюдается рост тест-культуры P. aeruginosa АТСС 27853. Начиная с 4ой ячейки, интенсивность инактивации фермента снижается, и в 8ой ячейке отмечается отсутствие роста тест-культуры до уровня референтного значения чувствительности - 2 мкг/мл (EUCAST 2015 г).

В табл. 2 представлены результаты инактивации антибиотика имипенема в присутствии стандартного реактива МβЛ в отношении тест-культуры P. aeruginosa АТСС 27853. Фермент в ячейках 1-2 полностью инактивирует антибиотик, при этом в ячейках наблюдается рост тест-культуры P. aeruginosa АТСС 27853. Начиная с 3ей ячейки, интенсивность инактивации фермента снижается, и в 8ой ячейке отмечается отсутствие роста тест-культуры до уровня референтного значения чувствительности - 4 мкг/мл (EUCAST 2015 г).

В табл. 3 представлены результаты инактивации антибиотика меропенема в присутствии стандартного реактива МβЛ в отношении тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747. Показано, что фермент в ячейках 1-4 полностью инактивирует антибиотик в количестве от 1 мкг/мл до 512 мкг/мл, при этом в ячейках наблюдается рост тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747. Начиная с 5ой ячейки, интенсивность инактивации фермента снижается, и в 8ой ячейке отмечается отсутствие роста тест-культуры до уровня референтного значения чувствительности - 2 мкг/мл (EUCAST 2015 г).

В табл. 4 представлены результаты инактивации антибиотика меропенема в присутствии стандартного реактива МβЛ в отношении тест-культуры K. pneumoniae АТСС 70603. Показано, что фермент в ячейках 1-3 полностью инактивирует антибиотик в количестве от 1 мкг/мл до 32 мкг/мл, при этом в ячейках наблюдается рост тест-культуры К. pneumoniae АТСС 70603. Начиная с 4ой ячейки, интенсивность инактивации фермента снижается, и в 8ой ячейке отмечается отсутствие роста тест-культуры до уровня референтного значения чувствительности - 2 мкг/мл (EUCAST 2015 г).

Результаты предварительного исследования показывают возможность моделирования приобретения ранее чувствительными к карбапенемам штаммами грамотрицательных микроорганизмов различных уровней резистентности к карбапенемам в присутствии разных доз стандартного реактива фермента МβЛ.

Результаты лабораторной апробации подтвердили получение заявленного технического результата и ниже приведены примеры конкретной его реализации.

Пример 1,

которым подтверждаются на основе полученных результатов апробации соотношение (вес.:вес.) антибиотика карбапенема и бисфосфоната в отношении тест-культуры Р. aeruginosa АТСС 27853:

1. Меропенем и клодроновая кислота 1:3750

2. Меропенем и этидроновая кислота 1:25000

3. Имипенем и этидроновая кислота 1:25000

4. Имипенем и клодроновая кислота 1:469.

В табл. 5 представлены результаты ингибирования МβЛ клодроновой кислотой в комбинации с меропенемом в отношении тест-культуры P. aeruginosa АТСС 27853. В ячейках без клодроновой кислоты отмечается рост тест-культуры P. aeruginosa АТСС 27853 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Эффект ингибитора отмечен со 2ой ячейки, где он содержится в количестве 469 мкг. Отмечен эффект инактивации МβЛ и отсутствие роста тест-культуры в ячейке 6 с количеством антибиотика, равного референтному значению чувствительности тест-штамма - 2 мкг/мл. Исходя из данных, представленных в таблице 5, предложена антимикробная комбинация в отношении Р. aeruginosa, которая содержит меропенем и ингибитор МβЛ клодроновую кислоту в соотношении 1:3750.

В табл. 6 представлены результаты ингибирования МβЛ этидроновой кислотой в композиции с меропенемом в отношении тест-культуры P. aeruginosa АТСС 27853. В ячейках, где отсутствует бисфосфонат, выявляется рост тест-штамма P. aeruginosa АТСС 27853 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Начиная с 3ей ячейки выявлен эффект ингибирования МβЛ, что характеризуется отсутствием роста тест-штамма. Исходя из данных табл. 6, предложена антимикробная комбинация в отношении Р. aeruginosa, содержащая меропенем и этидроновую кислоту в соотношении 1:25000.

В табл. 7 представлены результаты ингибирования МβЛ этидроновой кислотой в композиции с имипенемом в отношении тест-культуры P. aeruginosa АТСС 27853. В ячейках, где отсутствует бисфосфонат, выявляется рост тест-штамма P. aeruginosa АТСС 27853 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Начиная со 2ой ячейки, выявлен эффект ингибирования МβЛ, что характеризуется отсутствием роста тест-штамма. Исходя из данных табл. 7, предложена антимикробная комбинация в отношении Р. aeruginosa, содержащая имипенем и этидроновую кислоту в соотношении 1:25000.

В табл. 8 представлены результаты ингибирования МβЛ клодроновой кислотой в композиции с имипенемом в отношении тест-культуры P. aeruginosa АТСС 27853. В ячейках, где отсутствует бисфосфонат, выявляется рост тест-штамма P. aeruginosa АТСС 27853 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Начиная со 2ой ячейки, выявлен эффект ингибирования МβЛ, что характеризуется отсутствием роста тест-штамма. Исходя из данных табл. 8, предложена антимикробная комбинация в отношении Р. aeruginosa, содержащая имипенем и клодроновую кислоту в соотношении 1:469.

Пример 2,

которым подтверждаются на основе полученных результатов апробации соотношение (вес.:вес.) антибиотика карбапенема и бисфосфоната в отношении тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747:

1. Имипенем и клодроновая кислота 1:1875

2. Имипенем и этидроновая кислота 1:25000

3. Меропенем и этидроновая кислота 1:25000

4. Меропенем и клодроновая кислота 1:938.

В табл. 9 представлены результаты ингибирования МβЛ клодроновой кислотой в комбинации с имипенемом в отношении тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747. В ячейках без клодроновой кислоты отмечается рост тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Эффект ингибитора отмечен со 2ой ячейки, где он содержится в количестве 469 мкг. Отмечен эффект инактивации МβЛ и отсутствие роста тест-культуры в ячейке 3 с количеством антибиотика, равного референтному значению чувствительности тест-штамма - 2 мкг/мл. Исходя из данных, представленных в таблице 9, предложена антимикробная комбинация в отношении А. baumannii, которая содержит имипенем и ингибитор МβЛ клодроновую кислоту в соотношении 1:1875.

В табл. 10 представлены результаты ингибирования МβЛ этидроновой кислотой в комбинации с имипенемом в отношении тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747. В ячейках без этидроновой кислоты отмечается рост тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Эффект ингибитора отмечен со 2ой ячейки, где он содержится в количестве 1563 мкг. Отмечен эффект инактивации МβЛ и отсутствие роста тест-культуры в ячейке 7 с количеством антибиотика, равного референтному значению чувствительности тест-штамма - 2 мкг/мл. Исходя из данных, представленных в таблице 10, предложена антимикробная комбинация в отношении А. baumannii, которая содержит имипенем и ингибитор МβЛ этидроновую кислоту в соотношении 1:25000.

В табл. 11 представлены результаты ингибирования МβЛ этидроновой кислотой в комбинации с меропенемом в отношении тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747. В ячейках без этидроновой кислоты отмечается рост тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Эффект ингибитора отмечен со 2ой ячейки, где он содержится в количестве 1563 мкг. Отмечен эффект инактивации МβЛ и отсутствие роста тест-культуры в ячейке 7 с количеством антибиотика, равного референтному значению чувствительности тест-штамма - 2 мкг/мл. Исходя из данных, представленных в таблице 11, предложена антимикробная комбинация в отношении А. baumannii, которая содержит меропенем и ингибитор МβЛ этидроновую кислоту в соотношении 1:25000.

В табл. 12 представлены результаты ингибирования МβЛ клодроновой кислотой в комбинации с меропенемом в отношении тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747. В ячейках без клодроновой кислоты отмечается рост тест-культуры A. baumannii АТСС ВАА-747 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Эффект ингибитора отмечен со 2ой ячейки, где он содержится в количестве 469 мкг. Отмечен эффект инактивации МβЛ и отсутствие роста тест-культуры в ячейке 4 с количеством антибиотика, равного референтному значению чувствительности тест-штамма - 2 мкг/мл. Исходя из данных, представленных в таблице 12, предложена антимикробная комбинация в отношении А. baumannii, которая содержит меропенем и ингибитор МβЛ клодроновую кислоту в соотношении 1:938.

Пример 3,

которым подтверждаются на основе полученных результатов апробации соотношение (вес.:вес.) антибиотика карбапенема и бисфосфоната в отношении тест-культуры К. pneumoniae АТСС 70603:

1. Имипенем и клодроновая кислота 1:938

2. Имипенем и этидроновая кислота 1:12500

3. Меропенем и этидроновая кислота 1:25000

4. Меропенем и клодроновая кислота 1:3750.

В табл. 13 представлены результаты ингибирования МβЛ клодроновой кислотой в комбинации с имипенемом в отношении тест-культуры К. pneumoniae АТСС 70603. В ячейках без клодроновой кислоты отмечается рост тест-культуры К. pneumoniae АТСС 70603 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Эффект ингибитора отмечен со 2ой ячейки, где он содержится в количестве 469 мкг. Отмечен эффект инактивации МβЛ и отсутствие роста тест-культуры в ячейке 4 с количеством антибиотика, равного референтному значению чувствительности тест-штамма - 2 мкг/мл. Исходя из данных, представленных в таблице 13, предложена антимикробная комбинация в отношении К. pneumoniae, которая содержит имипенем и ингибитор МβЛ клодроновую кислоту в соотношении 1:938.

В табл. 14 представлены результаты ингибирования МβЛ этидроновой кислотой в комбинации с имипенемом в отношении тест-культуры К. pneumoniae АТСС 70603. В ячейках без этидроновой кислоты отмечается рост тест-культуры К. pneumoniae АТСС 70603 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Эффект ингибитора отмечен со 2ой ячейки, где он содержится в количестве 1563 мкг. Отмечен эффект инактивации МβЛ и отсутствие роста тест-культуры в ячейке 6 с количеством антибиотика, равного референтному значению чувствительности тест-штамма - 2 мкг/мл. Исходя из данных, представленных в таблице 14, предложена антимикробная комбинация в отношении К. pneumoniae, которая содержит имипенем и ингибитор МβЛ этидроновую кислоту в соотношении 1:12500.

В табл. 15 представлены результаты ингибирования МβЛ этидроновой кислотой в комбинации с меропенемом в отношении тест-культуры К. pneumoniae АТСС 70603. В ячейках без этидроновой кислоты отмечается рост тест-культуры К. pneumoniae АТСС 70603 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Эффект ингибитора отмечен со 2ой ячейки, где он содержится в количестве 1563 мкг. Отмечен эффект инактивации МβЛ и отсутствие роста тест-культуры в ячейке 6 с количеством антибиотика, равного референтному значению чувствительности тест-штамма - 2 мкг/мл. Исходя из данных, представленных в таблице 15, предложена антимикробная комбинация в отношении К. pneumoniae, которая содержит меропенем и ингибитор МβЛ этидроновую кислоту в соотношении 1:25000.

В табл. 16 представлены результаты ингибирования МβЛ клодроновой кислотой в комбинации с меропенемом в отношении тест-культуры К. pneumoniae АТСС 70603. В ячейках без клодроновой кислоты отмечается рост тест-культуры К. pneumoniae АТСС 70603 за счет инактивации антибиотика ферментом МβЛ. Эффект ингибитора отмечен со 2ой ячейки, где он содержится в количестве 469 мкг. Отмечен эффект инактивации МβЛ и отсутствие роста тест-культуры в ячейке 6 с количеством антибиотика, равного референтному значению чувствительности тест-штамма - 2 мкг/мл. Исходя из данных, представленных в таблице 16, предложена антимикробная комбинация в отношении К. pneumoniae, которая содержит меропенем и ингибитор МβЛ клодроновую кислоту в соотношении 1:3750.

Технико-экономическая эффективность заявленных антимикробных комбинаций карбапенемов и бисфосфонатов состоит в ингибировании высоких доз стандартного реактива МβЛ, а также в усилении действия карбапенемов в отношении ранее чувствительных к ним штаммов грамотрицательных микроорганизмов при моделировании приобретения ими различных уровней резистентности. При этом эффективные дозы бисфосфонатов, представленные в комбинациях с карбапенемами, составляют от 3% до 13% суточной дозы клодроновой кислоты и от 8% до 17% суточной дозы этидроновой кислоты, что предполагает высокую эффективность этих комбинаций в отношении резистентных к карбапенемам грамотрицательных микроорганизмов в терапевтической практике.

Использованные источники информации

1. Шевченко О.В., Эйдельштейн М.В., Степанова М.Н. Металло-β-лактамазы: значение и методы выявления у грамотрицательных неферментирующих бактерий. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2007; 9(3): 211-19.

2. Композиции и способы лечения, включающие цефтаролин. Патент RU 2524665 C2.

3. Халконы в качестве усилителей антимикробных средств. Патент RU 2521252 C2.

4. Anti-Acinetobacter baumannii drug combination and application thereof. Патент CN 102475703.

5. Ингибиторы металло-β-лактамазы. Патент RU 2462450 C2 (прототип)

6. Eliopoulos G.M., and R.C. Moellering. 1991. Antimicrobial combinations, p. 432-492. In V. Lorian (ed.), Antibiotics in laboratory medicine. The Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD.

7. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04).

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической микробиологии, и описывает антимикробные комбинации сочетанного применения карбапенемов и бисфосфонатов в отношении устойчивых к карбапенемам грамотрицательных бактерий вида Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, продуцирующих металло-β-лактамазу. Антимикробные комбинации характеризуются весовым соотношением компонентов, а именно комбинации имипенем/клодроновая кислота, меропенем/клодроновая кислота, имипенем/этидроновая кислота, меропенем/этидроновая кислота используются в соотношениях 1:469, 1:3750, 1:25000, 1:25000 соответственно. Изобретение может быть использовано для преодоления устойчивости к карбапенемам у грамотрицательных бактерий вида Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. 16 табл.

Антимикробная комбинация сочетанного применения карбапенемов и бисфосфонатов в отношении устойчивых к карбапенемам грамотрицательных бактерий вида Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, продуцирующих металло-β-лактамазу, приводит к инактивации МβЛ в весовом соотношении:

Имипенем и клодроновая кислота 1:469

Меропенем и клодроновая кислота 1:3750

Имипенем и этидроновая кислота 1:25000

Меропенем и этидроновая кислота 1:25000.