ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТАТРАН 4-ХЛОР-2-МЕТИЛФЕНОКСИАЦЕТАТА ДЛЯ УГНЕТЕНИЯ СУММАРНОЙ АКТИВНОСТИ ОСНОВНОЙ (ЩЕЛОЧНОЙ) ФОСФОЛИПАЗЫ А2 МОНОНУКЛЕАРОВ Российский патент 2017 года по МПК A61K31/205 A61P43/00 A61P3/06 

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и, конкретно, может быть использовано, например, для повышения устойчивости сосудистой системы к холестерину при развитии атеросклеротического процесса

В последнее время доказано участие в атерогенезе лизосомальных липолитических ферментов, ответственных за деградацию липидных компонентов липопротеидов (ЛП). Определено их участие в механизме нарушений обмена липидов и липопротеидов при атеросклерозе, выявлена взаимосвязь между степенью изменений их активности в мононуклеарах крови, уровнем липидов крови и коэффициентом атерогенности [Серебров В.Ю., Балашов П.П., Шарыпова Н.Г. Исследование активности фосфолипаз плазматических мембран лимфоцитов при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией: // Сб. науч. трудов Сиб. Мед. Универ. (Томск). Актуальные проблемы биологии; - 2004. - Т. 3. - С. 209; Mallat Z, Benessiano J, Simon T, et all. Circulating secretory phospholipase A2 activity and risk of incident coronary events in healthy men and women: The EPIC-NORFOLK Study. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2007; - V. 27: - P.1177-83], [1, 2]. Развитие атеросклероза связано с патологическими процессами в эндотелии сосудов. На раннем этапе атерогенеза активируется эндотелий, который экспрессирует на своей поверхности адгезионные молекулы для моноцитов (Мц), нейтрофилов и лейкоцитов крови и продуцирует хемоаттрактанты, привлекающие Мц в интиму сосудов. Мц, мигрирующие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги, которые выступают как катализаторы образования окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛНП), миграции и пролиферации гладкомышечных клеток из мышечной оболочки в интиму. Частицы модифицированных ЛНП захватываются макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки. Активированные макрофаги, продуцирующие металлопротеиназы и коллагеназу, способствуют распаду коллагена в бляшке и возникновению разрыва бляшки, образованию тромба и развитию инфаркта миокарда. Следовательно, макрофаги играют ключевую роль в развитии атеросклеротических повреждений [Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты // Бюлл. СО РАМН (2006); №2 (120), с. 47-55] [3]. В этом плане заслуживают внимания исследования средств, изменяющих активность гидролаз Мц, в частности фосфолипазы А2 - (ФЛА2) (КФ 3.1.1.14) - лизосомального липолитического фермента класса гидролаз, имеющей оптимум действия при щелочных значениях рН, участвующего в атерогенезе, что обусловлено его участием в метаболизме липидов клеточных мембран, процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ), синтезе эйкозаноидов и др. [Ji Huang, Hai-Yan Qian, Zhi-Zhong Li,. et all. Role of endothelial lipase in atherosclerosis // Translational Research, - 2010, vol. 156, Issue 1. - P. 1-6; Бельков В.В. С-реактивный белок и липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2: новые факты и новые возможности для диагностики и стратификации сердечно-сосудистых рисков // Ж. «Поликлиника» - 2010 - №1. - С. 18-21], [4, 5]. Следовательно, изменение активности ФЛА2 под влиянием тех или иных средств может служить критерием эффективности антиатеросклеротических препаратов. При этом существует потребность в поиске и внедрении в практику новых диагностических и лекарственных средств, обладающих указанной активностью.

В качестве ближайшего аналога может быть указан источник: М.М. Расулов, М.К. Нурбеков, П.А. Стороженко, М.Г. Воронков., А.Н. Мирскова, Т.А. Снисаренко, К.А. Абзаева, М.И. Яхкинд, А.П. Оржековский. Применение комплекса-трис-(2-гидроксиэтил) амина с бис-(2-метил-феноксиацетатом) цинка (цинкатрана) в качестве средства, угнетающего общую активность основной (щелочной) фосфолипазы А2 мононуклеаров // Патент на изобретение RU №2546537 от 21 мая 2014 [6].

Задачей изобретения является разработка нового средства, которое возможно применить для понижения общей активности основной фосфолипазы А2 мононуклеаров.

Поставленная задача решается тем, что в качестве средства, понижающего общую активность основной фосфолипазы А2, предлагается использовать синтезированное нами ранее [Воронков М.Г., Адамович С.Н., Мирсков Р.Г., Мирскова А.Н. Синтез новых биологически активных О-гидрометаллоатранов // ЖОХ, 2009, т. 79, №1, С. 162-163] [7] биологически активное соединение - протатран 4-хлор-2-метилфеноксиацетат (хлоркрезацин) формулы:

4-Cl-2-СН₃С₆Н₃ОСН₂СОО^-[NH(CH₂CH₂OH)₃]⁺

Заявляемая биологическая активность хлоркрезацина не была известна. Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующими представленными ниже примерами.

Пример 1

К раствору 1.66 г 2-метил-феноксиуксусной кислоты в 10 мл диэтилового (серного) эфира, содержащему 0.01 г порошкообразного Al, при перемешивании прибавляют 1.35 г хлористого сульфурила. Реакционную смесь нагревают до кипения в течение 4 ч и горячей фильтруют. Фильтрат охлаждают до 0-5°C. Выпавший белый кристаллический осадок отсасывают, промывают эфиром и сушат в вакууме. Выход 2-метил-4-хлор-феноксиуксусной кислоты с т.пл. 111-112°C 2.9 г (98%).

Найдено, %: С 53.23; Н 4.31; Cl 17.72. C₉H₉O₃Cl.

Вычислено, %: С 53.86; Н 4.49; Cl 17.71 [Воронков М.Г., Власова Н.Н., Григорьева О.Ю. Патент №2427568, Способ получения 2-метил-4-галоген-феноксиацетатов трис-(2-гидроксиэтил)аммония (2-метил-4-галоген-феноксиацетоксипротатранов), 2011, Б.И. 24].

Пример 2

К раствору 4.0 г 2-метил-4-хлор-феноксиуксусной кислоты в 10 мл ацетона при перемешивании прибавляют 3.0 г триэтаноламина. Реакционную смесь выдерживают 0.5 ч, выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в вакууме. Получено 6.8 г (98%) хлоркрезацина с т.пл. 87-88°C [лит. данные 91-92°C, Софьина З.П., Воронков М.Г., Дьяков М.Г. и др. // Хим.-фарм. журн., 1978. Т. 12, №4. С. 74-77]. Найдено, %: С 51.43; Н 6.87; N 4.20; Cl 10.10. C₁₅H₂₄O₆NCl. Вычислено, %: С 51.50; Н 6.90; N 4.01; Cl 10.16 [Колесникова О.П., Мирскова А.Н.. Адамович С.Н., Мирсков Р.Г., Кудаева О.Т., Воронков М.Г., ДАН, 2009, Т. 425, №4, с. 556-560].

Свойство хлоркрезацина снижать общую (суммарную) активность основной фосфолипазы A2 в литературе не описано.

Применение хлоркрезацина (Хк) по новому назначению стало возможным благодаря нами выявленным его новым свойствам.

Впервые показано, что введение хлоркрезацина снижает активность лизосомального липолитического фермента из класса гидролаз (КФ 3.1.1): ФЛА2.

Пример 3

Эксперименты проводят на кроликах Шиншилла с исходной массой тела 1,8-2,0 кг. Атеросклероз вызывают методом Н.Н. Аничкова. Кроликам опытных групп (10 животных) вводят внутримышечно свежеприготовленный водный раствор Хк в дозе 10 мг/кг в течение 2 мес.

Контрольным животным (10) вводят внутримышечно физиологический раствор. В конце экспериментов в крови животных стандартными методами определяют содержание липидов, триацилглицеринов, β-липопротеинов и холестерина.

Мононуклеары выделяют из крови путем последовательного центрифугирования в градиенте фикол-верографин [Gmelig - Meyling F., Waldman T.A. Separation of human blood monocytes and lymphocytes on a continuous percoll gradient // J. Immunol. Method. - 1980. - Vol. 26. - P. 603-308 [8]. Гепаринизированную кровь разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 и осторожно наслаивают раствор фикола с 76% верографином, центрифугируют 45 мин. После центрифугирования отбирают Мц и вновь центрифугируют их 30 мин при 1200 g. Полученные в виде осадка Мц троекратно отмывают физиологическим раствором в соотношении 5:1 центрифугируя по 10 мин при 1200 g. Осадок гомогенизируют в 2 мл 0,25М раствора сахарозы pH 7,4 с 0,001М ЭДТА. Активность ФЛА2 определяют радиометрическим методом [Stoffel. W., Trabert. U. Studies on the occerence and proparties of lisosomal phospholipases Al and A2 and the degradation of posphatidie acid in rat liver lysosomes // Hoppe-Seyler's Z. Fhysiol. Chem. - 1969. - Bd/ 350. - S. 836-844] [9] с использованием в качестве субстрата синтезированного нами 1-ацил-2(13-Н) арахидоноил- глицеро-3sn-фосфорилхолина [Robertson A.F., Lends W.E.M. Positional specificities in phospholipid hydrolises // Biochemistry (Wash.). - 1962. - Vol. 1. - P. 804-810] [10]. Инкубационная смесь содержит 150 нмолей меченого лецитина, 160 мкмолей 0,1 н., 8 ммоль CaCl₂ при pH 8,0 и источник ферментов (исследуемые Мц) в конечном объеме 1,3 мл. Инкубацию проводят на водяной вибробане в течение 30 мин при 37°C. Реакцию останавливают добавлением 3 мл смеси хлороформ: метанол (1:2 об/об) и немедленно экстрагируют по методу Клайера и Дайера. Продукты реакции разделяют тонкослойной хроматографией в закрепленном слое силикагеля («Chemapol») на стеклянных пластинах размером 20×20 см в системе растворителей хлороформ:метанол:вода (65:25:4). Фракции лизолицетина, лецитина и жирных кислот экстрагируют смесью хлороформ:метанол (1:2 об/об). Экстракты помещают во флаконы с 10 мл сцинциляционной жидкости, содержащей в 100 мл толуола особой чистоты 5 г 2,5-дифенилоксазола и 300 мг 1,4 бис/2-(5 фенилоксазолил)/ - бензола. Радиоактивность измеряют на сцинцилляционном счетчике «Rackbeta 1215» ЛКБ (Швеция). Об активности ФЛА2 судят по образованию меченой жирной кислоты, получившейся в результате воздействия этих ферментов на 1-ацил-2(13-H)-арахидонил-глицеро-3sn-фосфорилхолин. Активность ФЛА2 выражают в микромолях образовавшихся продуктов в минуту на 1 г белка.

Результаты обрабатывают статистически.

Выявлено, что при применении Хк в Мц снижается уровень холестерола и общих липидов (табл. 1).

Результаты ферментативного анализа, представленные в табл.2, свидетельствуют, что развитие атеросклероза сопровождается значительным увеличением суммарной активности ФЛА2 в Мц на 63% по сравнению с эталоном. При введении Хк достоверно снижается активность ФЛА2 в Мн на 33% по сравнению с контролем.

Активацию лизосомального липолиза можно рассматривать как компенсаторную реакцию ферментных систем на фоне преобладания неспецифического нерегулируемого эндоцитоза модифицированных ЛНП или надмолекулярных ЛНП-содержащих комплексов. При этом в условиях субстратного насыщения может возникнуть относительная недостаточность отдельных лизосомальных ферментов, в частности ФЛА2. ФЛА2 секретируется в виде профермента и для ее активации требуется гидролиз специфических пептидных связей. Для проявления каталитической активности ФЛА2 необходим Ca²⁺ в миллимолярных концентрациях. ФЛА2 имеют ключевое значение в продукции провоспалительных медиаторов - арахидоновой кислоты (АрК) и эйкозаноидов. Все метаболиты АрК называются эйкозаноидами. АрК образуется из фосфолипидов мембраны клеток (лейкоциты, тромбоциты) под действием фосфолипидов. Существует два основных пути метаболизма АрК - циклоксигеназный и липоксигеназный. Конечными продуктами циклоксигеназного пути являются простагландины и тромбоксаны, а липоксигеназного - гидроксиэйкозатетраеновая кислота и лейкотриены. Помимо циклооксигеназы и липоксигеназы, выявлен третий фермент - эпоксигеназа, который окисляет АрК в эпопоксиэйкозатриеновую кислоту и дигидроксиэйкозатриеновую кислоту. Высвобождение АрК происходит преимущественно через активацию ФЛА2, а фосфатидилхолин является первичным субстратом. ФЛА2 принимает участие в многочисленных физиологических процессах, включая иммунные реакции, воспаление, пролиферацию, вазо- и бронхоконстрикцию [Zhao Y, Tong J, Не D, et all. Role of lysophosphatidic acid receptor LPA2 in the development of allergic airway inflammation in a murine model of asthma // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2009. - Nov. 20, - p. 10-11] [11].

Таким образом, применение химического соединения - протатран 4-хлор-2-метилфеноксиацетата (хлоркрезацина) приводит к достоверному снижению общей активности основной (щелочной) фосфолипазы А2 мононуклеаров.

Изобретение позволит создать на основе хлоркрезацина новые фармакологические препараты для предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов, а также диагностические средства, указывающие на развитие склерозирования сосудов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Серебров В.Ю., Балашов П.П., Шарыпова Н.Г. Исследование активности фосфолипаз плазматических мембран лимфоцитов при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией: // Сб. науч. трудов Сиб. Мед. Универ. (Томск). Актуальные проблемы биологии; - 2004. - Т. 3. - С. 209.

2. Mallat Z, Benessiano J, Simon T. et all. Circulating secretory phospholipase A2 activity and risk of incident coronary events in healthy men and women: The EPIC-NORFOLK Study. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2007; - V. 27: - P. 1177-83.

3. Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты. // Бюлл. СО РАМН, (2006); №2 (120), с. 47-55.

4. Ji Huang, Hai-Yan Qian, Zhi-Zhong Li. et al. Role of endothelial lipase in atherosclerosis // Translational Research, - 2010, vol. 156, Issue 1. - P. 1-6.

5. Вельков В.В. С-реактивный белок и липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2: новые факты и новые возможности для диагностики и стратификации сердечно-сосудистых рисков // Ж. «Поликлиника» - 2010 - №1. - С. 18-21.

6. Пат. РФ №2546537, МПК А61К 31/192, А61К 45/06. Применение комплекса-трис-(2-гидроксиэтил) амина с бис-(2-метил-феноксиацетатом) цинком (цинкатраном) в качестве средства, угнетающего общую активность основной (щелочной) фосфолипазы А2 мононуклеаров [Текст] / Расулов М.М., Нурбеков М.К., Стороженко П.А. [и др.]; Заявитель и патентообладатель ФГУП "ГНИИХТЭОС №2014120502/15, заявл. 21.05.2014, опубл. 10.04.2015. Бюл. №10.

7. Воронков М.Г., Адамович С.Н., Мирское Р.Г., Мирскова А.Н. Синтез новых биологически активных О-гидрометаллоатранов // ЖОХ, 2009, т. 79, №1, С. 162-163.

8. Gmelig-Meyling F., Waldman Т.A. Separation of human blood monocytes and lymphocytes on a continuous percoll gradient // J. Immunol. Method. - 1980. - Vol. 26. - P. 603-308.

9. Stoffel. W., Trabert. U. Studies on the occerence and proparties of lisosomal phospholipases A1 and A2 and the degradation of posphatidie acid in rat liver lysosomes // Hoppe-Seyler's Z. Fhysiol. Chem. - 1969. - Bd/350. - S. 836-844.

10. Robertson A.F., Leuds W.E.M.. Positional specificities in phospholipid hydrolises // Biochemistry (Wash.). - 1962. - Vol. 1. - P. 804-810.

11. Zhao Y, Tong J, He D. et al. Role of lysophosphatidic acid receptor LPA2 in the development of allergic airway inflammation in a murine model of asthma // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2009. - Nov. 20, - p. 10-11.

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и, конкретно, может быть использовано, например, для повышения устойчивости сосудистой системы к холестерину при развитии атеросклеротического процесса. Предложено применение протатран 4-хлор-2-метилфеноксиацетата (хлоркрезацина) в качестве средства, угнетающего суммарную активность основной (щелочной) фосфолипазы А2 мононуклеаров. Изобретение позволяет расширить область применения вещества и создать на основе хлокрезацина новые фармакологические препараты для предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов. 2 табл., 3 пр.

Применение протатран 4-хлор-2-метилфеноксиацетата (хлоркрезацина) в качестве средства, угнетающего суммарную активность основной (щелочной) фосфолипазы А2 мононуклеаров.