Способ получения иммобилизованных бислойных везикул Российский патент 2017 года по МПК C12N11/00 

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии, биоаналитики и касается способа получения иммобилизованных бислойных везикул.

Известен способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки твердой поверхности слюды водной суспензией специально приготовленных агрегатов бислойных липидных везикул, приводящей к формированию на поверхности липидного полислоя с включенными в него везикулами (О. Teschke, E.F. de Souza, Liposome structure imaging by atomic force microscopy: verification of improved liposome stability during adsorption of multiple aggregated vesicles, Langmuir, 2002, v. 18, p. 6513).

Известен способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем последовательной обработки стеклянной подложки бычьим сывороточным альбумином, олеил-О-полиэтиленгликолем и водной суспензией отрицательно заряженных везикул (US Patent №7501280, кл. 435/325).

Наиболее близким к заявляемому является известный способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки катионного носителя суспензией анионных бислойных везикул в водосодержащей среде. При этом в данном способе в качестве заряженного катионного носителя используют дисперсные частицы метилметакрилатного латекса в воде, содержащие привитые катионные цепи поли-2-метилпропеноилоксиэтилтриметиламмоний бромида, а в качестве иммобилизуемых анионных бислойных везикул используют суспензию везикул, полученных в водосодержащей среде из смеси анионного кардиолипина и электронейтрального фосфатидилхолина (патент России, RU 2409668 С1, МПК C12N 11/00, 2009, см. пример 1) - прототип.

Недостатком известного способа является его относительная сложность, связанная с проведением многостадийной синтетической процедуры модификации поверхности носителя и очистки модифицированной поверхности носителя от не вступившего в реакцию полимеризации исходного мономера и не закрепленного на поверхности полимера и/или олигомера.

Задачей изобретения является разработка способа получения иммобилизованных бислойных везикул, лишенного вышеуказанных недостатков, и расширение арсенала технических средств, которые могут быть использованы в качестве способа получения иммобилизованных бислойных везикул. Технический результат изобретения заключается в упрощении известного способа получения иммобилизованных бислойных везикул.

Предварительно были проведены эксперименты с различными носителями и различными бислойными везикулами, которые показали, что вышеуказанный технический результат достигается только в том случае, если в известном способе получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки катионного носителя суспензией анионных бислойных везикул в водосодержащей среде носитель и/или иммобилизуемые везикулы содержат ковалентно связанный полиэтиленгликоль (ПЭГ), а в качестве носителя используют везикулы, содержащие по крайней мере один катионный липид или его смесь по крайней мере с одним липидом, содержащим ковалентно связанный ПЭГ, причем на одну частицу носителя приходится не менее двух иммобилизованных везикул.

Предлагаемый способ позволяет сохранять целостность иммобилизованных на поверхности бислойных везикул. При этом химическая природа противоионов у носителя и у везикул принципиального значения не имеет.

В предлагаемом техническом решении в качестве носителя используют везикулы, полученные путем самопроизвольной или принудительной агрегацией в водосодержащей среде любого катионного липида, например, такого как димиристоилтриметилпропиламмоний хлорид, диметилдиоктадециламмоний бромид,

димиристоилдиметиламмонийпропан и т.д., или смеси катонного липида с любым липидом, содержащим ковалентно связанный ПЭГ, например, таким как октаноилсфингозин-сукцинилметоксиполиэтиленгликоль (1244), дипальмитоилфосфоэтаноламин-метоксиполиэтиленгликоль 550 (1240), цетиловый эфир полиэтиленгликоля (1138) и т.д. При этом мольное содержание катионного липида в вышеуказанной смеси может варьироваться в широких пределах, например, от 20 до 100%. При получении носителя концентрация липидов в водосодержащей среде может варьироваться в широких пределах.

Если при получении носителя использовать везикулы, не содержащие катионного липида, то предлагаемый способ утрачивает работоспособность.

В предлагаемом способе при получении иммобилизуемых анионных везикул можно использовать любой анионный липид, например, такой как натриевая соль димиристоилфосфатидной кислоты, натриевая соль дилауроилфосфоглицерола или натриевая соль диолеоилфосфосерин и т.д., его смесь с любым липидом, содержащим ковалентно связанный ПЭГ, например, таким как октаноилсфингозин-

сукцинилметоксиполиэтиленгликоль общей формулы C₆₃H₁₂₁NO₂₂, аммониевая соль дипальмитоилфосфоэтаноламин-метоксиполиэтиленгликоля (550) общей формулы C₉₉H₁₁₉NO₂₂P, цетиловый эфир полиэтиленгликоля (1138) общей формулы С₆₀Н₁₁₄O₂₃ и т.д. или тройную смесь, содержащую анионный липид, липид, содержащий ковалентно связанный ПЭГ, и электронейтральный липид, например, такой как диолеоилфосфохолин (786), яичный лецитин (700), димиристоилфосфохолин (677). При этом мольное содержание анионного липида в вышеуказанной смеси может варьироваться в широких пределах, например, от 5 до 20%. При получении суспензии иммобилизуемых везикул в водосодержащей среде концентрация каждого из липидов и всей смеси липидов может варьироваться в широких пределах.

Следует отметить, что иммобилизуемые везикулы обязательно должны иметь отрицательный заряд. Если для иммобилизации использовать везикулы, состоящие только из электронейтрального липида, либо для этой цели использовать катионные везикулы, то данный способ утрачивает работоспособность.

При получении носителя и/или иммобилизуемых везикул, содержащих ковалентно связанный ПЭГ, степень полимеризации фрагментов ПЭГ может варьироваться в широких пределах, например, у октаноилсфингозин-сукцинилметоксиполиэтиленгликоля она равна 15, у аммониевой соли дипальмитоилфосфоэтаноламин-метоксиполиэтиленгликоля она равна 11, а у цетиловый эфир полиэтиленгликоля (1138) 22.

В предлагаемом техническом решении можно использовать носители и иммобилизуемые везикулы разного размера в зависимости от решаемой задачи. Унифицировать размер носителя и иммобилизуемых везикул можно путем пропускания суспензии липидов через экструдер, снабженный мембранами с порами различного размера или с помощью ультразвуковой гомогенизации. При этом частота ультразвука, мощность ультразвука и продолжительность воздействия ультразвука на объект могут быть различны в зависимости от конкретной решаемой задачи.

Липиды, используемые в предложенном изобретении для получения как носителя, так и иммобилизуемых везикул, описаны в научно-технической литературе и являются коммерчески доступными соединениями (см., например, каталог Avanti Polar Lipids).

Обработку катионного носителя суспензией анионных бислойных везикул необходимо проводить в водосодержащей среде, в качестве которой можно использовать водно-солевые или буферные растворы. При этом на одну частицу носителя должно приходиться не менее двух везикул. Если соотношение носитель: везикула будет 1:1, то в данном случае будет образовываться липосомальный дуплекс.

Иммобилизация анионных везикул на поверхности катионного носителя может сопровождаться образованием коагулирующего осадка, который может быть вновь переведен в коллоидную дисперсию путем добавления новой порции суспензии носителя или бислойных везикул.

Получать носитель, иммобилизуемые везикулы и осуществлять их иммобилизацию на носителе можно в широком интервале температур, однако из соображений удобства эти операции целесообразно проводить при комнатной температуре. При выполнении этих операций рН среды и концентрация соли в водно-солевом растворе могут варьироваться в широких пределах. Конкретные значения этих параметров выбирают с учетом состава везикул и носителя.

Иммобилизованные на поверхности везикулы могут быть использованы в качестве контейнеров для инкапсулирования и контролируемого высвобождения различных веществ, например лекарств, пищевых добавок, катализаторов химических реакций и т.д.

Строение и состав конечных продуктов, получаемых с помощью предлагаемого способа, могут быть оценены и доказаны различными физико-химическими методами: лазерным электрофорезом, динамическим светорассеянием, флуоресценцией, электронной микроскопией, эллипсометрией, атомно-силовой микроскопией и т.д. Например, целостность иммобилизованных везикул доказывают, используя везикулы, внутренний водный объем которых заполнен 1 М водным раствором водорастворимой соли (например, хлорида натрия). Разрушение везикул неизбежно сопровождается возрастанием электропроводности суспензии, что регистрируется кондуктометрически. Неразрушенные везикулы не вносят вклад в электропроводность суспензии. Эксперименты показывают, что электропроводность суспензии иммобилизованных везикул, полученных с помощью предлагаемого нами способа, остается неизменной, что свидетельствует о сохранении целостности иммобилизованных везикул.

Преимущества предлагаемого способа иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1.

Опыт проводят при комнатной температуре.

Носитель получают следующим образом. 2 мл 0,1 вес. % раствора димиристоилтриметилпропиламмоний хлорида в растворителе - метаноле помещают в круглодонную стеклянную колбу и удаляют метанол на роторном испарителе в вакууме. После удаления метанола на стенках колбы образуется тонкая пленка липида, которую диспергируют в 2 мл 10^-2 М боратного буфера с рН 9,2. Получают опалесцирующий раствор липида в буферном растворе, на который затем воздействуют ультразвуком частоты 22 кГц в течение 400 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают 2 мл суспензии катионного носителя в водосодержащей среде с концентрацией 1 мг/мл.

Иммобилизуемые бислойные везикулы получают из смеси анионного липида димиристоилфосфатидной кислоты, электронейтрального липида диолеоилфосфохолина и липида, содержащего ковалентно связанный ПЭГ, октаноилсфингозин-сукцинилметоксиполиэтиленгликоля 750 следующим образом. Смесь 0,2 мл 0,1 вес.% раствора анионного липида натриевой соли димиристоилфосфатидной кислоты в растворителе - хлороформе, 1,82 мл 0,1 вес.% раствора электронейтрального липида диолеоилфосфохолина в хлороформе и 0,85 мл 0,1 вес.% раствора липида, содержащего ковалентно связанный ПЭГ, октаноилсфингозин-сукцинилметоксиполиэтиленгликоля750 в хлороформе помещают в круглодонную стеклянную колбу и удаляют хлороформ на роторном испарителе в вакууме. После удаления хлороформа на стенках колбы образуется тонкая пленка смеси липидов, которую диспергируют в 2 мл 10^-2 М боратного буфера с рН 9,2. Получают опалесцирующий раствор липидов в буферном растворе, на который затем воздействуют ультразвуком частоты 22 кГц в течение 400 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают суспензию анионных бислойных везикул, состоящих из анионного, электронейтрального и ПЭГилированного липидов, в водосодержащей среде с концентрацией 1,43 мг/мл.

Иммобилизованные бислойные везикулы получают путем смешения 1,6 мл суспензии ранее полученных анионных бислойных везикул с 0,2 мл суспензии ранее полученного катионного носителя.

Целостность катионного носителя и иммобилизованных везикул доказывают путем проведения двух аналогичных опытов, в одном из которых на стадии приготовления носителя в реакционную систему вводят флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин (КФ) в концентрации 10^-5 М. О целостности носителя свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул. В другом опыте на стадии приготовления иммобилизуемых везикул в реационную систему вводят флуоресцентный краситель КФ в концентрации 10^-5 М. О целостности иммобилизованных везикул свидетельствует отсутствие флуоресценции в суспензии иммобилизованных на носителе везикул.

Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Пример 2.

Опыт проводят при 15°С.

Носитель получают из смеси катионного липида и липида, содержащего ковалентно связанный ПЭГ, следующим образом. Смесь 1,4 мл 0,1 вес.% раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в растворителе - метаноле и 1,2 мл 0,1 вес.% раствора липида, содержащего ковалентно связанного ПЭГ, дипальмитоилфосфоэтаноламин-метоксиполиэтиленгликоля 550 в метаноле помещают в круглодонную стеклянную колбу и удаляют метанол на роторном испарителе в вакууме. После удаления метанола на стенках колбы образуется тонкая пленка смеси липидов, которую диспергируют в 2 мл 10^-2 М ТРИС буфера с рН 7. Получают опалесцирующий раствор смеси липидов в буферном растворе, на который затем воздействуют ультразвуком частоты 20 кГц в течение 450 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают 2 мл суспензии катионного носителя в водосодержащей среде с концентрацией 1,3 мг/мл.

Иммобилизуемые бислойные везикулы получают из смеси анионного липида и электронейтрального липида следующим образом. Смесь 0,4 мл 0,1 вес.% раствора анионного липида натриевой соли дилауроилфосфоглицерола в растворителе - хлороформе и 1,84 мл 0,1 вес.% раствора электронейтрального липида яичного лецитина в хлороформе помещают в круглодонную стеклянную колбу и удаляют хлороформ на роторном испарителе в вакууме. После удаления хлороформа на стенках колбы образуется тонкая пленка липидов, которую диспергируют в 2 мл 10^-2 М ТРИС буфера с рН 7. Получают опалесцирующий раствор липидов в буферном растворе, на который затем воздействуют ультразвуком частоты 25 кГц в течение 350 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают 2 мл суспензии анионных бислойных везикул в водосодержащей среде с концентрацией 1,1 мг/мл.

Иммобилизованные бислойные везикулы получают путем смешения 1,3 мл суспензии ранее полученных анионных бислойных везикул с 0,5 мл суспензии ранее полученного катионного носителя. Целостность иммобилизованных везикул и катионного носителя доказывают аналогично примеру 1.

Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Пример 3.

Опыт проводят при 25°С.

Носитель получают из смеси катионного липида и липида, содержащего ковалентно связанный ПЭГ, следующим образом. Смесь 1,8 мл 0,1 вес.% раствора катионного липида димиристоилдиметиламмонийпропана в растворителе - метаноле и 0,45 мл 0,1 вес.% раствора цетилового эфира полиэтиленгликоля 20 в метаноле помещают в круглодонную стеклянную колбу и удаляют метанол на роторном испарителе в вакууме. После удаления метанола на стенках колбы образуется тонкая пленка смеси липидов, которую диспергируют в 2 мл 10^-2 М боратного буфера с рН 9,2. Получают опалесцирующий раствор смеси липидов в буферном растворе, на который затем воздействуют ультразвуком частоты 20 кГц в течение 450 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают 2 мл суспензии катионного носителя в водосодержащей среде с концентрацией 1,1 мг/мл.

Иммобилизуемые бислойные везикулы получают из смеси анионного липида, электронейтрального липида и лилда, содержащего коваленто связанный ПЭГ, следующим образом. Тройную смесь 0,3 мл 0,1 вес.% раствора анионного липида натриевой соли диолеоилфосфосерина в растворителе - этаноле, 1,76 мл 0,1 вес.% раствора электронейтрального липида димиристоилфосфохолина в этаноле и 0,24 мл 0,1 вес.% раствора липида, содержащего ковалентно связанный ПЭГ, октаноилсфингозин-сукцинилметоксиполиэтиленгликоля 750 в этаноле помещают в круглодонную стеклянную колбу и удаляют растворитель на роторном испарителе в вакууме. После удаления растворителя на стенках колбы образуется тонкая пленка смеси липидов, которую диспергируют в 2 мл 10^-2 М боратного буфера с рН 9,2. Получают опалесцирующий раствор липидов в буферном растворе, на который затем воздействуют ультразвуком частоты 22 кГц в течение 400 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают 2 мл суспензии анионных бислойных везикул в водурастворимой среде с концентрацией 1,22 мг/мл.

Иммобилизованные бислойные везикулы получают путем смешения 1,4 мл суспензии ранее полученных анионынных бислойных везикул с 0,2 мл суспензии ранее полученного катионного носителя. Целостность иммобилизованных везикул и катионного носителя доказывают аналогично примеру 1.

Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Пример 4.

Опыт проводят при комнатной температуре.

Носитель получают из смеси катионного липида и липида, содержащего ковалентно связанный ПЭГ, следующим образом. Смесь 0,8 мл 0,1 вес.% раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в растворителе - метаноле и 2,4 мл 0,1 вес.% раствора липида, содержащего коваленто связанный ПЭГ, дипальмитоилфосфоэтаноламинметоксиполиэтленгликоля550 в метаноле помещают в круглодонную стеклянную колбу и удаляют метанол на роторном испарителе в вакууме. После удаления метанола на стенках колбы образуется тонкая пленка смеси липидов, которую диспергируют в 2 мл 10^-2 М фосфатного буфера с рН 7. Получают опалесцирующий раствор смеси липидов в буферном растворе, на который затем воздействуют ультразвуком частоты 22 кГц в течение 400 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают 2 мл суспензии катионного носителя в водосодержащем растворе с концентрацией 1,6 мг/мл.

Иммобилизуемые бислойные везикулы получают из смеси анионного липида, электронейтрального липида и липида, содержащего коваленто связанный ПЭГ, следующим образом. Тройную смесь 0,1 мл 0,1 вес.% раствора анионного липида натриевой соли дилауроилфосфоглицерола в растворителе - хлороформе, 1,5 мл 0,1 вес.% раствора электронейтрального липида яичного лецитина в хлороформе и 1,5 мл 0,1 вес.% раствора октаноилсфингозин-сукцинилметоксиполиэтилен-гликоля 750 в хлороформе помещают в круглодонную стеклянную колбу и удаляют растворитель на роторном испарителе в вакууме. После удаления хлороформа на стенках колбы образуется тонкая пленка смеси липидов, которую диспергируют в 2 мл 10^-2 М фосфатного буфера с рН 7. Получают опалесцирующий раствор смеси липидов в буферном растворе, на который затем воздействуют ультразвуком частоты 22 кГц в течение 400 с при постоянном охлаждении колбы проточной водой. Получают 2 мл суспензии анионных бислойных везикул в водосодержащем растворе с концентрацией 1,4 мг/мл.

Иммобилизованные бислойные везикулы получают путем смешения 3 мл суспензии ранее полученных анионных бислойных везикул с 0,5 мл суспензии ранее полученного катионного носителя. Целостность иммобилизованных везикул и катионного носителя доказывают аналогично примеру 1.

Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Пример 5.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако при получении носителя используют смесь 2 мл 0,1 вес.% раствора димиристоилтриметилпропиламмоний хлорида в растворителе - метаноле и 2 мл 0,1 вес.% раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в метаноле.

Целостность иммобилизованных везикул и катионного носителя доказывают аналогично примеру 1.

Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Пример 6.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако при получении носителя используют смесь 2 мл 0,1 вес.% раствора димиристоилтриметилпропиламмоний хлорида в растворителе - метаноле, 2 мл 0,1 вес.% раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в метаноле и 1,8 мл 0,1 вес.% раствора катионного липида димиристоилдиметиламмонийпропана в растворителе - метаноле.

Целостность иммобилизованных везикул и катионного носителя доказывают аналогично примеру 1.

Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Целостность иммобилизованных везикул и катионного носителя доказывают аналогично примеру 1.

Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Пример 7.

Опыт проводят аналогично примеру 2, однако, носитель получают, используя тройную смесь, содержащую 1,4 мл 0,1 вес.% раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в растворителе - метаноле, 1,2 мл 0,1 вес.% раствора липида, содержащего ковалентно связанного ПЭГ, дипальмитоилфосфоэтаноламин-метоксиполиэтиленгликоля 550 в метаноле и 1,24 мл 0,1 вес.% раствора липида, содержащего ковалентно связанный ПЭГ, октаноилсфингозин-сукцинилметоксиполиэтиленгликоля 750 в метаноле. Целостность иммобилизованных везикул и катионного носителя доказывают аналогично примеру 1.

Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Пример 8.

Опыт проводят аналогично примеру 7, однако, при получении катонного носителя используют смесь, состоящую из пяти липидов, содержащую 1,4 мл 0,1 вес.% раствора катионного липида диметилдиоктадециламмоний бромида в растворителе - метаноле, 1,2 мл 0,1 вес.% раствора липида, содержащего ковалентно связанного ПЭГ, дипальмитоилфосфоэтаноламин-метоксиполиэтиленгликоля 550 в метаноле и 1,24 мл 0,1 вес.% раствора липида, содержащего ковалентно связанный ПЭГ, октаноилсфингозин-сукцинилметоксиполиэтиленгликоля 750 в метаноле и 1 мл 0,1 вес.% раствора цетилового эфира полиэтиленгликоля 20 в метаноле. Целостность иммобилизованных везикул и катионного носителя доказывают аналогично примеру 1.

Методом криогенной просвечивающей микроскопии доказывают, что полученный продукт сохраняет свою морфологию в течение нескольких дней.

Таким образом, из приведенных примеров действительно видно, что предложенный способ действительно упрощает известный способ получения иммобилизованных бислойных везикул и расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для получения иммобилизованных бислойных везикул.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Предложен способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки катионного носителя суспензией анионных бислойных везикул в водосодержащей среде. В предложенном способе носитель и/или иммобилизуемые везикулы содержат ковалентно связанный полиэтиленгликоль (ПЭГ), при этом носитель содержит по крайней мере один катионный липид или его смесь с по крайней мере с одним липидом, содержащим ковалентно связанный полиэтиленгликоль. Предложенный способ является более простым в выполнении по сравнению с известными способами получения иммобилизованных бислойных везикул. 8 пр.

Способ получения иммобилизованных бислойных везикул путем обработки катионного носителя суспензией анионных бислойных везикул в водосодержащей среде, отличающийся тем, что носитель и/или иммобилизуемые везикулы содержат ковалентно связанный полиэтиленгликоль, а в качестве носителя используют везикулы, содержащие по крайней мере один катионный липид или его смесь по крайней мере с одним липидом, содержащим ковалентно связанный полиэтиленгликоль, причем на одну частицу носителя приходится не менее двух иммобилизованных везикул.