Изобретение относится к области микробиологии, а именно идентификации определенных R-плазмид, обусловливающих устойчивость бактерий к антибиотикам и другим лекарственным препаратам.
Известен штамм Escherichia соИ К 12 F для идентификации R-плазмид 1.
Однако известный штамм хотя и обладает свойствами универсального реципиента в генетических скрещиваниях, но лизируется фагом ТЗ и фагом Т7.
Целью изобретения является новый штамм, обладающий свойствами универсального реципиента в генетических скрещиваниях.
Штамм Е. соИ MF выделен из кишечника белой мыши.
Штамм Е. соП M.F депонирован во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов под номером В-1805.
Морфологические признаки. Клетки Е. соИ MF имеют вид прямых палочек величиной 1,5-3,0X0,3-0,5 мкм, слабо подвижны, перитрихи, спор и капсул не образуют, по Граму не окрашиваются.
Культуральные признаки. На мясо-пептонном бульоне (рН 7,2-7,4) через 18 ч при 37° Е. соИ MF образует равномерное
помутнение и осадок, на мясо-пептонном агаре - круглые слегка выпуклые полупрозрачные колонии диаметром 1-3 мм,на среде Эндо - круглые колонии, окрашенные в темно-красный цвет с металлическим блеском, диаметром 1-3 мм, на среде Левина (мясо-пептонный агар с эозин-метиленовым синим) - круглые колонии, окрашенные в темно-синий цвет, диаметром 1-
1Q 3 ММ, на среде Плоскирева - круглые колонии, окрашенные в розовый цвет, диаметром 1-3 мм, на кровяном мясо-пептонном агаре - круглые колонии без гемолиза, полупрозрачные, диаметром 1-3 мм, на
15 голодном агаре с глюкозой (среда М-9-1+ 0,4% глюкозы -f 2% агар-агара) через 48 ч - плоские полупрозрачные колонии размером от 1 до 3 мм в диаметре (прототроф). Штамм размножается при 20-40°,
20 оптимум роста 36-37°.
Физиологические признаки. Е. coli MF не образует оксидазу, глюкозу расщепляет с образованием кислоты и газа, ферментирует арабинозу, лактозу, мальтозу, манно25 зу, сорбит, ксилозу, восстанавливает нитраты в нитриты, образует индол, обладает лизин- и орнитиндекарбоксилазой, дает положительную реакцию с метиловым красным, не ферментирует сахарозу, дульцит,
30 инозит, не образует ацетилметилкарбинола.
не усваивает цитрата натрия, не образует сероводорода, не обладает уреазной активностью.
Генетические особенности. Штамм Е. соИ Мр- служит хорошим реципиентом в опытах по передаче R-плазмид от различных доноров. Штамм Е. ME обладает природной устойчивостью к фагам ТЗ, Т7, Я, и PI. Однако Е. MF становится чувствительной к фагу ТЗ и ТУ после передачи ей путем конъюгации R-плазмид некоторых групп несовместимости, например, Inc J и Inc X .
С целью облегчения отбора эксконъюгантов в опытах при генетических скрещиваниях из исходного штамма Е. соН МЕ получены два мутанта, один из которых обладает устойчивостью к 120 мкг/мл налидиксовой кислоты (Е. соП МР NaK), другой - к 200 мкг/мл рифампицина (Е. соИ MF- RifO.
Пример практического использования штамма.
У диких штаммов шигелл и кишечной палочки выявлены 23 различные конъюгативные R-плазмиды: pKMR 13, pKMR 14, pKMR 16, pKMR 20, pKMR 26, pKMR 34, pKMR 46, pKMR 51, pKMR 64, pKMR 73, pKMR.74, pKMR 77, pKMR 90, pKMR 95, pKMR 98, pKMR 105, pKMR 111, pKMR 117, pKMR 155, pKMR 161, pKMR 169, pKMR 182, pKMR 200. Передачу этих R-плазмид проводят Е. coli MF NaK (RifO no стандартной методике. Культуры донора (дикие штаммы кишечных бактерий, обладаюш,ие устойчивостью к антибиотикам) и реципиента (Е. coli MF) выраш,ивают в течение 12 ч в 5 мл мясо-пептонного бульона (МПБ), разводят свежим МПБ в соотношении 1:10, подраш,ивают в течение 3 ч, готовят конъюгационные смеси из донора и реципиента 1 : 10 соответственно, смеси выдерживают в термостате 2 ч и 20 ч, производят высев смесей на селективные (с антибиотиками) питательные среды в чашках, чашки выдерживают в термостате 24 ч, эксконъюганты отсевают на питательные среды в пробирках. Все 23 R-плазмиды были переданы Е. coli MF.
Штамм Е. coli MF и его производные-Е. coli ME- Nal и Е. соИ AIF Rif были проверены на устойчивость к колифагам ТЗ, Т7, Я и Р1 методом спорт-теста. Для этого 0,1 мл четырехчасовой бульонной культуры бактерий вносят в расплавленный и охлажденный до 45° С
0,7%-ный МПА, который перемешивают и наслаивают на пластинку 1,5%-ного МПА. После охлаждения чашки подсушивают и на поверхность верхнего слоя МПА пастеровской пипеткой наносят капли фагов ТЗ, Т7,
А и Р1 с титром 10 бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл). Посевы инкубируют в течение ночи при 37° С и учитывают результаты опыта по наличию или отсутствию лизиса бактерий в точках нанесения
соответствующих фагов.
Предложенный штамм является универсальным реципиентом в генетических скрещиваниях, но в отличие от известного штамма Е. coli К 12 F и его производных не
лизируется колифагами ТЗ, Т7, К и PI. Вместе с тем штамм Е. coli MF приобретает способность лизироваться фагом ТЗ при передаче ему путем конъюгации R-плазмид Inc Х-, Inc А-, Inc J групп несовместимости и фагом Т7 - после передачи ему R-плазмид Inc J- и Inc групп несовместимости, что позволит быстро идентифицировать исследуемые R-плазмиды.
Формула изобретения
Штамм Escherichia coli MF для идентификации R-плазмид. Хранится в музее культур промышленных микроорганизмов института «ВНИИгенетика под номером В-1805.
Источник инфор.мации,
принятый во внимание при экспертизе:
1. Жакоб Ф., Вольман Э. Пол и генетика бактерий. М., «И. Л., 1974.
