Штамм Bacillus cereus - продуцент серотонина Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A61K31/4045 C12R1/85 

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 №-12401 может быть использован для получения серотонина.

Известно, что продукция серотонина достаточно распространена в микробном мире, включая представителей симбиотической и паразитической микробиоты животных и человека. Серотонин способны продуцировать Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus и определено высокое содержание серотонина в культурах бактерий Morganella morganii, Klebsiella pneumonia и Hafnia alvei (Олескин А.В., Эль-Регистан Г.И., Шендеров Б.А. Межмикробные химические взаимодействия и диалог микробиота-хозяин: роль нейромедиаторов // Микробиология, 2016, том 85, №1, с. 3-25).

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении средства для продуцирования серотонина

Указанный технический результат достигается тем, что в качестве продуцента серотонина используется выделенный из образцов многолетнемерзлых пород галоценового периода штамм бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9.

Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика за №В-12401 (копия справки о депонировании прилагается), Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 выделен из многолетнемерзлых пород (из серого ожелезненного песка ниже торфяного горизонта, глубина места отбора пробы 2 м ниже берегового растительного покрова) при отборе проб с правого берега реки Чара на 9 км выше по течению реки от поселка Новая Чара (Читинская обл.), координаты: (N560 45. 688', Е 1180 11, 440').

Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма Bacillus cereus 9-08-СН9.

Колонии на ГРМ-агаре матовые, шероховатые, мелкие, с неровным краем.

Грамположительные палочки имеют центральное расположение споры.

Условия и состав сред для выращивания штамма Bacillus cereus 9-08-СН9. Культивирование указанного штамма осуществляют в термостате посевом клеток бактерий штрихом в стандартные пробирки на скошенный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар (г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) или питательный агар для культивирования широкого спектра микроорганизмов (ООО «НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич. ТУ 9385-001-64786015-2012)) в аэробных условиях, в термостате при t° от +25 до +36°С 18-24 часа. Все работы по культивированию осуществляют при соблюдении стерильности.

Физиолого-биохимические особенности штамма Bacillus cereus 9-08-СН9: каталаза+, оксидаза+, рост на ЖСА+, лецитиназа-, желатиназа-, кровяной агар+, гемолиз+, МПБ+, МПА+, анаэробный рост-, рост на цитратной среде+, глюкоза K+, арабиноза К+, ксилоза К+, крахмал-, казеин+, восстановление нитратов+, сероводород-, индол-.

Чувствительность к антибиотикам: штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 №В-12401. Заявляемый штамм чувствителен к пенициллину, эритромицину, налидиксовой кислоте, линкомицину. устойчив к стрептомицину.

Срок хранения высеянного в пробирки на питательную среду штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 №В-12401 в холодильнике (2°С-5°С) 2 месяца.

Штамм бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9, №В-12401 не является зоопатогенным или фитопатогенным.

Достижение указанного технического результата изобретения проводилось следующим образом.

Культивирование штамма бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 осуществляли по описанной ниже методике. Штамм бактерий высевали штрихом в пробирки на скошенный, приготовленный стандартным методом, питательный агар (ГРМ-агар, г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) и культивировали в термостате 48 часа при t=26°C. Затем производили смыв микроорганизмов из каждой пробирки 5 мл дистиллированной воды. Концентрацию микроорганизмов определяли культуральным методом серийных разведений по количеству КОЕ на агаризованной питательной среде в чашках Петри (Герхард, 1984). После определения количества клеток бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 в исходной маточной суспензии плотность культур доводили до рабочей концентрации в 1-3⋅10⁹ КОЕ в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Суспензию бактериальных клеток в дистиллированной воде инкубировали в термостате при t=26°С в течение 3 суток, после чего ее центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут.

Определение биогенного амина серотонина осуществляли методом иммуноферментного анализа (ИФА). По данным С.Д. Зайко, ведущего специалиста по продукции ЗАО «АНАЛИТИКА», сравнительные исследования показывают высокую степень корреляции результатов ИФА с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии. (Определение биогенных аминов в лабораторной практике. С.Д. Зайко / Клинико-лабораторный консилиум, 2009, том 4 (29), с. 54-60.)

Для определения серотонина использовали «Набор реагентов для определения серотонина в сыворотке крови и тромбоцитах (Strotonin ELISA Fast Track)»; номер по каталогу: ВАЕ-8900; производитель Labor Diagnostika nord GmbH & Co.Kg, Германия.

Определение концентрации серотонина в супернатанте клеток бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 производилась в четырех независимых пробах.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программы «SPSS ver. 11.5. for Windows».

Результаты измерений концентрации серотонина и кортизола в ИФА приведены в таблицах 1.

Референтное значение содержания серотонина в сыворотке крови здорового человека от 70 до 270 нг/мл

Результаты определения концентрации серотонина в супернатанте клеток бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 показали, что они находятся на уровне референтных значений концентраций данных веществ в биологических жидкостях здорового человека.

Приведенные результаты исследования подтверждают достижение технического результата и соответствие заявленного штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 критериям новизна, изобретательский уровень, промышленная применимость.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Bacillus cereus, обладающий способностью продуцировать серотонин, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным номером B-12401. Изобретение направлено на получение нового штамма, обеспечивающего получение серотонина. 1 табл.

Штамм микроорганизмов Bacillus cereus 9-08-СН9, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным номером В-12401, в качестве продуцента серотонина.