Продуцент кортизола Российский патент 2020 года по МПК C12P1/04 A61K31/573 C12N1/20 C12R1/85 

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 №-12401 может быть использован для получения кортизола.

Кортизол относится к группе глюкокортикоидов. В основном их получают синтетическим и полусентетическим путем (Лавин Н. Эндокринология. Практическое руководство Москва. - "Практика". - 1999. - 1128 с).

Известны микробиологические способы получения кортизола с использованием гриба Tieghemella orchidie шт. 233 (Патент №370229), Mycobaterium globiforme 193 (Патент № SU(11)376440), Arthrobacter globiformis 193 (Патент №2156302), Arthrobacter, Corynebacterium, Bacillus, Nocardia, Streptomyces и др. (Charney W., Herzog H. Microbial transformation of Steroids. Academic Press. Inc. New York. 1967, pp.236-261), Nocardioides simplex BKM Ас-2033Д (Патент № RU 2447154).

Во всех приведенных выше патентах получение конечного клюкокортикоида достигается микробиологической биотрансформацией стероидов, введенных в питательную среду различных микроорганизмов. По завершению процесса биотрансформации конечный продукт выделяют различными биохимическими методами. Сами микроорганизмы, используемые для биотрансформации стероидов, осуществляют дегидрирование стероидов и не являются продуцентами глюкокортикостероидов.

Задачей изобретения является получение средства для продуцирования кортизола.

Указанная задача решается тем, что в качестве продуцента кортизола используется выделенный из образцов многолетнемерзлых пород галоценового периода штамм бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9.

Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за № В-12401 (копия справки о депонировании прилагается). Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 выделен из многолетнемерзлых пород (серого ожелезненного песка ниже торфяного горизонта, глубина места отбора пробы 2 м ниже берегового растительного покрова) правого берега реки Чара на 9 км выше по течению реки от поселка Новая Чара (Читинская обл.), координаты: N560 45, 688', Е 1180 11, 440'.

Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма Bacillus cereus 9-08-СН9. Колонии на ГРМ-агаре матовые, шероховатые, мелкие, с неровным краем. Грамположительные палочки имеют центральное расположение споры.

Условия и состав сред для выращивания штамма Bacillus cereus 9-08-СН9. Культивирование указанного штамма осуществляют в термостате посевом клеток бактерий штрихом в стандартные пробирки на скошенный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар (г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006)) или питательный агар для культивирования широкого спектра микроорганизмов (ООО «НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич, ТУ 9385-001-64786015-2012)) в аэробных условиях, в термостате при t° от +25 до +36°С 18-24 часа. Все работы по культивированию осуществляют при соблюдении стерильности.

Физиолого-биохимические особенности штамма Bacillus cereus 9-08-СН9: каталаза+, оксидаза+, рост на ЖСА+, лецитиназа-, желатиназа-, кровяной агар+, гемолиз+, МПБ+, МПА+, анаэробный рост-, рост на нитратной среде+, глюкоза K+, арабиноза K+, ксилоза K+, крахмал-, казеин+, восстановление нитратов+, сероводород-, индол-.

Чувствительность к антибиотикам штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401. Заявляемый штамм чувствителен к пенициллину, эритромицину, налидиксовой кислоте, линкомицину, устойчив к стрептомицину.

Срок хранения высеянного в пробирки на питательную среду штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 в холодильнике (2°С - 5°С) 2 месяца.

Штамм бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 не является зоопатогенным или фитопатогенным.

Достижение указанного технического результата изобретения проводилось следующим образом.

Культивирование штамма бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 осуществляли по описанной ниже методике. Штамм бактерий высевали штрихом в пробирки на скошенный, приготовленный стандартным методом, питательный агар (ГРМ-агар, г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) и культивировали в термостате 48 часа при t=26°С. Затем производили смыв микроорганизмов из каждой пробирки 5 мл дистиллированной воды. Концентрацию микроорганизмов определяли культуральным методом серийных разведений по количеству КОЕ на агаризованной питательной среде в чашках Петри (Герхард, 1984). После определения количества клеток бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 в исходной маточной суспензии плотность культур доводили до рабочей концентрации в 1-3 × 10⁹ КОЕ в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Суспензию бактериальных клеток в дистиллированной воде инкубировали в термостате при t = 26°С в течение 3х суток, после чего ее центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут.

Определение кортизола осуществляли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). По данным С.Д. Зайко. ведущего специалиста по продукции ЗАО «АНАЛИТИКА», сравнительные исследования показывают высокую степень корреляции результатов ИФА с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии (Определение биогенных аминов в лабораторной практике. С.Д. Зайко / Клинико-лабораторный консилиум, 2009, том 4 (29), с. 54-60.)

Для определения кортизола использовали «Набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации кортизола в сыворотке крови», КОРТИЗОЛ-ИФА-БЕСТ, набор реагентов Х-3964, производства АО «ВЕКТОР-БЕСТ», г. Новосибирск. Инструкция по применению утверждена 03.03.2011, Приказом Росздравнадзора №960-Пр/11.

Определение концентрации кортизола в супрнатанте клеток бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 производилась в четырех независимых пробах.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программы «SPSS ver. 11.5. for Windows».

Результаты измерений концентрации кортизола приведены в таблице 1.

Референтное значение содержания кортизола в сыворотке крови здорового человека 160-670 нмоль/л

Результаты определения концентрации кортизола в супернатанте клеток бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 показали, что они находятся на уровне референтных значений концентраций данных веществ в биологических жидкостях здорового человека.

Заявленное изобретение позволяет использовать штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 в разработке биотехнологических процессов в качестве продуцента кортизола и для создания биопрепаратов на его основе с направленным действием.

Приведенные результаты исследования подтверждают достижение технического результата и соответствие заявленного штамма критериям новизна, изобретательский уровень, промышленная применимость.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено средство для получения кортизола - штамм Bacillus cereus ВКПМ В-12401, продуцирующий глюкокортикостероиды. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для получения кортизола, используемого в биологических препаратах. 1 табл.

Применение штамма Bacillus cereus 9-08-СН9, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под номером В-12401, для получения кортизола.