Плазмида, обеспечивающая экспрессию щелочной сериновой протеиназы, содержащая ген, экспрессирующий щелочную сериновую протеиназу семейства S1 из Streptomyces avermitilis VKM Ac-1301, штамм E. coli M15 (pRep4, pQE30-A2.1) - продуцент данной протеиназы Российский патент 2018 года по МПК C12N9/52 C12N1/21 C12N15/57 

Описание патента на изобретение RU2662888C1

Бактериальные протеиназы – это ферменты, катализирующие гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Микробные протеиназы составляют одну из важных групп промышленно и коммерчески получаемых ферментов, объемы продаж которых составляют примерно 2/3 всех продаж ферментов. Динамика роста количества патентов на получение протеиназ является наиболее высокой среди промышленно значимых ферментов.

В качестве источника генетического материала, кодирующего ранее неохарактеризованную протеиназу семейства S1 (далее по тексту белок A2.1), был выбран штамм Streptomyces avermitilis - VKM Ас-1301, относящийся к порядку Actinomycetales.

Для получения искомого гена была проведена амплификация с использованием ДНК-зависимой ДНК-полимеразы Q5 и праймерами:

А2.1_F_wSP_BamHI: TATATGGATCCGCCATCGAGCCGCCC

А2.1_R_HindIII: TATATAAGCTTTCAGAGACGCTGCCACA

При амплификации искомого гена последовательность, кодирующая сигнальный пептид, была исключена. Полученный ПЦР-продукт был обработан эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII и клонирован в экспрессионный вектор pQE30 (pREP4). Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки Е. coli M15 (pREP4), отдельные клоны трансформантов E. coli анализировались на наличие вставки с помощью ПЦР с ДНК–зависимой ДНК–полимеразой Q5, с праймерами к плазмиде. Клоны со вставкой пересевали на ночную культуру для последующего выделения плазмидной ДНК pQE30 (pREP4, pQE30-A2.1). Анализ клонируемой последовательности ДНК проводился методом секвенирования. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего рекомбинантный белок, представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO: 1, а карта полученной плазмидной ДНК представлена на фиг. 1.

Полученный экспрессионный штамм E. coli M15 (pRep4, pQE30-A2.1) позволяет получить протеиназу А2.1 молекулярной массой 44,92 кДа, pH оптимум 8 (при гидролизе 2% денатурированного гемоглобина) и 10–11 (при гидролизе 2% казеина), температурный оптимум 60°С. Показано, что активность протеиназы А2.1 не ингибируется полностью в присутствии SDS и незначительно изменяется в присутствии Triton X–100, Twin 20. Полученные результаты являются предпосылкой для возможного применения данной протеиназы в составе моющих средств.

Похожие патенты RU2662888C1

название год авторы номер документа
РЕКОМБИНАНТНАЯ ДВУХДОМЕННАЯ ЛАККАЗА БАКТЕРИИ Streptomyces griseoflavus Ac-993, ОБЛАДАЮЩАЯ ВЫСОКОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬЮ И ЩЕЛОЧНЫМ ОПТИМУМОМ pН ОКИСЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ; ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ДВУХДОМЕННУЮ ЛАККАЗУ БАКТЕРИИ Streptomyces griseoflavus Ac-993; СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУХДОМЕННОЙ ЛАККАЗЫ БАКТЕРИИ Streptomyces griseoflavus Ac-993 2012
  • Юревич Любовь Игоревна
  • Леонтьевский Алексей Аркадьевич
  • Лисов Александр Викторович
RU2539780C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА (ВАРИАНТЫ), ШТАММ ESCHERICHIA COLI (ВАРИАНТЫ) - ПРОДУЦЕНТ ХИМЕРНЫХ БЕЛКОВ, ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ, КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НА ЦЕЛЛЮЛОЗЕ, СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НА ПОЛИСТИРОЛЬНЫХ НОСИТЕЛЯХ 2008
  • Аксенова Екатерина Ивановна
  • Лунин Владимир Глебович
  • Галушкина Зоя Михайловна
  • Полетаева Нина Николаевна
  • Грабко Владимир Иванович
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2378371C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pESAT6-CFP10-DBD, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli M15 [pREP4, pESAT6-CFP10-DBD], СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ, ИММОБИЛИЗАЦИИ, КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ESAT6-CFP10-DBD НА ДЕКСТРАНЕ, РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК ESAT6-CFP10-DBD И ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ БЕЛОК ESAT6-CFP10-DBD 2013
  • Ткачук Артем Петрович
  • Лящук Александр Михайлович
  • Аксенова Екатерина Ивановна
  • Полетаева Нина Николаевна
  • Галушкина Зоя Михайловна
  • Сергиенко Ольга Васильевна
  • Кондратьева Татьяна Константиновна
  • Апт Александр Соломонович
  • Ерохин Владислав Всеволодович
  • Карягина-Жулина Анна Станиславовна
  • Лунин Владимир Глебович
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2539026C1
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗЫ 1995
  • Эткинсон Хауард Джон
  • Макферсон Майкл Джон
  • Эрвин Питер Эдвард
RU2182598C2
Применение Т5 промотора для экспрессии гена бета-литической протеазы Lysobacter capsici VKM B-2533 и штамм L. capsici blp P-продуцент данной протеазы 2021
  • Афошин Алексей Сергеевич
  • Кудрякова Ирина Валерьевна
  • Леонтьевская Елена Алексеевна
  • Леонтьевская Наталья Валерьевна
RU2787787C1
РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК Collbd-BMP-2, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pCollbd-BMP-2, ШТАММ Escherichia coli-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Collbd-BMP-2, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Collbd-BMP-2 2009
  • Лунин Владимир Глебович
  • Карягина-Жулина Анна Станиславовна
  • Сергиенко Ольга Васильевна
  • Галушкина Зоя Михайловна
  • Лаврова Наталья Витальевна
  • Семихин Александр Сергеевич
  • Шарапова Наталья Евгеньевна
  • Котнова Алина Петровна
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2408727C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ТРЕХ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ ОБОЛОЧКИ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ К СИБИРСКОМУ (DBD2-D3S), ЕВРОПЕЙСКОМУ (DBD2-D3E) И ДАЛЬНЕВОСТОЧНОМУ (DBD2-D3D) ПОДТИПАМ ВИРУСА; РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПЛАЗМИДЫ pDBD2-D3S, pDBD2-D3E И pDBD2-D3D; ШТАММЫ-ПРОДУЦЕНТЫ Escherichia coli M15 [pREP4]; ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2014
  • Лящук Александр Михайлович
  • Аксенова Екатерина Ивановна
  • Ершова Анна Степановна
  • Грунина Татьяна Михайловна
  • Бартов Михаил Сергеевич
  • Савина Дарья Михайловна
  • Манухина Мария Сергеевна
  • Гудов Владимир Петрович
  • Семихин Александр Сергеевич
  • Гра Ольга Алексеевна
  • Ткачук Артем Петрович
  • Галушкина Зоя Михайловна
  • Карягина-Жулина Анна Станиславовна
  • Лунин Владимир Глебович
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2560588C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА Ag85A-DBD И ДЕКСТРАНА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pAg85A-DBD, ШТАММ Escherichia coli [pREP4, pAg85A-DBD], ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК Ag85A-DBD 2013
  • Ткачук Артем Петрович
  • Лящук Александр Михайлович
  • Аксенова Екатерина Ивановна
  • Полетаева Нина Николаевна
  • Галушкина Зоя Михайловна
  • Сергиенко Ольга Васильевна
  • Апт Александр Соломонович
  • Карягина-Жулина Анна Станиславовна
  • Лунин Владимир Глебович
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2520078C1
РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК Collbd-BMP-7, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pCollbd-BMP-7, ШТАММ Escherichia coli-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Collbd-BMP-7, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Collbd-BMP-7 2009
  • Лунин Владимир Глебович
  • Карягина-Жулина Анна Станиславовна
  • Сергиенко Ольга Васильевна
  • Галушкина Зоя Михайловна
  • Лаврова Наталья Витальевна
  • Семихин Александр Сергеевич
  • Шарапова Наталья Евгеньевна
  • Котнова Алина Петровна
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2408730C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА pESAT6-DBD И ДЕКСТРАНА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pESAT6-DBD, ШТАММ Escherichia coli, ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК ESAT6-DBD И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2013
  • Ткачук Артем Петрович
  • Лящук Александр Михайлович
  • Аксенова Екатерина Ивановна
  • Полетаева Нина Николаевна
  • Галушкина Зоя Михайловна
  • Сергиенко Ольга Васильевна
  • Апт Александр Соломонович
  • Карягина-Жулина Анна Станиславовна
  • Лунин Владимир Глебович
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2520737C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 662 888 C1

Реферат патента 2018 года Плазмида, обеспечивающая экспрессию щелочной сериновой протеиназы, содержащая ген, экспрессирующий щелочную сериновую протеиназу семейства S1 из Streptomyces avermitilis VKM Ac-1301, штамм E. coli M15 (pRep4, pQE30-A2.1) - продуцент данной протеиназы

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена плазмидная ДНК pQE30-A2.1, обеспечивающая экспрессию щелочной сериновой протеиназы, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантную щелочную сериновую протеиназу семейства S1 из Streptomyces avermitilis VKM Ac-1301. Предложен штамм E. coli M15 (pRep4, pQE30-A2.1) - продуцент щелочной сериновой протеиназы семейства S1, полученный путем трансформации штамма E. coli М15 (pRep4) указанной плазмидой. Группа изобретений позволяет получать ранее неохарактеризованную протеиназу из Streptomyces avermitilis VKM Ac-1301 с молекулярной массой 44,92 кДа, которая в дальнейшем может быть использована в составе моющих средств. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 662 888 C1

1. Плазмидная ДНК pQE30-A2.1, схема которой представлена на фиг.1, обеспечивающая экспрессию щелочной сериновой протеиназы, содержащая нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1), кодирующую рекомбинантную щелочную сериновую протеиназу семейства S1 из Streptomyces avermitilis VKM Ac-1301.

2. Штамм E. coli M15 (pRep4, pQE30-A2.1) - продуцент щелочной сериновой протеиназы семейства S1, полученный путем трансформации штамма E. coli М15 (pRep4) плазмидой pQE30-A2.1 по п.1.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2018 года RU2662888C1

ПОЛИНУКЛЕОТИД, КОДИРУЮЩИЙ МУТАНТНУЮ РЕКОМБИНАНТНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ Neisseria meningitidis СЕРОГРУППЫ В, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ПОЛИНУКЛЕОТИД, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК, РЕКОМБИНАНТНАЯ IgA1 ПРОТЕАЗА Neisseria memingitidis СЕРОГРУППЫ В, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗРЕЛОЙ ФОРМЫ IgA1 ПРОТЕАЗЫ 2011
  • Румш Лев Давыдович
  • Серова Оксана Викторовна
  • Зинченко Алексей Алексеевич
  • Аллилуев Александр Павлович
  • Козлов Леонид Васильевич
  • Котельникова Ольга Викторовна
  • Жигис Лариса Стефановна
  • Ягудаева Елена Юрьевна
  • Андина Светлана Семеновна
  • Анохина Ирина Викторовна
  • Зуева Вера Сергеевна
  • Гордеева Елена Анатольевна
  • Мелихова Татьяна Дмитриевна
  • Нокель Елена Адамовна
RU2486243C1
US20050112579 A1, 26.05.2005
WO1993000925 A1, 21.01.1993
NCBI Reference Sequence: WP_010982438.1, 15.05.2013; Найдено в Инетрнет 06.09.2017 по адресу: www.ncbi.nlm.nih.gov/protein?cmd=Retrieve&dopt=GenPept&list_uids=499291180#sequence_WP-010982438.1.

RU 2 662 888 C1

Авторы

Афошин Алексей Сергеевич

Шадрин Андрей Михайлович

Лисов Александр Викторович

Леонтьевский Алексей Аркадьевич

Даты

2018-07-31Публикация

2017-04-06Подача