НАБОР РЕАКТИВОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК Российский патент 2018 года по МПК C12N15/10 

Изобретение относится к биохимии. Известен наиболее близкий набор реактивов для выделения ДНК [RU 2485178, С2, 20.06.2013], способ выделения ДНК из биологических объектов, заключающийся в том, что биологический объект измельчают и помещают в пробирку с лизирующим буферным раствором состава: 0,1 М Трис-HCl, 0,1 М ЭДТА, 0,1 М NaCl, 0,5% N-лаурилсаркозил Na и протеиназы K, рН 6-7, получают клеточный лизат, к лизату добавляют сорбент магнитных наночастиц, модифицированных хитозаном, перемешивают и инкубируют в течение 25-35 мин, пробирку помещают на магнитный штатив, разделяют смесь на фракции - сорбент, связанный с ДНК, и надосадочную жидкость, надосадок удаляют, а к осадку приливают элюирующий буферный раствор состава: 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА, инкубируют, пробирки помещают на магнитный штатив, разделяют смесь на фракции - сорбент - осадок и надосадок - ДНК, растворенная в элюирующем буферном растворе, осадок удаляют, в надосадке остается ДНК-конечный продукт.

Известный набор реактивов для выделения ДНК имеет недостаток: маленький выход ДНК.

Задачей заявляемого набора для выделения ДНК является увеличение выхода ДНК.

В результате использования данного изобретения достигнут технический результат: увеличился выход ДНК до 5 раз, а именно от 200 до 500-1000 нг из 5 г исходного материала.

Технический результат достигается тем, что в качестве лизирующего буферного раствора набор содержит буфер для лизиса и связывания гуанидин тиоцианат формулы C₂H₆N₄S-CH₅N₃·HSCN концентрацией 5 М, трис гидрохлорид формулы C₄H₁₁NO₃·HCl концентрацией 20 мМ, тритон концентрацией 15%, в качестве промывочных растворов: промывочный буфер №1, содержащий гуанидин тиоцианат концентрацией 4 М, трис гидрохлорид концентрацией 25 мМ, этиловый спирт концентрацией 34%, в качестве сорбента - суспензию из магнитных микросфер со средним размером 1,26 мкм в солевом растворе 1 М NaCl и 0,05% NaN₃, промывочный буфер №2, содержащий трис гидрохлорид концентрацией 5 мМ, натрия хлорид концентрацией 15 мМ и этиловый спирт концентрацией 80%, в качестве элюирующего раствора берут деионизированную воду.

Объясняется технический результат тем, найденные в результате экспериментов реактивы и их концентрации оказались оптимальными для максимального выхода ДНК. Кроме того, эти реактивы более доступны и дешевле, чем набор реактивов, использованный в прототипе.

Пример использования заявляемого набора реактивов.

Выделение ДНК проводится из 100 мкл контрольного образца.

1. Внести по 100 мкл образца в 1,5 или 2 мл пробирки.

2. Внести в эти же пробирки по 500 мкл буфера для лизиса и связывания ДНК, перемешать на вортексе.

3. Инкубировать пробирки при 60°С в течение 15 минут.

4. Внести по 10 мкл суспензии магнитных частиц. Перемешать пипетированием.

5. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, перемешивать во время инкубирования 2-3 раза на вортексе.

6. Поместить пробирки в магнитный штатив, подождать, пока частицы полностью соберутся на стенке пробирок (2 минуты) и удалить супернатант.

7. Внести в пробирки по 350 мкл промывочного буфера №1, ресуспендировать магнитные частицы в растворе.

8. Поместить пробирки в магнитный штатив, подождать, пока частицы полностью соберутся на стенках пробирок и удалить супернатант.

9. Внести в пробирки по 350 мкл хорошо перемешанного промывочного буфера №2, перемешать на вортексе.

10. Поместить пробирки в магнитный штатив, подождать, пока частицы полностью соберутся на стенках пробирок и удалить супернатант.

11. Повторить пункты 9 и 10.

12. Поместить пробирки с приоткрытыми крышками в термостат и инкубировать при 60°С в течение 10 минут для просушки и удаления остаточного этанола.

13. Внести в пробирки по 50 мкл элюирующего буфера. Ресуспендировать частицы на вортексе.

14. Инкубировать при 60°С в течение 10 минут, во время инкубирования перемешать 2-3 раза на вортексе.

15. Поместить пробирки в магнитный штатив, подождать, пока частицы полностью соберутся на стенках пробирок.

16. Перенести супернатант, содержащий выделенную ДНК, в новую пробирку.

Таким образом, предлагаемый набор реактивов пригоден для эффективного выделения ДНК из исходного биологического материала.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен набор реактивов для выделения ДНК из биологических объектов. Набор включает лизирующий буферный раствор, промывочные буферные растворы №1 и №2, элюирующий буферный раствор. Лизирующий буферный раствор содержит гуанидин тиоцианат, трис гидрохлорид, тритон и сорбент, в виде суспензии из магнитных микросфер в солевом растворе. Промывочный буфер №1 содержит гуанидин тиоцианат, трис гидрохлорид и этиловый спирт. Промывочный буфер №2 содержит трис гидрохлорид, хлорид натрия и этиловый спирт. Элюирующий раствор представляет собой деионизированную воду. Изобретение обеспечивает увеличение выхода ДНК. 1 пр.

Набор реактивов для выделения ДНК из биологических объектов, включающий лизирующий буферный раствор, промывочные буферные растворы №1 и №2, сорбент - магнитные частицы, элюирующий буферный раствор, отличающийся тем, что в качестве лизирующего буферного раствора используют раствор, содержащий гуанидин тиоцианат формулы C₂H₆N₄S-CH₅N₃·HSCN концентрацией 5 М, трис гидрохлорид формулы C₄H₁₁NO₃·HCl концентрацией 20 мМ, тритон концентрацией 15%, в качестве сорбента - суспензию из магнитных микросфер со средним размером 1,26 мкм в солевом растворе 1 М NaCl и 0,05% NaN₃, в качестве промывочных растворов - промывочный буфер №1, содержащий гуанидин тиоцианат концентрацией 4 М, трис гидрохлорид концентрацией 25 мМ, этиловый спирт концентрацией 34%, промывочный буфер №2, содержащий трис гидрохлорид концентрацией 5 мМ, хлорид натрия концентрацией 15 мМ и этиловый спирт концентрацией 80%, а в качестве элюирующего раствора берут деионизированную воду.