СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕЙРОНОВ И ИХ АКСОНОВ В ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/48 A61D99/00 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности нейробиологии, и может быть использовано для выявления нейронов и их аксонов на нейрохимическом уровне у животных (крыс, кроликов, кошек).

В расположении нейроморфологов и нейробиологов имеется широкий спектр методик для выявления нервных структур в органах, системах органов и в тканях. Классические методы выявления нейронов в центральной нервной системе и, в частности, в стволе мозга по Н.Н. Боголелепову, Нисслю, Гольджи, Марки, Ferrari, Kishida и многие другие, очень трудоемки, требуют применения весьма дорогих реактивов и оборудования. Существующие методики, хотя и окрашивают нейроны с их дендритами, не выявляют тончайших нервных волокон в структурных образованиях мозга.

Наиболее близким из способов выявления нервных элементов в тканях и, в частности, выявления нейронов в ЦНС является метод с азотнокислым кобальтом по Де Фано [Пирс Э. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. М. 1962; Лойд 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М., «Мир», 1982].

Суть метода заключается в следующем:

а) кусочки толщиной 3-4 мм фиксируют в смеси следующего состава: Co(N0₃)₂ 1 г, дистиллированной воды 100 см³, кислого формалина 15 см³. Продолжительность фиксации - 6-8 часов для молодых и 12-24 часа для взрослых тканей. Комнатная температура;

б) фиксированный материал быстро ополаскивают и помещают в 1,5% раствор азотнокислого серебра (AgN0₃), в темноте, при комнатной температуре на 24-48 часа, в зависимости от величины кусочков;

в) далее, после быстрого ополаскивания в дистиллированной воде, кусочки материала переносят на 8-24 часа для восстановления в смесь: гидрохинона 1-2 г, нейтрального формалина 15 см³, воды 100 см³, сульфида натрия (безводный) 0,1-0,5 г (количество сульфида натрия достаточное, чтобы в ванне сразу появилась желтоватая окраска). Раствор готовят перед самым употреблением.

г) далее исследуемый материал быстро ополаскивают водой, заливают в парафин или целлоидин.

Однако проведение метода Де Фано является малоинформативным, так как неспецифичность окраски нервных структур и окружающих их соединительно-тканных и клеточных образований приводит к наслаиванию ионов Ag+ на основные компоненты ткани.

Наиболее близким по технической сущности является способ выявления нервных структур в тканях. Патент №2595849. Суть данного способа заключалась в следующем:

а) перфузируют кусочки исследуемого материала через сосуды 5% раствором глюкозы;

б) на 10-15 минут исследуемый материал помещают в 1-2% раствор диметил-сульфоксида на дистиллированной воде с последующей промывкой сосудистого русла 5% раствором глюкозы шприцом;

в) далее шприцом вводят в сосуды 2% раствор Co(NO₃)₂ нa 15-20 минут;

г) промывают 5% раствором глюкозы в течение 1-2 минут;

д) помещают объект исследования в смесь следующего состава: 10%Na₂S и 70% этиловый спирт - от 1 до 8 часов (время определяют эмпирическим путем в зависимости от структуры и массы органа);

е) промывают в дистиллированной воде до исчезновения запаха сероводорода;

ж) фиксируют в 10% нейтральном формалине - 3 суток;

з) приготавливают на замораживающем микротоме гистологические срезы и докрашивают их в 0,15% растворе галлоцианина. Время окрашивания варьируют от 16 до 24 часов;

и) проводят традиционную проводку через реактивы, заключение в бальзам по стандартной методике.

Однако и этот способ не дает полной информации о структуре нейронов и их дендритов и, особенно, нейронов ганглиев парасимпатического отдела вегетативной нервной системы, их связей и требует проведения дополнительной окраски стромы, что приводит к искажению структуры аксональных волокон.

Задачей изобретения является повышение эффективности выявления нейронов, их аксонов и дендритов, информативности биохимических процессов и экономичности.

Поставленная задача достигается первоначальной перфузией исследуемого материала в 5% растворе глюкозы с последующим введением в сосуды 0,133 м раствора или CoSO₄ на 5% растворе глюкозы и дальнейшим помещением исследуемых кусочков мозга в 10% раствор Na₂S с 70° этиловым спиртом с кратковременным ополаскиванием (10-15 минут) в 10% растворе формалина с докрашиванием срезов в 0,1% растворе AgNO₃.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Сразу после забоя животного, промывают сосуды мозга теплым 5% раствором глюкозы при t=37-40°С.

2. Вводят в сосуды 0,133 м раствор на 5% глюкозе на 15-20 минут. При отсутствии можно использовать CoSO₄.

3. Вымывают раствор кобальта теплым 5% раствором глюкозы.

4. Кусочки мозга помещают в 10% раствор Na₂S на 5-10 часов. Последняя готовится следующим образом - 31 г. Na₂S-9Н₂O+69 мл дистиллированной воды. Эту смесь фильтруют перед использованием и к 2 мл 10% раствора Na₂S добавляют 100 мл 70° спирта.

5. Вымывают Na₂S раствором глюкозы, кусочки мозга ополаскивают в течение 5-10 минут в 10% растворе формалина, промывают в дистиллированной воде, режут на замораживающем микротоме.

6. Срезы быстро обрабатывают, не более 10 секунд, в 0,1% растворе AgNO₃, тщательно промывают в дистиллированной воде с последующим обезвоживанием и заливают в бальзам.

Результат: В нейронах выявляются черные гранулы сульфида кобальта (CoS), которые их маркируют (CO₂+Na₂S→CoS→черный осадок). Кроме того, выявляются тончайшие нервные волокна аксонов и дендритов (CoS+2Ag→Ag₂S) темно-коричневого цвета.

Применение методики позволяет сделать заключение о достаточно высокой чувствительности и селективности разработанного гистохимического метода на основе реакции сульфида кобальта в сочетании с солями серебра.

Изобретение относится к нейробиологии и может использоваться для выявления нейронов и их аксонов на нейрохимическом уровне у животных (крыс, кроликов, кошек). Изобретение относится к способу выявления нейронов и их аксонов в центральной нервной системе, включающему промывку 5% раствором глюкозы сосудов исследуемого материала, помещение его в 10% раствор Na₂S, промывку 5% раствором глюкозы и дистиллированной водой, приготовление срезов и заливку их бальзамом, отличающееся тем, что после промывки сосудов исследуемого материала 5% раствором глюкозы в них на 15-20 минут вводят 0,133 м раствор CoCl₂ или CoSO₄ на 5% глюкозе и после помещения в 10% раствор Na₂S, который вымывают раствором глюкозы, ополаскивают 5-10 минут в 10% растворе формалина, а замороженные срезы быстро, не более 10 секунд, обрабатывают в 0,1% растворе AgNO₃, тщательно промывают в дистиллированной воде, с дальнейшим обезвоживанием и бальзамированием, причем в исследуемых нейронах на микропрепаратах выявляются черные гранулы COS и тончайшие аксоны и дендриты темно-коричневого оттенка. Способ обеспечивает повышение эффективности выявления нейронов, их аксонов и дендритов.

Способ выявления нейронов и их аксонов в центральной нервной системе, включающий промывку 5% раствором глюкозы сосудов исследуемого материала, помещение его в 10% раствор Na₂S, промывку 5% раствором глюкозы и дистиллированной водой, приготовление срезов и заливку их бальзамом, отличающееся тем, что после промывки сосудов исследуемого материала 5% раствором глюкозы в них на 15-20 минут вводят 0,133 м раствор CoCl₂ или CoSO₄ на 5% глюкозе и после помещения в 10% раствор Na₂S, который вымывают раствором глюкозы, ополаскивают 5-10 минут в 10% растворе формалина, а замороженные срезы быстро, не более 10 секунд, обрабатывают в 0,1% растворе AgNO₃, тщательно промывают в дистиллированной воде, с дальнейшим обезвоживанием и бальзамированием, причем в исследуемых нейронах на микропрепаратах выявляются черные гранулы COS и тончайшие аксоны и дендриты темно-коричневого оттенка.