СПОСОБЫ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЛЮТЕНОВОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И ЕЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ С ЦЕЛИАКИЕЙ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/53 

Родственная заявка

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной патентной заявке США №61/434501, поданной 20 января 2011 г., полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и наборам для диагностики кишечных заболеваний и патологий, включающих по меньшей мере глютеновую иммунореактивность и чувствительность, латентную целиакию и болезнь Крона.

Уровень техники

Аллергия на пшеницу, целиакия и глютеновая чувствительность представляют собой три различных состояния, вызванные употреблением в пищу глиадина пшеницы (1, 2). В этих условиях реакция на глютен опосредуется как клеточным, так и гуморальным иммунным ответом, что приводит к проявлению различных симптоматических комплексов. Например, при аллергии на пшеницу определенная последовательность пептидов глиадина перекрестно связывает две молекулы IgE на поверхности тучных клеток и базофилов, что вызывает высвобождение медиаторов, например, гистаминов и лейкотриенов (3).

Указанные и другие внешние материалы, обсуждаемые в настоящем документе, полностью включены посредством ссылок. Если определение или использование термина во включенном источнике не соответствует или противоречит определению указанного термина в настоящем документе, применяют определение указанного термина, представленное в настоящем документе, а определение указанного термина в источнике не употребляют.

Целиакия (CD) представляет собой аутоиммунное состояние с известными генетическими предпосылками и этиологическими факторами окружающей среды, например, пептидами глиадина. CD поражает 1-2% от общей численности населения. Следует учитывать, что в тексте настоящей заявки, если из контекста не следует обратное, все приведенные диапазоны включают их предельные значения, а открытые диапазоны включают значения, имеющие практическое значение. Аналогично, следует учитывать, что все списки значений включают промежуточные значения, если из контекста не следует обратное.

Маркеры для подтверждения диагноза указанного расстройства представляют собой IgA против нативных дезамидированных пептидов глиадина и аутоантитело IgA против тканевой трансглутаминазы (tTg). В отличие от CD, глютеновая чувствительность (GS) поражает до 30% населения (4). Согласно двум статьям, опубликованных в 2010 и 2011 гг. Sapone et al (5, 6), симптомы GS могут напоминать некоторые из желудочно-кишечных симптомов, ассоциированных с CD или аллергией на пшеницу, однако подчеркивается, что объективных диагностических тестов на глютеновую чувствительность в настоящее время не существует (5, 6). При изучении врожденного и иммунного ответа при CD по сравнению с аналогичными реакциями при GS исследователи обнаружили, что содержание TLR1, TLR2 и TLR4, ассоциированных с врожденным иммунитетом, было повышено в слизистой при GS, но не при CD, в то время как биомаркеры адаптивного иммунитета, например, IFN-g, IL-21 и IL-17A, экспрессировались в слизистой ткани при CD, но не при GS. Исследователи считали, что измерения Toll-подобных рецепторов и IFN-γ, IL-21 и IL-17A позволило бы им отличить CD от GS (5, 6) с помощью способа, являющегося высоко инвазивным и требующего проведения биопсии. Глютеновая гиперчувствительность немедленного типа опосредована IgE, в то время как глютеновая гиперчувствительность замедленного типа представляет собой ответ, опосредованный антителами (IgG, IgA) и Т-клетками, называемый целиакией или глютеновой чувствительностью с энтеропатией (7). В отсутствие IgG и IgA против tTg повышенное содержание IgG и IgA против различных антигенов и пептидов пшеницы указывает на потерю иммунной толерантности к пептидам пшеницы в слизистой и развитие глютеновой чувствительности (7). Вследствие антигенного сходства между антигенами пшеницы и тканями человека как CD, так и GS могут привести к развитию многих аутоиммунных заболеваний, в том числе диабета типа 1, артрита, тиреоидита и даже нейроаутоиммунных состояний, например, глютеновой атаксии и рассеянного склероза(8-10).

Следует учитывать, что термин "пациенты" относятся к людям, находящимся под присмотром профессионального врача. Однако в более широком смысле новые протоколы тестирования и анализа, описанные здесь, можно применять к людям, не являющимся пациентами, и любому другому животному, которое может страдать целиакией, глютеновой чувствительностью и кишечными аутоиммунными расстройствами.

Хотя у пациентов при GS, аналогично пациентам при CD, имеет место непереносимость глютена и могут развиваться такие же или аналогичные комплексы желудочно-кишечных симптомов, при GS эта иммунная реакция не приводит к повреждению тонкой кишки (5, 6). Указанное отсутствие повреждений кишечника при GS и ассоциация CD с генетическими маркерами HLA DQ2/DQ8 в сочетании с повреждением тонкой кишки существенно облегчает диагноз CD по сравнению с GS. Менее тяжелая клиническая картина при GS, отсутствие аутоантител к tTg и игнорирование значения повышенного уровня IgG и IgA против различных белков и пептидов пшеницы многими врачами делает GS крайне опасным расстройством. Это обусловлено тем, что сохранение IgG- и/или IgA-антител в крови в течение длительных периодов времени наряду с индукторами воспалительных каскадов может привести к полномасштабному аутоиммунному расстройству. В указанных случаях, в связи с тяжестью развивающегося повреждения тканей возможно, что даже безглютеновая диета не могла бы способствовать обратному развитию аутоиммунной реакции, вызванной IgG- и IgA-антителами против различных антигенов и пептидов пшеницы.

Сравнение между целиакией и глютеновой иммунореактивностью/чувствительностью показано на Фиг. 1. Согласно указанной модели, если двое детей, один с отрицательным (HLA DQ2/DQ8^-), а другой с положительным генотипом (HLA DQ2/DQ8⁺), подвергаются воздействию факторов окружающей среды, например, ротавируса, бактериальных эндотоксинов и некоторых лекарств или их синергическому действию, это может приводить к нарушению иммунной толерантности слизистой у обоих детей. Индукция иммунной толерантности слизистой против глиадина приводит к продукции IgA и/или IgG против нативных белков и пептидов пшеницы, что является следующим этапом инициации чувствительности к глиадину у обоих индивидуумов, обладающих генотипами HLA DQ2/DQ8^- и HLA DQ2/DQ8⁺.

Тем не менее, у индивидуума с положительным генотипом антитела IgG и IgA против глиадина совместно с биомаркерами воспаления могут активировать tTg, индуцировать повреждение ворсинок и привести к атрофии ворсинок. Дезамидирование специфических пептидов глиадина приводит к образованию комплекса между ним и tTg; презентация этого комплекса антиген-презентирующими клетками Т-клеткам и В-клеткам приводит к продукции IgA и IgG против tTg, дезамидированного глиадина и комплекса глиадин-tTg. Образование указанных антител и их обнаружение в крови является отличительным признаком CD, представляющей собой наследственное заболевание, обнаруживаемое у 1-2% населения. Если CD не лечить, исходом заболевания может быть аутоиммунное расстройство и рак.

Для сравнения, у лица с отрицательным генотипом HLA DQ2/DQ8 такое нарушение иммунологической толерантности и сопутствующая продукция IgA и/или IgG против нативных белков и пептидов пшеницы может активировать воспалительный каскад. В то же время при отсутствии активации tTg атрофии ворсинок не происходит. Кроме того, пептиды глиадина не подвергаются дезамидированию, и, следовательно, IgG- и IgA-антитела продуцируются только против нативных пептидов пшеницы и глиадина.

При непрерывном воздействии антигенов пшеницы и продолжительной иммунной толерантности слизистой антигены пшеницы и реакционноспособные антитела образуют "нечестивый союз" иммунокомплексов, приводящий к тяжелой глютеновой иммунореактивности и чувствительности. Указанная иммунореактивность и чувствительность представляет собой ненаследственное заболевание, обнаруживаемое у 30% населения. Если это расстройство не остановить, продолжительное воздействие IgG- и IgA-антител против антигенов и пептидов пшеницы и их перекрестное взаимодействие с различными тканевыми антигенами может привести к различным аутоиммунным расстройствам. Таким образом, даже в отсутствие CD GS все же может обеспечить условия для продукции других аутоантител, связанных с глютеном, которые атакуют различные органы.

Кроме того, безглютеновую диету обычно рекомендуют только для лиц, соответствующих критериям диагноза CD, а не глютеновой иммунореактивности и чувствительности. К сожалению, в результате указанного остаются многие глютен-чувствительные люди, чрезмерно страдающие расстройствами с очень тяжелыми симптомами, что подвергает их риску развития осложнений; указанные состояния могли бы быть скорректированы с применением безглютеновой диеты, если бы пациенты знали об этом.

Таким образом, требуется новая парадигма для диагностики и дифференцирования различных кишечных заболеваний, в том числе глютеновой иммунореактивности и чувствительности, латентной целиакии, целиакии и кишечного аутоиммунного расстройства.

Сущность изобретения

Объект настоящего изобретения представляет собой устройство, системы и способы, в которых антитела применяют в качестве биомаркеров с целью диагностики глютеновой иммунореактивности и чувствительности, латентной целиакии, болезни Крона и других кишечных патологий.

В некоторых аспектах настоящего изобретения цельную кровь, сыворотку крови, слюну или другие образцы, полученные из организма человека или другого животного, тестируют на наличие антител к (a) антигену пшеницы, (b) антигену глиадина и (c) одному или более из агглютинина зародыша пшеницы, глютеоморфина, глютенина, дезамидированного глютенина, продинорфина и динорфина.

Результаты теста можно успешно применять для того, чтобы отличить глютеновую иммунореактивность или чувствительность от целиакии, особенно если антиген пшеницы дезамидирован, а антиген глиадина выбран из группы, состоящей из 33-мера α-глиадина, 17-мера ϕ-глиадина, 15-мера γ-глиадина, 17-мера ω-глиадина и 21-мера глютенина.

В некоторых аспектах настоящего изобретения цельную кровь, сыворотку крови, слюну или другие образцы, полученные из организма человека или другого животного, тестируют на наличие антител к одному или нескольким веществам из: белка γ-глиадина или его пептида, например, 15-мера γ-глиадина, белка ω-глиадина или его пептида, например, 17-мера ω-глиадина, агглютинина зародыша пшеницы, глютеоморфина, белка глютенина или его пептида, например, 21-мера глютенина, дезамидированного белка глютенина или его пептида, продинорфина и динорфина.

В некоторых аспектах настоящего изобретения выполняют тесты и/или анализируют результаты проведения теста на антитела, которые можно применять для того, чтобы отличить глютеновую иммунореактивность и/или чувствительность, латентную или атипичную целиакию от целиакии с выраженными симптомами (классической целиакии), болезнью Крона и хронической иммунной активацией. Особый интерес представляют планшеты и наборы для осуществления теста на наличие антител к по меньшей мере трем, пяти, семи или всем веществам из следующих: α-глиадина, γ-глиадина, ω-глиадина, глютенина, агглютинина зародыша пшеницы, глютеоморфина, продинорфинов, трансглутаминазы и глиадин-связанной трансглутаминазы (комплекса глиадин-трансглутаминаза).

В некоторых аспектах настоящего изобретения анализы и наборы, представляющие особый интерес, позволяют проводить тест на наличие IgA- и/или IgG-антител к одному или нескольким антигенам пшеницы, белку α-глиадина или одному или более из его пептидов, например, 33-меру α-глиадина и/или 17-меру α-глиадина, белку γ-глиадина или одному или более из его пептидов, например, 15-меру γ-глиадину, белку ω-глиадина или одному или более из его пептидов, например, 17-меру ω-глиадина, агглютинину зародыша пшеницы, опиоидным пептидам, например, одному или более из глютеоморфина, продинорфина и/или динорфина, белку глютенина или одному или более из его пептидов, например, 21-меру глютенина, дезамидированному белку глютенина или одному или более из его пептидов, комплексу глиадин-трансглутаминаза или их комбинации.

В некоторых аспектах настоящего изобретения обнаружение антител можно осуществить с применением иммуноанализа, включая твердофазный ИФА, РИА, латекс-агглютинацию, анализ с использованием гранул, протеомный анализ и другие виды иммуноанализа, известные в данной области техники, но не ограничиваясь ими.

Различные цели, признаки, аспекты и преимущества предмета настоящего изобретения станут более очевидными из подробного описания предпочтительных вариантов реализации, приведенного ниже вместе с сопроводительными чертежами, в которых аналогичные цифры обозначают аналогичные компоненты.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схему, на которой показаны различия между целиакией (список справа) и глютеновой иммунореактивности/чувствительности (список слева) согласно настоящему документу.

Фиг. 2 представляет собой диаграмму, на которой показана компоновка образца титрационного микропланшета, содержащего 12 различных рядов с 12 различными антигенами и пептидами.

Фиг. 3 представляет собой диаграмму, на которой показана компоновка образца титрационного микропланшета, с помощью которого измеряют IgG или IgA против 12 различных антигенов или пептидов пшеницы и ассоциированных тканевых антигенов (антигены или пептиды изображены прозрачными).

Фиг. 4 представляет собой диаграмму, на которой показана компоновка образца титрационного микропланшета, с помощью которого измеряют IgG или IgA с еженедельными отрицательными и положительными контролями для целей контроля качества (антигены или пептиды изображены прозрачными).

Фиг. 5 представляет собой диаграмму протокола тестирования антител при целиакии с применением tTg и различных антигенов в соответствии с предшествующим уровнем техники (17).

Фиг. 6 представляет собой диаграмму протокола тестирования целиакии с применением пептида дезамидированного глиадина в соответствии с предшествующим уровнем техники (17).

Фиг. 7 представляет собой диаграмму предлагаемого протокола тестирования целиакии, глютеновой иммунореактивности/чувствительности и аутоиммунного расстройства с применением репертуара антигенов и пептидов пшеницы согласно некоторым аспектам настоящего изобретения.

Подробное описание чертежей

В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, антитела применяют в качестве биомаркеров для того, чтобы диагностировать и отличить глютеновую иммунореактивность и чувствительность, латентную целиакию, болезнь Крона и другие кишечные патологии от классической целиакии с применением матрицы антигенов и пептидов пшеницы.

В некоторых аспектах настоящего изобретения биологическую жидкость тестируют на антитела, относящиеся к иммуноглобулинам G (IgG) и/или иммуноглобулинам A (IgA) против одного или более из: антигена цельной пшеницы; белка α-глиадина или одного или более из его пептидов; белка γ-глиадина или одного или более из его пептидов; белка ω-глиадина или одного или более из его пептидов; белка глютенина или одного или более из его пептидов; одного или более из опиоидных пептидов; комплекса глиадин-трансглутаминаза (глиадина, связанного с трансглутаминазой); трансглутаминазы; агглютинина зародыша пшеницы; и их комбинации.

В некоторых аспектах настоящего изобретения антиген цельной пшеницы дезамидирован и может быть получен путем объединения водорастворимых и растворимых в спирте белков цельной пшеницы. Белок α-глиадина или один или более из его пептидов включает 33-мер α-глиадина и/или 17-мер α-глиадина, причем рассматриваются и другие пептиды α-глиадина. Белок γ-глиадина или один или более из его пептидов включает 15-мер γ-глиадина, причем рассматриваются и другие пептиды γ-глиадина. Белок ω-глиадина или один или более из его пептидов включает 17-мер ω-глиадина, причем рассматриваются и другие пептиды ω-глиадина. Белок глютенина или один или более из его пептидов включает 21-мер глютенина, причем рассматриваются и другие пептиды глютенина. Один или более из опиоидных пептидов включает экзорфиновые пептиды, включая глютеоморфин, продинорфин и/или динорфин, причем рассматриваются и другие экзорфиновые пептиды.

В некоторых аспектах настоящего изобретения цельную кровь, сыворотку/сыворотки крови, слюну или другие образцы биологических жидкостей, полученные из организма человека или другого животного, тестируют на наличие антител к (a) антигену пшеницы, (b) антигену глиадина и (c) одному или более из: агглютинина зародыша пшеницы, глютеоморфина, глютенина, дезаминированного глютенина, продинорфина и динорфина. Результаты тестирования представляют особый интерес, если антиген пшеницы дезамидирован, а антиген глиадина выбран из группы, состоящей из 33-мера α-глиадина, 17-мера α-глиадина, 15-мера γ-глиадина, 17-мера ω-глиадина и 21-мера глютенина. Планшеты и наборы для тестирования позволяют успешно проводить тесты на присутствие по меньшей мере трех, пяти, семи или всех из следующих веществ: α-глиадина, γ-глиадина, ω-глиадина, глютенина, агглютинина зародыша пшеницы, глютеоморфина, продинорфинов, трансглутаминазы и глиадин-связанной трансглутаминазы.

В некоторых аспектах настоящего изобретения способы анализа и наборы для анализа, представляющие особый интерес, позволяют проводить тест на наличие антител IgA и/или IgG к одному или нескольким антигенам пшеницы, белку α-глиадина или одному или более из его пептидов, например, 33-меру α-глиадина и/или 17-меру α-глиадина, белку γ-глиадина или одному или более из его пептидов, например, 15-меру γ-глиадина, белку ω-глиадина или одному или более из его пептидов, например, 17-меру ω-глиадина, агглютинину зародыша пшеницы, опиоидным пептидам, например, одному или более из глютеоморфина, продинорфина и/или динорфина, белку глютенина или одному или более из его пептидов, например, 21-меру глютенина, дезамидированному белку глютенина или одному или более из его пептидов, комплексу глиадин-трансглутаминаза или их комбинации.

В некоторых аспектах настоящего изобретения обнаружение антител можно осуществить с применением иммуноанализа, включая твердофазный ИФА, РИА, латекс-агглютинацию, анализ с использованием гранул, протеомный анализ и другие виды иммуноанализа, известные в данной области техники, но не ограничиваясь ими.

Ниже приведены типичные описания аналитических методик, а также их применение и анализ по отношению к некоторым тестируемым пациентам. Хотя для осуществления или практической реализации настоящего изобретения можно применять другие материалы и методы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, с целью дополнительной иллюстрации настоящего изобретения в типичном описании аналитических методик описаны предпочтительные способ и материалы.

Пример 1

Твердофазный ИФА

A. Материалы и методики - подготовка планшета и образца

Антигены и пептиды пшеницы. Антиген цельной пшеницы получали объединением водорастворимых и растворимых в спирте белков. Различные пептиды глиадина, в том числе 33-мер и 17-мер α-глиадина, 15-мер γ-глиадина, 17-мер ω-глиадина, глютеоморфин, продинорфин, трансглутаминазы и глиадин, связанный с трансглутаминазой, декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD-65) для ВЭЖХ синтезировали в Bio-Synthesis Inc. (Льюисвилл, штат Техас, США). Агглютинин зародыша пшеницы (WGA) приобрели в Sigma/Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури, США).

Антигены и пептидов растворяли в метаноле в концентрации 1,0 мг/мл, затем разбавляли 1:100 в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,5, и вносили по 50 мкл в каждую лунку полистиролового плоскодонного планшета для твердофазного ИФА.

Планшеты для твердофазного ИФА инкубировали в течение ночи при 4°C, а затем трижды промывали 200 мкл физиологического раствора с трис-буфером (TBS), содержащего 0,05% Твин-20 (pH 7,4). Неспецифическое связывание иммуноглобулинов предотвращали добавлением 200 мл 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в TBS и инкубировали планшеты в течение ночи при 4°C. Планшеты промывали и после проведения контроля качества хранили при 4°C до использования.

Конъюгаты ферментов включали: аффинно очищенное антитело козы против IgG человека, меченное фосфатазой (Jackson ImmunoResearch, № по каталогу 109-055-008) и аффинно очищенное антитело козы против IgA человека, меченное фосфатазой (Jackson ImmunoResearch, № по каталогу 109-055-011).

Другие дополнительные реагенты и материалы, включенные в способ согласно описанию, приведенному далее в настоящем документе, включали: порошок физиологического раствора с фосфатным буфером (Sigma, № по каталогу р3813-10РАК), бычий сывороточный альбумин (Biocell, № по каталогу 3203-00), азид натрия (Sigma, № по каталогу S-2002), твин-20 (Sigma, № по каталогу Р1379-1000 мл), глицерин (Sigma, № по каталогу G5516-500 мл), гидроксид натрия (Sigma, № по каталогу S-5881), хлорид магния (Sigma, № по каталогу 8266), диэтаноламин (Sigma, № по каталогу D-8885), 1,0 н. раствор соляной кислоты (Sigma, № по каталогу Н3162), 5-мг таблетки субстрата: p-NPP (пара-нитрофенилфосфат) (Sigma, № по каталогу S-0942) и дистиллированную воду (д. H₂O).

Микропланшеты подготавливали и покрывали желательным количеством антигенов и/или пептидов, ассоциированных с пшеницей. В следующих примерах 12 различных антигенов и пептидов, ассоциированных с пшеницей, иммобилизовали на микропланшетах. Калибратор, положительные контроли и разбавленные образцы от пациентов вносили в лунки, и во время первого инкубирования с ними связывались аутоантитела, распознающие различные антигены пшеницы. После промывки лунок для удаления несвязанных белков, на следующем этапе промывки удаляли несвязанный очищенный конъюгат антитела кролика против IgG/IgA человека, меченный щелочной фосфатазой.

Связанный конъюгат визуализировали с применением паранитрофенилфосфатного (PNPP) субстрата, образующего желтый продукт реакции, интенсивность которого пропорциональна концентрации аутоантител в образце. Для остановки реакции в каждую лунку добавляли гидроксид натрия. Интенсивность окрашивания считывали при 405 нм.

Для сбора образцов применяли пробирки с чисто-красными или красно-тигровыми крышками (SST-пробирки), хотя в некоторых аспектах для этого анализа предусматривали применение других устройств для сбора образцов.

Образцы крови собирали, применяя асептических методики венепункции; сыворотку получали с помощью стандартных процедур. В некоторых аспектах предпочтительно использовать, как минимум, приблизительно 50 мкл сыворотки для анализа, что, таким образом, соответствует приблизительно 0,5 мл или большему количеству крови.

B. Процедура тестового анализа

В данном разделе приведено обсуждение аналитической процедуры для матриц IgG- и/или IgA-антител с целью диагностики и обнаружения глютеновой иммунореактивности и чувствительности, латентной целиакии, болезни Крона и других кишечных патологий. В некоторых аспектах перед началом тестового анализа все реагенты оставляли до достижения ими комнатной температуры. Процедура тестового анализа включала подготовку желательного количества лунок или планшетов с желательным количеством и типом антигенов и/или пептидов, ассоциированных с пшеницей. После подготовки лунок микропланшета в ряды A и B микропланшета добавляли приблизительно 100 мкл разбавленного 1:100 контрольного калибратора, как показано на Фиг. 3, применяя многоканальную пипетку. Приблизительно 100 мкл разбавленного 1:100 тестируемого образца от пациента, в данном случае сыворотки крови, добавляли в парные лунки рядов С и D для клинического образца 1, рядов Е и F для клинического образца 2 и рядов G и Н для клинического образца 3.

В отдельном планшете осуществляли периодические отрицательные и положительные контроли аналогично клиническим образцам в двух повторениях, как показано на Фиг. 4.

Затем планшеты инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре. После инкубирования из лунок удаляли содержимое и четырежды промывали лунки PBS, применяя промывающее устройство для твердофазного ИФА. Приблизительно 100 мкл оптимально разбавленного антитела козы против IgA человека, меченного щелочной фосфатазой, добавляли к IgA-планшету, или приблизительно 100 мкл IgG, меченного ферментом, добавляли к IgG-планшету при оптимальном разбавлении.

Соответствующие планшеты инкубировали в течение 30-60 минут при комнатной температуре. Приблизительно за десять минут до конца инкубирования конъюгатов изготавливали раствор субстрата путем смешивания 5-мг таблетки п-нитрофенилфосфата с 5 мл субстратного буфера, который хорошо перемешивали до полного растворения таблетки. Повторяли четырехкратную промывку PBS с применением промывающего устройства для твердофазного ИФА. Затем в каждую лунку добавляли приблизительно 100 мкл раствора субстрата. Затем планшет инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, избегая воздействия прямого солнечного света. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 3 н. NaOH. Интенсивность окрашивания в лунках считывали с применением ридера для микропланшетного при 405 нм против пустой лунки с записью оптической плотности калибраторов, контролей и неизвестных образцов.

С. Подсчет результатов

После считывания планшета при 405 нм для получения значений оптической плотности (ОП405) средние значения ОП отрицательных контролей, средние значения ОП положительных контролей и средние значения ОП каждого клинического образца делили на средние ОП калибраторов по рядам А и В, получая каждое значение индекса (IV).

Значение индекса (IV) для каждого антитела рассчитывали по отношению к 12 различным антигенам путем деления средней ОП каждого дублированного образца на среднюю ОП контрольного калибратора (например, делением средней ОП лунок C1 и D1 на среднюю ОП лунок A1 и B1, средней ОП лунок C2 и D2 на среднюю ОП лунок А2 и В2, средней ОП лунок C3 и D3 на среднюю ОП лунок A3 и B3, и т.д.).

Затем результаты сравнивали с установленными эталонными диапазонами.

Расчет индекса для антигенов пшеницы Кал. 1 (ОП) 0,41 Кал. 2 (ОП) 0,44 Образец 3 A (ОП) 3,77 Образец 3 B (ОП) 3,79 Индекс 8,93

D. Интерпретация результатов

Примеры картины IgG- и IgA-антител у 3 пациентов с целиакией, у 3 пациентов с глютеновой иммунореактивностью и чувствительностью и у 3 пациентов с болезнью Крона, перекрывающейся с глютеновой чувствительностью, показаны в Таблицах 2-7 (см. в конце описания). Болезнь Крона, также известная как регионарный энтерит, является разновидностью воспалительного заболевания кишечника, характеризующейся выраженным генетическим фактором. Ее часто описывают как аутоиммунное заболевание, но другие считают, что она является заболеванием с иммунной недостаточностью.

Интерпретация данных и лабораторное дифференцирование целиакии с глютеновой иммунореактивностью/чувствительностью/аутоиммунным расстройством приведены в Таблице 8 (см. в конце описания). В частности, в настоящее время считают, что целиакию можно дифференцировать с латентной целиакией, глютеновой иммунореактивностью/чувствительностью и/или глютеновым аутоиммунным расстройством следующим образом:

a. Показана серологическая картина при латентной целиакии, когда результаты тестов включали положительные результаты для IgA и/или IgG к любому белку пшеницы или комбинации белков пшеницы, 33-меру α-глиадина, дезамидированного 33-меру α-глиадина, 25-меру α-глиадина, 18-меру α-глиадина, 17-меру α-глиадина, 15-меру γ-глиадина, 17-меру ω-глиадина, глютенина, дезамидированного глютенина, глютеоморфина, продинорфина и агглютинина зародыша пшеницы и отрицательные результаты по отношению к трансглутаминазе-2, и по меньшей мере один из тестов на IgA и IgG к по меньшей мере одному из трансглутаминазы-3 и трансглутаминазы-6 был положительным.

b. Показана серологическая картина глютеновой иммунореактивности и чувствительности, когда результаты тестов включали положительные результаты для IgG и/или IgA к антигенам пшеницы, в частности нативному α-глиадину, γ-глиадину, ω-глиадину, глютенину, дезамидированному глютенину, глютеоморфину и агглютинину зародыша пшеницы, но не дезамидированному α-глиадину и не трансглутаминазе-2.

c. Показан диагноз, связанный с глютеновой иммунореактивностью/чувствительностью и аутоиммунным расстройством, когда результаты тестов включали положительный результат для IgG и/или IgA против антигенов пшеницы, в частности нативного α-глиадина, γ-глиадина, ω-глиадина, глютенина, дезамидированного глютенина, глютеоморфина и агглютинина зародыша пшеницы, положительные результаты для любого IgG, IgA или IgM к декарбоксилазе глутаминовой кислоты, антигенам или пептидам тканей мозжечка или другим тканевым антигенам и отрицательные результаты для IgA к дезамидированному α-глиадину, дезамидированному глютенину или против трансглутаминазы-2, но положительные IgA или IgG против трансглутаминазы-3 и/или трансглутаминазы-6.

Регистрируемые диапазоны и эталонные диапазоны показаны в Таблице 1 (см. в конце описания), которая может обновляться время от времени. Читатель заметит, что по сравнению с установленными эталонными диапазонами по двум стандартам, превышающими среднее значение, в то время как IgA-антитела против tTg и комплекса глиадин-tTg являлись высоко положительными (что подтверждало диагноз CD), картина и сила антител IgG- и IgA-антител колебались от антигена к антигену. Например, в то время как IgG и IgA против антигенов пшеницы у всех трех пациентов с целиакией превышали эталонный диапазон в 4-6 раз при измерении IgG и IgA против 33-мера α-глиадина, уровень IgG-антител был значительно повышен у одного, а уровень IgA - у двух из трех пациентов (Таблицы 2, 3).

По сравнению с пациентами с целиакией, ни у одного из трех пациентов с глютеновой иммунореактивностью и чувствительностью не наблюдалось значительной реактивности IgA против tTg и комплекса глиадин-tTg, в то время как IgG- и IgA-антитела против антигенов пшеницы и в комбинации с одним или более пептидами пшеницы (α-глиадином, γ-глиадином, ω-глиадином, глютенином, глютеоморфином, продинорфином и агглютинином зародыша пшеницы) были значительно повышены. Иммунный IgA-ответ против антигенов и пептидов пшеницы в комбинации с tTg и комплексом глиадин-tTg четко различается при целиакии и глютеновой иммунореактивности/чувствительности, при которых IgG- и/или IgA-антитела взаимодействуют с различными антигенами и пептидами пшеницы, но не с tTg и комплексом глиадин-tTg (Таблицы 4, 5).

Таблицы 6 и 7 представляют результаты трех пациентов с болезнью Крона. Картина IgG- и IgA-антител против tTg и комплекса глиадин-tTg четко показывает, что указанные пациенты, в дополнение к болезни Крона, также страдали глютеновой иммунореактивностью/чувствительностью, а также, возможно, целиакией (Таблицы 6, 7).

Примеры клинических случаев

Ниже показаны четыре описания различных клинических случаев, первый из которых относится к пациенту с целиакией, второй - с глютеновой чувствительностью, третий - с глютеновой чувствительностью и аутоиммунным расстройством, а четвертый - с глютеновой чувствительностью, перекрывающейся с болезнью Крона.

A. Описание случая №1: Диагностика целиакии у пожилых людей за счет применения IgA против глиадина и тканевой трансглутаминазы с улучшением за счет безглютеновой диеты

76-летний мужчина с длительной диспепсией, расстройством пищеварения, утомляемостью и быстрой потерей массы тела был направлен на обследование желудочно-кишечного тракта. Анализы крови показали макроцитарную анемию с низким содержанием фолата и витамина В-12. Концентрация гемоглобина у пациента составляла 79 г/л, альбумина - 32 г/л, а трансглутаминазы - 212 мкг/мл (нормальный диапазон=0-10 мкг/мл). Выполнили срочную колоноскопию и биопсию двенадцатиперстной кишки, которая дала макроскопически нормальные результаты. После этого у него проверили концентрации IgG и IgA против глиадина и трансглутаминазы с помощью наборов, одобренных FDA. Как IgG, так и IgA против α-глиадина являлись сильно повышенными; IgA, но не IgG против трансглутаминазы в 3,8 раза превышали эталонный диапазон. Учитывая положительный IgA против глиадина и трансглутаминазы и диагноз целиакии, пациенту перелили 2 единицы эритроцитарной массы и начали лечение с применением как безглютеновой диеты, так и 20 мг преднизолона в день. Спустя шесть месяцев пациент набрал приблизительно 12 фунтов и демонстрировал незначительные желудочно-кишечные симптомы. Из-за этого улучшения пациент стал приверженцем безглютеновой диеты. Спустя год после первого анализа IgG- и IgA-антител против глиадина и трансглутаминазы, повторные тесты указанных антител являлись отрицательными, что является еще одним указанием на то, что управление ходом заболевания плюс безглютеновая диета сыграли важную роль в лечении указанного пожилого пациента с латентной целиакией.

Обсуждение: Согласно Catassi et al. (1, 11), целиакия (CD) является одним из наиболее распространенных пожизненных расстройств в западных странах. Тем не менее, в большинстве случаев CD не диагностируют, главным образом, вследствие плохой осведомленности лечащего врача об этом важном заболевании (Catassi С, et al., Am J Gastroenterol, 102:1454-1460, 2007). Целиакия воспринимается как возникающие желудочно-кишечные симптомы, сопровождающися нарушением всасывания. Однако у многих пациентов с целиакией желудочно-кишечные симптомы не возникают. Указанные лица могут страдать латентной или атипичной целиакией, и указанное состояние может проявляться недостатком железа, анемией, повышением уровня ферментов печени, остеопорозом или неврологическими симптомами (12). В настоящем документе термин «атипичная целиакия» относится к целиакии у пациентов, демонстрирующих лишь незначительные симптомы, а термин "латентная целиакия" относится к целиакии, протекающей бессимптомно.

Все более широкое распознавание целиакии связано с использованием новых серологических анализов с повышенной чувствительностью и специфичностью. До недавнего времени целиакию неправильно воспринимали как редкое заболевание, и выявляли в основном в младенческом или детском возрасте. Тем не менее в настоящее время признают, что большинство случаев CD происходит у взрослых в возрасте 40-60 лет. Пациенты в указанной возрастной группе могут демонстрировать симптомы, результаты лабораторных испытаний и другие признаки атипичным образом. Фактически, в соответствии с новейшей публикацией, CD правильно диагностируют менее чем у одного из семи пациентов (13).

Следовательно, как показано в этом случае, если у взрослого пациента проявляются симптомы и признаки, свидетельствующие о нарушении всасывания, следует рассматривать тестирование на IgA-антитела против глиадина и трансглутаминазы. Если результаты тестирования положительны, целиакию следует рассматривать в качестве части дифференциальной диагностики, на основании которой следует рекомендовать безглютеновую диету. Если безглютеновая диета улучшает симптомы, пациента следует перевести на указанную диету независимо от возраста.

B. Описание случая №2: Глютеновая иммунореактивность и чувствительность, вызванная комбинацией анестетиков, антибиотиков и обезболивающих средств

46-летняя женщина была направлена на ежегодное обследование ее терапевтом. На основании медицинского обследования и нормальных значений OAK, биохимического анализа, включая ферменты печени, и аутоиммунного профиля, ее классифицировали как здорового человека. На указанном этапе не измеряли антитела к глютену. Через несколько месяцев она пошла к своему стоматологу для депульпирования зуба, трансплантации кости и подготовки к имплантации зубов. Во время пяти различных визитов в течение десяти дней ее лечили с применением анестетика (мепивакаина), антибиотиков и болеутоляющих средств. Спустя четыре месяца выполнили процедуру имплантации зубов под местной анестезией с применением лидокаина с последующим назначением антибиотика (амоксициллина) и болеутоляющих средств. Через четыре часа у нее развилась сильная аллергическая реакция с локализованным отеком, в частности губ и периорбитальной области. У пациентки началось возбуждение и генерализованный зуд, особенно в области лица, кистей и ступней. Стеснение в груди с хрипами и затрудненном дыханием было признаком аллергической реакции на одно или более из примененных лекарственных средств. Ей немедленно ввели адреналин внутримышечно из расчета 0,01 мл на кг массы тела с антигистаминными средствами. Тем не менее, несмотря на контролируемость аллергической реакции, у пациентки развилась тяжелая рвота и понос с сильной болью в животе, продолжавшиеся в течение 8 дней. Спустя две недели, несмотря на ослабление диареи, пациентка продолжала жаловаться на вздутие живота и дискомфорт в животе с признаками синдрома раздраженного кишечника. Ее направили к гастроэнтерологу, который при тщательном обследовании не обнаружил ничего, достойного внимания. Затем предположиливозможность глютеновой чувствительности, и пациентку подвергли типированию HLA и IgG- и IgA-антител против глиадина и трансглутаминазы. Иммунологические тесты показали следующие результаты: IgG против глиадина 6,8 Ед/мл (нормальный диапазон<20 Ед/мл); IgA против глиадина 4,1 Ед/мл (нормальный диапазон<20 Ед/мл); IgG против tTg 2,1 Ед/мл (нормальный диапазон<6 Ед/мл), IgA против tTg 1,2 Ед/мл (нормальный диапазон<4 Ед/мл), и HLA DQ2 и DQ8 отрицательны. Основываясь на этих данных, исключили глютеновую чувствительность и целиакию и сделали вывод, что пациентка страдала психогенной реакцией или идиосинкразией, связанной с реакцией на анестетик и его синергическое действие с антибиотиками. Спустя девяносто дней при ее контрольном визите пациентка по-прежнему жаловалась на вздутие живота и боли в животе, в частности, через 1-3 часа после каждого приема пищи. Назначили повторное тестирование, а также как базовый, так и комплексный анализ на IgG и IgA против глиадина и tTg наряду с IgG ASCA (антителами протиа Saccharomyces cerevisiae) и p-ANCA (околоядерными антинейтрофильными цитоплазматическими антителами), представляющими собой рекомендуемые тесты при подозрении на болезнь Крона и язвенный колит. Примечательно, что почти через 100 дней после первого дискомфорта в ЖКТ, несмотря на то, что уровни ASCA и р-ANCA полностью находились в пределах нормального диапазона, уровень как IgG, так и IgA против глиадина были от 4 до 9 раз выше нормального диапазона (IgG против глиадина=79 Ед/мл; IgA=54 Ед/мл). Тем не менее, уровни IgG- и IgA-антител против tTg находились в пределах нормального диапазона. Кроме того, провели тестирование IgG- и IgA-антител по отношению к матрице антигенов пшеницы, глиадина, глютенина, агглютинина зародыша пшеницы, комплекса глиадин-tTg и tTg. Обнаружили, что уровень IgG против 8 из 12 тестируемых антигенов и IgA против 6 из 12 тестируемых антигенов был в 2-7 раз выше установленных эталонных диапазонов. Как IgG, так и IgA против tTg и комплекса глиадин-tTg были отрицательными (см. Таблицы 4 и 5, образец №1). Указанные результаты вместе с положительными базовыми тестами IgG и IgA против глиадина, но не против трансглутаминазы указывали, что пациентка вследствие аллергической реакции на факторы окружающей среды утратила толерантность к антигенам пшеницы, и у нее развилась глютеновая чувствительность, но не целиакия. Несмотря на отсутствие повышения уровней IgG и IgA против tTg, в связи с непрерывным ЖК-дискомфортом и повышенным уровнем IgG и IgA против глиадина рекомендовали безглютеновую диету, и диетолог посоветовал пациентке принимать пробиотики и перейти на ограниченную безглютеновую и безлектиновую диету, поскольку уровень WGA (агглютинина зародыша пшеницы) также был повышен как для IgG, так и для IgA. Через шесть месяцев после введения диеты и пробиотиков ЖК-дискомфорт пациентки ослабел, и она выздоровела.

Обсуждение: Термин глютеновая чувствительность относится к состоянию повышенной иммунологической реактивности на глютен, показателем чего является повышение уровней IgG, IgA или их обоих против глиадина, но не против трансглутаминазы (14). Глютеновая чувствительность начинается с потери иммунной толерантности слизистой к антигенам и пептидам пшеницы из-за экологических факторов, воздействующих на иммунный гомеостаз слизистой.

В данном случае глютеновую чувствительность подтвердили на основании желудочно-кишечных симптомов и иммунологического тестирования, в частности, IgG и IgA против глиадина и ассоциированных с ним белков и пептидов почти через 100 дней после воздействия провоцирующих факторов на ее иммунологическую толерантность к пшенице и ассоциированным антигенам. По-видимому, у данной пациентки синергическое действие анестетиков, антибиотиков и болеутоляющих средств привело к нарушению регуляции иммунной системы ее слизистых оболочек с последующим нарушением иммунологической толерантности к пшенице и другим пищевым белкам и пептидам. Указанные факторы, возможно, в комбинации с воздействием факторов окружающей среды на активность пищеварительных ферментов, привели к открытию плотных контактов и поступлению непереваренных белков и пептидов пшеницы в подслизистую, лимфатические узлы и кровеносное русло. Затем антигенпрезентирующие клетки презентировали указанные антигены Т-клеткам и В-клеткам. Во время этого процесса глиадин-специфические Т-клетки активировали глиадин-специфические В-клетки, что привело к клональной экспансии В-клеток и высвобождению IgG- и IgA-антител к глиадину и ассоциированным белкам и пептидам, которые в данном случае обнаружились приблизительно через 100 дней после исходного травматического воздействия.

В настоящем документе сделан вывод о том, что скрининг на глютеновую чувствительность у пациентов с ЖК-дискомфортом, ассоциированным с применением анестетиков и антибиотиков, можно легко и с минимальными затратами выполнить путем измерения циркулирующих IgG и IgA против глиадина и ассоциированных белков и пептидов. Невыполнение этого скрининга может не только лишить пациента точного диагноза и правильного лечения за счет применения безглютеновой диеты, но также может привести к ненужному медицинскому вмешательству и связанным с ним побочным эффектам.

C. Описание случая №3: Глютеновая иммунореактивность, чувствительность и аутоиммунное расстройство

В настоящей заявке описан клинический случай, при котором исходная демонстрация привела к ошибочному диагнозу синдрома раздраженного кишечника, что привело к неправильному медицинскому вмешательству. Правильный диагноз глютеновой иммунореактивности и чувствительности поставили через несколько лет ненадлежащего лечения.

49-летнюю женщину с болями в животе, запорами, изжогой и головной болью обследовал терапевт. Исследование выявило нормальный OAK с уровнем гемоглобина 10,8 г/дл и нормальный биохимический профиль, включая ферменты печени. За несколько посещений исследовали подробные биохимические и иммунологические профили, в том числе уровни ANA (антинуклеарных антител), ревматоидного фактора, Т3, Т4 и ТТГ, причем результаты всех анализов были в пределах нормального диапазона. После неоднократных жалоб на ЖК-дискомфорт пациентку направили на обследование ЖКТ. Результаты эндоскопии и анализа Н. pylori были нормальными. Пациентке поставили диагноз синдром раздраженного кишечника и назначили β-блокаторы и нексиум, которые умеренно улучшили ее симптоматологию. Тем не менее спустя четыре года, в дополнение к имевшимся желудочно-кишечным симптомам и головной боли у нее проявились симптомы недомогания, ухудшение зрения и сыпь на лице. У нее наблюдались периоды сонливости и раздражительности, а также проблемы с дыханием. Дальнейшие лабораторные тесты выявили уровень гемоглобина 9,7 г/дл при MCV (среднем объеме эритроцита) 72 фл, повышенную скорость оседания эритроцитов (46 мм/1-й час), ANA 1:80 (нормальный диапазон <40), незначительное повышение IgA-антител гладких мышц; антитела против двуцепочечной ДНК и экстрагируемому ядерному антигену были отрицательны. На основании имеющихся доказательств ревматолог поставил диагноз системной красной волчанки (СКВ) и начал лечение с применением стероидов. Ее общее состояние несколько улучшилось, однако уровень гемоглобина оставался низким, в то время как СОЭ колебалась. Спустя два года у нее развились затруднения прохождения мочи, сопровождавшиеся покалыванием, и сенсорные нарушения в туловище и ногах, что привело к ее обращению к неврологу. Подробный опрос выявил лентоподобное ощущение в туловище и снижение остроты зрения (8/46 в правом глазу, 8/23 в левом глазу) с незначительной болью в глазах, но нормальным движением глаз. Лабораторное исследование выявило низкий уровень гемоглобина, аномальное значение MCV и низкое содержание ферритина в сыворотке - 14 мкг/л (нормальный диапазон 10-150 мкг/л), что указывало на недостаток железа. МРТ головного мозга показала обширные аномалии белого вещества, не характерные для рассеянного склероза, однако в спинномозговой жидкости аномалий не обнаружили. Хотя анализ крови и спинномозговой жидкости не выявил бактериальной и вирусной инфекции, в том числе сифилиса, микобактерий, боррелий, ЭБВ, ЦМВ, HTLV (вируса T-клеточного лейкоза человека) и герпеса 6 типа, вызванные потенциалы зрительного нерва выявили задержки в обоих зрительных нервах. С учетом этих нарушений и ввиду того, что при более ранних исследованиях не проводили анализов на глютеновую чувствительность, рассмотрели возможность глютеновой чувствительности. Заказали полную панель IgG и IgA против репертуара белков и пептидов пшеницы, а также против tTg и различных тканевых антигенов. Указанный полный скрининг глютеновой чувствительности и иммунореактивности выявил IgG против антигенов пшеницы, 33- и 17-мера α-глиадина, γ- и ω-глиадина, глютенина, глютеоморфина, продиноморфина, комплекса глиадин-tTg, агглютинина зародыша пшеницы и декарбоксилазы глутаминовой кислоты 65 (ГАД-65). Были обнаружены IgA-антитела против антигенов пшеницы и агглютинина зародыша пшеницы (см. Таблицы 4 и 5, образец #3). Примечательно, что как IgA, так и IgG против tTg находились в пределах нормального диапазона.

Кроме того, протестировали уровни антител против ганглиозида, синапсина мозжечка, основного белка миелина, коллагена, тиреоглобулина и пероксидазы щитовидной железы, и все они были в 2-4 раза выше эталонного диапазона. Эндоскопия и биопсия верхних отделов ЖКТ выявила нормальную гистологическую картину и интраэпителиальные лимфоциты. В целом, у пациентки диагностировали глютеновую чувствительность с ассоциированными аутоиммунными расстройствами, включая глютеновую атаксию, головную боль, аномалии белого вещества и нейромиелит зрительного нерва. Провели пятидневный курс внутривенных инъекций метилпреднизолона, и сенсорные, моторные и визуальные симптомы постепенно улучшились. Кроме того, на основании очень высоких уровней IgG- и некоторых IgA-антител против репертуара антигенов и пептидов пшеницы, ввели безглютеновую диету, и спустя 12 недель в клинической симптоматике пациентки наблюдалось заметное улучшение. Она оставалась на 100% безглютеновой диете под наблюдением диетолога, а лечение стероидами прекратили. Через шесть месяцев после введения диеты повторили тесты на антитела против антигенов и пептидов пшеницы и тканей человека; наблюдалось более чем 60% снижение уровня антител, и симптомы заболевания у пациентки практически исчезли.

Обсуждение: Исходя из указанных данных, автор изобретения пришел к выводу, что пациент может страдать глютеновой иммунореактивностью и чувствительностью без гистологических аномалий тканей или плоского эрозивного гастрита и антител против tTg, на основании которых обычно ставят диагноз целиакии. Если пациентов с глютеновой чувствительностью и иммунореактивностью не обнаруживают вовремя на основе надлежащих лабораторных тестов, в частности, IgG- и IgA-антител против репертуара белков и пептидов пшеницы, многие врачи на основании симптоматики пациентов могут ошибочно лечить своих пациентов от волчанки, синдрома, аналогичного рассеянному склерозу, нейромиелита зрительного нерва и многих других аутоиммунных заболеваний. Следовательно, измерение IgG- и IgA-антител против репертуара антигенов и пептидов пшеницы рекомендуется для пациентов с признаками и симптомами аутоиммунных расстройств, так что введение безглютеновой диеты будет играть важную роль в изменении аутоиммунных состояний, ассоциированных с глютеновой иммунореактивностью и чувствительностью. В противном случае, в отсутствие лечения и/или при неправильном лечении у пациента разовьются множественные аутоиммунные расстройства.

D. Описание случая №4: Глютеновая иммунореактивность и чувствительность, перекрывающаяся с болезнью Крона

Болезнь Крона представляет собой воспалительное расстройство, часто возникающее во время второго или третьего десятилетия жизни, поражая подвздошную кишку у более чем двух третей пациентов (15). Считается, что комбинация генетических и экологических факторов, в том числе изменения кишечной флоры и нарушенные реакции на нее, приводит к нарушениям регуляции иммунитета, изменению барьерной функции кишечника, и, возможно, аутоиммунному расстройству (16).

В настоящем описании представлен 32-летний мужчина, страдавший неприятными ощущениями в желудочно-кишечном тракте и диареей 23 раза в месяц. Результаты лабораторных анализов, включая биохимическую панель, OAK, железо, ферритин, трансферрин, витамин В-12, функции щитовидной железы и анализ мочи, находились в пределах среднего уровня нормального диапазона. После второго посещения и продолжения желудочно-кишечных симптомов его направили к гастроэнтерологу, который назначил дополнительные лабораторные исследования. Указанные тесты представляли собой микробиологический анализ кала и анализ крови на антитела против Н. pylori, Saccharomyces и глиадина. Анализ кала с целью обнаружения Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, энтеропатогенных и энтерогеморрагических Е. coli или Clostridium difficile дал отрицательный результат. Что касается анализов антител в крови, IgG против Н. pylori и IgA против Saccharomyces и глиадина были отрицательны, однако уровень IgG против глиадина был умеренно повышен и составлял 59 Ед/мл (нормальные значения= <20 Ед/мл). Повышение уровня IgG-антител посчитали неспецифическим или защитным, пациенту назначили обезболивающие и отправили домой без диагноза какого-либо конкретного расстройства. Спустя три года, после повышения частоты водянистой диареи до 3-5 раз в день и потери 12 фунтов массы тела в течение последних двух месяцев, пациент пошел к другому гастроэнтерологу за заключением другого врача. Выполнили биопсию и эндоскопию желудка и двенадцатиперстной кишки. В то время как эндоскопия верхних отделов ЖКТ выявила гастрит антрального отдела желудка, с гистологической точки зрения биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки оказались отрицательными. Выполнили тест всасывания D-ксилозы; полученное значение 1,89 г/5 ч в моче указывало на мальабсорбцию. С иммунологической точки зрения, титры ANA были ниже 1:40, p-ANCA и c-ANCA были отрицательными, однако уровень IgA против антигена Saccharomyces (ASCA) был положителен и составлял 85 Ед/мл (нормальное значение= <10 Ед/мл). На основании повышенной частоты водянистой диареи, нарушения всасывания D-ксилозы и положительных IgA-ASCA поставили диагноз болезни Крона. Начали пробную терапию с применением холестирамина, однако частота диареи не изменилась. Кроме того, пациента лечили с применением 230 мг метилпреднизолона и 2×1000 мг месалазина. Через два года после указанного лечения у пациента развились кишечно-кишечные свищи подвздошной кишки с поражением сигмовидной кишки. После поступления в больницу провели илеоколэктомию и резекцию 22 см подвздошной кишки. После выписки назначили поддержание ремиссии с применением 3×500 мг месалазина.

В течение восьми лет после указанного лечения пациент продолжал страдать учащенной водянистой диареей и потерял еще 14 фунтов. В указанный период предприняли несколько дополнительных попыток лечения с применением аспирина, лоперамида и будесонида, к сожалению, без существенного клинического улучшения. Более того, пациент с каждым месяцем терял все больше массы тела. Полный обзор истории болезни выявили тот факт, что почти тринадцать лет назад было установлено повышение IgG-антител против глиадина, что в то время было сочтено нормальным. Так как все классические способы лечения болезни Крона не смогли улучшить клиническую картину за все годы, назначили полный анализ для оценки глютеновой иммунореактивности и чувствительности. Указанный анализ включал IgG и IgA против пшеницы, пептидов нативного и дезамидированного α-глиадина, γ-глиадина, ω-глиадина, глютенина, глютеоморфина, продинорфина, комплекса глиадин-tTg, трансглутаминазы, агглютинина зародыша пшеницы и GAD-65.

Результаты, преведенные в Таблицах 6 и 7, образец №3, показывают, что у пациента наблюдалось значительное повышение IgG-антител против 11 из 12 протестированных антигенов, и было обнаружено, что уровень IgA-антител против пшеницы, 33-мера α-глиадина, ω-глиадина, продинорфина, агглютинина зародыша пшеницы и GAD-65 в 2-5 раза превышал нормальный диапазон. На основании указанных результатов в дополнение к болезни Крона также поставили диагноз глютеновой чувствительности. Немедленно ввели диету, состоящую из риса, картофеля и других продуктов, не содержащих глютена/дрожжей, что через шесть недель привело к полному прекращению диареи. При продолжении безглютеновой диеты не только восстановилась нормальная консистенция стула, но и начала расти масса тела пациента. При последующем наблюдении через год пациент вернулся в нормальное состояние и вновь набрал более 80% потерянной массы тела.

Обсуждение: В настоящем описании клинического случая представлена ассоциация болезни Крона с глютеновой чувствительностью, но не с целиакией. На основании выраженного клинического ответа на безглютеновую диету в сочетании с обнаружением IgG- и IgA-антител против различных антигенов пшеницы, и повторного анализа уровня IgG-антител, обнаруженных 14 лет назад, окончательно установили диагноз болезни Крона с вторичной мальабсорбцией и глютеновой чувствительности. Поскольку обнаружили IgG-антитела против глиадина, но не трансглутаминазы, можно утверждать, что у данного пациента заболевание началось с глютеновой чувствительности, а не с болезни Крона. Первоначально поставили диагноз болезни Крона, несмотря на то, что статья о демонстрации продолжительного воздействия глютена и риске аутоиммунных заболеваний была опубликована в 1999 г. (Ventura A et al., Gastroenterol, 117: 303-310, 1999): к сожалению, указанную статью проигнорировали.

В настоящем описании предположили, что непрерывное воздействие факторов окружающей среды, например, воспаления, вызванного антигеном пшеницы, в течение длительного времени привело к воспалительному заболеванию кишечника или болезни Крона.

Выводы касательно описаний клинических случаев

Вышеописанные исследования клинических случаев показывают важность надлежащего лабораторного тестирования для подтверждения диагноза целиакии, глютеновой иммунореактивности/чувствительности и аутоиммунного расстройства. Указанные исследования демонстрируют, что неправильное тестирование и неправильная диагностика в течение нескольких лет могут привести к страданиям в течение нескольких лет. Очень важно получить наиболее точную информацию и наиболее точный диагноз для дифференцирования одного состояния с другим. На Фиг. 5 и 6 показана сводная информация о современном состоянии тестирования, а также предлагаемое будущее направление для повышения точности диагностики целиакии, предложенное Volta et al. (17). На Фиг. 7 приведена сводная информация о протоколе согласно некоторым аспектам настоящего изобретения, а также предлагается тестирование по отношению к репертуару антигенов и пептидов пшеницы с целью обеспечения наиболее точной информации и подтверждения целиакии, болезни Крона, глютеновой иммунореактивности/чувствительности и аутоиммунного расстройства.

Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что без отхода от концепций изобретения, изложенных в настоящем документе, возможно осуществить многие другие модификации изобретения, помимо уже описанных. Таким образом, не подразумевается ограничение предмета изобретения, за исключением рамок прилагаемой формулы изобретения. Более того, при интерпретации как описания, так и формулы изобретения все термины следует интерпретировать в наиболее широком смысле в соответствии с контекстом. В частности, термины «включает» и «включающий» следует интерпретировать как неисключительным образом относящиеся к элементам, компонентам или этапам, указывая, что упомянутые элементы, компоненты или этапы могут присутствовать, или использоваться, или применяться в сочетании с другими элементами, компонентами или этапами, не упомянутыми явным образом. Если формула изобретения относится по меньшей мере к чему-либо одному, выбранному из группы, состоящей из A, B, C … и N, текст следует интерпретировать таким образом, что требуется только один элемент из группы, а не А плюс N, или В плюс N и т.д.

ЛИТЕРАТУРА

1. Catassi С, Fasano A. Celiac disease. Curr Opin Gastroenterol, 24: 687691,2008.

2. Anderson LA, McMillan SA, Watson RG, et al. Malignancy and mortality in a population-based cohort of patients with coeliac disease or ‘gluten sensitivity.’ World J Gastroenterol, 13: 146-151, 2007.

3. Tanabe S. Analysis of food allergen structures and development of foods for allergic patients. Biosci Biotechnol Biochem, 72: 649-659, 2008.

4. Chin RL, Latov N, Green PHR, et al. Neurological complications of celiac disease. J Clin Neuromusc Dis, 5: 129-137, 2004.

5. Sapone A, Lammers KM, Mazzarella G, et al. Differential mucosal IL-17 expression in two gliadin-induced disorders: gluten sensitivity and the autoimmune enteropathy celiac disease. Int Arch Allergy Immunol. 152: 75-80, 2010.

6. Sapone A, Lammers KM, Casolaro V, et al. Divergence of gut permeability and mucosal immune gene expression in two gluten-associated conditions: celiac disease and gluten sensitivity. BMC Med. 9: 23, 2011.

7. Vojdani A, O’Bryan T, Kellermann GH. The immunology of immediate and delayed hypersensitivity reaction to gluten. Eur JInjlamm. 6(1): 1-10, 2008.

8. Shor DB, Barzilai O, Ram M, et al. Gluten sensitivity in multiple sclerosis: experimental myth or clinical truth? Ann NYAcadSci, 1173: 343-349, 2009.

9. Vojdani A, O’Bryan T, Green JA, et al. Immune response to dietary proteins, gliadin and cerebellar peptides in children with autism. Nutr Neurosci. 7(3): 151 - 161, 2004.

10. Hadjivassiliou M, Grunewald RA, Lawden M, et al. Headache and CNS white matter abnormalities associated with gluten sensitivity. Neurol, 56: 385-388, 2001.

11. Catassi C, et al. Detection of Celiac disease in primary care: a multicenter case-finding study in North America. Am J Gastroenterol, 102:1454-1460, 2007.

12. Sanders DS, et al. Antibody negative coeliac disease presenting in elderly people-an easily missed diagnosis. BMJ, 330: 775-776, 2005.

13. Matthias T, Neidhofer S, Pfeiffer S, et al. Novel trends in celiac disease. Cell. Mol. Immunol. 8: 121-125, 2011.

14. Jacob S et al. Gluten sensitivity and neuromyelitis optica: Two case reports. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 76: 1028-1030, 2005.

15. Egan СЕ, et al. Synergy between intraepithelial lymphocytes and lamina propria T cells drives intestinal inflammation during infection. Mucosal Immunol, 4: 658670, 2011.

16. Kaser A et al. Inflammatory Bowel Disease. Annu Rev Immunol, 28: 573-621, 2010.

17. Volta U and Villanaci V. Celiac disease: diagnostic criteria in progress. Cell Mol Immunol, 8:96-102, 2011.

18. Vojdani A. 2011. The characterization of the repertoire of wheat antigens and peptides involved in the humoral immune responses in patients with gluten sensitivity and Crohn’s disease. ISRN Allergy. Article ID 950104, 1-12.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использована для диагностики ассоциированного с кишечником заболевания и/или ассоциированной с кишечником патологии у животного. Способ включает получение образца от указанного животного. Проводят измерение первого сигнала, полученного за счет связывания первой части образца с антигеном цельной пшеницы, содержащим растворимые в спирте и растворимые в воде антигены пшеницы. Измеряют второй сигнал, полученный за счет связывания второй части образца с антигеном глиадина, включающим дезамидированный α-глиадин. Также проводят измерение третьего сигнала, полученного за счет связывания третьей части образца с антигеном, выбранным из группы, состоящей из: (1) агглютинина зародыша пшеницы; (2) глютеоморфина; (3) глютенина; (4) дезамидированного глютенина; и (5) продинорфина, и анализ результатов указанного теста. При этом полученные результаты свидетельствуют о наличии целиакии в случае, если указанный первый сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против указанных антигенов пшеницы, указанный второй сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против антигена глиадина, и указанный третий сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, состоящей из глютеоморфина, глютенина, дезамидированного глютенина и продинорфина. Полученные результаты свидетельствуют о наличии глютеновой иммунореактивности и чувствительности в случае, если указанный первый сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против указанных антигенов пшеницы, указанный второй сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против антигена глиадина, за исключением дезамидированного α-глиадина, и указанный третий сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, состоящей из глютеоморфина, глютенина, или свидетельствует об отсутствии IgA или IgG против дезамидированного глютенина. Группа изобретений относится также к варианту способа диагностики, к планшету для осуществления теста для применения в способе дианостики. Использование данной группы изобретений позволяет дифференцировать глютеновую иммунореактивность и чувствительность, латентную целиакию, болезнь Крона и другие кишечные патологии от классической целиакии. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 7 ил., 8 табл., 4 пр.

1. Способ диагностики ассоциированного с кишечником заболевания и/или ассоциированной с кишечником патологии у животного, включающий:

получение образца от указанного животного;

измерение первого сигнала, полученного за счет связывания первой части образца с антигеном цельной пшеницы, содержащим растворимые в спирте и растворимые в воде антигены пшеницы;

измерение второго сигнала, полученного за счет связывания второй части образца с антигеном глиадина, включающим дезамидированный α-глиадин; и

измерение третьего сигнала, полученного за счет связывания третьей части образца с антигеном, выбранным из группы, состоящей из: (1) агглютинина зародыша пшеницы, (2) глютеоморфина, (3) глютенина; (4) дезамидированного глютенина; и (5) продинорфина,

и анализ результатов указанного теста,

при этом полученные результаты свидетельствуют о наличии целиакии в случае, если указанный первый сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против указанных антигенов пшеницы, указанный второй сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против антигена глиадина, и указанный третий сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, состоящей из глютеоморфина, глютенина, дезамидированного глютенина и продинорфина; и

при этом полученные результаты свидетельствуют о наличии глютеновой иммунореактивности и чувствительности в случае, если указанный первый сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против указанных антигенов пшеницы, указанный второй сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против антигена глиадина, за исключением дезамидированного α-глиадина, и указанный третий сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, состоящей из глютеоморфина, глютенина, или свидетельствует об отсутствии IgA или IgG против дезамидированного глютенина.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец включает сыворотку крови.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный образец включает слюну.

4. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап измерения четвертого сигнала, который получен в результате связывания четвертой части указанного образца с антигеном, выбранным из группы, состоящей из декарбоксилазы глутаминовой кислоты и пептида мозжечка,

при этом полученные результаты свидетельствуют о наличии глютеновой иммунореактивности/чувствительности и аутоиммунного расстройства, в случае, если указанный первый сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против указанных антигенов пшеницы, указанный второй сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против антигена глиадина, за исключением дезамидированного α-глиадина, указанный третий сигнал свидетельствует о присутствии IgА или IgG против по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, состоящей из глютеоморфина, глютенина, или свидетельствует об отсутствии IgG или IgA против дезамидированного глютенина, и указанный четвертый сигнал свидетельствует о присутствии IgG против по меньшей мере одного из антигенов, выбранных из декарбоксилазы глутаминовой кислоты и пептида мозжечка.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один из антигенов пшеницы дезамидирован.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что животное представляет собой человека.

7. Способ по п. 6, включающий тестирование образца, полученного от человека, включающее:

проведение тестирования или получение образца, протестированного на IgA против дезамидированного 33-мера α-глиадина или трансглутаминазы-2; и

тестирование или получение образца, протестированного на IgA против дезамидированного 21-мера глютенина, и

использование результатов тестирования для осуществления исследования, помогающего отличить целиакию от: (а) глютеновой иммунореактивности и чувствительности и (б) диагноза, связанного с глютеновой иммунореактивностью/чувствительностью и аутоиммунным расстройством.

8. Способ по п. 7, дополнительно включающий проведение тестирования или получение образца, протестированного на присутствие серологической картины, которая указывает на латентную целиакию, отличающийся тем, что:

по меньшей мере один из тестов на IgA и IgG против по меньшей мере одного из: 33-мера α-глиадина, 33-мера дезамидированного α-глиадина, 25-мера α-глиадина, 18-мера α-глиадина, 17-мера α-глиадина, 15-мера γ-глиадина, 17-мера ω-глиадина, глютенина, дезамидированного глютенина, глютеоморфина, продинорфина и агглютинина зародыша пшеницы является положительным; и

как тест на IgA, так и тест на IgG против трансглутаминазы-2 являются отрицательными, и по меньшей мере один из тестов на IgA и IgG против по меньшей мере одного из трансглутаминазы-3 и трансглутаминазы-6 являются положительными.

9. Способ по п. 7, дополнительно включающий проведение тестирования или получение образца, протестированного на присутствие серологической картины, которая указывает на глютеновую иммунореактивность и чувствительность, отличающийся тем, что:

по меньшей мере один из тестов на IgA и IgG против по меньшей мере одного из α-глиадина, γ-глиадина, ω-глиадина, глютенина, дезамидированного глютенина, глютеоморфина и агглютинина зародыша пшеницы является положительным; и

как тест на IgA, так и тест на IgG к дезамидированному α-глиадину, дезамидированному глютенину или трансглутаминазе-2 являются отрицательными.

10. Способ по п. 7, дополнительно включающий проведение тестирования или получение образца, протестированного на присутствие серологической картины, которая указывает на диагноз, относящийся к глютеновой иммунореактивности и чувствительности и аутоиммунному расстройству, отличающийся тем, что:

по меньшей мере один из тестов на IgA и IgG против по меньшей мере одного из нативного α-глиадина, γ-глиадина, ω-глиадина, глютенина, дезамидированного глютенина, глютеоморфина и агглютинина зародыша пшеницы является положительным;

по меньшей мере один из тестов на IgG, IgA и IgM к по меньшей мере одному из: декарбоксилазы глутаминовой кислоты и ткани мозжечка является положительным; и

тест на IgA к дезамидированному α-глиадину, дезамидированному глютенину или трансглутаминазе является отрицательным.

11. Способ диагностики ассоциированного с кишечником заболевания и/или ассоциированной с кишечником патологии у пациента, включающий:

получение образца от указанного пациента;

скрининг на присутствие по меньшей мере одного из антител IgG и IgA у указанного пациента способом, включающим

получение результатов тестирования, полученных из измерения первого, второго и третьего сигналов, причем первый сигнал получают за счет связывания первой части образца с антигеном цельной пшеницы, содержащим растворимые в спирте и растворимые в воде антигены пшеницы, второй сигнал получают за счет связывания второй части образца с антигеном глиадина, включающим дезамидированный α-глиадин, а третий сигнал получают за счет связывания третьей части образца с антигеном, выбранным из группы, состоящей из: (1) агглютинина зародыша пшеницы; (2) глютеоморфина; (3) глютенина; (4) дезамидированного глютенина; и (5) продинорфина; и

применение результатов теста для того, чтобы выяснить, что у указанного пациента присутствует ассоциированное с кишечником заболевание и/или ассоциированная с кишечником патология,

при этом полученные результаты свидетельствуют о наличии целиакии в случае, если указанный первый сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против указанных антигенов цельной пшеницы, указанный второй сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против дезамидированного α-глиадина, и указанный третий сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, состоящей из глютеоморфина, глютенина, дезамидированного глютенина и продинорфина, и

при этом полученные результаты свидетельствуют о наличии глютеновой иммунореактивности и чувствительности или наличии глютеновой иммунореактивности и чувствительности и аутоиммунного расстройства в случае, если указанный первый сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против указанных антигенов цельной пшеницы, указанный второй сигнал свидетельствует об отсутствии IgA или IgG против дезамидированного α-глиадина, и указанный третий сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, состоящей из глютеоморфина, глютенина, или свидетельствует об отсутствии IgA или IgG против дезамидированного глютенина.

12. Способ по п. 11,

дополнительно включающий этап измерения четвертого сигнала, который получен в результате связывания четвертой части указанного образца с антигеном, выбранным из группы, состоящей из декарбоксилазы глутаминовой кислоты и пептида мозжечка,

при этом полученные результаты свидетельствуют о наличии глютеновой иммунореактивности/чувствительности и аутоиммунного расстройства, в случае, если указанный первый сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против указанных антигенов пшеницы, указанный второй сигнал свидетельствует о присутствии IgA или IgG против антигена глиадина, за исключением дезамидированного α-глиадина, указанный третий сигнал свидетельствует о присутствии IgА или IgG против по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, состоящей из глютеоморфина, глютенина, или свидетельствует об отсутствии IgG или IgA против дезамидированного глютенина, и указанный четвертый сигнал свидетельствует о присутствии IgG против по меньшей мере одного из антигенов, выбранных из декарбоксилазы глутаминовой кислоты и пептида мозжечка..

13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что антиген глиадина выбран из группы, состоящей из 33-мера α-глиадина, 25-мера α-глиадина, 18-мера α-глиадина, 17-мера α-глиадина, 15-мера γ-глиадина и 17-мера ω-глиадина.

14. Способ по п. 11, дополнительно включающий применение результатов теста, которые помогают выяснить наличие целиакии у указанного пациента.

15. Способ по п. 11, дополнительно включающий обеспечение результатов тестирования образца по меньшей мере на пять антител из антител к α-глиадину, γ-глиадину, ω-глиадину, глютенину, агглютинину зародыша пшеницы, глютеоморфину, продинорфинам, трансглутаминазе и глиадин-связанной трансглутаминазе.

16. Способ по п. 11, дополнительно включающий обеспечение результатов тестирования образца по меньшей мере на пять антител к α-глиадину, γ-глиадину, ω-глиадину, глютенину, агглютинину зародыша пшеницы, глютеоморфину, продинорфину и трансглутаминазе.

17. Способ по п. 11, дополнительно включающий применение результатов тестов, которые помогают выяснить наличие у пациента по меньшей мере одного из: глютеновой иммунореактивности и чувствительности и глютеновой иммунореактивности и чувствительности и аутоиммунного расстройства.

18. Способ по п. 11, дополнительно включающий обеспечение или получение результатов тестов, полученных на основании измерения сигналов, происходящих за счет связывания антител пациента с (а) по меньшей мере одним из α-глиадина и трансглутаминазы, и (b) по меньшей мере одного из растворимых в воде и спирте компонентов пшеницы, агглютинина зародыша пшеницы, ω- и γ-глиадинов, глютенина и глютеоморфина.

19. Планшет для осуществления теста для применения в способе согласно любому из пп. 1, 7, 11 и 18, содержащий по меньшей мере три связанных тестируемых вещества, при этом указанные вещества представляют собой антигены пшеницы, выбранные из: (1) растворимых в воде и спирте компонентов пшеницы в качестве первого вещества, (2) дезамидированного α-глиадина в качестве второго вещества; и (3) дезамидированного глютенина в качестве третьего вещества.

20. Планшет по п. 19, отличающийся тем, что указанный планшет дополнительно содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из 33-мера α-глиадина, 17-мера α-глиадина, 15-мера γ-глиадина, 17-мера ω-глиадина, в качестве второго вещества; и/или указанный планшет дополнительно содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из 21-мера глютенина, 16-мера глютеоморфина, продинорфина, глиадин-связанной трансглутаминазы и агглютинина зародыша пшеницы, в качестве третьего вещества.

21. Планшет для осуществления теста по п. 19 или 20, содержащий по меньшей мере пять связанных тестируемых веществ.

22. Планшет для осуществления теста по п. 19 или 20, содержащий по меньшей мере семь связанных тестируемых веществ.

23. Планшет для осуществления теста по п. 19 или 20, содержащий каждое из указанных связанных тестируемых веществ.

24. Набор для осуществления теста, включающий планшет для осуществления теста по п. 19 и инструкции по применению указанного планшета.