СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТОВ ИЗ РОДА PANAX, ВКЛЮЧАЯ ДИКИЙ ЖЕНЬШЕНЬ ИЛИ ЖЕНЬШЕНЬ, ЛИБО КАМБИАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК, ПРОИСХОДЯЩИХ ИЗ РОДА PANAX, ИЛИ ИХ ЭКСТРАКТОВ, СОДЕРЖАЩИХ РЕДКИЕ ГИНСЕНОЗИДЫ В БОЛЬШОМ КОЛИЧЕСТВЕ Российский патент 2018 года по МПК C12N5/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается способа повышения содержания редких гинсенозидов при получении экстрактов из рода Panax, включая дикий женьшень или женьшень, камбиальных меристематических клеток, происходящих из рода Panax, или их экстрактов, экстрактов женьшеня, полученных этим способом, камбиальных меристематических клеток (CMCs), происходящих из рода Panax, или их экстрактов, полученных этим способом, и композиций для профилактики или лечения диабета, улучшения кровообращения или улучшения функции печени, содержащих полученный этим способом экстракт женьшеня или экстракт камбиальных меристематических клеток (CMCs), происходящих из рода Panax, в качестве активного ингредиента.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Женьшень представляет собой растение, принадлежащее к роду Panax, а его корни применяются в лечебных целях.

Гинсенозиды, которые являются активными ингредиентами, присутствующими в женьшене, ответственны за лекарственные эффекты женьшеня. Гинсенозиды в соответствии со структурой агликона гинсенозида подразделяются на три типа, т.е. гинсенозиды типа протопанаксадиола, гинсенозиды типа протопанаксатриола и гинсенозиды типа олеанана. Производными гинсенозидов являются соединения, в которых такие сахара, как глюкоза, рамноза, ксилоза или арабиноза связаны эфирными связями со спиртовыми OH-группами из R1, R2 и R3 протопанаксадиола или протопанаксатриола, которые являются тритерпеновыми агликонами. Основные гинсенозиды женьшеня, которые известны в настоящее время, включают около 13 распространенных гинсенозидов и около 11 редких гинсенозидов, которые преобразуются из них.

Женьшень может применяться в различных формах, включая свежий женьшень, белый женьшень, получаемый при высушивании свежего женьшеня, и красный женьшень, получаемый при обработке паром свежего женьшеня.

Как известно в данной области, свежий женьшень в основном состоит из таких гликозидов гинсенозидов, как Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd и т.п., а обработанный женьшень может содержать повышенное количество редких гинсенозидов типа Rg3, Rh1, Rh2 и соединения K, которые редко присутствуют в свежем женьшене.

В последнее время активно проводились многие исследования для дальнейшего повышения содержания сапонинов женьшеня, которые присутствуют только в обработанных препаратах женьшеня.

Красный женьшень, репрезентативный продукт обработки женьшеня, может быть получен путем обработки паром свежего женьшеня, причем во время получения могут подвергаться гидролизу гликозиды, присоединенные по положению С-20 агликона гинсенозида, который химически неустойчив. Содержание таких гинсенозидов, как Rh1, Rh2, Rg2, Rg3 и др. в красном женьшене, полученном при такой обработке, больше, чем содержание гинсенозидов в свежем женьшене или в белом женьшене. Однако известно, что гинсенозид Rh2, тип редкого гинсенозида, присутствует в очень небольшом количестве даже в красном женьшене.

Поскольку сообщалось, что эффекты фармакологически активных ингредиентов таких продуктов обработки женьшеня при профилактике рака, подавлении раковых заболеваний, снижении кровяного давления, защите нейронов мозга, противодействии тромбозам, антиоксидантной активности и т.д., лучше, чем у женьшеня, содержащего распространенные гинсенозиды, то применялись различные методы для получения редких гинсенозидов, которые могли бы присутствовать в обработанном женьшене. Наиболее известные способы включают методы повышения содержания определенных гинсенозидов либо при помощи микроорганизмов, либо путем гидролиза сапонинов женьшеня с помощью кислоты и ферментов.

На этом фоне авторы настоящего изобретения обнаружили, что содержание определенных желательных гинсенозидов в камбиальных меристематических клетках, происходящих из рода Panax, может быть повышено при помощи способа, включающего культивирование камбиальных меристематических клеток, происходящих из рода Panax, и тепловую обработку культивируемых камбиальных меристематических клеток, происходящих из рода Panax, и тем самым совершили настоящее изобретение.

Информация, приведенная в разделе «Уровень техники», предназначается только для лучшего понимания предпосылок настоящего изобретения, поэтому она не может содержать информацию, составляющую предшествующий уровень техники, который должен быть известен рядовым специалистам в данной области.

CУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является разработка способа повышения содержания определенных гинсенозидов, к примеру, редких гинсенозидов, которые редко встречаются в необработанных экстрактах из рода Panax или камбиальных меристематических клетках, происходящих из рода Panax, либо их экстрактах, или же способа преобразования распространенных гинсенозидов, находящихся в неочищенных экстрактах из рода Panax или камбиальных меристематических клетках, происходящих из рода Panax, либо их экстрактов, в редкие гинсенозиды, при получении действенных экстрактов из рода Panax, камбиальных меристематических клеток, происходящих из рода Panax, либо их экстрактов.

Техническое решение

Для достижения вышеуказанных целей настоящим изобретением предусмотрен способ повышения содержания гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и протопанаксадиола (в дальнейшем именуется PPD), при получении камбиальных меристематических клеток (в дальнейшем именуются CMCs) из рода Panax либо их экстрактов, который включает: тепловую обработку культивируемых камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax либо их экстракта при температуре от 85°C до 160°C.

Настоящим изобретением также предусмотрен способ повышения содержания гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, при получении экстрактов женьшеня, который включает: тепловую обработку экстракта женьшеня при температуре от 85°C до 160°C.

Настоящим изобретением также предусмотрены камбиальные меристематические клетки (CMCs), происходящие из рода Panax, либо их экстракты, полученные этим способом, у которых содержание гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, выше, чем их содержание до тепловой обработки.

Настоящим изобретением также предусмотрены композиции для профилактики или лечения диабета, включающие камбиальные меристематические клетки (CMCs), происходящие из рода Panax, либо их экстракты или экстракты женьшеня в качестве активного ингредиента. Настоящим изобретением также предусмотрен способ профилактики или лечения диабета, включающий введение субъекту вышеописанных камбиальных меристематических клеток, происходящих из рода Panax, либо их экстракта или экстракта женьшеня, либо содержащей их композиции.

Настоящим изобретением также предусмотрены композиции для улучшения кровообращения, содержащие камбиальные меристематические клетки (CMCs), происходящие из рода Panax, либо их экстракты или экстракты женьшеня в качестве активного ингредиента. Настоящим изобретением также предусмотрен способ улучшения кровообращения, включающий введение субъекту вышеописанных камбиальных меристематических клеток, происходящих из рода Panax, либо их экстракта или экстракта женьшеня, либо содержащей их композиции.

Настоящим изобретением также предусмотрены композиции для улучшения функции печени, содержащие камбиальные меристематические клетки (CMCs), происходящие из рода Panax, либо их экстракты или экстракты женьшеня в качестве активного ингредиента. Настоящим изобретением также предусмотрен способ улучшения функции печени, включающий введение субъекту вышеописанных камбиальных меристематических клеток, происходящих из рода Panax, либо их экстракта или экстракта женьшеня, либо содержащей их композиции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 представлены результаты анализа редких гинсенозидов при детектировании методом HPLC в том случае, когда перед тепловой обработкой проводилось статическое культивирование. A: экстракция при 85°C в течение 24 ч; B: экстракция при 85°C в течение 48 ч; C: экстракция при 85°C в течение 72 ч.

На фиг. 2 представлены результаты анализа редких гинсенозидов при детектировании методом HPLC в том случае, когда перед тепловой обработкой не проводилось статическое культивирование. A: экстракция при 85°C в течение 24 ч; B: экстракция при 85°C в течение 48 ч; C: экстракция при 85°C в течение 72 ч.

На фиг. 3 представлены результаты анализа редких гинсенозидов при детектировании методом HPLC в зависимости от времени статического культивирования перед тепловой обработкой.

На фиг. 4 представлены результаты анализа редких гинсенозидов при детектировании методом HPLC в тех случаях, когда проводилось или не проводилось перемешивание.

На фиг. 5 представлены результаты анализа распространенных гинсенозидов в образцах, содержащих CMCs из дикого женьшеня, женьшень, красный женьшень, выращенный в лесу женьшень или культивированные придаточные корни дикого женьшеня, до тепловой обработки. A: CMCs дикого женьшеня; B: женьшень; C: красный женьшень, D: выращенный в лесу женьшень; E: культивированные придаточные корни дикого женьшеня.

На фиг. 6 представлены результаты анализа обнаруженных редких гинсенозидов в образцах, содержащих CMCs из дикого женьшеня, женьшень, красный женьшень, выращенный в лесу женьшень или культивированные придаточные корни дикого женьшеня, после сушки горячим воздухом и тепловой обработки. A: CMCs дикого женьшеня; B: женьшень; C: красный женьшень, D: выращенный в лесу женьшень; E: культивированные придаточные корни дикого женьшеня.

На фиг. 7 представлены результаты перорального теста на толерантность к глюкозе (OGTT), проводившегося для проверки антидиабетического эффекта CMCs дикого женьшеня, полученных в соответствии с одним примером настоящего изобретения.

На фиг. 8 представлены результаты антитромбоцитарного теста в отношении CMCs дикого женьшеня, полученных в соответствии с одним примером настоящего изобретения.

На фиг. 9 представлены результаты оценки улучшения функции печени при гепатите под действием CMCs из дикого женьшеня, полученных в соответствии с одним примером настоящего изобретения (ALT, аланинаминотрансфераза; АСТ, аспартатаминотрансфераза; GalN, D-галактозамин).

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не указано иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют такие же значения, которые обычно понимаются рядовыми специалистами в той области, к которой относится изобретение. Как правило, использующаяся здесь номенклатура и экспериментальные методы, которые будут описаны ниже, являются хорошо известными и широко применяются в данной области.

В одном аспекте настоящее изобретение касается способа повышения содержания гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, при получении камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax либо их экстрактов, который включает: тепловую обработку культивируемых камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax либо их экстракта при температуре от 85°C до 160°C.

Настоящее изобретение также касается способа повышения содержания гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, при получении экстрактов женьшеня, который включает: тепловую обработку экстракта женьшеня при температуре от 85°C до 160°C.

В соответствии с настоящим изобретением, можно значительно повысить содержание редких гинсенозидов, в особенности Rh2, посредством тепловой обработки культивируемых камбиальных меристематических клеток из рода Panax либо их экстрактов, но не стандартным способом обработки паром или обработки кислотой, ферментами или микроорганизмами.

В настоящем изобретении термин “камбиальные меристематические клетки, происходящие из рода Panax” относится к исходно недифференцированным клеткам, выделенным из ткани камбия из рода Panax, которые отличаются тем, что они являются однородными клетками, не подвергались дедифференцировке в каллюс и сохраняют меристематическую непрерывность. Авторы настоящего изобретения впервые выделили из камбия растений камбиальные меристематические клетки из рода Panax, которые являются исходно дифференцированными однородными клетками, в отличие от дедифференцированного каллюса. Способ выделения камбиальных меристематических клеток из рода Panax подробно описан в Korean Patent No. 1064518, который включен сюда в качестве ссылки.

Камбиальные меристематические клетки, которые применяются в настоящем изобретении, могут представлять собой, к примеру, камбиальные меристематические клетки из белого женьшеня, дикого женьшеня или выращенного в лесу женьшеня, хотя тип женьшеня, из которого происходят камбиальные меристематические клетки, не имеет особых ограничений, если только это будут камбиальные меристематические клетки из рода Panax, которые являются исходно недифференцированными однородными клетками, не подвергались дедифференцировке в каллюс и сохраняют меристематическую непрерывность. Происхождение растений из рода Panax, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не имеет особых ограничений. Например, род Panax, который используется в настоящем изобретении, может быть представлен женьшенем из Кореи, США, Японии, Гималаев, Вьетнама или Китая. Примеры камбиальных меристематических клеток из рода Panax, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, без ограничения, целые меристематические клетки либо их порошки, концентраты или экстракты. В одном воплощении настоящего изобретения для преобразования гинсенозидов в редкие гинсенозиды в основном применяются порошки или экстракты (обычные экстракты гинсенозидов), но при практическом применении настоящего изобретения также можно использовать любые формы, которые вообще имеются в продаже в данной области.

Экстракты меристематических клеток или экстракты женьшеня могут быть получены любым способом, который обычно применяется в данной области. Например, экстракты могут быть получены путем смешивания 1 весовой части меристематических клеток или высушенного женьшеня с 10-500 весовыми частями дистиллированной воды, а затем экстрагирования при температуре от 50°C до 100°C.

При этом авторы настоящего изобретения обнаружили, что при использовании красного женьшеня, выращенного в лесу женьшеня или культивируемых придаточных корней дикого женьшеня не следует ожидать, что содержание таких редких гинсенозидов, как Rh2, повысится до требуемого уровня, даже с применением способа по настоящему изобретению, но содержание редких гинсенозидов типа Rh2 в камбиальных меристематических клетках из рода Panax может значительно повыситься при простой тепловой обработке культивируемых камбиальных меристематических клеток из рода Panax.

Такие гинсенозиды, как Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 или PPD являются редкими гинсенозидами, которые содержатся в очень небольших количествах в необработанном женьшене, не подвергавшемся обработке в соответствии с настоящим изобретением, или же практически отсутствуют или не присутствуют в необработанном женьшене. Однако в соответствии со способом настоящего изобретения такие гинсенозиды, как Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Гипенозид XVII или F2 (в дальнейшем именуются распространенными гинсенозидами), которые в основном содержатся в необработанных экстрактах женьшеня, камбиальных меристематических клетках из рода Panax или их экстрактах, превращаются в редкие гинсенозиды в процессе тепловой обработки. При этом повышается содержание редкого гинсенозида Rh2 и одного или нескольких редких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, по сравнению с необработанными (не подвергавшимися тепловой обработке) экстрактами женьшеня, камбиальными меристематическими клетками из рода Panax или их экстрактами.

В некоторых случаях, согласно настоящему изобретению, повышается содержание Rh2, Rg3, Rg5 и PPD либо Rh2, Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, именуемых “редкими гинсенозидами”, в камбиальных меристематических клетках из рода Panax или их экстрактах.

Кроме того, может повышаться содержание Rh2, Rg3, Rg5 и PPD в экстрактах женьшеня по сравнению с не подвергавшимися специальной обработке необработанными (не подвергавшимися тепловой обработке) экстрактами женьшеня.

Повышение содержания редких гинсенозидов может означать превращение распространенных гинсенозидов в редкие гинсенозиды способом настоящего изобретения. В частности, это может означать, что Rh2 и один или несколько гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, в экстрактах женьшеня, камбиальных меристематических клетках из рода Panax или их экстрактах, полученных по настоящему изобретению, содержатся в количестве 80-100% масс. или 90-98% масс. от общей массы гинсенозидов. Если редкие гинсенозиды типа Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, содержатся в количестве 80-100% масс., то содержание распространенных гинсенозидов, к примеру, Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd, гипенозид XVII или F2, может составлять 20-0% масс.

Если редкие гинсенозиды содержатся в количестве 100% масс. от общей массы гинсенозидов, то это может означать, что распространенные гинсенозиды, содержавшиеся в экстракте женьшеня, камбиальных меристематических клетках из рода Panax или их экстракте до обработки, подверглись полному превращению в редкие гинсенозиды. При этом редкие гинсенозиды представляют собой Rh2 и один или несколько редких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD.

При этом Rh2 может содержаться в количестве 10-35% масс. или 11-33% масс. от общей массы Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 и PPD. Было установлено, что содержание Rh2 в женьшене, выращенном в лесу женьшене или культивированных придаточных корнях дикого женьшеня составляет лишь 3-8% от содержания этого редкого гинсенозида в экстрактах женьшеня, камбиальных меристематических клетках из рода Panax или их экстрактах, полученных в соответствии с настоящим изобретением, даже при применении способа настоящего изобретения.

Камбиальные меристематические клетки из рода Panax могут быть получены в соответствии со способом, изложенным в Korean Patent No. 1064518 на Заявителя. Выделенные меристематические клетки можно культивировать в условиях культуры для размножения (пролиферационной культуры) или культуры для продукции (продукционной культуры).

В качестве среды для пролиферационной культуры можно использовать содержащую 3% сахарозы среду MS (среду Мурасиге и Скуга, 1962). Камбиальные меристематические клетки из рода Panax можно высеять в среду, а затем культивировать в течение примерно 13 дней при скорости потока воздуха, подходящей для культивирования.

В качестве среды для продукционной культуры можно использовать содержащую 3% коричневого сахара модифицированную среду MS. Камбиальные меристематические клетки из рода Panax после пролиферационного культивирования можно высеять в среду, а затем обработать индуктором и культивировать в течение примерно 11 дней при скорости потока воздуха, подходящей для культивирования.

Примеры индукторов включают любые вещества из группы, состоящей из метилжасмоната, экстрактов грибков, экстрактов бактерий, дрожжевых экстрактов, хитозана, глюкоманнана, глюкана, фенилаланина, бензойной кислоты, салициловой кислоты, арахидоновой кислоты, STS, мевалоната, N-бензоилглицина, ABA, SNP, IPP, BHT, SSS, этефона, гиппуровой кислоты, нитрата аммония церия, AgNO₃, ванадилсульфата, п-аминобензойной кислоты, брассиностероидов, альгината натрия и ацетата натрия. Предпочтительно в качестве индуктора применяется метилжасмонат. При этом метилжасмонат в качестве индуктора используют на уровне 50-200 мкМ.

В камбиальных меристематических клетках из рода Panax при культивировании в условиях пролиферационной культуры или продукционной культуры могут присутствовать распространенные гинсенозиды, к примеру, Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd, гипенозид XVII или F2, а редкие гинсенозиды, к примеру, Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 или PPD, могут не обнаруживаться.

Способ настоящего изобретения включает стадию тепловой обработки культивированных камбиальных меристематических клеток из рода Panax или их экстрактов при температуре от 85°C до 160°C. Посредством этой операции можно получить такие камбиальные меристематические клетки из рода Panax или их экстракты, которые содержат повышенное количество редких гинсенозидов в результате превращения распространенных гинсенозидов в редкие гинсенозиды.

В одном воплощении способ по настоящему изобретению может дополнительно включать, перед стадией тепловой обработки, стадию диспергирования культивированных камбиальных меристематических клеток из рода Panax в дистиллированной воде.

В некоторых случаях перед диспергированием в дистиллированной воде также может проводиться сушка вымораживанием. Посредством сублимационной сушки клетки легко контролировать и хранить, причем часть воды в клетках или микроорганизмах и т.п., присутствующих в этой воде, удаляется, а размножение микроорганизмов в воде с клетками подавляется.

Дистиллированная вода, которая используется для диспергирования камбиальных меристематических клеток из рода Panax, может составлять 1-200 массовых долей или 30-200 массовых долей на 1 долю высушенных камбиальных меристематических клеток из рода Panax. При использовании меристематических клеток без высушивания дистиллированная вода может составлять 2-15 массовых долей или 2,5-10 массовых долей на 1 долю не высушенных меристематических клеток.

При возрастании соотношения между количеством дистиллированной воды и количеством камбиальных меристематических клеток из рода Panax в пределах описанного выше диапазона содержание редких гинсенозидов может увеличиваться, а содержание распространенных гинсенозидов уменьшается.

Способ настоящего изобретения может дополнительно включать, после стадии диспергирования, стадию подвергания камбиальных меристематических клеток из рода Panax, диспергированных в дистиллированной воде, статическому культивированию без встряхивания.

Статическое культивирование может осуществляться путем смешивания камбиальных меристематических клеток из рода Panax с дистиллированной водой и оставления их в неподвижном состоянии при температуре, к примеру, от 1 до 35°C или от 10 до 24°C в течение 1-15 дней или 2-10 дней.

Было установлено, что камбиальные меристематические клетки из рода Panax, полученные способом, включающим эту стадию, почти или совсем не содержат распространенных гинсенозидов и содержат значительно повышенные количества редких гинсенозидов. В частности, оказалось, что по мере возрастания времени статического культивирования в вышеописанных пределах сильно повышается содержание Rh2 среди редких гинсенозидов.

В другом воплощении способ по настоящему изобретению может дополнительно включать, перед стадией тепловой обработки, стадию сушки горячим воздухом культивированных камбиальных меристематических клеток из рода Panax. Было установлено, что камбиальные меристематические клетки из рода Panax, полученные способом, включающим эту стадию, почти или совсем не содержат распространенных гинсенозидов и содержат значительно повышенные количества редких гинсенозидов. В частности, как оказалось, сильно повышается содержание Rh2 среди редких гинсенозидов.

Сушка горячим воздухом может проводиться в воздушной сушилке при температуре, к примеру, от 45 до 75°C или от 50 до 70°C. При этом сушка горячим воздухом может продолжаться, к примеру, 24-72 часа или 30-60 часов. Было установлено, что камбиальные меристематические клетки из рода Panax, полученные путем сушки горячим воздухом в вышеописанных пределах, содержат значительно повышенные количества редких гинсенозидов. В частности, как оказалось, сильно повышается содержание Rh2 среди редких гинсенозидов.

Способ по настоящему изобретению включает, после статического культивирования или сушки горячим воздухом, тепловую обработку камбиальных меристематических клеток из рода Panax. Тепловая обработка может означать экстракцию горячей водой с использованием дистиллированной воды при температуре от 85 до 160°C.

Камбиальные меристематические клетки из рода Panax после статического культивирования можно сразу же подвергать тепловой обработке при температуре от 85 до 160°C, так как эти клетки находятся в диспергированном состоянии в дистиллированной воде перед статическим культивированием. Кроме того, камбиальные меристематические клетки из рода Panax после сушки горячим воздухом также можно диспергировать в дистиллированной воде и подвергнуть тепловой обработке. При этом дистиллированная вода может составлять 1-200 массовых долей на 1 долю высушенных камбиальных меристематических клеток из рода Panax или 30-200 массовых долей на 1 долю камбиальных меристематических клеток из рода Panax.

Тепловая обработка может проводиться путем нагревания камбиальных меристематических клеток при температуре 85-160°C или 85-115°C или 95-115°C. В соответствии с настоящим изобретением был определен температурный диапазон, подходящий для превращения распространенных гинсенозидов в редкие гинсенозиды, и было установлено, что содержание редких гинсенозидов повышается в пределах описанного выше диапазона температур. При повышении температуры тепловой обработки в вышеописанных пределах содержание редких гинсенозидов может повышаться, а содержание распространенных гинсенозидов уменьшается или же распространенные гинсенозиды полностью превращаются в редкие гинсенозиды.

Тепловая обработка может проводиться, к примеру, от 10 минут до 72 часов или от 24 часов до 72 часов или же от 48 часов до 72 часов. В настоящем изобретении был определен диапазон времени тепловой обработки, подходящий для превращения распространенных гинсенозидов в редкие гинсенозиды. В частности, при тепловой обработке в пределах вышеописанного диапазона времени обнаруживались редкие гинсенозиды в камбиальных меристематических клетках из рода Panax. При увеличении времени тепловой обработки в вышеописанных пределах содержание редких гинсенозидов может повышаться, а содержание распространенных гинсенозидов уменьшается или же распространенные гинсенозиды полностью превращаются в редкие гинсенозиды.

Тепловая обработка может проводиться при атмосферном давлении, но давление также может возрастать с повышением температуры. При нагревании в описанном выше диапазоне температур тепловая обработка может проводиться, к примеру, при нормальном давлении (в пределах от 0,57 до 6,1 атм).

Способ настоящего изобретения может дополнительно включать процесс перемешивания во время тепловой обработки. При этом перемешивание может проводиться, к примеру, при 10-200 об/мин или 30-180 об/мин. При перемешивании в этих условиях содержание редких гинсенозидов может еще больше повышаться по сравнению с тем, когда перемешивание не проводится. Кроме того, при проведении перемешивания может повышаться содержание редких гинсенозидов или же уменьшаться время, необходимое для превращения распространенных гинсенозидов в редкие гинсенозиды.

В другом аспекте настоящее изобретение касается камбиальных меристематических клеток из рода Panax или их экстрактов, получаемых вышеописанным способом, которые отличаются повышенным содержанием редкого гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, по сравнению с таковым до тепловой обработки. Кроме того, настоящее изобретение касается экстрактов женьшеня, получаемых вышеописанным способом и имеющих повышенное содержание гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD.

Вышеописанные конфигурации, связанные с редкими гинсенозидами или их содержанием, точно так же применены к изобретениям, связанным с камбиальными меристематическими клетками из рода Panax, их экстрактами и экстрактами женьшеня.

В следующем аспекте настоящее изобретение касается композиций для профилактики или для лечения диабета, которые содержат, в качестве активного ингредиента, вышеописанные меристематические клетки либо их экстракты или экстракты женьшеня. Настоящее изобретение также касается способа профилактики или лечения диабета, включающего введение субъектам вышеописанных камбиальных меристематических клеток из рода Panax либо их экстрактов или экстрактов женьшеня либо содержащих их композиций. Было установлено, что камбиальные меристематические клетки из рода Panax, их экстракты или экстракты женьшеня по настоящему изобретению, которые содержат повышенное количество редких гинсенозидов, проявляют значительную толерантность к глюкозе, что указывает на их антидиабетическое действие.

Кроме того, настоящее изобретение касается композиций для улучшения кровообращения, которые содержат, в качестве активного ингредиента, вышеописанные меристематические клетки либо их экстракты или экстракты женьшеня. Кроме того, настоящее изобретение касается способа улучшения кровообращения, включающего введение субъектам вышеописанных камбиальных меристематических клеток из рода Panax либо их экстрактов или экстрактов женьшеня либо содержащих их композиций. Было установлено, что камбиальные меристематические клетки из рода Panax, их экстракты или экстракты женьшеня по настоящему изобретению, которые содержат повышенное количество редких гинсенозидов, проявляют эффективную способность к ингибированию агрегации тромбоцитов, что указывает на их значительные эффекты по улучшению кровообращения.

Вышеозначенное кровообращение можно контролировать не только по физическим факторам, включая гематокрит, вязкость, кровяное давление и т.д., но и по изменению состава триглицеридов в крови, гемоцитов (тромбоцитов) и т.д. В нормальных условиях гомеостаз хорошо поддерживается, но при нарушении регуляторной функции кровообращения при таких заболеваниях и состояниях, как диабет, наркотики, курение и т.д., происходит чрезмерная агрегация плазмы, тромбоцитов, эритроцитов и пр. и возникает аномальный гемостаз, тем самым нарушается течение крови. Кроме того, известно, что при усилении агрегации активированных тромбоцитов нарушается гомеостаз кровотока, причем нарушение кровотока приводит к возникновению атеросклероза, инсульта, сердечно-сосудистых заболеваний, ишемической болезни сердца и цереброваскулярных заболеваний.

Композиции для улучшения кровообращения по настоящему изобретению могут ингибировать тромбоз, что способствует улучшению кровообращения и тем самым предотвращает старение клеток и всех органов и способствует росту и регенерации клеток. В частности, они могут улучшать кровоток и тем самым предотвращать или лечить нарушения кровообращения, к примеру, атеросклероз, кровоизлияния в мозг, инсульт и/или инфаркт мозга и/или нарушения периферического кровотока, холодные конечности, симптомы выпадения волос, вызванные нарушением кровообращения в коже головы.

Кроме того, настоящее изобретение касается композиций для улучшения функции печени, которые содержат, в качестве активного ингредиента, вышеописанные меристематические клетки из рода Panax либо их экстракты или экстракты женьшеня. Кроме того, настоящее изобретение касается способа улучшения функции печени, включающего введение субъектам вышеописанных камбиальных меристематических клеток из рода Panax либо их экстрактов или экстрактов женьшеня либо содержащих их композиций.

В настоящем изобретении улучшение функции печени может означать, к примеру, предотвращение или лечение жировых болезней печени. Жировая болезнь печени может представлять собой алкогольную жировую болезнь печени, неалкогольную жировую болезнь печени, алиментарную жировую болезнь печени, жировую болезнь печени при голодании, вызванную ожирением жировую болезнь печени, диабетическую жировую болезнь печени или стеатогепатит. Кроме того, улучшение функций печени может означать профилактику или лечение печеночных заболеваний, к примеру, цирроза печени, алкогольного цирроза, стеатоза, токсических заболеваний печени и острого или хронического гепатита.

Было установлено, что камбиальные меристематические клетки из рода Panax, их экстракты или экстракты женьшеня по настоящему изобретению, которые содержат повышенное количество редких гинсенозидов, проявляют значительные эффекты по исправлению гепатита и ослаблению неалкогольной жировой дистрофии печени.

Композиции настоящего изобретения могут быть представлены в виде фармацевтических композиций, содержащих камбиальные меристематические клетки из рода Panax, их экстракты или экстракты женьшеня, по отдельности или в сочетании по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом или разбавителем. Кроме того, фармацевтические композиции можно вводить в фармацевтически эффективном количестве в зависимости от вида заболевания и его тяжести, возраста, веса, состояния здоровья и пола пациента, способа введения и продолжительности лечения. Определение композиций настоящего изобретения на основании таких факторов находится в компетенции рядовых специалистов в данной области. Как правило, композиции можно вводить в суточных дозах от 0,0001 мг/кг до 2,000 г/кг.

В настоящем изобретении термин “фармацевтически приемлемый” относится к таким композициям, которые являются физиологически приемлемыми и не вызывают расстройства желудка, аллергических реакций типа желудочно-кишечных расстройств или головокружения или аналогичных реакций при введении людям. Примерами таких носителей, наполнителей или разбавителей могут служить лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, стеарат магния и минеральные масла.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут дополнительно включать наполнители, средства против агрегации, смазывающие вещества, смачивающие средства, отдушки, эмульгаторы и консерванты.

Кроме того, фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть составлены любым способом, известным в данной области, таким образом, чтобы они обеспечивали быстрое, продолжительное или замедленное высвобождение активного ингредиента после введения млекопитающим. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть составлены в виде порошков, гранул, таблеток, эмульсий, сиропов, аэрозолей, мягких или твердых желатиновых капсул, стерильных растворов для инъекций, стерильных порошков и т.д.

Камбиальные меристематические клетки из рода Panax по настоящему изобретению могут быть представлены, к примеру, в виде функциональных пищевых продуктов. Термин “функциональные продукты” в настоящем изобретении означает такие продукты, которые проявляют функцию профилактики или лечения заболеваний при содержании в них камбиальных меристематических клеток из рода Panax в качестве активного ингредиента.

Функциональные пищевые продукты могут иметь вид, к примеру, порошков, гранул, таблеток, капсул или напитков. Кроме того, функциональные продукты могут дополнительно содержать, в качестве приемлемых пищевых добавок, различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), ароматизаторы типа синтетических и природных ароматизаторов, красители и улучшающие средства, пектиновую кислоту и её соли, альгиновую кислоту и её соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, регуляторы рН, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт, или карбонизирующие (газировочные) средства.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно на примерах. Рядовым специалистам в этой области должно быть ясно, что эти примеры служат только в целях иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1. Экстракт женьшеня, содержащий редкие гинсенозиды, преобразованные из распространенных гинсенозидов

1. Получение экстракта женьшеня, содержащего редкие гинсенозиды, преобразованные из распространенных гинсенозидов

В дистиллированную воду вносили порошок экстракта корней женьшеня (Panax ginseng C.A. Meyer) (Xian LVSEN Biotechnology Co., Ltd.) и растворяли в соотношении 30:1 (концентрация 0,033%), а затем подвергали тепловой обработке при 120°C и нормальном давлении в течение 48 часов. Экстракт охлаждали и собирали только лишь образовавшийся осадок. Собранный осадок подвергали сушке вымораживанием.

2. Анализ методом HPLC

Для анализа редких гинсенозидов использовали систему Agilent 1260 DAD и колонку Zorbax Eclipse Plus С18 (4,6 х 100 мм, 3,5 мкм) (Agilent) при следующих условиях: длина волны на детекторе DAD: 203 нм УФ; температура колонки: 30°C; подвижная фаза: содержащая 0,05% трифторуксусной кислоты вода и ацетонитрил; и скорость потока: 1 мл/мин. При анализе распространенных гинсенозидов и редких гинсенозидов подбирали соотношение подвижной фазы. Стандарты гинсенозидов, используемые при анализе, приобретали у фирмы Chromadex (США), Sigma-Aldrich (США) и Ambo Institute (Корея). Поскольку стандартов для редких гинсенозидов Rk2 и Rh3 не существует, то количественный анализ Rk2 и Rh3 не проводили, а проводили только идентификацию Rk2 и Rh3 методом LC/MS. В качестве растворителей при анализе использовали ацетонитрил (Merck, Германия), метанол (J.T. Baker, США) или трифторуксусную кислоту (Daejung, Корея). Экстракцию гинсенозидов из каждого образца проводили при различных соотношениях метанол/вода, экстракты фильтровали через фильтр на 0,2 мкм, а затем анализировали. Проводили анализ конверсии в редкие гинсенозиды, результаты которого представлены ниже в табл. 1.

Таблица 1. Содержание редких гинсенозидов в экстрактах женьшеня

Партия 1 Партия 2 До тепловой обработки После тепловой обработки До тепловой обработки После тепловой обработки Rg1+Re 95,39 0,00 0,00 0,00 Rb1 33,34 0,00 36,99 0,00 Rc 94,02 0,00 145,71 0,00 Rb2 26,70 0,00 28,74 0,00 Rd 40,37 0,00 14,56 0,00 Гипенозид XVII 6,41 0,00 12,90 0,00 F2 10,75 0,00 11,45 0,00 Сумма 306,98 0,00 250,34 0,00 Rg3 9,21 96,02 6,59 117,92 Rg5 4,94 58,81 2,90 80,02 Соединение K 0,00 0,00 0,00 0,00 Rh2 1,77 30,83 2,15 60,37 PPD 0,00 1,84 0,00 4,27 Сумма 15,92 187,50 11,65 262,58

* Каждое цифровое значение означает содержание (мг) гинсенозида в 1 г порошка экстракта женьшеня

Пример 2. Получение порошка камбиальных меристематических клеток дикого женьшеня (CMCs), содержащего редкие гинсенозиды, преобразованные из распространенных гинсенозидов

1. Культивирование CMCs дикого женьшеня

Выделяли CMCs дикого женьшеня из камбия Panax ginseng (дикий женьшень, Gangwon-do, Korea). Культивирование CMCs дикого женьшеня постепенно увеличивали в объеме из колбы на 250 мл до биореактора на 3 л, биореактора на 20 л и биореактора на 250 л.

При обычном культивировании растительных клеток в качестве регулятора роста клеток используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту или нафталинуксусную кислоту для индукции деления клеток. Однако CMCs дикого женьшеня культивируют при установленных условиях пролиферационного культивирования в отсутствие регулятора роста. Для поддержания сырой массы CMCs дикого женьшеня в условиях пролиферационного культивирования использовали среду MS (среду Мурасиге и Скуга, 1962), содержащую 3% сахарозы, при этом среду MS доводили до рН 5,8 и проводили культивирование в течение 13 дней.

По завершении пролиферационного культивирования проводили продукционное культивирование в модифицированной среде MS, содержащей 3% коричневого сахара, в течение 11 дней после обработки 100 мкМ метилжасмонатом. Пролиферационное культивирование и продукционное культивирование проводили в одной и той же культуральной комнате, которую поддерживали при температуре 21 ± 1°C в темноте.

2. Получение CMCs, содержащих редкие гинсенозиды, преобразованные из распространенных гинсенозидов

После получения биомассы и распространенных гинсенозидов (Rb1, Rb2, Rc и Rd) при пролиферационном и продукционном культивировании клетки подвергали статическому культивированию в культуральной комнате в течение 5 дней при отключенной подаче воздуха. Для получения редких гинсенозидов, включая Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, PPD и др., клетки подвергали тепловой обработке в экстракторе. После преобразования распространенных гинсенозидов в редкие гинсенозиды (Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 и PPD) в процессе тепловой обработки биомассу собирали, а затем сушили (вымораживанием или горячим воздухом).

3. Анализ методом HPLC

Анализ редких гинсенозидов в CMCs дикого женьшеня проводили таким же образом, как описано в примере 1.

Экспериментальный пример 1. Сравнение степени превращения в редкие гинсенозиды при различных соотношениях воды при экстракции

При выполнении примера 2-2 после примера 2-1 смеси, состоящие из 1 массовой доли высушенных CMCs дикого женьшеня и 20-200 массовых долей дистиллированной воды, подвергали тепловой обработке в экстракторе при 85°C в течение 24 часов, чтобы определить соотношение CMCs/дистиллированная вода, подходящее для преобразования распространенных гинсенозидов в редкие гинсенозиды.

Таблица 2

85°C/24 ч Контроль 1:30 1:50 1:100 1:150 1:200 Rb1 15,61 4,42 0,28 0,25 0,00 0,00 Rc 4,95 1,40 0,72 0,15 0,00 0,00 Rb2 2,52 1,28 0,58 0,12 0,00 0,00 Rd 1,85 4,57 3,11 1,05 0,51 0,29 Гипенозид XVII 0,14 6,13 3,95 1,00 0,43 0,25 F2 0 0,86 0,89 0,85 0,81 0,72 Rg3 0 26,19 30,83 33,95 34,10 31,19 Rk1 0 7,14 7,55 7,63 7,41 7,00 Rg5 0 13,91 15,50 15,79 15,32 14,44 Rh2 0 15,92 19,18 22,98 23,91 22,57 Сумма 25,1 81,8 82,6 83,8 82,5 76,5

* Каждое цифровое значение означает содержание (мг) гинсенозида в 1 г высушенных CMCs дикого женьшеня

Как видно из приведенной выше табл. 2, в условиях тепловой обработки при температуре 85°C и продолжительности в 24 часа содержание большинства распространенных гинсенозидов в CMCs дикого женьшеня снижается с увеличением доли дистиллированной воды.

Экспериментальный пример 2. Сравнение степени превращения в редкие гинсенозиды в зависимости от температуры при тепловой обработке

При выполнении примера 2-2 после примера 2-1 смесь из 1 массовой доли высушенных CMCs дикого женьшеня и 100 массовых долей дистиллированной воды подвергали тепловой обработке в экстракторе при температуре в пределах от 85°C до 115°C в течение 24 часов, чтобы определить температуру, подходящую для преобразования распространенных гинсенозидов в редкие гинсенозиды.

Таблица 3

1:100 / 24 ч Контроль 85°C 95°C 115°C Rb1 15,61 0,25 0,00 0,00 Rc 4,95 0,15 0,00 0,00 Rb2 2,52 0,12 0,00 0,00 Rd 1,85 1,05 0,00 0,00 Гипенозид XVII 0,14 1,00 0,00 0,00 F2 0 0,85 1,21 3,10 Rg3 0 33,95 41,95 38,75 Rk1 0 7,63 11,29 20,30 Rg5 0 15,79 22,97 40,87 Rh2 0 22,98 31,41 36,11 Сумма 25,1 83,8 108,8 139,1

* Каждое цифровое значение означает содержание (мг) гинсенозида в 1 г высушенных CMCs дикого женьшеня

Как видно из приведенной выше табл. 3, при соотношении CMC/вода 1:100 и продолжительности тепловой обработки в 24 часа содержание большинства распространенных гинсенозидов в CMCs дикого женьшеня снижается с увеличением температуры тепловой обработки.

Экспериментальный пример 3. Сравнение степени превращения в редкие гинсенозиды в зависимости от продолжительности тепловой обработки

При выполнении примера 2-2 после примера 2-1 смесь из 1 массовой доли высушенных CMCs дикого женьшеня и 100 массовых долей дистиллированной воды подвергали тепловой обработке в экстракторе при температуре 85°C в течение 24-72 часов, чтобы определить время, подходящее для преобразования распространенных гинсенозидов в редкие гинсенозиды.

Таблица 4

1:100 / 85°C Контроль 24 ч 48 ч 72 ч Rb1 15,61 0,25 0,00 0,00 Rc 4,95 0,15 0,00 0,00 Rb2 2,52 0,12 0,00 0,00 Rd 1,85 1,05 0,00 0,00 Гипенозид XVII 0,14 1,00 0,00 0,00 F2 0 0,85 0,00 0,00 Rg3 0 33,95 37,79 38,65 Rk1 0 7,63 8,83 9,15 Rg5 0 15,79 17,79 18,11 Rh2 0 22,98 28,63 32,00 Сумма 25,1 83,8 93,0 97,9

* Каждое цифровое значение означает содержание (мг) гинсенозида в 1 г высушенных CMCs дикого женьшеня

Как видно из приведенной выше табл. 4, при соотношении CMC/вода 1:100 и температуре тепловой обработки 85°C большинство распространенных гинсенозидов в CMCs дикого женьшеня почти исчезают с увеличением продолжительности тепловой обработки.

Экспериментальный пример 4. Сравнение продуктивности по редким гинсенозидам в зависимости от наличия или отсутствия статического культивирования

Готовили дополнительные CMCs дикого женьшеня таким же образом, как описано в примере 2-2, за исключением того, что не проводилось статическое культивирование перед тепловой обработкой. На фиг. 1 и 2 представлены результаты, полученные тогда, когда перед тепловой обработкой проводилось статическое культивирование в течение 5 дней, по сравнению с результатами, полученными тогда, когда не проводилось статическое культивирование перед тепловой обработкой. Как видно из фиг. 1 и 2, когда перед тепловой обработкой проводилось статическое культивирование, содержание Rh2 и PPD среди редких гинсенозидов возрастало (см. фиг. 1), в отличие от того, когда статическое культивирование перед тепловой обработкой не проводилось (см. фиг. 2).

Экспериментальный пример 5. Сравнение продуктивности по редким гинсенозидам в зависимости от продолжительности статического культивирования

Готовили CMCs дикого женьшеня таким же образом, как описано в примере 2-2 (тепловая обработка при 95°C в течение 48 ч), а содержание редких гинсенозидов, полученных при различной продолжительности статического культивирования, представлено на фиг. 3 и в приведенной ниже табл. 5. Как видно из фиг. 3 и табл. 5, содержание Rh2 среди редких гинсенозидов возрастает с увеличением продолжительности статического периода.

Таблица 5

Редкие гинсенозиды Содержание, мг/г массы сухих клеток A. Статическая культура – 5 дней B. Статическая культура – 9 дней C. Статическая культура – 13 дней Rg3 54,05 46,65 43,94 Rh2 12,77 19,46 22,34 Rg5 47,69 40,49 39,12 PPD 1,26 1,17 1,17 Сумма 115,77 107,77 106,57

Экспериментальный пример 6. Сравнение продуктивности по редким гинсенозидам в зависимости от наличия или отсутствия перемешивания

В примере 2 смесь из 1 массовой доли (сырой вес) CMCs дикого женьшеня и 2,5-10 массовых долей дистиллированной воды (50-200 массовых долей дистиллированной воды на 1 долю сухой массы CMCs) перемешивали при 30-180 об/мин в то время как её подвергали тепловой обработке при 95°C в течение 48 ч, и исследовали, изменяется ли содержание редких гинсенозидов при наличии перемешивания. Как видно из фиг. 4 и приведенной ниже табл. 6, когда проводилось перемешивание, содержание редких гинсенозидов типа Rg3, Rh2, Rg5 и PPD было выше, чем в отсутствие перемешивания.

Таблица 6

Редкие гинсенозиды Содержание, мг/г массы сухих клеток A. С перемешиванием B. Без перемешивания Rg3 44,7 43,9 Rh2 21,2 17,5 Rg5 43,1 36,4 PPD 1,1 0,5 Сумма 110,1 98,3

Пример 3. Проведение сушки горячим воздухом и тепловой обработки

Готовили CMCs дикого женьшеня таким же образом, как описано в примере 2-1. Полученные CMCs сушили горячим воздухом в HK-06H (Korea Technology Eng. Co., Ltd.) при 60°C/48 ч, а затем превращали в порошок (120 меш), после чего добавляли 1 массовую долю порошка на 100 массовых долей дистиллированной воды и подвергали экстракции горячей водой при 95°C в течение 48 ч. Кроме того, подвергали тепловой обработке и женьшень, красный женьшень, выращенный в лесу женьшень и культивированные придаточные корни дикого женьшеня в таких же условиях, как описано выше. Результаты представлены на фиг. 5 и 6 и в приведенных ниже табл. 7 и 8.

Таблица 7

Распространенные гинсенозиды Содержание, мг/г массы сухих клеток A. CMCs дикого женьшеня B. Женьшень C. Красный женьшень D. Лесной женьшень E. Культура придаточных корней дикого женьшеня Rg1+Re 0 16,85 5,83 14,30 4,18 Rb1 3,01 9,55 4,21 7,73 0,87 Rc 0,98 7,91 2,76 5,84 0,30 Rb2 2,01 2,62 1,91 1,98 0,20 Rd 0,76 1,22 0,60 0,65 0 Гипенозид XVII 4,07 0,06 0 0,06 0,20 F2 0,67 0,14 0 0,16 0,19 Сумма 11,5 38,35 15,31 30,72 5,94

Таблица 8

Редкие гинсенозиды Содержание, мг/г массы сухих клеток A. CMCs дикого женьшеня B. Женьшень C. Красный женьшень D. Лесной женьшень E. Культура придаточных корней дикого женьшеня Rg3 42,11 34,66 15,25 19,97 3,15 Rk1 11,84 7,00 6,59 5,69 0,99 Rg5 24,19 13,19 15,01 12,29 1,63 Rh2 33,57 1,17 0,96 2,53 1,99 Сумма 111,7 56,0 37,8 40,5 7,8

Как видно из фиг. 5 и приведенной выше табл. 7, содержание распространенных гинсенозидов типа гипенозида XVII и F2 в высушенных горячим воздухом CMCs дикого женьшеня было выше, чем в других препаратах женьшеня, а также, когда проводилась тепловая обработка, содержание Rh2 в CMCs дикого женьшеня было значительно выше, чем в других препаратах женьшеня. Кроме того, женьшень, выращенный в лесу женьшень и культивированные придаточные корни дикого женьшеня, за исключением красного женьшеня, приобретали в не высушенном (сыром) состоянии и сушили горячим воздухом в таких же условиях, как описано выше, но повышения содержания распространенных гинсенозидов типа гипенозида XVII и F2, которые могли бы повлиять на продукцию редкого гинсенозида Rh2, не наблюдалось, причем содержание редкого гинсенозида Rh2 было очень низким, даже при тепловой обработке.

По-видимому, это потому, что для получения Rh2 предпочтительными являются такие структуры, как гипенозид XVII и F2, которые содержат одну молекулу глюкозы, присоединенную в положении углерода C-3. В частности, в случае гипенозида XVII и
F2, две молекулы глюкозы и одна молекула глюкозы, соответственно, присоединены в положении углерода C-20, а также одна молекула глюкозы присоединена в положении углерода C-3. По-видимому, Rh2 получается тогда, когда молекулы глюкозы, присоединенные в положении углерода C-20, легко отделяются при нагревании, и только одна молекула глюкозы остается присоединенной в положении углерода C-3. Вот поэтому и получаются приведенные выше результаты.

Более того, как видно из фиг. 6 и табл. 8, способ тепловой обработки по настоящему изобретению способен превратить большинство распространенных гинсенозидов в редкие гинсенозиды. Невысушенные (сырые) CMCs дикого женьшеня нагреваются на клеточном уровне, тогда у CMCs дикого женьшеня, высушенных вымораживанием или горячим воздухом, тепло передается в порошкообразном состоянии, поэтому они имеют высокую эффективность теплопередачи и обладают превосходством при превращении в редкие гинсенозиды. Например, красный женьшень получают при обработке паром свежего женьшеня в состоянии, при котором сохраняется характерная форма свежего женьшеня. Как видим, содержание большинства редких гинсенозидов в красном женьшене низкое, а содержание распространенных гинсенозидов высокое. Однако, когда свежий женьшень превращают в порошок и применяется способ тепловой обработки по настоящему изобретению, то видно, что большинство распространенных гинсенозидов превращаются в редкие гинсенозиды, а содержание редкого гинсенозида Rg3 тоже становится высоким.

Как описано выше, в отличие от обычного красного женьшеня, свежего женьшеня, выращенного в лесу женьшеня и культивированных придаточных корней дикого женьшеня, CMCs дикого женьшеня, полученные способом настоящего изобретения, имеют существенно повышенное содержание редких гинсенозидов, в том числе Rh2. Поскольку у CMCs дикого женьшеня тепло передается на клеточном уровне, а продукты измельчения или превращения в порошок после сушки имеют размер частиц в пределах от нескольких сотен нм до нескольких десятков мкм, то эффективность теплопередачи будет высокой. Это приводит к легкому отделению молекул сахаров, присоединенных к агликону PPD в положении углерода C-20.

Предпринимались различные попытки увеличить содержание редких гинсенозидов. Однако при использовании красного женьшеня, свежего женьшеня, выращенного в лесу женьшеня или культивируемых придаточных корней дикого женьшеня они подвергаются различной обработке (обработке нагреванием, ферментами, кислотами, основаниями и т.п.) на тканевом уровне. Видимо, по этой причине эффективность удаления сахаров в положении С-20 очень низка, а повышение содержания редких гинсенозидов очень мало.

Пример 4. Экстракт CMCs дикого женьшеня, содержащий редкие гинсенозиды, преобразованные из распространенных гинсенозидов

1. Получение экстракта CMCs дикого женьшеня, содержащего редкие гинсенозиды, преобразованные из распространенных гинсенозидов

Смесь 1 массовой доли высушенных CMCs дикого женьшеня и 50-200 массовых долей дистиллированной воды подвергали экстракции при 75°C в течение 18 часов. Экстракт отделяли от CMCs дикого женьшеня и фильтровали через фильтр на 0,2 мкм, получая при этом экстракт CMCs дикого женьшеня. Полученный экстракт CMCs дикого женьшеня подвергали тепловой обработке в автоклаве (MSR-3L-150/250-MD-S6-SYS, Phos-Entech Co., Ltd.) при 140°C, 150°C или 160°C и нормальном давлении в течение 60 мин. Экстракт CMCs дикого женьшеня охлаждали, а образовавшийся осадок собирали и подвергали сушке вымораживанием.

2. Анализ методом HPLC

Анализ редких гинсенозидов в экстракте CMCs дикого женьшеня проводили таким же образом, как описано в примере 1. Проводили анализ конверсии в редкие гинсенозиды, результаты которого представлены ниже в табл. 9.

Таблица 9. Содержание преобразованных редких гинсенозидов в экстракте CMCs дикого женьшеня

Гинсенозиды Содержание, мг/л До тепловой обработки 140°C 150°C 160°C Rg1+Re 101,36 0,00 0,00 0,00 Rb1 533,42 67,15 0,00 0,00 Rc 149,43 17,33 0,00 0,00 Rb2 129,09 12,36 0,00 0,00 Rd 142,42 21,91 0,00 0,00 Гипенозид XVII 217,52 0,00 0,00 0,00 F2 50,29 24,88 17,49 29,15 Сумма 1222,2 143,6 17,49 29,15 Rg3 24,10 261,03 133,92 120,77 Rg5 8,58 256,59 134,78 220,08 Rh2 2,90 70,61 29,38 32,02 PPD 1,90 0,00 0,00 0,00 Сумма 37,48 588,22 298,08 372,87

Экспериментальный пример 7. Антидиабетическое действие CMCs дикого женьшеня

Антидиабетическое действие CMCs дикого женьшеня, полученных в примере 2, изучали с помощью перорального теста на толерантность к глюкозе (OGTT). CMCs дикого женьшеня подвергали тепловой обработке при 95°C в течение 48 часов, а экстракт, полученный при экстракции CMCs 70%-м этанолом, вводили перорально. Мышей C57BL/6J (8-недельные, самцы) не кормили в течение ночи. У мышей C57BL/6J измеряли вес и уровень глюкозы в крови, а затем мышам вводили перорально 2 г/кг D-глюкозы. В это время мышам давали питьевую воду, но не давали корма. Отмечали изменения уровня глюкозы в крови с интервалом в 2 ч на протяжении 2 часов.

Результаты измерений представлены на фиг. 7 и в приведенной ниже табл. 10. При пероральном введении D-глюкозы в диабетической группе почти или совсем не наблюдалось толерантности к глюкозе, в отличие от нормальной группы. Экстракт CMCs дикого женьшеня сравнивали с устойчивым мальтодекстрином (RMD) и экстрактом красного женьшеня (RG-200), которые известны как лечебные добавки в области борьбы с диабетом. В результате было установлено, что CMCs дикого женьшеня (CMCs-200 дикого женьшеня) проявляли толерантность к глюкозе (антидиабетический эффект), сравнимую с таковой у образцов, известных как лечебные добавки.

Таблица 10. Уровень глюкозы в крови (мг/дл)

Время Норма DM RMD RG-200 CMCs-200
дикого женьшеня 0 118 354 169 239 214 30 386 600 485 486 489 60 255 567 350 372 368 120 152 547 282 279 315

DM: контрольная диабетическая группа; RMD: получавшая устойчивый мальтодекстрин (2 г/кг) диабетическая группа; RG-200: получавшая экстракт красного женьшеня (200 мг/кг) диабетическая группа; CMCs-200: получавшая экстракт CMCs дикого женьшеня (200 мг/кг) диабетическая группа.

Экспериментальный пример 8. Действие CMCs дикого женьшеня по улучшению кровообращения

Проводили антитромбоцитарный тест в отношении CMCs из дикого женьшеня, полученных в примере 2. CMCs дикого женьшеня подвергали тепловой обработке при 95°C в течение 48 часов и экстрагировали 70%-м этанолом, а полученный экстракт CMCs дикого женьшеня вводили перорально.

Готовили 3,2% трехзамещенный цитрат натрия и смешивали с кровью, взятой из брюшной аорты, в соотношении 1:9 (об/об). Смесь оставляли на круговой мешалке на 10 мин, а затем центрифугировали при 1000 об/мин при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем собирали супернатант (обогащенная тромбоцитами плазма, PRP). Подсчитывали число тромбоцитов в PRP, а затем разводили PRP до концентрации 250-400×10³ тромбоцитов/мл и это разведение оставляли на круговой мешалке на 5 мин. В агрегометр (Chrono-log, США) вносили PRP или PRP с добавлением образца и нагревали до 37°C, а затем вносили агонист (АДФ, коллаген и т.д.), вызывающий агрегацию тромбоцитов. Затем, используя PPP в качестве контроля, измеряли изменение мутности для определения степени агрегации (%) (100: максимальная агрегация; 0: минимальная агрегация). Ингибирование в процентах можно выразить в виде следующего уравнения:

ингибирование (%) = [ингибирование (%) только PRP – ингибирование (%) смеси PRP/образец] / ингибирование (%) только PRP × 100

Результаты представлены на фиг. 8 и в табл. 11. В качестве контроля использовали экстракт листьев гинкго (GB-40) и экстракт красного женьшеня (RG-50), которые известны как лечебные добавки в области улучшения кровообращения. Результаты сравнения с контролем показали, что экстракты CMCs дикого женьшеня (CMCs-20 дикого женьшеня и CMCs-50 дикого женьшеня) оказывали превосходное действие на кровообращение по сравнению с образцами, известными как лечебные добавки.

Таблица 11. Степень ингибирования агрегации тромбоцитов (%)

GB-40 RG-50 CMCs-20
дикого женьшеня CMCs-50
дикого женьшеня Ингибирование (%) 18,5 20,1 28,5 37,8

GB-40: получавшая экстракт листьев гинкго (40 мг/кг) группа; RG-50: получавшая экстракт красного женьшеня (50 мг/кг) группа; CMCs-20: получавшая экстракт CMCs дикого женьшеня (20 мг/кг) группа; CMCs-50: получавшая экстракт CMCs дикого женьшеня (50 мг/кг) группа

Экспериментальный пример 9. Действие CMCs дикого женьшеня по улучшению функции печени

1. Эффект улучшения функции печени при вызванном GalN гепатите

Высушенные замораживанием CMCs дикого женьшеня растворяли в стерильном физрастворе и вводили перорально через зонд. 7-недельных самцов крыс Sprague-Dawley не кормили в течение 18 часов, а затем мышам вводили внутрибрюшинно GalN (700 мг/кг PBS). Через 24 часа у мышей брали пробы крови и ткани печени и измеряли активность ALT и AST в сыворотке крови. Исследуемый образец вводили мышам перорально один раз в день в одно и то же заданное время в течение 14 дней перед введением GalN. В день введения GalN исследуемый образец вводили перорально за 2 часа до введения и через 6 часов после введения GalN.

Как видно из фиг. 9, на индуцированной GalN модели уровни ALT и AST в сыворотке крови у мышей, получавших 75, 150 и 300 мг/кг CMCs дикого женьшеня на протяжении 2 недель, значительно уменьшались по сравнению с получавшей силимарин группой положительного контроля.

2. Эффект улучшения при неалкогольном ожирении печени

CMCs дикого женьшеня суспендировали в дистиллированной воде, а затем вводили перорально через зонд в течение 10 недель. Мышам 57BL (22-26 г) давали корм с высоким содержанием жиров в течение 10 недель, чтобы вызвать ожирение печени. Каждая группа животных имела свободный доступ к твердому корму или корму с высоким содержанием жиров (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, США) и воде.

Как видно из таблицы 12, при введении CMCs дикого женьшеня значительно снижается вес тела, уровень триглицеридов в сыворотке и печени и активность ALT в сыворотке.

Таблица 12. Эффекты CMCs дикого женьшеня на вес тела, уровень триглицеридов и активность ALT в сыворотке у мышей при диете с высоким содержанием жиров

Группа Вес тела (г) TG в печени (мг/г) TC в печени (мг/г) TG в сыворотке (мг/дл) TC в сыворотке (мг/дл) ALT (ед./л) NFD 31,5 14,2 17,2 83,4 141,0 36,6 HFD 44,6 20,7 26,8 111,2 173,2 45,5 HFD 75 35,4 15,1 18,6 75,2 156,2 40,2 HFD 150 33,8 14,0 14,6 72,0 143,5 35,8 HFD 300 33,2 14,8 19,8 82,6 150,0 29,0 HFD sily 34,9 11,7 15,4 72,8 145,2 31,8

По 8-10 мышей на группу. ALT, аланинаминотрансфераза; HFD, диета с высоким содержанием жиров; NFD, диета с нормальным содержанием жиров; TC, общий холестерин; TG, триглицериды; HFD 75, HFD + CMCs дикого женьшеня 75 мг/кг; HFD 150, HFD + CMCs дикого женьшеня 150 мг/кг; HFD 300, HFD + CMCs дикого женьшеня 300 мг/кг; HFD sily, HFD + силимарин 100 мг/кг.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано в отношении специфических особенностей, однако специалистам должно быть известно, что это описание только для предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, действительный объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и её эквивалентами.

Промышленное применение

Как описано выше, в соответствии со способом настоящего изобретения можно эффективно получить камбиальные меристематические клетки из рода Panax, их экстракты или экстракты женьшеня, содержащие повышенное количество одного или нескольких редких гинсенозидов из группы, состоящей из фармакологически очень активных Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 и PPD, посредством простого процесса.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение относится к способу повышения содержания гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, в камбиальных меристематических клетках (CMCs) из рода Panax, который включает тепловую обработку культивируемых камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax при температуре от 85°C до 160°C, камбиальным меристематическим клеткам (CMCs) из рода Panax, в которых содержание гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, повышено по сравнению с их содержанием до тепловой обработки с помощью способа по п. 1, экстракту женьшеня, в котором содержание гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, повышено по сравнению с их содержанием до тепловой обработки с помощью способа по п. 2, применению камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax по п. 18 при производстве медикамента для улучшения кровообращения. Изобретение позволяет повысить содержание гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, в камбиальных меристематических клетках (CMCs) из рода Panax. 5 н. и 15 з.п. ф-лы, 9 ил., 12 табл., 4 пр.

1. Способ повышения содержания гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, в камбиальных меристематических клетках (CMCs) из рода Panax, который включает тепловую обработку культивируемых камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax при температуре от 85°C до 160°C.

2. Способ повышения содержания гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, в экстракте женьшеня, который включает тепловую обработку экстракта женьшеня при температуре от 85°C до 160°C.

3. Способ по п. 1, где содержание гинсенозидов Rh2, Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD в камбиальных меристематических клетках (CMCs) из рода Panax повышается по сравнению с их содержанием до тепловой обработки.

4. Способ по п. 2, где содержание гинсенозидов Rh2, Rg3, Rg5 и PPD в экстракте женьшеня повышается по сравнению с их содержанием в экстракте женьшеня до тепловой обработки.

5. Способ по п. 3 или 4, где Rh2 и один или несколько гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, содержатся в количестве 80-100% масс. от общей массы гинсенозидов.

6. Способ по п. 3 или 4, где Rh2 содержится в количестве 10-35% масс. от общей массы Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 и PPD.

7. Способ по п. 1, где содержание гинсенозидов Rh2, Rg3 и Rg5 в экстракте камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax повышается по сравнению с их содержанием до тепловой обработки.

8. Способ по п. 1, дополнительно включающий перед стадией тепловой обработки стадию диспергирования культивированных камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax в дистиллированной воде.

9. Способ по п. 8, где дистиллированная вода добавляется в количестве 1-200 массовых долей на 1 долю камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax.

10. Способ по п. 8, дополнительно включающий стадию подвергания камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax, диспергированных в дистиллированной воде, статическому культивированию без встряхивания.

11. Способ по п. 10, где статическое культивирование проводится при температуре от 1 до 35°C в течение 1-15 дней.

12. Способ по п. 10, дополнительно включающий стадию сушки замораживанием перед статическим культивированием.

13. Способ по п. 10, дополнительно включающий перед стадией тепловой обработки стадию сушки горячим воздухом культивированных камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax.

14. Способ по п. 13, где сушка горячим воздухом проводится при температуре от 45 до 75°C в течение 24-72 часов.

15. Способ по п. 1 или 2, где тепловая обработка проводится от 10 минут до 72 часов.

16. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий операцию перемешивания при 10-200 об/мин во время тепловой обработки.

17. Способ по п. 1 или 2, где женьшень представляет собой белый женьшень, дикий женьшень или выращенный в лесу женьшень.

18. Камбиальные меристематические клетки (CMCs) из рода Panax, в которых содержание гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, повышено по сравнению с их содержанием до тепловой обработки с помощью способа по п. 1.

19. Экстракт женьшеня, в котором содержание гинсенозида Rh2 и одного или нескольких гинсенозидов, выбранных из группы, состоящей из Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 и PPD, повышено по сравнению с их содержанием до тепловой обработки с помощью способа по п. 2.

20. Применение камбиальных меристематических клеток (CMCs) из рода Panax по п. 18 при производстве медикамента для улучшения кровообращения.