СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2017 года по МПК A61K39/04 A61P35/02 

Описание патента на изобретение RU2631607C1

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и может быть использовано для профилактики лейкоза крупного рогатого скота. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения и обеспечивает пожизненную устойчивость животных к вирусу лейкоза.

Известны средства для профилактики лейкоза крупного рогатого скота и способы профилактики заболевания с использованием этих средств.

Известна инактивированная вакцина против лейкоза крупного рогатого скота (см. авторское свидетельство СССР №820015 по кл. А61К 39/12, опуб. 23.10.87), содержащая белковые фракции р25 и gP70, выделенные из лейкоцитарных клеток периферической крови больных лейкозом животных.

Полученный антиген-белковый иммунизирующий агент вводят телятам в возрасте 1-3 месяца с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. Иммунизацию проводят трехкратно с интервалом 10-12 дней.

Известна также инактивированная вакцина против лейкоза крупного рогатого скота (см. патент РФ №2202367 по кл. МПК А61К 39/12, опуб. 20.04.2003), содержащая вируссодержащие лейкоцитарные клетки периферической крови животных. Иммунизацию животных проводят подкожно трехкратно с интервалом 10-14 дней. Животных вакцинируют в возрасте от 2-х месяцев до 2-х лет.

Однако, применение вакцин не нашло широкого практического использования из-за отсутствия средств коррекции иммунологической недостаточности и образования антител с низким титром.

Известны различные препараты для профилактики лейкоза крупного рогатого скота.

В частности, известно применение янтарного биостимулятора (см. патент РФ №2420275 по кл. МПК А61К 31/194, опуб. 10.06.2011), поликарбоксиэтилена (см. патент РФ №2421184 по кл. МПК 2421184, опуб. 20.06.2011), метронидазола и норсульфазола или сульфадимезина (см. патент РФ №2300883 по кл. МПК А61К 67/02, опуб. 20.06.2007), лигфола (см. патент РФ №2320357 по кл. МПК А61К 36/00, опуб. 27.03.2008) и других.

Однако, воздействие этих препаратов на иммунную систему при лейкозе не изучено и практического применения эти препараты не нашли.

В частности, метронидазол и сульфаниламиды обладают бактерицидным, а не вирулицидным действием, что не позволяет оказывать специфическое действие на вирус лейкоза. Лигфол представляет собой гидролизат природного лигнина, действующим началом которого являются гуминовые вещества. Лигфол проявляет стресс-корректорное и адаптогенное действие, инъекции болезненны и вызывают длительное беспокойство животных. Воздействие янтарного биостимулятора, представляющего собой смесь янтарной кислоты и антисептика стимулятора Дорогова (АСД) фракция №2, как и любого биологически-активного препарата, также изучено мало и требует дополнительных исследований.

Наиболее близким к заявляемому является профилактика лейкоза крупного рогатого скота на основе туберкулезного анатоксина (см. патент РФ №2396978 по кл. МПК А61К 39/295, опуб. 20.08.2010). Туберкулезный анатоксин вводят подкожно за 20-30 суток до вакцинации инактивированной вакциной против лейкоза КРС. Туберкулезный анатоксин получают (см., например, патент РФ №2392002 по кл. МПК А61К 39/00, опуб. 20.06.2010) путем детоксикации туберкулезных экзо- и эндотоксинов двумя детоксикаторами - 0,2% раствором формалина в течение 7-9 суток при 42-45°C и 0,5% раствором этония в течение 7-9 суток при 42-45°C.

Однако, в известном способе профилактики лейкоза используют сам продукт разрушения микобактерий, а не выделенную из него белковую фракцию. Продукт разрушения содержит и белки, и липиды, и полисахариды. Липиды и полисахариды увеличивают иммуногенную нагрузку на организм животных, изменяют состояние гомеостаза и препятствуют целенаправленному иммунному ответу на белки микобактерий, что, в конченом итоге, снижает эффективность профилактических мер и не обеспечивает пожизненной устойчивости животных к заболеванию.

Изобретение направлено на решение задачи расширения спектра профилактических препаратов и формирования новых подходов к проблеме профилактики лейкоза крупного рогатого скота, позволяющих обеспечить пожизненную устойчивость животных к заражению лейкозом.

Достигаемый при этом технический результат заключается в создании средства и способа профилактики лейкоза крупного рогатого скота, позволяющих эффективно и с минимальными затратами обеспечить целенаправленный иммунный ответ путем активизации клеточного иммунитета против вируса лейкоза крупного рогатого скота за счет увеличения количества киллерных клеток.

Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, а именно - средство для профилактики лейкоза КРС и способ его применения.

Указанный технический результат в части самого средства достигается тем, что средство для профилактики лейкоза крупного рогатого скота, согласно изобретению, содержит водорастворимую белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенную из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза, и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, фосфатно-солевой буферный раствор, водный раствор муравьиного альдегида и изотонический раствор натрия хлорида при следующем соотношении компонентов, мас. %:

водорастворимая белковая фракция с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенная из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза 0,05-0,125% фосфатно-солевой буферный раствор 9,95-24,875 водный раствор муравьиного альдегида 0,025-0,046 изотонический раствор натрия хлорида остальное

Указанный технический результат в части способа применения этого средства достигается тем, что телятам 1-9-дневного возраста вводят однократно внутримышечно в дозе 4,0-6,0 мл средство, содержащее водорастворимую белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенную из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза, и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, фосфатно-солевой буферный раствор, водный раствор муравьиного альдегида и изотонический раствор натрия хлорида при следующем соотношении компонентов, мас. %:

водорастворимая белковая фракция с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенная из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза 0,05-0,125% фосфатно-солевой буферный раствор 9,95-24,875 водный раствор муравьиного альдегида 0,025-0,046 изотонический раствор натрия хлорида остальное

Указанные признаки являются существенными и достаточными для получения требуемого технического результата.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано средства для профилактики лейкоза крупного рогатого скота, обеспечивающего пожизненную устойчивость животных к заражению лейкозом за счет активизации клеточного иммунитета путем увеличения количества киллерных клеток. Смесь выделенной из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза водорастворимой белковой фракции с молекулярной массой 18-20 кДа в фосфатно-солевом буферном растворе с растворами муравьиного альдегида и хлорида натрия обеспечивает активизацию киллерной системы защиты, а именно - вовлечение в иммунный ответ субпопуляции Т-лимфоцитов: Th0.

В заявляемом средстве для профилактики лейкоза крупного рогатого скота используют смесь раствора муравьиного альдегида с изотоническим раствором хорда натрия не в качестве детоксикатора, а в качестве компонента, обеспечивающего стабилизацию иммунного ответа на уровне киллерной системы.

Введение только белковой фракции или только муравьиного альдегида не дает желаемого результата. Только синергизм компонентов и экспериментальным путем подобранные их соотношения позволили получить высокий эффект устойчивости животных к заражению лейкозом за счет активизации киллерной системы. При этом концентрация муравьиного альдегида не изменяет структуру белкового компонента микобактерий.

Авторами найден новый, неочевидный подход к решению задачи профилактики лейкоза КРС путем использования смеси компонентов (белковой фракции с определенной молекулярной массой, выделенной из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза и смеси растворов муравьиного альдегида и хлорида натрия) для увеличения количества киллерных клеток иммунной системы.

Известно, что киллерные клетки тормозят развитие опухолевых клеток (см., например, патент РФ №2443411 по кл. МПК А61К 9/08, опубл. 27.02.2012; патент РФ №2262941 по кл. МПК А61К 35/16, опуб. 27.10.2005). Однако они используются исключительно для лечения заболевания.

Использование механизма увеличения киллерных клеток иммунной системы для профилактики лейкоза неизвестно и нигде не описано.

Также неизвестно использование белковой фракции, выделенной из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза, для профилактики лейкоза.

Введение средства телятам до 10-дневного возраста (т.е. в неонатальный период) на основе смеси выделенной белковой фракции с раствором муравьиного альдегида для профилактики лейкоза крупного рогатого скота также неизвестно.

Обработка телят в неонатальный период данным средством объясняется тем, что у таких телят при рождении гуморальный иммунитет отсутствует, а клеточный достаточно развит. Активизация клеточного иммунитета в столь раннем возрасте и, как следствие, киллерной системы иммунитета, обеспечивает пожизненную устойчивость животных к заражению лейкозом.

Известно, что за клеточный иммунитет отвечают цитотоксические Т-лимфоциты CD8 и воспалительные Т-лимфоциты CD4 (Тh1), за гуморальный - Т-хелперные лимфоциты CD4 (Th2) и В-лимфоциты.

В данном изобретении решена задача активизации эффективного иммунитета против лейкоза путем увеличения цитотоксических лимфоцитов (CD8) и воспалительных Т-лимфоцитов CD4 (Th1), уменьшения Т-хелперных лимфоцитов CD4 (Th2) и увеличения количества третьей субпопуляции Т-лимфоцитов - Th0.

Таким образом, в организме животных заранее создаются условия для увеличения количества киллерных клеток, которые, являясь барьером, препятствуют развитию опухолевых клеток. Данный механизм позволяет сохранить баланс клеточного и гуморального иммунитетов, который поддерживается на протяжении всей жизни.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется рисунком 1, на котором представлена хроматограмма белковой фракции, выделенной из продуктов разрушения возбудителя туберкулеза бычьего вида M.bovis (штамм №8).

Средство для профилактики лейкоза крупного рогатого скота готовят следующим образом.

В качестве продуктов разрушения возбудителя туберкулеза используют ППД-туберкулин для млекопитающих, полученный из штамма M.bovis №8 и представляющий собой прозрачную жидкость светло-коричневого цвета (см. Инструкцию по применению туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, утвержденную заместителем Руководителя Россельхознадзора 30.09.2011).

Для получения белковой фракции жидкость с продуктами разрушения возбудителя осаждают солевым раствором (например, сульфатом аммония) и центрифугируют. Надосадок удаляют, а осадок перерастворяют в солевом буферном растворе.

Проводят диализ, доводят рН раствора до 7,0-7,4, после чего определяют концентрацию белка общепринятыми методами, в частности - методом Лоури.

Выбор значений показателя рН растворителя объясняется значением показателя в клетках организма. Общеизвестно (см., например, http://zenslim.ru/content), что в клетках организма рН имеет значение около 7,0, во внеклеточной жидкости - 7,4.

Молекулярную массу белка определяли с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC), которую проводили, в частности, на жидкостном хроматографе «Стайер», с использованием спектрофотометрического детектора А214 (длина волны 214 нм). Для разделения использовали колонку BioSep-SEC-S 2000 5 мкм 145А, 300×7,8 мм. В качестве элюента применяли 0,01М фосфатно-солевой буфер, скорость потока - 1 мл в минуту, либо 0,01М фосфатносолевой буфер с 0,025% раствором азида натрия рН 6,8 и при скорости потока 2 мл в минуту.

В качестве стандартов использовали бычий сывороточный альбумин с молекулярной массой 64-70 кДа, лактоферрин с молекулярной массой 75-80 кДа и папаин с молекулярной массой 20 кДа.

Учитывали такие стандартные показатели, как время задержки образца на колонке или время ретракции (RT, мин), интенсивность пиков по высоте (mAU) и относительно количественное содержание вещества, которое определялось как % отношения каждого пика к общей площади пиков (А, %).

Основные белки в выделенной из продуктов разрушения возбудителя туберкулеза бычьего вида M.bovis (штамм №8) имели молекулярную массу 18-20 кДа (см. рис.1).

В таблице 1 представлен результат хроматографии композиции на основе белковой фракции, выделенной из продуктов разрушения возбудителя туберкулеза.

Далее смешивают полученную белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа в буферном растворе, в котором содержится от 4,8 мг/мл до 5,2 мг/мл белка (т.е. от 0,48% до 0,52%), с изотоническим раствором хлорида натрия 085,-0,95% концентрации.

Для приготовления 50% раствора белковой фракции берут 1 часть буферного раствора с белком и добавляют 1 часть изотонического раствора.

Состав полученной смеси будет следующим:

- белковая фракция - 0,24%-0,26%,

- фосфатно-солевой буферный раствор - 49,74%-49,76%,

- раствор хлорида натрия - остальное.

При приготовлении 20% раствора белковой фракции состав полученной смеси будет следующим:

- белковая фракция - 0,096% - 0,104%,

- фосфатно-солевой буферный раствор - 49,896%-49,904%

- раствор хлорида натрия - остальное.

Далее готовят смесь водного раствора муравьиного альдегида с изотоническим раствором натрия хлорида.

Для этого берут 0,15-0,25 мл 36,5-37,5%-ного медицинского раствора муравьиного альдегида (формальдегида), добавляют его в 99,75-99,85 мл изотонического 0,85%-ного (или 0,95%-ного) раствора хлорида натрия. Смесь растворов тщательно перемешивают.

Соотношение частей компонентов раствора муравьиного альдегида и изотонического раствора хлорида натрия были подобраны экспериментальным путем.

При приготовлении препарата из 37%-ного раствора муравьиного альдегида конечная концентрация муравьиного альдегида в полученном препарате будет составлять 0,055-0,0925 мас. %.

Затем смешивают полученную смесь растворов: белковой фракции в буферном и изотоническом растворах со смесью растворов муравьиного альдегида и изотоническим раствором хлорида натрия.

Пример 1 приготовления средства для профилактики лейкоза

Берут 100 мл ППД-туберкулин для млекопитающих, полученный из штамма M.bovis №8. Из него готовят белковую фракцию следующим образом.

К 100 мл туберкулина добавляют 42 г сульфата аммония для осаждения белка, центрифугируют при 4500 об/мин. в течение 20 мин. Надосадок удаляют, а осадок перерастворяют в 1 мл 0,01М раствора фосфатно-солевого буфера. Диализуют при помощи диализной мембраны с диаметром пор 3500 Да в 0,01М растворе фосфатно-солевого буфера в течение 24 часов, доводят рН раствора до 7,2-7,4, после чего определяют концентрацию белка методом Лоури на биохимическом анализаторе StatFax 3300.

Количество белковой фракции из продуктов разрушения возбудителя туберкулеза составляло 5,0 мг/мл.

Аналогично описанному в примере 1 были получены белковые фракции из других партий ППД-туберкулина. Количество белка везде варьировалось от 4,8 до 5,2 мг/мл.

Далее смешивают полученную белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа в буферном растворе, в котором содержится 5 мг/мл белка (т.е. 0,5%), с изотоническим раствором хлорида натрия 085,-0,95% концентрации.

Затем готовят смесь водного раствора муравьиного альдегида с изотоническим раствором хлорида натрия.

Для этого берут 0,2 мл 37%-ного медицинского раствора муравьиного альдегида (формальдегида), добавляют его в 99,8 мл изотонического 0,85%-ного раствора хлорида натрия. Смесь растворов тщательно перемешивают. Конечная концентрация муравьиного альдегида в полученном препарате будет составлять 0,074 мас. %.

Смешивают белковую фракцию в фосфатно-солевом буферном растворе со смесью растворов муравьиного альдегида и натрия хлорида в равных соотношениях -1:1.

Содержание компонентов препарата будет следующим, мас. %:

водорастворимая белковая фракция с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенная из продуктов разрушения микобактерий штамма M.bovis №8 0,125 фосфатно-солевой буферный раствор 24,875 водный раствор муравьиного альдегида 0,037 изотонический раствор натрия хлорида остальное

Аналогично описанному готовили препарат из белковых фракций с содержанием белка от 0,48% и 0,52%.

Пример 2. Обоснование количественного содержания компонентов в препарате.

В экспериментах было использовано 120 телят 2-9-дневного возраста, из которых 108 вводили средство в дозах от 4 до 6 мл для профилактики лейкоза при разных количественных содержаниях компонентов.

При этом 12 голов были контрольными, которым вводили физиологический раствор в дозе 5 мл на голову.

Результаты представлены в таблице 2.

В контрольной группе из 12 голов пало 4 головы, что составило 33,3%.

Пример 3.

Для обоснования увеличения количества киллерных клеток в организме животных (нетелей и коров) проводили иммунологические исследования крови животных, обработанных в возрасте 2-9 дней средством для профилактики лейкоза крупного рогатого скота:

- нетелей 2,5-летнего возраста,

- коров 5-летнего возраста,

Результаты представлены в таблице 3.

Из таблицы 3 следует, что у 2,5-годовалых нетелей регистрируется снижение соотношения Т-хелперов к Т-супрессорам (Тх/Тс) и увеличение количества третьей субпопуляции Т-лимфоцитов - Th0.

У 5-летних (опытных) коров регистрируется достоверное повышение содержания всех фракций лимфоцитов (Т и В) при сохранении повышенного содержания Th0 (киллеров).

Результаты серологических исследований на наличие антител к вирусу лейкоза, проведенные в реакции иммунодиффузии, у нетелей и коров в возрасте соответственно 2,5 года и 5 лет были отрицательны.

Таким образом, заявляемое средство для профилактики лейкоза крупного рогатого скота, а также способ его применения обеспечивают пожизненную устойчивость животных к заражению лейкозом путем активизации клеточного иммунитета против вируса лейкоза крупного рогатого скота за счет увеличения количества киллерных клеток.

Похожие патенты RU2631607C1

название год авторы номер документа
КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОДДЕРЖАНИЯ НОРМАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ГОМЕОСТАЗА И ПРЕПАРАТ НА ЕЁ ОСНОВЕ 2021
  • Ласкавый Владислав Николаевич
RU2784067C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ 2014
  • Ласкавый Владислав Николаевич
  • Кузнецова Анна Евгеньевна
  • Козлов Сергей Васильевич
RU2560684C1
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 1998
  • Ласкавый В.Н.
  • Лакман Э.Д.
RU2146533C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЛУЧЕВОЙ БОЛЕЗНИ 2022
  • Ласкавый Владислав Николаевич
RU2797586C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КОРОНАВИРУСНЫХ, РЕТРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ГЕПАТИТА С 2020
  • Ласкавый Владислав Николаевич
  • Шурдов Михаил Аркадьевич
RU2738719C1
СРЕДСТВО ДЛЯ АКТИВАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК 2008
  • Ласкавый Владислав Николаевич
  • Горюнов Дмитрий Владимирович
RU2376985C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ 2019
  • Флорова Марина Александровна
  • Ласкавый Владислав Николаевич
  • Сафиуллин Хайдар Ахметсабирович
RU2728709C1
СПОСОБ ОЗДОРОВЛЕНИЯ ХОЗЯЙСТВ ОТ НЕКРОБАКТЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2013
  • Ласкавый Владислав Николаевич
  • Морозов Сергей Михайлович
RU2535007C1
ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ПРОТИВ КАНДИДОЗА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ 2005
  • Ласкавый Владислав Николаевич
  • Шуманов Вячеслав Михайлович
RU2281110C1
ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИСЦЕРАЛЬНЫХ МИКОЗОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ГРИБОМ РОДА MUCOR RACEMOSUS 2004
  • Агольцов Валерий Александрович
  • Ласкавый Владислав Николаевич
RU2270694C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 631 607 C1

Реферат патента 2017 года СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к средству для профилактики лейкоза крупного рогатого скота. Средство для профилактики лейкоза крупного рогатого скота, которое содержит водорастворимую белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенную из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза, и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, фосфатно-солевой буферный раствор, водный раствор муравьиного альдегида и изотонический раствор натрия хлорида, взятые в определенном соотношении компонентов. Способ применения средства для профилактики лейкоза крупного рогатого скота. Вышеописанное средство эффективно для профилактики лейкоза крупного рогатого скота, позволяет эффективно и с минимальными затратами обеспечить целенаправленный иммунный ответ путем активизации клеточного иммунитета против вируса лейкоза крупного рогатого скота за счет увеличения количества киллерных клеток. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 631 607 C1

1. Средство для профилактики лейкоза крупного рогатого скота, характеризующееся тем, что оно содержит водорастворимую белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенную из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза, и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, фосфатно-солевой буферный раствор, водный раствор муравьиного альдегида и изотонический раствор натрия хлорида при следующем соотношении компонентов, мас.%:

водорастворимая белковая фракция с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенная из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза 0,05-0,125 фосфатно-солевой буферный раствор 9,95-24,875 водный раствор муравьиного альдегида 0,025-0,046 изотонический раствор натрия хлорида остальное

2. Способ применения средства для профилактики лейкоза крупного рогатого скота, включающий внутримышечное введение телятам 1-9-дневного возраста в дозе 4,0-6,0 мл на голову средства, содержащего водорастворимую белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенную из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, фосфатно-солевой буферный раствор, водный раствор муравьиного альдегида и изотонический раствор натрия хлорида при следующем соотношении компонентов, мас.%:

водорастворимая белковая фракция с молекулярной массой 18-20 кДа, выделенная из продуктов разрушения микобактерий туберкулеза 0,05-0,125 фосфатно-солевой буферный раствор 9,95-24,875 водный раствор муравьиного альдегида 0,025-0,046 изотонический раствор натрия хлорида остальное

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2017 года RU2631607C1

СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ РАЗВИТИЯ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2009
  • Евглевский Анатолий Алексеевич
  • Евглевский Дмитрий Анатольевич
RU2396978C1
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2009
  • Евглевский Алексей Алексеевич
  • Лебедев Алексей Федорович
  • Емельянов Александр Федорович
  • Епифанов Александр Васильевич
  • Стебловская Светлана Юрьевна
  • Овсянникова Ольга Борисовна
RU2420275C1
RU 2005127138 А, 10.03.2007
RU 2008112753 А, 02.10.2009.

RU 2 631 607 C1

Авторы

Ласкавый Владислав Николаевич

Даты

2017-09-25Публикация

2016-11-22Подача