Применение бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония для угнетения суммарной активности основной (щелочной) фосфолипазы А мононуклеаров Российский патент 2020 года по МПК A61K31/205 A61P43/00 

Изобретение относится к биохимии германийорганических соединений и касается биологически активного вещества бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония формулы [(HOCH₂CH₂)₃NH⁺]₂[Ge₂(μ-Tart)₂(μ-OH)₂]^2- (соединение I, вигетан), где Tart – остаток винной кислоты -OC(O)CH(O-)CH(O-)C(O)O-. Изобретение также относится к медицине – кардиологии, гематологии, фармакологии, медицинской химии и биологии и, конкретно, может быть использовано, например, для повышения устойчивости сосудистой системы к холестерину при развитии атеросклеротического процесса.

В последнее время доказано участие в атерогенезе лизосомальных липолитических ферментов, ответственных за деградацию липидных компонентов липопротеидов (ЛП). Определено их участие в механизме нарушений обмена липидов и ЛП при атеросклерозе, выявлена взаимосвязь между степенью изменений их активности в мононуклеарах крови, уровнем липидов крови и коэффициентом атерогенности [см.Серебров В.Ю., Балашов П.П., Шарыпова Н.Г. Исследование активности фосфолипаз плазматических мембран лимфоцитов при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией: // Сб. науч. трудов Сиб. Мед. Универ. (Томск). Актуальные проблемы биологии; - 2004. - Т. 3. - С. 209; Mallat Z, Benessiano J, Simon T, et all. Circulating secretory phospholipase A2 activity and risk of incident coronary events in healthy men and women: The EPIC-NORFOLK Study. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2007; - V. 27: - P.1177-83].

Развитие атеросклероза связано с патологическими процессами в эндотелии сосудов. На раннем этапе атерогенеза активируется эндотелий, который экспрессирует на своей поверхности адгезионные молекулы для моноцитов (Мц), нейтрофилов и лейкоцитов крови и продуцирует хемоаттрактанты, привлекающие Мц в интиму сосудов. Мц, мигрирующие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги, которые выступают как катализаторы образования окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛНП), миграции и пролиферации гладкомышечных клеток из мышечной оболочки в интиму. Частицы модифицированных ЛНП захватываются макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки. Активированные макрофаги, продуцирующие металлопротеиназы и коллагеназу, способствуют распаду коллагена в бляшке и возникновению разрыва бляшки, образованию тромба и развитию инфаркта миокарда. Следовательно, макрофаги играют ключевую роль в развитии атеросклеротических повреждений [см. Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты // Бюлл. СО РАМН (2006); №2 (120), с. 47-55]. В этом плане заслуживают внимания исследования средств, изменяющих активность гидролаз Мц, в частности фосфолипазы А₂ (ФЛА2) (КФ 3.1.1.14) – лизосомального липолитического фермента класса гидролаз, имеющего оптимум действия при щелочных значениях рН, участвующего в атерогенезе, что обусловлено его участием в метаболизме липидов клеточных мембран, процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ), синтезе эйкозаноидов и др. [см. Ji Huang, Hai-Yan Qian, Zhi-Zhong Li,. et all. Role of endothelial lipase in atherosclerosis // Translational Research, - 2010, vol. 156, Issue 1. - P. 1-6; Бельков В.В. С-реактивный белок и липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2: новые факты и новые возможности для диагностики и стратификации сердечно-сосудистых рисков // Ж. «Поликлиника» - 2010 - №1. - С. 18-21]. Следовательно, изменение активности ФЛА2 под влиянием тех или иных средств может служить критерием эффективности антиатеросклеротических препаратов. При этом существует потребность в поиске и внедрении в практику новых диагностических и лекарственных средств, обладающих указанной активностью.

Известно, что некоторые германийорганические соединения обладают адаптогенным действием [cм. Жигачёва И.В. Бинюков В.И., Миль Е.М., Генерозова И.П., Расулов М.М. Влияние германийорганического соединения на функциональное состояние митохондрий растительного и животного происхождения // Научный альманах (Биологические науки). 2015, N 7(9), 955-966]. Органические соединения германия обладают биологической активностью (см. кн. - Лукевиц Э.Я. и др. Биологическая активность соединений германия. Рига: Зинатне, 1990, стр.981). Содержащие германий органические полимеры эффективны при лечении психоневрологических нарушений (патент США 4281015, 1981 г., МПК А61К 31/28), офтальмологических расстройств (патент США 4296123, 1981 г., МПК А61К 31/28), нарушений функций печени (патент США 4309412, 1982 г., МПК А61К 31/74), фиброза легких (патент США 4321273, 1982 г., МПК А61К 31/28), аллергических заболеваний (патент США 4322402, 1982 г., МПК А61К 31/74) и гепатита (патент США 5340806, 1994 г., МПК А61К 31/79). Также они способствуют выработке интерферона в организме (патент США 4473581, 1984 г., МПК А61К 31/28) и защищают его от простуды (патент США 4898882, 1990 г., МПК А61К 31/28). Моногидрат 1-гидроксигерматрана обладает цитокинной активностью в отношении триптофанил-тРНК синтетазы (патент РФ № 2553986, 2015 г., МПК А61К 31/205).

В настоящее время существует необходимость поиска новых эффективных препаратов, обеспечивающих торможение атерогенеза.

В качестве средства, понижающего общую активность основной (щелочной) фосфолипазы А₂, предлагается использовать синтезированное ранее [см. Воронков М.Г., Адамович С.Н., Мирсков Р.Г., Мирскова А.Н. Синтез новых биологически активных О-гидрометаллоатранов // ЖОХ, 2009, т. 79, №1, С. 162-163] биологически активное соединение: бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германат (IV) триэтаноламмония, которое имеет формулу:

[(HOCH₂CH₂)₃NH⁺]₂[Ge₂(μ-Tart)₂(μ-OH)₂]^2- (соединение I), где Tart – остаток винной кислоты -OC(O)CH(O-)CH(O-)C(O)O-. Это соединение (далее – вигетан) имеет следующий вид:

В качестве ближайшего аналога может служить хлоркрезацин (см. М.И. Яхкинд, М.Г. Воронков, М.И. Сусова, М.К. Нурбеков, М.М. Расулов, К.А. Абзаева, Р.М.Расулов. Применение протатран 4-хлор-2-метил-феноксиацетата для угнетения суммарной активности основной (щелочной) фосфолипазы А2 мононуклеаров // Патент на изобретение RU №2619860 от 15.04.2016).

Хлоркрезацин или протатран 4-хлор-2-метилфеноксиацетат имеет формулу: 4-Cl-2-CH₃C₆H₃OCH₂COO^-[NH(CH₂CH₂OH)₃]⁺ и вид:

Задачей изобретения является разработка нового средства, которое возможно применить для понижения общей активности основной фосфолипазы А2 мононуклеаров.

Технический результат – расширение арсенала средств, обладающих свойством снижать суммарную активность основной (щелочной) фосфолипазы А₂ мононуклеаров за счет выявленной новой биологической активности бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония.

Предлагается применение бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония в качестве средства, угнетающего суммарную активность основной (щелочной) фосфолипазы А2 мононуклеаров.

При этом бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германат (IV) триэтаноламмония может применяться в виде раствора в официальном растворе 0,9% натрия хлорида или в воде для инъекций.

При этом раствор может содержать 5-20 мас.% бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония.

Заявляемая биологическая активность бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония не была ранее известна.

Свойство бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония снижать общую (суммарную) активность основной (щелочной) фосфолипазы A2 в литературе не описано.

Применение бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония по новому назначению стало возможным благодаря выявленным нами новым свойствам данного соединения.

Впервые показано, что введение бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония снижает активность лизосомального липолитического фермента из класса гидролаз (КФ 3.1.1) ФЛА₂.

Заявляемое изобретение относится к приоритетному направлению развития науки и технологий «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных» [см. Алфавитно-предметный указатель к Международной патентной классификации по приоритетным направлениям развития науки и технологий / Ю.Г. Смирнов, Е.В. Скиданова, С.А. Краснов – М.: ПАТЕНТ, 2008. – с.15].

При разработке изобретения авторы использовали различные растворители для получения средства для воздействия на активность основной (щелочной) ФЛА2 мононуклеаров. Были испытаны различные растворы на водной основе, в частности раствор вышеуказанного активного вещества в воде для инъекций и в официальном 0,9% растворе натрия хлорида. При этом в том и в другом случае были получены аналогичные результаты. Следует отметить, что нами исследовались полученные таким образом растворы с различной концентрацией активного вещества – бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония (5%, 10%, 20%, 50%, 70%). При этом положительные эффекты от их использования, отмеченные ниже, значимо не различались. В исследованиях использовали различные дозы активного вещества: от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг массы животного. Эффект угнетения активности фермента ФЛА2 присутствовал во всех случаях и был прямо пропорционален дозе используемого активного вещества. Соответственно, для достижения указанного нами технического результата важным является как таковое новое свойство данного соединения, а не его доза. Поэтому ниже, в примере, приведен для демонстрации только опыт с использованием активного вещества в дозе 10 мг/кг ежедневно. В данном случае применяли раствор активного вещества, который приготовляли ex tempore, используя официальный 0,9% раствор натрия хлорида, смешивая с ним активное вещество.

Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующим примером.

Пример.

Исследование проводили на кроликах Шиншилла с исходной массой 1,8-2,0 кг в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации». Правила утверждены приказом Министерства здравоохранения РФ от 19.06.2003 г №267 (Правила лабораторной практики в Российской Федерации Министерства здравоохранения РФ Приказ от 19 июня 2003 года № 267 http://www.kodeks.ru (24 апреля 2010г)). Животных содержали в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемыми для экспериментальных и иных научных целей. По окончании эксперимента животным проводили эвтаназию цервикальной дислокацией 5 позвонка, соблюдая правила «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).

Гиперлипидемию у кроликов вызывали методом Аничкова-Халатова.

Испытуемые вещества для инъекций растворяли «ex tempore» в официальном растворе 0,9% натрия хлорида. Кролики были разделены на следующие группы (по 10 голов):

1) группа опыта, которым в течение 2 мес вводили внутримышечно ежедневно раствор бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония, доза активного вещества 10 мг/кг массы животного, в виде свежеприготовленного раствора.

2) группа плацебо – контроля, которым вводили внутримышечно ежедневно эквиобъёмное количество официального 0,9% раствора натрия хлорида в течение 2 месяцев.

3) группа животных, получавших внутримышечно свежеприготовленный раствор аналога – хлоркрезацина в дозе активного вещества 10 мг/кг массы животного, ежедневно в течение 2 месяцев.

Эталоном служат данные, полученные у интактных кроликов.

В конце экспериментов в крови животных стандартными методами определяли содержание липидов, триацилглицеринов, β-липопротеинов и холестерина.

Мононуклеары (моноциты – Мц) выделяли из крови путем последовательного центрифугирования в градиенте фикол-верографин [см. Gmelig - Meyling F., Waldman T.A. Separation of human blood monocytes and lymphocytes on a continuous percoll gradient // J. Immunol. Method. - 1980. -Vol. 26. - P. 603-308. Гепаринизированную кровь разводили 0,9% официальным раствором натрия хлорида в соотношении 1:1 и осторожно наслаивали раствор фикола с 76% верографином, центрифугировали 45 мин. После центрифугирования отбирали Мц и вновь центрифугировали их 30 мин при 1200 g. Полученные в виде осадка Мц троекратно отмывали физиологическим раствором в соотношении 5:1 центрифугируя по 10 мин при 1200 g. Осадок гомогенизировали в 2 мл 0,25М раствора сахарозы pH 7,4 с 0,001М ЭДТА. Активность ФЛА2 определяли радиометрическим методом [см. Stoffel. W., Trabert. U. Studies on the occerence and proparties of lisosomal phospholipases Al and A2 and the degradation of posphatidie acid in rat liver lysosomes // Hoppe-Seyler's Z. Fhysiol. Chem. - 1969. - Bd/ 350. - S. 836-844] с использованием в качестве субстрата синтезированного ранее 1-ацил-2(13-Н) арахидоноил-глицеро-3sn-фосфорилхолина [см. Robertson A.F., Lends W.E.M. Positional specificities in phospholipid hydrolises // Biochemistry (Wash.). - 1962. - Vol.1. - P. 804-810]. Инкубационная смесь содержала 150 нмолей меченого лецитина, 8 ммоль CaCl₂ при pH 8,0 и источник ферментов (исследуемые Мц) в конечном объеме 1,3 мл. Инкубацию проводили на водяной вибробане в течение 30 мин при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 3 мл смеси хлороформ: метанол (1:2 об/об) и немедленно экстрагировали по методу Клайера и Дайера. Продукты реакции разделяли тонкослойной хроматографией в закрепленном слое силикагеля («Chemapol») на стеклянных пластинах размером 20×20 см в системе растворителей хлороформ: метанол:вода (65:25:4). Фракции лизолецитина, лецитина и жирных кислот экстрагировали смесью хлороформ:метанол (1:2 об/об). Экстракты помещали во флаконы с 10 мл сцинциляционной жидкости, содержащей в 100 мл толуола особой чистоты 5 г 2,5-дифенилоксазола и 300 мг 1,4-бис-(5-фенилоксазолил-2)-бензола. Радиоактивность измеряли на сцинцилляционном счетчике «Rackbeta 1215» ЛКБ (Швеция). Об активности ФЛА2 судили по образованию меченой жирной кислоты, получившейся в результате воздействия этих ферментов на 1-ацил-2(13-H)-арахидонил-глицеро-3sn-фосфорилхолин.

Активность ФЛА2 выражали в микромолях образовавшихся продуктов в минуту на 1 г белка.

Статистическую обработку данных проводили методом Стьюдента. Данные представлены в виде средних и стандартных значений ошибки – М и m, соответственно. Достоверными считаются различия при р ≤ 0,05 (см. Петри А., Сэбин К., 2009].

Результаты.

В эксперименте на лабораторных животных выявлено, что при применении бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония снижается уровень холестерола и общих липидов в Мц (таблица 1).

Результаты ферментативного анализа, представленные в таблице 2, свидетельствуют, что развитие гиперлипидемии сопровождается значительным увеличением суммарной активности ФЛА2 в Мц по сравнению с эталоном. При введении бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо)германата (IV) триэтаноламмония (вигетана) достоверно снижается активность ФЛА2 в Мн по сравнению с контролем, как и при применении аналога – хлоркрезацина.

Активацию лизосомального липолиза можно рассматривать как компенсаторную реакцию ферментных систем на фоне преобладания неспецифического нерегулируемого эндоцитоза модифицированных ЛНП или надмолекулярных ЛНП-содержащих комплексов. При этом в условиях субстратного насыщения может возникнуть относительная недостаточность отдельных лизосомальных ферментов, в частности ФЛА2. ФЛА2 секретируется в виде профермента, и для ее активации требуется гидролиз специфических пептидных связей. Для проявления каталитической активности ФЛА2 необходим Ca²⁺ в миллимолярных концентрациях. ФЛА2 имеют ключевое значение в продукции провоспалительных медиаторов – арахидоновой кислоты (АрК) и эйкозаноидов. Все метаболиты АрК называются эйкозаноидами. АрК образуется из фосфолипидов мембраны клеток (лейкоциты, тромбоциты).

Существует два основных пути метаболизма АрК – циклоксигеназный и липоксигеназный. Конечными продуктами циклоксигеназного пути являются простагландины и тромбоксаны, а липоксигеназного - гидроксиэйкозатетраеновая кислота и лейкотриены. Помимо циклооксигеназы и липоксигеназы, выявлен третий фермент – эпоксигеназа, который окисляет АрК в эпоксиэйкозатриеновую кислоту и дигидроксиэйкозатриеновую кислоту. Высвобождение АрК происходит преимущественно через активацию ФЛА2, а фосфатидилхолин является первичным субстратом. ФЛА2 принимает участие в многочисленных физиологических процессах, включая иммунные реакции, воспаление, пролиферацию, вазо- и бронхоконстрикцию [см. Zhao Y, Tong J, Не D, et all. Role of lysophosphatidic acid receptor LPA2 in the development of allergic airway inflammation in a murine model of asthma // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2009. - Nov. 20, - p. 10-11].

Таким образом, применение химического соединения – бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо)германата (IV) триэтаноламмония приводит к достоверному снижению общей активности основной (щелочной) фосфолипазы А₂ мононуклеаров.

Изобретение позволит создать на основе бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония новые фармакологические препараты для предотвращения нарушений липидного обмена.

Таблица 1

Показатели липидного обмена при применении бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония в физиологическом растворе

Показатели Сыворотка крови Эталон - интактные Липиды общие (моль/л) 4,3±0,4 Холестерол (моль/л) 3,5±0,3 Триацилглицерины (моль/л) 1,7±0,2 β- липопротеины (моль/л) 0,78±0,09 Контроль – нелеченые Липиды общие (моль/л) 72,4±4,9 ** Холестерол (моль/л) 34,5±1,9 ** Триацилглицерины (моль/л) 16,2±2,1 ** β- липопротеины (моль/л) 3,8±0,3 ** Аналог – хлоркрезацин, 10 мг/кг Липиды общие (моль/л) 42,5±3,3* ** Холестерол (моль/л) 23,2±1,5* ** Триацилглицерины (моль/л) 8,1±0,7* ** β- липопротеины (моль/л) 1,6±0,2* ** Опыт – вигетан, 10 мг/кг Липиды общие (моль/л) 30,1±1,9* ** Холестерол (моль/л) 17,9±0,8* ** Триацилглицерины (моль/л) 6,2±0,32* ** β- липопротеины (моль/л) 0,89±0,07* **

Примечание : * - p<0.05 по отношению к контролю;

** - p<0.05 по отношению к эталону.

Таблица 2

Изменения активности ФЛА2 в моноцитах кроликов (мкмоль/мин на 1 г белка) при применении бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония в физиологическом растворе

объект Эталон контроль Хлоркрезацин Опыт Моноциты 1,85±0,03* 3,1±0,1** 1,95±0,1* ** 1,9±0,06* **

Примечание : * - p<0.05 по отношению к контролю;

** - p<0.05 по отношению к эталону.

Изобретение относится к медицине и касается применения бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония в качестве средства, угнетающего суммарную активность основной (щелочной) фосфолипазы А2 мононуклеаров. Изобретение обеспечивает угнетение суммарной активности основной (щелочной) фосфолипазы А2 мононуклеаров. 3 з.п. ф-лы, 1 пр., 2 табл.

1. Применение бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германата (IV) триэтаноламмония в качестве средства, угнетающего суммарную активность основной (щелочной) фосфолипазы А2 мононуклеаров.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германат (IV) триэтаноламмония используют в виде раствора в 0,9%-ном растворе натрия хлорида или в воде для инъекций.

3. Применение по п. 2, отличающееся тем, что бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германат (IV) триэтаноламмония применяют в виде раствора, содержащего 5-20 мас.% активного вещества.

4. Применение по п. 1, или 2, или 3, отличающееся тем, что применяют раствор, содержащий активное вещество бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) германат (IV) триэтаноламмония в дозе 10 мг/кг массы животного.