СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно - к лабораторной диагностике иммунологическими методами, и может быть использовано для выявления больного и инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Известен гематологический способ выявления больного лейкозом крупного рогатого скота, включающий предварительное выявление животных, положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии (РИД), основанное на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Животных, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД, признают зараженными вирусом лейкоза и исследуют гематологическим методом, заключающимся в подсчете лейкоцитов в единице объема крови. При обнаружении повышенного их количества выводят лейкоцитарную формулу и оценивают статус животного по лейкозу согласно «лейкозному ключу» как здорового, подозрительного по заболеванию лейкозом или больного лейкозом. Больных животных выводят из стада [Методические указания по диагностике лейкоза крупного скота / Департамент ветеринарии, Минсельхоз России - 2000 - №13-7-2/2130].

Используемый для прижизненной диагностики гематологический метод позволяет выявить только 60-65% больных лейкозом. 35-40% животных не имеют лейкозных изменений, и это затрудняет эффект проводимых оздоровительных мероприятий. Из хозяйств выбывают животные с лейкемоидными реакциями, а больные лейкозом нередко остаются [Нахмансон В.М. Меры профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота из генетически устойчивых линий и семейств [В.М.Нахмансон, Е.А.Дун и др. // Тр. ВИЭВ. - 1986. - Т.59. - С.82-86].

При некоторых патологических состояниях, таких как лимфогранулематоз, онкологические заболевания, кратковременная инкубация лимфоцитов in vitro в среде с левамизолом приводит к повышению числа Е-РОК, что свидетельствует о модификации рецепторов к эритроцитам барана на Т-лимфоцитах больных. Авторы рассматривают наблюдавшийся эффект как свидетельство устранения блокады Т-клеток [Дондоладзе М.Б. Анализ диагностической значимости модификации поверхности Т-клеток при лимфопролиферативных заболеваниях / М.Б.Дондоладзе, А.А.Ярилин, Н.З.Пирадашвили // Иммунология. - 1986. - №2. - С.66-68].

Известен способ определения чувствительности лимфоцитов к левамизолу [авторское свидетельство СССР SU №1064952; МПК A61K 39/00], который предусматривает использование левамизола в концентрации 0,01 мкг/мл среды.

Наиболее близким к изобретению является способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий выявление положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных и гематологический метод исследования, у инфицированных животных определяют процентное содержание общего числа лимфоцитов в мазке крови и Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, определяют коэффициент отношения (К_о) содержания лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов, при К_о, равном 4,3 и более, животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота и выводят из стада [патент РФ RU №2379683; МПК G01N 33/48].

Недостатком метода является то, что сниженная экспрессия рецепторов к эритроцитам барана Т-лимфоцитов может наблюдаться при многих инфекционных заболеваниях и других состояниях организма, сопровождающихся вторичными иммунодефицитами. Введение иммуномодуляторов, стимулирующих Т-систему организма, также затрудняет выявление животных с повышенным риском к заболеванию лейкозом.

Техническим результатом является повышение точности и достоверности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Указанный технический результат достигается тем, что способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота включает выявление положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных, гематологический метод исследования, у инфицированных животных определение процентного содержания Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, дополнительно в крови определяют процентное содержание Т-лимфоцитов после инкубации с левамизолом в конечной концентрации 0,5 мкг/мл с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, вычисляют индекс сдвига (ИС) по формуле:

при ИС, равном 1,2 и более, животное считают больным лейкозом крупного рогатого скота и выводят из стада.

Способ осуществляется следующим образом. У животных осуществляют забор проб крови, выявляют положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных, проводят гематологический метод исследования, определяют процентное содержание Т-лимфоцитов, используя реакцию спонтанного розеткообразования (Е-РОК). Реакцию ставят параллельно с двумя пробами лимфоцитов: чистой взвесью (контрольная) и с обработанными левамизолом (опытная). Лимфоциты опытной пробы обрабатывают левамизолом в концентрации 0,5 мкг/мл среды 199, содержащей 1·10⁵ лимфоцитов, и инкубируют 1 час при 37°C.

Постановку реакции Е-розеткообразования проводят путем 5-минутного центрифугирования смеси суспензии лимфоцитов с 0,4%-ной взвесью эритроцитов барана и двухэтапной инкубацией: 30 мин в термостате при 37°C и 18-20 ч в холодильнике при 10°C.

В опытной и контрольной группах подсчитывают процент розеток и высчитывают индекс сдвига (ИС), вызванного инкубацией с левамизолом, при ИС, равном 1,2 и более, животное считают больным лейкозом крупного рогатого скота и выводят из стада.

Вычисление индекса сдвига (ИС) применяется для оценки влияния левамизола на активность клеток в тесте [Лебедев К.А. Иммунная недостаточность (выявление и лечение) / К.А.Лебедев, И.Д.Понякина. - М.: Медицинская книга, Н.Новгород: Изд-во НГМА, 2003. - С.405-407].

Увеличение ИС свидетельствует о наличии Т-клеточного дефицита, вызванного вирусом лейкоза крупного рогатого скота. Если ИС≤1,0, то животное считают здоровым, если ИС≥1,2, то животное считают больным.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. В неблагополучном по лейкозу хозяйстве исследуют 20 коров, из которых формируют 3 группы: 1 группа - 6 коров вирусоносителей (РИД-положительные); 2 группа - 4 больные коровы, положительно реагирующие в РИД и подтвержденные гематологическим методом исследования, и 3 группа - 10 здоровых (не реагирующих в РИД) коров. В периферической крови определяют число Т-лимфоцитов с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) при постановке реакции со средой №199 (контроль), а также количество Е-РОК при воздействии левамизола in vitro, используя различные его концентрации: 50 мкг/мл, 0,5 мкг/мл и 0,01 мкг/мл.

Определение чувствительности лимфоцитов к левамизолу осуществляли по методике В.В.Казимирчука с соавторами [авторское свидетельство SU №1064952, МПК A61K 39/00], по мнению авторов, оптимальной концентрацией левамизола при исследовании чувствительности к ним лимфоцитов (in vitro) является 0,01 мкг/мл.

Другими исследователями для изучения действия левамизола in vitro на Т-лимфоциты у больных лимфогранулематозом людей предлагается использовать концентрацию 50 мкг/мл [Пантелеева Е.С. О причинах дефицита Т-лимфоцитов периферической крови у больных лимфогранулематозом / Е.С.Пантелеева, А.А.Ярилин, Г.С.Неприна, Г.Д.Байсоголов // Иммунология. - 1981. - №1. - С.70-74].

С целью выбора оптимальной концентрации для изучения действия левамизола in vitro на Т-лимфоциты носителей ВЛКРС и больных лейкозом коров были взяты различные концентрации препарата (табл.1).

Из таблицы 1 видно, что при определении чувствительности in vitro Е-РОК к левамизолу в концентрации 50 мкг/мл отмечено подавление розеткообразования у животных всех групп, наиболее выраженное при повышенном уровне этих клеток в периферической крови (РИД-отрицательные).

Таблица 1. Изучение действия различных концентраций левамизола в реакции Е-РОК на лимфоциты in vitro у крупного рогатого скота с разной степенью компрометации к лейкозу Группа животных Символы статисти-
ки Е-РОК, % Контроль(без левамизола) с левамизолом, мкг/мл 50 0,5 0,01 Вирусоносители M±m 20,16±1,08 12,66±1,3 32,83±3,34 21,16±2,36 (РИД+) P   <0,001 <0,01 >0,05 Гембольные M±m 19,5±2,06 15,0±1,15 32,0±1,22 21,25±2,53   P   >0,05 <0,01 >0,05 Здоровые (РИД-) M±m 30,0±2,30 10,7±1,50 22,8±2,84 19,8±1,92   P   <0,001 >0,05 <0,01

При воздействии левамизола на Т-лимфоциты in vitro в концентрации 0,5 мкг/мл у вирусоносителей и больных лейкозом животных наблюдается достоверное повышение Т-розеткообразования, тогда как у РИД-отрицательных их количество оказалось сниженным.

Концентрация левамизола 0,01 мкг/мл существенно не повышала количества Е-РОК у вирусоносителей и больных лейкозом коров, в то же время подавляла розеткообразование у РИД-отрицательных животных.

Таким образом, для изучения чувствительности in vitro Е-РОК к левамизолу у носителей вируса лейкоза и больных лейкозом животных предпочтительно применение препарата в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. При использовании этой концентрации препарата происходит стимуляция in vitro Т-лимфоцитов у животных со сниженным уровнем этих клеток в периферической крови (вирусоносители и больные), в то же время существенного влияния на лимфоциты здоровых животных не выявлено. Это может являться прогностическим критерием для характеристики индивидуально больных.

Пример 2. Исследуют 40 коров и по результатам серологических (РИД) и гематологических исследований разделяют на 3 группы: 1-я - 11 коров носителей вируса лейкоза крупного рогатого скота (РИД-положительные); 2-я - 12 больных лейкозом коров; 3-я - 17 здоровых, не реагирующих в РИД животных. Проводят исследование крови путем постановки реакции розеткообразования параллельно с двумя пробами лимфоцитов: чистой взвесью (контрольная) и с обработанными левамизолом (опытная). Лимфоциты опытной пробы обрабатывают левамизолом в концентрации 0,5 мкг/мл среды 199, содержащей 1·10⁵ лимфоцитов, и инкубируют 1 час при 37°C. Затем вычисляют индекс сдвига по формуле: ИС=%Е-РОК после инкубации с левамизолом/% Е-РОК до инкубации с левамизолом.

Также проводят исследование крови известным способом [патент RU №2379683, МПК G01N 33/48], выводя коэффициент отношения количества общего числа лимфоцитов к количеству Т-лимфоцитов (табл.2).

Таблица 2. Сравнительная характеристика иммунного статуса крупного рогатого скота с разной степенью компрометации к лейкозу, проведенная по известному и предлагаемому способу, М±m Изучаемые величины Здоровые Вирусоносители P Больные P Индекс сдвига 0,56±0,07 2,45±0,33 <0,001 2,12±0,22 <0,001 Коэффициент отношения (прототип) 2,68±0,28 7,70±1,70 <0,01 7,37±1,15 <0,01

Из таблицы 2 видно, что индекс нагрузки у носителей вируса лейкоза и больных по отношению к здоровым животным с высокой степенью достоверности увеличивается (Р<0,001). Также достоверно увеличивается у инфицированных и больных животных коэффициент отношения.

При анализе изучаемых величин у каждого отдельного животного устанавливают, что ИС среди здоровых животных не превышает 0,95, в то же время среди вирусоносителей и больных животных составлял от 1,2 и выше. Следует отметить, что коэффициент отношения у всех гематологически больных и у большинства вирусоносителей составил ≥4,3.

В таблице 3 представлены результаты исследований животных, проведенных по известному и предлагаемому способу, в зависимости от степени компрометации к лейкозу.

Таблица 3. Результаты исследования животных, проведенных по известному и предлагаемому способу Группа животных Количество животных Выявлено известный способ Предлагаемый способ дополнительно ИС≤1,2 ИС≥1,2 животных % Вирусоносители (РИД+) 11 8 - 11 - - Гембольные 12 12 - 12 - - Здоровые (РИД-) 17 3 12 5 2 11,8

Полученные результаты подтверждают, что предлагаемый способ диагностики лейкоза наиболее точен и достоверен, так как подтвердил диагноз у всех носителей вируса лейкоза и больных лейкозом животных (табл.3). Также удалось дополнительно выявить 2 (11,8%) больных коров среди не реагирующих в РИД.

Пример 3. Проводят опыт на 20-ти коровах, которым 3 месяца ранее был введен иммуномодулятор, стимулирующий Т-систему организма.

Проводят исследование крови путем постановки реакции розеткообразования параллельно с двумя пробами лимфоцитов: чистой взвесью (контрольная) и с обработанными левамизолом (опытная). Затем вычисляют индекс сдвига. Также проводят серологические, гематологические исследования и высчитывают коэффициент отношения по известному способу.

Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты исследования животных неблагополучного стада после предварительного введения иммуномодулятора, стимулирующего Т-систему организма, с использованием различных способов диагностики лейкоза Количество животных Выявлено Дополнительно РИД+ Гематологически Известный способ Предлагаемый способ животных % 20 7 2 2 7 2 10

Из таблицы 4 видно, что исследование животных с помощью известного способа через 3 месяца после введения иммуномодулятора, стимулирующего Т-систему организма, затрудняет диагностику, о чем свидетельствуют только 2 выявленных из 7 инфицированных животных, тогда как предлагаемый способ позволил выявить 5 из 7 инфицированных животных, а также 2 дополнительно.

Предлагаемый способ диагностики крупного рогатого скота выявляет на 11,8% больше животных больных лейкозом крупного рогатого скота, является более точным и повышает достоверность. Также может быть успешно использован для диагностики лейкоза у животных, которым были введены иммуностимулирующие средства.

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, выявление положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных, гематологический метод исследования. определение процентного содержания Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (%Е-РОК). Дополнительно в крови определяют процентное содержание Т-лимфоцитов после инкубации с левамизолом в конечной концентрации 0,5 мкг/мл с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана. Затем вычисляют индекс сдвига (ИС) по формуле:

% Е - РОК до инкубации с левамизолом при ИС, равном 1, 2 и более, животное считают больным лейкозом крупного рогатого скота и выводят из стада. Изобретение обеспечивает повышение точности и достоверности диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Способ диагностики выявляет на 11,8% больше животных, больных лейкозом крупного рогатого скота, является более точным и повышает достоверность. Способ может быть использован для диагностики лейкоза у животных, которым были введены иммуностимулирующие средства. 4 табл., 3 пр.

Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий выявление положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных, гематологический метод исследования, у инфицированных животных определение процентного содержания Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (%Е-РОК), отличающийся тем, что дополнительно в крови определяют процентное содержание Т-лимфоцитов после инкубации с левамизолом в конечной концентрации 0,5 мкг/мл с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, вычисляют индекс сдвига (ИС) по формуле

при ИС, равном 1, 2 и более, животное считают больным лейкозом крупного рогатого скота и выводят из стада.