СПОСОБ ОЦЕНКИ БЕЗОПАСНОСТИ БИОМЕДИЦИНСКИХ КЛЕТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Российский патент 2018 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной технике, и может быть использовано для контроля безопасности биомедицинских клеточных продуктов.

Биомедицинский клеточный продукт (БМКП) представляет собой продукт, состоящий из клеточной (клеточных) линии и вспомогательных веществ либо состоящий из клеточной (клеточных) линии и вспомогательных веществ в сочетании с фармацевтическими субстанциями и (или) медицинскими изделиями. Клеточная линия представляет собой популяцию однородных клеток с воспроизводимым клеточным составом, полученную путем изоляции из организма человека биологического материала с последующим ее культивированием вне организма и предназначенную для использования при разработке, доклинических исследованиях, производстве БМКП. При этом безопасность БМКП для здоровья реципиента определяет возможность его медицинского применения (см. Федеральный закон "О биомедицинских клеточных продуктах" от 23.06.2016 N 180-ФЗ).

Потенциальная опасность БМКП определяется двумя основными факторами:

а) возможностью заражения реципиента инфекционными агентами и продуктами их жизнедеятельности (бактерии, вирусы, грибы, эндотоксины) в результате контаминации БМКП на одном из этапов производства (биологическая опасность БМКП);

б) способностью БМКП образовывать тератомы и (или) индуцировать развитие опухолей в организме реципиента (туморогенная опасность БМКП, син.: тератогенная, канцерогенная опасность БМКП).

Настоящее изобретение предназначено для выявления туморогенной опасности БМКП на этапе его доклинических испытаний.

Туморогенная опасность наиболее характерна для БМКП на основе стволовых клеток человека в силу их высокой пролиферативной активности, а также для БМКП, полученных с использованием стареющих клеточных культур, но может быть выявлена и у БМКП на основе нормальных соматических клеток в связи с непредсказуемостью изменения их генотипа и фенотипа в процессе культивирования. Следует учитывать, что туморогенность БМКП отличается от туморогенности фармацевтического препарата, так как туморогенное преобразование может произойти в самом клеточном компоненте БМКП, а не только у реципиента в результате лечения БМКП. Это определяет необходимость обязательного исследования клеточной культуры и БМКП на ее основе для исключения этой угрозы для здоровья реципиента. Единых методических подходов для решения этой задачи в настоящее время в мире и РФ не разработано.

Известен способ оценки туморогенной безопасности БМКП на основе фибробластов, основанный на детекции процесса «старения» клеточной культуры, из которой получен БМКП, путем регистрации снижения дегидрогеназной активности клеток методом МТТ (Супотницкии М.В., Елапов А.А., Меркулов В.А. и соавт. Основные технологические процессы, используемые при производстве биомедицинских клеточных продуктов. Биопрепараты. 2015. №2. С. 36-45). Метаболический потенциал культивируемой клеточной культуры фибробластов меняется с количеством пассажей. После выделения первичной культуры клеток из биологического образца их дегидрогеназная активность возрастает на протяжении нескольких первых пассажей, но затем начинает постепенно снижаться. Это объясняется тем, что сразу после выделения в клеточной культуре оказывается много зрелых фибробластов, имеющих низкий уровень метаболизма. Доля юных, метаболически активных клеток, с каждым пассажем возрастает вследствие увеличения их количества в культуре и постепенного вытеснения ими зрелых клеток. Однако способность к делению соматических клеток невысока, в результате постепенно доля метаболически активных клеток сокращается. Снижение доли метаболически активных клеток приводит к снижению интегральной дегидрогеназной активности клеток культуры. Недостатком данного способа является то, что он позволяет судить о потенциальной туморогенной опасности БМКП косвенно, на основании вероятной взаимосвязи процессов старения и мутогенного перерождения клеток в культуре.

Известен способ оценки туморогенной безопасности БМКП, основанный на регистрации увеличения экспрессии в клетках БМКП бета-галактозидазы - маркера клеточного старения клеточной культуры in vitro (Wang Y, Zhang Z, Chi Y. et al. Long-term cultured mesenchymal stem cells frequently develop genomic mutations but do not undergo malignant transformation. Cell Death and Disease. 2013; 4: e950).

Недостатком данного способа также является то, что он регистрирует процесс старения клеточной культуры, но не процесс ее туморогенной трансформации.

Известен способ определения туморогенного (тератогенного) потенциала клеточных линий и (или) БМКП на их основе, заключающийся в том, что тестируемые клетки (БМКП) имплантируются под капсулу яичек экспериментальных животных - иммунодефицитных самцов мышей линии C.B.-17/GbmsTac-scid-bgDF N7 (см. Martins JP, Santos JM, deAlmeida JM. et al. Towards an advanced therapy medicinal product based on mesenchymal stromal cells isolated from the umbilical cord tissue: quality and safety data. Stem Cell Res Ther. 2014; 5(1): 9). В качестве положительного контроля используют эмбриональные стволовые клетки линии Н-9. Рост тератомы определяют путем пальпации. Кроме того, на 6-8 неделе после имплантации контрольных и тестируемых клеток проводят гистологическое исследование ткани яичек. Недостатком данного способа является трудоемкость, длительность исследования (2 месяца и более) и необходимость использовать экспериментальных животных.

Ближайшим аналогом к заявленному способу оценки безопасности БМКП является способ, основанный на регистрации увеличения уровня теломеразной активности в клетках БМКП (Giardini MA, Segatto М, daSilva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomere and telomerase biology. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014; 125: 1-40 - прототип). Известно, что чем больше делений проходит клетка в культуре, тем сильнее укорочение теломер ее хромосом. Дисфункция теломер, вызванная их укорачиванием, приводит к нестабильности кариотипа клетки, ее старению и последующему апоптозу либо опухолевой трансформации [Sensebe L. et al. Production of mesenchymal stromal stem cells according to good manufacturing practices: a review. Stem Cell Res. Therapy 2013; 4: 66-71; Chase LG. et al. Development and characterization of a clinicallycompliant xenofree culture medium in good manufacturing practice for human mutipotent mesenchymal stem cells. Stem Cells Transl. Med. 2012; 1: 750-8].

Известно, что в злокачественных и иммортализованных клетках процесс укорочения теломер компенсируется увеличением уровня экспрессии и активности данного фермента. Чем выше способность клетки к неограниченному числу делений (что характерно для клеток с опухолевой трансформацией), тем выше уровень экспрессии и активности hTERT [Скворцов Д.А., Зверева М.Э., Шпанченко О.В., Донцова О.А. Теломераза: методы определения активности. Acta Naturae. 2011. Т. 3. №1. С. 51-73]. Способ-прототип основан на сравнении теломеразной активности в клетках «нулевого» пассажа и клетках в составе БМКП и (или) подлежащих к включению в состав БМКП. При этом туморогенным признается БМКП, уровень теломеразной активности в котором превышает таковой в клетках нулевого пассажа. Недостатком данного способа является отсутствие количественных критериев, позволяющих точно судить о повышении уровня теломеразной активности. Кроме того, нельзя исключить, что клетки «нулевого пассажа» в силу различных причин оказались изначально туморогенными. В таком случае, при регистрации сохраненного уровня теломеразной активности в клетках БМКП относительно клеток «нулевого» пассажа возможны ошибочные заключения о том, что БМКП безопасен для реципиента.

Проблемой, на решение которой направлено изобретение, является оценка безопасности БМКП.

Технический результат - повышение точности за счет использования экспериментально установленных контрольных количественных параметров - уровня теломеразной активности в клетках с различным туморогенным потенциалом.

В результате собственных исследований установлены контрольные уровни теломеразной активности клеток с различным туморогенным потенциалом: клеток, используемых для получения БМКП нулевого пассажа (контроль 1); клеток раковой линии - клеток линии HeLa (контроль 2, положительный); нормальных нераковых клеток, например, линии фибробластов кожи человека (контроль 3, отрицательный); мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК) (контроль 4, рабочий).

Проводится оценка корректности экспериментально установленных контрольных величин и затем сравнивается теломеразная активность исследуемых клеток на раннем пассаже (после выделения) и клеток, используемых для изготовления БМКП (или клеток в составе БМКП). Увеличение или снижение теломеразной активности клеток, зарегистрированные в процессе их пассирования, служат основанием для признания клеточной культуры и БМКП на ее основе опасными для здоровья реципиента.

Новизна данного технического решения заключается в использовании контрольных количественных величин, характеризующих уровень теломеразной активности в клетках с заведомо различным туморогенным потенциалом. Неочевидность предложенного технического решения вытекает из недостаточности современных представлений о количественных значениях уровня теломеразной активности в нормальных клетках, не трансформированных в результате мутагенеза.

Способ осуществляют следующим образом.

Объектом исследования являются клетки контрольных клеточных культур и испытуемые клетки: клетки, используемые для получения БМКП и (или) клетки в составе БМКП. При этом культивирование контрольных и испытуемых клеток проводится по рекомендованным протоколам. Определение уровня теломеразной активности в клетках контрольных и испытуемых культур проводится любым из известных способов, позволяющих выполнить количественное измерение величины данного параметра [Скворцов Д.А. и др. ActaNaturae. 2011. Т. 3. №1. С. 51-73], при условии, что при получении экспериментальных данных используется один метод. Количество измерений для каждой контрольной и испытуемой клеточной культуры должно быть достаточным для получения статистически корректного результата, что достигается использованием технических повторов (не менее трех для каждого эксперимента).

Сначала экспериментально устанавливаются контрольные количественные величины, характеризующие уровень теломеразной активности в клетках с различным туморогенным потенциалом:

- контроль 1: клетки, используемые для получения БМКП на «нулевом» пассаже;

- контроль 2 (положительный): клетки линии HeLa;

- контроль 3 (отрицательный): нормальные нераковые клетки, например нормальные фибробласты кожи человека;

- контроль 4 (рабочий): мезенхимальные стволовые клетки человека (МСК).

Далее проводится оценка корректностей контролей. Для этого сопоставляются уровни теломеразной активности в различных контролях. Контроли считаются корректными при соблюдении следующих условий:

1) уровни теломеразной активности в контролях 3 и 4 достоверно ниже такового в контроле 2;

2) уровень теломеразной активности в контроле 3 достоверно ниже такового в контроле 4.

При соблюдении данных условий контроли считаются корректными.

Далее проводится оценка безопасности испытуемых клеток, используемых для получения БМКП или клеток в составе БМКП. Для этого сравнивается уровень теломеразной активности в клетках, используемых для получения БМКП и (или) клетках в составе БМКП с уровнями теломеразной активности в контролях.

При этом клетки, используемые для получения БМКП и (или) клетки в составе БМКП признаются нетуморогенными (безопасными) при соблюдении следующих условий:

1) уровень теломеразной активности в клетках раннего пассажа не превышает таковой в контролях 2 и 4;

2) уровень теломеразной активности в клетках, используемых для получения БМКП и (или) в клетках в составе БМКП не отличается от такового в контроле 1.

В случае если теломеразная активность в испытуемых клетках раннего пассажа превышает таковую в контроле 4 и оказывается сопоставимой или выше аналогичного показателя в контроле 2, делается вывод о высоком туморогенном потенциале испытуемых клеток и невозможности их использования для производства БМКП.

В случае если теломеразная активность в клетках, используемых для получения БМКП и (или) в клетках в составе БМКП достоверно ниже таковой в контроле 1, делается вывод о старении клеточной культуры в процессе пассирования и невозможности ее использования для производства БМКП.

Сравнение точности оценки безопасности биомедицинских клеточных продуктов по заявленному способу и способу-прототипу

Как известно, при получении БМКП чаще используют первичные клеточные линии, выделенные из биологических тканей донора. Далее они могут использоваться в неизменном виде либо подвергаться направленной трансформации с целью усиления терапевтического эффекта БМКП. Нельзя исключить ситуацию, когда забор биологической ткани у донора с целью наработки первичной клеточной культуры, на основе которой в дальнейшем будет получен БМКП, будет выполнен из локуса, в котором клетки уже подверглись мутагенной трансформации, не зарегистрированной клинически в силу стертой симптоматики. Так как получить подобный клинический материал в экспериментальных целях представляется проблематичным, для иллюстрации данной ситуации в качестве испытуемых клеток нами были использованы клетки с изначально высоким пролиферативным потенциалом, а именно клетки иммортализованной линии кератиноцитов человека линии НаСаТ. Как известно, клетки этой линии обладают фенотипом, похожим на фенотип нормальных кератиноцитов человека, способностью к дифференцировке, наряду с высокой пролиферативной активностью, что ассоциировано с высокой активностью теломеразы в клетках [Ramadan Q, Ting FC. In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin. Lab Chip. 2016; 16(10): 1899-908].

Первоначально осуществили оценку безопасности испытуемых клеток по заявленному способу. Теломеразную активность определяли методом TRAP [Vineis Р, Matullo G, Manuguerra M.An evolutionary paradigm for carcinogenesis? J Epidemiol Community Health. 2003; 57(2): 89-95]. При этом за 100% принимали теломеразную активность в наиболее туморогенных клетках (контроль 2). Количественные значения по контрольным и испытуемым клеткам вычисляли в долях от величины теломеразной активности в контроле 2. Количественные величины полученных контрольных данных представлены ниже:

Контроль 1: 37,9±1,5%;

Контроль 2 (клеточная линия HeLa): 100±2%;

Контроль 3: 0,09±0,01%;

Контроль 4 (мезенхимальные стволовые клетки): 1,27±0,09%.

Затем провели оценку корректности контролей:

1) сравнили уровни количественных величин анализируемого параметра в контролях 2, 3 и 4 и убедились, что теломеразная активность в контролях 3 и 4 достоверно ниже таковой в контроле 2;

2) сравнили теломеразную активность в контролях 3 и 4 и убедились, что величина анализируемого показателя в контроле 3 достоверно ниже таковой в контроле 4.

Сделали вывод о корректности контролей.

Далее провели исследование теломеразной активности испытуемых клеток. Для этого экспериментально оценили величину анализируемого показателя через 10 пассажей, которая составила: 37,2±1,1%.

Далее, следуя заявленному способу, сравнили теломеразную активность в испытуемых клетках раннего пассажа (контроль 1) и через 10 пассажей. Убедились, что величины анализируемого показателя не имеют достоверных отличий. Затем сравнили теломеразную активность контроля 1, контроля 2 контроля 4.

Затем провели экспериментальные испытания безопасности испытуемых клеток согласно способу-прототипу. Для этого оценили их теломеразную активность на раннем (первом) пассаже и через десять пассажей.

Теломеразная активность испытуемых клеток раннего пассажа: 37,9±1,5%;

Теломеразная активность испытуемых клеток через 10 пассажей: 37,2±1,1%.

Согласно способу-прототипу сравнили данные величины и убедились, что они не имеют достоверных отличий, на основании чего признали испытуемые клетки безопасными для здоровья человека.

Таким образом, заявленный способ оценки безопасности биомедицинских клеточных продуктов оказался точнее способа-прототипа.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Оценена потенциальная туморогенная опасность 10 пассажа первичных фибробластов кожи человека, используемых для получения дерматотропного БМКП.

Для этого получили контрольные данные, количественные величины которых представлены ниже:

Контроль 1 (фибробласты кожи нулевого пассажа) 0,001±0,0002%;

Контроль 2 (клеточная линия HeLa) 100±3%;

Контроль 3 (первичные кератиноциты человека) 0,0011±0,0003%;

Контроль 4 (мезенхимальные стволовые клетки) 1,43±0,12%.

Затем провели оценку корректности контролей:

1) сравнили уровни количественных величин анализируемого параметра в контролях 2, 3 и 4 и убедились, что теломеразная активность в контролях 3 и 4 достоверно ниже таковой в контроле 2;

2) сравнили теломеразную активность в контролях 3 и 4 и убедились, что величина анализируемого показателя в контроле 3 достоверно ниже таковой в контроле 4.

Сделан вывод о корректности контролей.

Провели исследование теломеразной активности испытуемых клеток на 10 пассаже, которая составила: 0,0009±0,0002%.

Далее, следуя заявленному способу, сравнили теломеразную активность в испытуемых клетках раннего пассажа (контроль 1) и 10 пассажа. Убедились, что величины анализируемого показателя не имеют достоверных отличий. Затем сравнили теломеразную активность контроля 1, контроля 2 и контроля 4. Установили, что теломеразная активность в испытуемых клетках раннего пассажа (контроль 1) достоверно ниже таковой в контролях 2 и 4, на основании чего сделан вывод о туморогенной безопасности выделенной первичной культуры и возможности ее использования для производства БМКП.

Пример 2. Оценена потенциальная туморогенная опасность 21 пассажа первичных фибробластов кожи человека, используемых для получения дерматотропного БМКП.

Для этого получили контрольные данные, количественные величины которых представлены ниже:

Контроль 1 (фибробласты кожи нулевого пассажа) 0,0012±0,0003%;

Контроль 2 (клеточная линия HeLa) 100±2%;

Контроль 3 (первичные кератиноциты человека) 0,0013±0,0002%;

Контроль 4 (мезенхимальные стволовые клетки) 1,23±0,14%.

Затем провели оценку корректности контролей:

1) сравнили уровни количественных величин анализируемого параметра в контролях 2, 3 и 4 и убедились, что теломеразная активность в контролях 3 и 4 достоверно ниже таковой в контроле 2;

2) сравнили теломеразную активность в контролях 3 и 4 и убедились, что величина анализируемого показателя в контроле 3 достоверно ниже таковой в контроле 4.

Сделан вывод о корректности контролей.

Провели исследование теломеразной активности испытуемых клеток на 21 пассаже, которая составила: 0,0005±0,0001%.

Следуя заявленному способу, сравнили теломеразную активность контроля 1, контроля 2 контроля 4. Установили, что теломеразная активность в испытуемых клетках раннего пассажа (контроль 1) достоверно ниже таковой в контролях 2 и 4. Затем сравнили теломеразную активность в испытуемых клетках раннего пассажа (контроль 1) и 21 пассажа. Убедились, что теломеразная активность клеток 21 пассажа достоверно ниже таковой в контроле 1, на основании чего, в соответствии с заявленным способом, сделан вывод о старении клеточной культуры в процессе пассирования и невозможности ее использования для производства БМКП.

Пример 3. Оценена потенциальная туморогенная опасность клеток линии Сасо-2.

Для этого получили контрольные данные, количественные величины которых представлены ниже:

Контроль 1 (клеточная линия Сасо-2) 126±5%;

Контроль 2 (клеточная линия HeLa) 100±2%;

Контроль 3 (нормальные фибробласты кожи человека) 0,0010±0,0001%;

Контроль 4 (мезенхимальные стволовые клетки) 1,33±0,09%.

Затем провели оценку корректности контролей:

1) сравнили уровни количественных величин анализируемого параметра в контролях 2, 3 и 4 и убедились, что теломеразная активность в контролях 3 и 4 достоверно ниже таковой в контроле 2;

2) сравнили теломеразную активность в контролях 3 и 4 и убедились, что величина анализируемого показателя в контроле 3 достоверно ниже таковой в контроле 4.

Сделан вывод о корректности контролей.

Провели исследование теломеразной активности испытуемых клеток через 10 пассажей, которая составила: 129±7%.

Далее, следуя заявленному способу, сравнили теломеразную активность в испытуемых клетках раннего пассажа (контроль 1) и через 10 пассажей. Убедились, что величины анализируемого показателя не имеют достоверных отличий. Затем сравнили теломеразную активность контроля 1, контроля 2 и контроля 4. Установили, что теломеразная активность в испытуемых клетках раннего пассажа (контроль 1) достоверно превышает таковую в контролях 2 и 4, на основании чего, в соответствии с заявленным способом, сделан вывод о высоком туморогенном потенциале исследуемых клеток и невозможности их использования для производства БМКП.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для оценки безопасности биомедицинского клеточного продукта (БМКП). Устанавливаются контрольные количественные величины, характеризующие уровень теломеразной активности в клетках с различным туморогенным потенциалом. Сопоставляются уровни теломеразной активности в контролях. Проводится оценка безопасности испытуемых клеток, используемых для получения БМКП или клеток в составе БМКП. Изобретение обеспечивает повышение точности за счет использования экспериментально установленных контрольных количественных параметров - уровня теломеразной активности в клетках с различным туморогенным потенциалом. 1 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ оценки безопасности биомедицинского клеточного продукта (БМКП), включающий количественное определение и сравнение уровней теломеразной активности клеток, используемых для получения БМКП на «нулевом» пассаже - контроль 1, и клеток после пассирования при получении БМКП или входящих в состав БМКП - испытуемые клетки, характеризующийся тем, что

устанавливаются контрольные количественные величины, характеризующие уровень теломеразной активности в клетках с различным туморогенным потенциалом:

- контроль 1: клетки, используемые для получения БМКП на нулевом пассаже;

- контроль 2, положительный: клетки HeLa;

- контроль 3, отрицательный: нормальные нераковые клетки;

- контроль 4, рабочий: мезенхимальные стволовые клетки человека;

сопоставляются уровни теломеразной активности в контролях, где контроли считаются корректными, если теломеразная активность в контролях 3 и 4 достоверно ниже, чем в контроле 2, и теломеразная активность в контроле 3 достоверно ниже, чем в контроле 4;

далее проводится оценка безопасности испытуемых клеток, используемых для получения БМКП или клеток в составе БМКП;

если уровень теломеразной активности в контроле 1 не превышает таковой в контролях 2 и 4, а теломеразная активность в испытуемых клетках не отличается от таковой в контроле 1, то БМКП признают нетуморогенными;

если уровень теломеразной активности в клетках контроля 1 превышает таковую в контроле 4 и оказывается равным или выше аналогичного показателя в контроле 2, делают вывод о высоком туморогенном потенциале выделенной первичной культуры и невозможности ее использования для производства БМКП;

если теломеразная активность в испытуемых клетках ниже таковой в контроле 1, делают вывод о старении клеточной культуры в процессе пассирования и невозможности ее использования для производства БМКП.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве нормальных нераковых клеток используют нормальные фибробласты кожи человека или первичные кератиноциты человека.