Способ получения штаммов возбудителя чумы с HFR - свойствами Советский патент 1991 года по МПК C12N15/01 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы, и может быть использовано для получения Hfr-доноров возбудителя.

Целью изобретения является повышение частоты образования Hfr-штаммов.

Способ заключается в том, что в бактериальные клетки вводят гетерологичную конъюгативную плазмиду F lac .Tn, транс- коньюганты рассевают до изолированных клонов и отбирают клоны, имеющие Hfr-доноров, однако при этом в качестве реципиентов F lac;:Tn используют штаммы возбудителя чумы, несущие плазмиду кальцийзависимости (pCad), в качестве селективной среды для отбора Hfr-доноров магниево-оксалатный агар на основе среды Эндо и отбирают клоны с сочетанием признака кальцийзависимости (Cad и способности сбраживать лактозу (Lac4).

Плазмида pCad J.pestis, играющая большую функцию в обеспечении свойства вирулентности, детерминирует, наряду с другими признаками, зависимость роста клеток от ионов Са2+ при 37°С. Клоны, несущие pCad, не способны расти на магниево- оксалатном агаре, дефектном по содержанию ионов, кальция, при указанной температуре, но вырастают при 28°С.

Плазмида pCad возбудителя чумы несовместима с конъюгативными плазмидами

Оч 00

ю

OJ

чэ

N3

группы IncFI, в том числе F lsc;;Tn. При передаче последней штамму pCad+ наблюдается выраженная элиминация как резидентной, так и,. в особенности, введенной плазмиды (при раздельном нахождении в клетках возбудителя оба репликона сохраняются достаточно стабильно). О наличии F1 1ас::Тп в клонах судят по устойчивости к хлорамфенико лу (в случае Тп9) или канами- цу Тп5), а также по способности сбраживать лактозу и, соответственно, по формированию окрашенных колоний на среде Эндо (природные штаммы l.pestls лактозонега- тивны).

Предлагаемая комбинированная магни- ево-оксалатная среда на основе агара Эндо позволяет одновременно тестировать микробную популяцию по признакам, кодируемым обеими плазмидами, При высеве на нее трансконьюгантов pCad F lac:;Tn большинство субклонов (69-91%, в среднем 77%) кальцийзависимы, не способны сбраживать лактозу и несут, по данным последующего скрининг-электрофореза, лишь резидентную плазмиду. Другая значительная фототипическая группа(9-30%, веред- нем 17%) - Cad Lac+ - обнаруживает лишь фракцию плазмидной ДНК, соответствующую по молекулярной массе F ac;Jn.

Кроме того, в каждом опыте выявляется относительно небольшое количество (1- 12% в среднем 5%) субклонов, сохранивших как кальцийзависимость, так и лактозопозитмвность (Cad+ Lac4). Однако электрофоретический анализ показывает наличие у них только одной автономной плазмиды - pCad, что свидетельствует о вероятной интеграции F lacrfFn с бактериальной хромосомой. Изучение донорной активности позволяет получить генетические доказательства интеграции: практически все тестируемые субклоны обладают свойствами Hfr-доноров. Они осуществляют градиентный перенос хромосомных генов, в ряде случаев - с высокой частотой (до ) и не передают маркеры р |ас:;Гп (Lac+ - признак и устойчивость к соответствующему антибиотику).

Показано, что транспозоны 1 п9 и Тп5 транслоцируются из плазмиды F lac в хромосому возбудителя чумы с чрезвычайно высокой частотой - до 100% в расчете на клетку, потерявшую вектор. Таким образом, при передаче F ас::Тп возбудителю происходит спонтанное формирование транспо- зонных областей гомологии (на конъюгативной плазмиде и в хромосоме). Далее имеет место гомологичная рекомбинация, приводящая к внедрению Flacrlfn в бактериальную хромосому и образованию

Hfr-доноров. Этот процесс, по видимому также идет с высокой эффективностью, поскольку, по данным изучения популяцион- ного состава трансконъюгантов pCad F1

lac::Tn, доля клонов с интегрированной коньюгативной плазмидой составляет 1- 12%.

При совместном нахождении в клетках возбудителя чумы F ac::Tn обычно сохраня0 ется менее стойко, чем p.Cad. Интеграция с хромосомой, вероятно, приводит к повышению стабильности наследования F lac::Tn, что внешне проявляется в возникновении клонов Cad+L.acT. Использование комбини5 рованной селективной среды позволяет по сочетанию этих двух фенотипичных признаков целенаправленно, с высокой эффективностью отбирать клоны, несущие вставку конъюгативной плазмиды в хромосому, а

0 следовательно, искомые Hfr-доноры.

Пример. Плазмиду F 1ас::Тп9 (F ас::Тгп передают в межродовых конъюга- ционных скрещиваниях от Escherfchla coll AB51-1I гесА штамму возбудителя чумы, не5 сущему плазмиду кальцийзависимости (например, pestis 358/12).

Для этого 3-часовую культуру донора, выращенную в бульоне Хоттингера (рН 7,2) на качалке до концентрации около 10

0 м.к./мл, смешивают с ночной бульонной культурой реципиента в соотношении 1:2 и инкубируют при 28°С в течение 3 ч. Конъю- гационную смесь высевают на пластинки агара Хоттингера (рН 7,2) с добавлением

5 полимиксина в концентрации 100 ед/мл (контрселективный агенгвозбудителю чумы свойственна природная устойчивость к пол- имиксину), а также антибиотика в соответствии с маркером транспозона - 25 мкг/мл

0 хлорам феникола (в случае Тп9) или канами- цмна (при использовании Тп5).

Выросшие через трое суток трансконь- югэнты (отбирают 4-5 клонов) после однократного пассажа на селективной среде

5 пересевают петлей на агар Эндо, изучают с помощью скрининг-электрофореза плазмидной ДНК и одновременно высевают на комбинированную магниево-оксалатную среду на основе агара Эндо.

0 Для ее приготовления к 150 мл горячей среды Эндо (t 50-55°С) добавляют 14 мл 0,25 М Ъксалата натрия, смесь взбалтывают и через 2-4 мин вносят 7 мл 0,5 М сульфата или хлорида магния. После перемешивания

5 среда готова к разливу.

Растворы солей стерилизуют автоклавированием при 110°С (0,5 атм) в течение 30 мин.

Каждый клон высевают на 2-3 чашки

так, чтобы получить 200-300 изолированных

колоний на агарной пластине. Посевы инкубируют двое суток при 37°С, после чего отмечают выросшие колонии кальцийнеза- висимых субклонов и переносят чашки в термостат при 28°С. Через сутки отмечают доросшие - кальцийзависимые колонии. Из них отбирают лактозопозитивные варианты (около 50 субклонов), отсевают на агар Хот- тингера, проверяют на наличие маркера транспозона, изучают с помощью электрофореза клеточных лизатов и используют в качестве доноров хромосомных генов в спотскрещиваниях со стрептомицино- устойчивыми ауксотрофными мутантами возбудителя чумы.

Использование нескольких независимых нитрозогуанидин- или транспозонмн- дуцированныхреципиентов с

повреждением одного - двух маркеров позволяет идентифицировать Шт-штаммы с различными 0-пунктами переноса,

Ночные бульонные культуры рецмпиен- тных штаммов с помощью металлических рапликаторов наносят на поверхность подсушенных чашек с селективной средой (ми- нимальный агар с добавлением стрептомицина в концентрации 100 мкг/мл и.факторов роста в соответствии с природой ауксотрофностью реципиента, исключая питательные вещества, требуемые в результате мутации).

Концентрация аминокислот (в а -форме) и азотистых оснований в среде составляет 10 мкг/мл, тиамина и никотиновой кислоты 1 мкг/мл.

После впитывания в агар на пятна культуры реципиента с помощью таких же репликаторов наносят ночные бульонные культуры предполагаемых Hfr-доноров. Через 3-6 сут отмечают рост рекомбинантов.

Доноры, дающие наибольшее количество колоний рекомбинантов в слот-тестах, излечивают от плазмиды pCad, наличие которой может неблагоприятно сказываться на стабильности Hfr-штамма. С этой целью

культуры высевают на магниево-оксалат- ный агар, отбирают по три капьцийнезави- симых субклонэ и тестируют их с помощью скрининг-электрофореза. По одному производному, потерявшему pCad, отбирают для дальнейшего изучения в развернутых скре- дивзниях с полиаухсотрофными нитрозогу- анидининдуцировачными мутантами возбудителя, чумы.

Преимущество предлагаемого способа заключается прежде всего в чрезвычайно высокой эффективности (100% в расчете на изолированный Cad Lac -клон по сравнению с 10%-ной эффективностью известного

способа. Способ весьма надежен и позволяет в короткие сроки (примерно а течение трех недель от момента посева J.pestls рСаЬ+для скрещивания с E.coil Ffac::Tn идо учета результатов спот-скрещиваний) целенаправленно получать десятки Hfr-доноров с различными сайтами интеграции плазмиды F lac::Tn, в то время как получение Hfr- доноров с помощью известного способа не всегда воспроизводимо ввиду весьма слабсго роста возбудителя при 40°С. Способ менее трудоемок, так как в нем отсуствует стадия выращивания возбудителя в бульоне в течение 18ч.

Формула изобретения

Способ получения штаммов возбудителя чумы с Hfr-саойствами, включающий введение в бактериальные клетки плазмиды F ас::Тп, выращивание клеток на средах, содержащих антибиотик, детерминируемый

транспозоном плазмиды, отбор Hfr-штам- мов, сохраняющих плазмидные маркеры, отличающийся тем, что, с целью повышения частоты образования Hfr- штаммов, в качестве реципиентов плазмиды F iac::Tn используют штаммы возбудителя чумы, содержащие плазмиду кальцийзависимости, а отбирают Hfr-штам- мы, сочетающие признаки кальцийзависимости и способность сбраживать лактозу.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы, и может быть использовано для получения Hfr-доноров возбудителя. Целью изобретения является повышение частоты образования Hfr-штаммов. Способ заключается в том, что плазмиду F lacj Tn вводят в бактериальные клетки, содержащие плазмиду кальцийзависимости (pCad). Транс- коныогантывыращиваютна магн иево-аксалатном агаре, приготовленном на основе среды Эндо. Отбор кланов с Н(г свойствами осуществляют по сочетанию признаков кальцийзависимости и способности сбраживать лактозу и последующей проверкой на перекос хромосомных маркеров в спот-тесте. Эффективность способа 100%, в расчете на выделенные Cad ас+-клоны. 6