Продуцент дофамина Российский патент 2020 года по МПК C12P1/04 C12N1/20 A61K31/56 C12R1/85 

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 №-12401 может быть использован для получения дофамина.

Известно, что продукция дофамина достаточно распространена в микробном мире, включая представителей симбиотической и паразитической микробиоты животных и человека. Дофамин способны продуцировать Bacillus spp (Кожиева М.Х., Мельников М.В., Роговский B.C., Олескин А.В., Кабилов М.Р., Бойко А.Н. Кишечная микробиота человека и рассеянный склероз // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Спецвыпуски. 2017; 117(10): с. 11-19).

Известно, что дофамин способны продуцировать Bacillus cereus, В. mycoides, В. subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Saccharomyces cerevisiae. (Олескин А.В., Эль-Регистан Г.И., Шендеров Б.А. Межмикробные химические взаимодействия и диалог микробиота-хозяин: роль нейромедиаторов // Микробиология, 2016, том 85, №1, с. 3-25).

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении средства для продуцирования дофамина.

Указанный технический результат достигается тем, что в качестве продуцента дофамина используется выделенный из образцов многолетнемерзлых пород галоценового периода штамм бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9.

Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика за № В-12401 (копия справки о депонировании прилагается). Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 выделен из многолетнемерзлых пород (серого ожелезненного песка ниже торфяного горизонта, глубина места отбора пробы 2 м ниже берегового растительного покрова) правого берега реки Чара на 9 км выше по течению реки от поселка Новая Чара (Читинская обл.), координаты: N560 45, 688', Е 1180 11, 440'.

Штамм Bacillus cereus 9-08-СН9 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма Bacillus cereus 9-08-СН9. Колонии на ГРМ-агаре матовые, шероховатые, мелкие, с неровным краем. Грамположительные палочки имеют центральное расположение споры.

Условия и состав сред для выращивания штамма Bacillus cereus 9-08-СН9. Культивирование указанного штамма осуществляют в термостате посевом клеток бактерий штрихом в стандартные пробирки на скошенный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар (г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006)) или питательный агар для культивирования широкого спектра микроорганизмов (ООО «НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич, ТУ 9385-001-64786015-2012)) в аэробных условиях, в термостате при t° от +25 до +36°С 18-24 часа. Все работы по культивированию осуществляют при соблюдении стерильности.

Физиолого-биохимические особенности штамма Bacillus cereus 9-08-СН9: каталаза+, оксидаза+, рост на ЖСА+, лецитиназа-, желатиназа-, кровяной агар+, гемолиз+, МПБ+, МПА+, анаэробный рост-, рост на нитратной среде+, глюкоза K+, арабиноза К+, ксилоза К+, крахмал-, казеин+, восстановление нитратов+, сероводород-, индол-.

Чувствительность к антибиотикам штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401. Заявляемый штамм чувствителен к пенициллину, эритромицину, налидиксовой кислоте, линкомицину, устойчив к стрептомицину.

Срок хранения высеянного в пробирки на питательную среду штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 в холодильнике (2°С-5°С) 2 месяца.

Штамм бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 № В-12401 не является зоопатогенным или фитопатогенным.

Достижение указанного технического результата изобретения проводилось следующим образом.

Культивирование штамма бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 осуществляли по описанной ниже методике. Штамм бактерий высевали штрихом в пробирки на скошенный, приготовленный стандартным методом, питательный агар (ГРМ-агар, г. Оболенск, ТУ 9398-020-78095326-2006) и культивировали в термостате 48 часа при t=26°С. Затем производили смыв микроорганизмов из каждой пробирки 5 мл дистиллированной воды. Концентрацию микроорганизмов определяли культуральным методом серийных разведений по количеству КОЕ на агаризованной питательной среде в чашках Петри (Герхард, 1984). После определения количества клеток бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 в исходной маточной суспензии плотность культур доводили до рабочей концентрации в 1-3×10⁹ КОЕ в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Суспензию бактериальных клеток в дистиллированной воде инкубировали в термостате при t=26°С в течение 3х суток, после чего ее центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут.

Определение дофамина производили методом иммуноферментного анализа (ИФА). По данным С.Д. Зайко, ведущего специалиста по продукции ЗАО «АНАЛИТИКА», сравнительные исследования показывают высокую степень корреляции результатов ИФА с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии (Определение биогенных аминов в лабораторной практике. С.Д. Зайко / Клинико-лабораторный консилиум, 2009, том 4 (29), с. 54-60.)

Для определения дофамина использовали «Набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации дофамина в плазме крови и моче (Dopamin ELISA Fast Track)»; номер по каталогу: ВАЕ-6300; производитель Labor Diagnostika nord GmbH & Co. Kg, Германия.

Определение концентрации дофамина в супернатанте клеток бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 производилась в четырех независимых пробах по методике, указанной в «Наборе реагентов для иммуноферментного определения концентрации дофамина в плазме крови и моче (Dopamin ELISA Fast Track)».

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программы «SPSS ver. 11.5. for Windows».

Результаты измерений концентрации дофамина в супернатанте клеток бактерий в реакции ИФА приведены в таблице 1.

Результаты определения концентрации дофамина в супернатанте бактерий Bacillus cereus 9-08-СН9 показали, что они находятся на уровне референтных значений концентраций данных веществ в биологических жидкостях здорового человека.

Заявленное изобретение позволяет использовать штамм Bacillus cereus 9-08-СН9, выделенный из многолетнемерзлых пород, в разработке биотехнологических процессов в качестве продуцента дофамина и для создания на его основе биопрепаратов с направленным действием.

Приведенные результаты исследования подтверждают достижение технического результата и соответствие заявленного штамма Bacillus cereus 9-08-СН9 критериям новизна, изобретательский уровень, промышленная применимость.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено средство для получения дофамина - штамм Bacillus cereus ВКПМ В-12401, продуцирующий дофамин. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для получения дофамина, используемого в биологических препаратах направленного действия. 1 табл.

Применение штамма микроорганизмов Bacillus cereus 9-08-СН9, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика под регистрационным номером В-12401, для получения дофамина.