СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДА ЭНДОМЕТРИОИДНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ ЯИЧНИКОВ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, к лабораторной диагностике в гинекологии.

Известно, что эндометриоз яичников согласно современным представлениям является мультифакторным дисгормональным иммунозависимым и генетически детерминированным заболеванием, характеризующимся присутствием эктопического эндометрия с признаками клеточной активности и его разрастанием. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению этиологии и патогенеза эндометриоидных поражений, до настоящего времени не существует единой теории происхождения эндометриоза, точно также как и механизмы его развития до конца не ясны, что затрудняет поиск эффективных методов профилактики и лечения. Лечение больных эндометриозом представляет собой одну из важнейших проблем современной гинекологии, поскольку не существует единого подхода и универсального метода терапии, который был бы абсолютно эффективным в отношении симптомов заболевания и гарантировал бы отсутствие рецидивов.

В результате исследований [Савельева Г.М., Соломатина А.А., Михалева Л.М. и др. соавт. Еще раз о терминологии эндометриоидных образований яичника // Акуш. и гинекол. - 2005. - №6. - С. 33], [Пашкова А.В. Клинико-морфологические параметры эндометриоза яичников. Диагностика и терапия // Автореф. дисс. …канд. мед. наук. М., 2004], [Дурасова Е.Н., Клинико-морфологические варианты и молекулярные особенности эндометриоза яичников // Автореф. дисс. …канд. мед. наук. М., 2011] установлено, что терминами «эндометриома» и «эндометриоидная киста» целесообразно обозначать различные гистологические варианты эндометриоидных образований яичников - железисто-кистозный и кистозный.

Описаны различные лабораторные методы диагностики при эндометриозе.

Известен СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОМЕТРИОИДНЫХ КИСТ ЯИЧНИКОВ (RU 2480761 С1, Ширинг и др., 27.04.2013), который включает исследование сыворотки крови, где у пациенток при наличии кисты яичника колориметрическим методом определяют активность аргиназы и при ее величине 0,73 ммоль/ч/л и выше диагностируют эндометриоидные кисты яичников. Однако этот способ не предусматривает диагностику морфологических форм эндометриоидных образований яичников в зависимости от их типов: кистозного и железисто-кистозного. Описан СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ К ГИСТЕРЭКТОМИИ ПРИ ГИПЕРПЛАЗИИ ЭНДОМЕТРИЯ (RU 2310857 C1, ММА им. И.М. Сеченова, 20.11.2007). В эндометрии определяют уровень онкомаркеров сосудистого эндотелиального фактора роста и белка Р53. При величине первого более 1 балла и обнаружении второго делают вывод о необходимости гистерэктомии. Использование способа позволяет повысить точность определения показаний к гистерэктомии у женщин с гиперплазией эндометрия, что дает возможность своевременно и обоснованно выполнить гистерэктомию, однако этот способ не предусматривает диагностику морфологических форм эндометриоидных образований яичников в зависимости от кистозного и железисто-кистозного типа.

Наиболее близким к патентуемому является СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕЦИДИВА ЭНДОМЕТРИОИДНОЙ КИСТЫ ЯИЧНИКА (RU 2304782 С1, Сидорова и др., 20.08.2007 - прототип). Иммуногистохимически определяют показатели экспрессии матриксной металлпротеиназы-7 и ингибитора матриксной металлопротеиназы - TIMP-4, по величине которых при величине первого более 5 и второго менее 5 баллов прогнозируют рецидив эндометриоидной кисты.

Однако этот способ не предусматривает диагностику морфологических форм эндометриоидных образований яичников и характеризуется недостатками, к которым следует отнести: неспецифичность маркера - выявленная закономерность может быть характерна и для других гормон-зависимых заболеваний; сопутствующая патология может влиять на уровень экспрессии гена-мишени. Поскольку маркером является экспрессия гена, это может, в некоторых ситуациях, не отражать представленность рецепторов в цитозоле или мембране (если говорится о ММР-9 или другом белке, то не отражать его количество). В качестве контроля использовался биоптат неизмененного яичника, следовательно в дальнейшем необходима проверка маркера, так как не учитывался возможный полиморфизм или мутации генов, что может внести погрешность при проверке маркера.

В основе патентуемого изобретения лежит комплексная оценка молекулярных маркеров гистологических вариантов эндометриоза яичников: железисто-кистозного и кистозного.

Патентуемый способ определения вида эндометриоза яичника включает патоморфологическое и молекулярно-биологическое исследование ткани яичника.

Отличие способа состоит в том, что проводится молекулярно-биологическое исследование экспрессии генов ингибитора матриксной металлопротеиназы TIMP1 и TIMP2 в тканях очага эндометриоза, которое позволило выявить увеличение экспрессии гена TIMP1 в 1,5 раза в ткани железисто-кистозного эндометриоза по сравнению с кистозным. Выявленное различие является основанием для разделения пациенток на 2 группы по типу эндометриоза яичников.

Проведя ROC-анализ на чувствительность и специфичность выбранного нами маркера (а именно TIMP1), мы получили прогностическую ценность (эффективность), равную 0,82 (AUC), что характеризуют наш маркер как отличный классификатор. Выбранным значением экспрессии гена TIMP1 относительно гена сравнения GAPDH для разделения пациенток на группы по типу эндометриоидного образования стало значение 0,5 о.е. Если значение экспрессии больше 0,5 о.е. - имеет место железисто-кистозный тип эндометриоза яичников, если меньше - то кистозный.

Технический результат изобретения - обеспечение надежной дифференциальной диагностики вида эндометриоза яичников: железисто-кистозного или кистозного путем оценки уровня экспрессии гена ингибитора матриксной металлопротеиназы TIMP1 в эндометриоидной ткани яичников.

В основе изобретения лежат результаты клинико-лабораторного обследования пациенток репродуктивного возраста с эндометриоидными образованиями яичников. Обследование пациенток с эндометриоидными яичниковыми образованиями проведено в соответствии с дифференциально-диагностическим алгоритмом, который включает в себя детальный сбор анамнеза, физикальное и гинекологическое обследование, методы лабораторной диагностики, УЗИ брюшной полости и органов малого таза по стандартной методике в 2Д режиме с оценкой, дополнительно, степени выраженности спаечного процесса для определения возможности проведения оперативного лечения лапароскопическим доступом у больных с ранее перенесенными чревосечениями, а также обследование желудочно-кишечного тракта. На дооперационном этапе всем пациенткам выполнено клинико-лабораторное обследование, включающее, помимо общеклинических методов исследования, УЗИ органов малого таза с допплерометрией (ЦДК), в сыворотке крови пациенток проводилось исследование биохимических маркеров: фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), эстрадиола и прогестерона, антимюллерова гормона (АМГ) - методом твердофазного хемилюминесцентного иммуноанализа в плазме крови на анализаторе ACS-180 «Chiron-Diagnostics» (Англия) в ООО «Независимая лаборатория Инвитро». Забор сыворотки крови для определения содержания ФСГ, ЛГ, эстрадиола осуществляется на 4-7 день менструального цикла.

Всем 88 пациенткам выполнено хирургическое вмешательство с использованием лапароскопического доступа: кистэктомия или экономная резекция яичников в пределах здоровых тканей, удаление обнаруживаемых на брюшине или крестцово-маточных связках очагов эндометриоза, разделение спаек. Окончательный диагноз у всех обследованных верифицирован при патоморфологическом исследовании, которое выполняется в условиях патологоанатомического отделения по стандартной методике. В зависимости от гистологического исследования удаленного материала все наблюдаемые (88) были разделены на две группы варианта патологии: кистозного (66) и железисто-кистозного типа (22).

Способ осуществляют следующим образом. Ткань эндометриоидного образования и ткань неизмененного яичника (0,2 см³), полученную интраоперационно, помещается в пробирку типа «эппендорф» с раствором RNA-later (QIAGEN) и хранится при температуре t=-20°С, не более 30 суток. Из биоптата выделяется мРНК с помощью комплекта реагентов «РИБО-преп» («AmpliSens», Россия) согласно инструкции производителя. Получение кДНК на матрице мРНК проводится с помощью реакции обратной транскрипции с использованием комплекта реагентов «PEBEPTA-L» («AmpliSens», Россия).

Для полимеразной цепной реакции в реальном времени может быть использован набор готовых реактивов для ПНР "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I" на приборе iCycler iQ5 real-time PCR (BioRad, Германия). В качестве контрольного гена используется ген GAPDH. Последовательность праймеров рецепторов эстрадиола, прогестерона и GAPDH для ПЦР известны и описаны [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/].

Количественное определение уровней экспрессии генов осуществляется с помощью формулы 0,5^-ΔCt (о.е., для выявления достоверных различий между группами данных) и 2 ^-ΔΔCt (для выяснения кратности различий), где ΔCt = Ct (искомого гена) - Ct (GAPDH) и ΔΔCt = ΔCt (при 1 патологии) - ΔCt (при 2 патологии).

Все первичные экспериментальные данные обрабатываются с использованием программы GraphPadPrism 5.0. Анализ соответствия признака закону нормального распределения проводится с применением критерия Колмогорова-Смирнова. Описательная статистика количественных признаков при нормальном распределении представлена в виде М±SE, где М - среднее значение, a SE - стандартная ошибка. Сравнение независимых переменных в двух группах осуществляется непараметрическим методом с применением критерия Манна-Уитни. Уровнем значимости при статистических расчетах в данной работе будет принято значение показателя вероятности ошибки (р) не более 5%, то есть р≤0,05.

Клинические примеры

Пример 1. Пациентка И.Е.Ю., 28 лет. Поступила в гинекологическое отделение 24.09.13 в плановом порядке на оперативное лечение лапароскопическим доступом по поводу эндометриоидного образования правого яичника. У пациентки жалобы на тянущие боли в нижних отделах живота, на обильные и болезненные менструации. По данным УЗИ малого таза: тело матки расположено в срединном положении, размерами 38-42-45 мм, структура миометрия однородная. М-эхо 8 мм, однородное. В области правых придатков лоцируется у ворот образование диаметром 35 мм с мелкодисперстной трудно смещаемой взвесью при тракции вагинальным датчиком, толщина стенки образования 2 мм, кровоток в ней не регистрируется. Левый яичник 30-28-27 мм, с мелкими фолликулами. Свободная жидкость в малом тазу четко не визуализируется. Концентрация опухолеассоциированного биохимического онкомаркера СА-125 - 40 Ед/мл. 25.09.13 - произведена оперативная лапароскопия, выполнен лизис спаек, кистэктомия справа с использованием биполярной энергии, коагуляция очагов эндометриоза, санация брюшной полости. Результат гистологического заключения №108007-11 Эндометриоз яичника (железисто-кистозный вариант). TIMP1 = 0,61 о.е.

Пример 2. Пациентка А.А.А., 27 лет. Поступила в гинекологическое отделение для оперативного лечения в плановом порядке. У пациентки жалобы на тянущие боли в нижних отделах живота, усиливающиеся накануне и во время менструации, на диспареунию. По данным УЗИ малого таза: тело матки размерами 39-41-44 мм, структура миометрия ячеистая. М-эхо - 9 мм, однородное. В левом яичнике визуализируется образование диаметром 70 мм, с тонкой стенкой, содержимое мелкодисперстная взвесь, аваскулярное. Правый яичник 28-31-29 мм, с фолликулами. Концентрация онкомаркера СА-125 - 8 мЕД/мл. Концентрация АМГ - 7.08 нг/мл. 13.03.2013 г была произведена оперативная лапароскопия, кистэктомия слева (капсула кисты отделена от стромы яичника с использованием аквадиссекции). По данным гистологического заключения №2239-44 - фрагменты яичниковой ткани в виде тонких узких полосок-эндометриоз яичника, железисто-кистозный вариант эндометриоза, соединительнотканная стенка кисты выстланная цилиндрическим эпителием. При АЦР-РТ исследовании экспрессии генов стероидных гормонов в ткани эндометриоидной кисты получены данные: TIMP1 = 0,95 о.е.

Пример 3. Пациентка Л.О.И., 28 лет поступила в гинекологическое отделение. Больная предъявляла жалобы на тянущие боли в нижних отделах живота периодического характера, усиливающиеся во время менструации. По данным УЗИ малого таза: тело матки расположено кзади, размерами 41-42-45 мм, миометрий однородной структуры. М-эхо 10 мм, однородное. В правом яичнике определяется образование с толстой стенкой, диаметром 60 мм, содержимое мелкодисперстная трудносмещаемая взвесь, аваскулярное. Левый яичник 26-29-30 мм, в структуре единичные фолликулы в поле зрения. Свободная жидкость в малом тазу четко не визуализируется. Онкомаркер СА-125-16.5 Ед/мл. Произведена лапароскопия, кистэктомия справа, лизис спаек с использованием аргоноплазменной энергии. По данным гистологического исследования - эндометриоз яичников, кистозный вариант.TIMP 1=0,22 о.е.

Пример 4. Пациентка О.И.М., 30 лет. Жалобы на периодические тянущие боли в нижних отделах живота, больше справа. По данным УЗИ м/т: тело матки расположено срединно, нормальных размеров и структуры. В правом яичнике имеется образование до 40 мм, содержимое трудносмещаемая взвесь, с единичным кровотоком в капсуле при ЦДК. Левый яичник 30-28-32 мм, с мелкими фолликулами. Концентрация онкомаркера СА-125 - 12.3 Ед/мл. Произведена лапароскопия, кистэктомия справа. По данным гистологического исследования - кистозный вариант эндометриоза яичников. TIMP1 = 0,17 о.е.

Таким образом представленные данные свидетельствуют о достижении технического результата: возможности молекулярнобиологической оценки типа эндометриоидной ткани (железисто-кистозного и кистозного) путем анализа транскриптома ткани, что обеспечит повышение эффективности диагностики и позволит осуществить персонализированный подход к лечению пациенток с эндометриозом яичников.

Изобретение относится к области медицины, к лабораторной диагностике в гинекологии и касается способа определения вида эндометриоза яичника. Способ включает анализ транскриптома эндометриоидной ткани очага эндометриоза яичника путем проведения исследования экспрессии гена TIMP1, при превышении экспрессии гена TIMP1 относительно гена выше 0,5 о.е. относят пациенток к группе с железисто-кистозным типом эндометриоза яичников, если меньше или равно 0,5 о.е. - к группе с кистозным вариантом эндометриоза яичников. Изобретение обеспечивает повышение эффективности диагностики и позволяет осуществить персонализированный подход к лечению пациенток с эндометриозом яичников. Предлагаемый маркер обладает специфичностью - 73%, чувствительностью - 83%, AUC=0,82. 4 пр.

Способ определения вида эндометриоза яичника, включающий молекулярно-биологическое исследование ткани биоптата,

отличающийся тем, что проводят анализ транскриптома ткани очага эндометриоза яичников,

определяют уровень экспрессии гена ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 (TIMP1) и при превышении экспрессии гена TIMP1 выше 0,5 о.е. Следует отнести пациенток к группе с железисто-кистозным типом эндометриоза яичников, если меньше или равно 0,5 о.е. - к группе с кистозным вариантом эндометриоза яичников.