Штамм @ @ @ / @ /,используемый как тест-объект для отбора химических соединений,активных в отношении нитрофураноустойчивых микроорганизмов Советский патент 1983 года по МПК C12N15/00 

щ

Штамм Esche ichia coli К12 /рШ1р5/,ЦМПЦВ-2164 (Ъннигенетика) , нш1ольэуемБ1й ка твст-рбт ект ддя отбора химшческих соединений, активных в отясшенни фураноустойчивых микроорганизмов.

эо

:о vj

ND Изобретение относится к микробио логии и касается нового штамма микроорганизмов, используемых для отбо ра эффективных химиотерапевтических препаратов, активных против нитрофу норезистёнтных бактерий, Известен штамм Escherichia coll Re 85,несущий трансмиссивные R-плаэ миды (R6K,p A5082, р1А5017, р А4733 JA4320) 1.11. Однако известный штамм обладает множественным характером трансмисси ной лекарственной устойчивости,при этом R-факторы наряду с детерминантами нитрофуранорезистентности несут маркеры устойчивости и к другим антибактериальным препаратам. Цель изобретения - создание штам ма Eschefichiai coll К 12/p.Dip5/ обладающего такой степенью трансмиссивной устойчивости к препаратам нитрофуранового ряда, которая позволяет использовать его как тест объект для отбора химических соединений, активных в отнсяаении нитрофураноустойчивых микроорганизмов, Штамк; Escherichia cqli 2 ./pLDlOS/ получен методом конъюгации музейного штамма Escherl chi af, coli К 12 str и клинического штам ма .Escherichial coli 92 f cfgfr , и последующей селекции трансконъюгантов на среде с фурангином (20 мкг)мл) . ji Штамм хранится в Центральном муз промышленных микроорганизмов института ВНИИГенетика под номером ЦМПМВ-2164, Штамм E.coli К 12/pLD105/ характеризуется следующими свойствами. Морфологические признаки. Клетки суточной культзфы прямые палочковидные размера (2-5)к(.0,5-/ О,7)мк ,подвижные,грамотрицатель- ные. Культуральные свойства. Прототрофный штамм,хорошо растет на простых питательных средах. Мясо-пептонный агар; колонии в OR-форме, неправильные, плоккие,кру ные (3-5) мк с .плотным центром и- пр .рачные по периферии. Поверхность ше ховатая, край фестончатый, структур зернистая, консистенция рыхлая. На среде Эндо образует подобные колони с металлическим блеском. Мясо-пепто ный бульон: крошковидный придонный рост, пленка на поверхности, просветление среды. Биохимические свойства. Дает положительную реакцию с мет ловым красным, не образует ацетилметил карбинол.; Не утилизирует цитрат, ферментирует глюкозу,лактозу, маннит, мальтозу, дульцит, сорбит, арабчнозу,. рамнозу, ксилозу,глицерин, не ферментирует сахарозу, инозит, раффинозу, желатин не разжижае Образует индол, не образует сероводорода, не расщепляет мочевину.Декарбоксилирует лизин, глутаыиновую кислоту и не активен в отношении аргини1 а орнитина и фенилаланина. Не обладает антагонистической Г Гемолитической активностью. Полученный ште1мм E.coli К12 /pLDlOS/ кожет быть практически испойьзован как тест-объект для отбора химических соединений, активных в отношении нитрофураноустойчивых микроорганизмов в ограничивающих распространение этого признака, а также для конструирования штаммов бактерий других видов с плазмидной устойчивостью этого типа. Плазмида pDDl05 облада.ет Fin фенотипом. Клетки штамма E.coli К 12, воспринявшие ее при конъюгации, приобретают донорн.ую активность, хотя характеризуются нечувствительностью к фагам Р,Ь,ргСпецифичным для штаммов с плазмидами Inc,F,lnc,IncP групп. Они передают признаки Fc (фурацилин), Fg (фурагин),Fz (фуразолидон) при повторном скрещивании реципиентному штамму E.coli В с частотой, сравнимой с частотой передачи типичных R-плазмид (табл. 1). Вместе с маркерами нитрофураноустойчивости наблюдается перенос и хромосомных генов донора, контролирующих синтез аминокислот (leu,pro trp,his,lys,ilv). Плазмиды, контролирующие устой/и- вость к производным 5-нитрофурана, стабильно сохраняются штаммом E.coli К12 /pI.rD105/ в течение четырех лет при поддержании микроорганизма на среде без соответствующих препаратов при 4с. Популяционный анализ штамма в отношении чувствительности к фурацилину., фурагину и фуразолидону выявлет незначительную спонтанную потерю указанных детерминант. Элиминация плазмид может быть усилена акрифлавкоаом, Выделение плазмидной ДНК из полученного штамма осуществляют с помощью метода центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Анализ Образца плазмидной ДНК, вьщеляемай из штаммов E.co.l.i К12 /pLD105/f обнаруживают присутствие трёх групп плазмид; основной с мол. весом 30,7+0,81 мегадальтон,дополнительной - 33,9+0,2 МД, кроме того, выделяется ряд молекул с мол.весом 8,9 - 10,1 МД. Пример 1.Уровни устойчивости к нитрофурановым препаратам определяют -методом серийнытк разведений в плотной питательной среде. Изучаемые химические соединения (S-алкилсул; фониевые соли 2-тиа5ициклоалканов) растворяю.т предварительно в диметилформамиде, а затем разводят : в мясо-пептонном бульоне. В качестве тест-культуры- исполь.зуют штамм Escherichib coli K12/pLD105/. - П -р и м е р 2. Конструирование штаммов бактерий с плазмидной устойчивостью к нитрофуранам. Штамм E.coli К l2/pLDl05/ используют, в качестве донора в опытах конъюгационного переноса признака нитрофуранорезистентности. Реципиентом служит штгшм Б.со 11 В,чувствитель ный к нитрофуранам. Суточные бульонные культуры донорного и реципиент-. ногоштаммов разводят свежим мясо-п.еп ТОННЮ4 бульоном в 10 раз и инкубируют при . Культуры, взятые в фазе логарифмического роста,смешивают в отношении 1:10. После 20-часЬвой: ин кубации конъюгационной смеси при отбирают пробы (0,5 мл), которые высевают на мясо-пептонный агар, содержащий фурагин и фуразолидон в концент рации 20 мкг/мл и рифампицин 500 мкг/мл. Учет результа,тов проводят через 48 ч инкубации посевов при . Частота формирования траисконъюганто не зависит от селективного агентами сравнима с частотой передачи типич,ных Р-плазмид, Пример 3. Мобилизации хромосомных генов. Мобилизацию тенов, контролирующих синтез аминокислот, изучают у предлагаемого про рофного штамма E.coli К l2/pLD105/F R B кроссах с рециииентными полиауксотрофиыми Н -штаммамиг E.coli j 62 и KS/4. Конъюгацию осуществляют по описгтной методике (пример 2). Рекомбинатц по хрсжосомным маркерам ,tpr,his, I)ys,М V селекционируют на минимальной среде Ледерберга с рифампицином (50 С мкг/мл) и соответствующими аминокислотами (20 мкг/мл). Перенос хромосомных генов К-плазмидой PLD105 рецепиеитным штаАшам в описанных условиях опыта осуществляется с частотой 10 - 10 на клетку реципиента. Таким, образом, предлагаемый штамм E.coli K12/PLD105/ несет трансмиссионную плазмиду нитрофуранорезистбнтности, -контралирующую устойчивость к группе соединений,не имеющих аналогов в природе, что выro;iHO отличает ее от других R-плаз- шд и делает перспективной векторной системой в генной инженерии.