ПЕПТИДЫ С АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ПРИРОДНОГО CXCR4 Российский патент 2018 года по МПК A61K38/10 

Настоящее изобретение относится к пептидам с антагонистической активностью в отношении природного CXCR4, терапевтическим применениям пептидов по изобретению, а также к способу получения пептидов по изобретению.

Уровень техники, предшествующий изобретению

Рецептор CXC-хемокина 4 (CXCR4) представляет собой сопряженный с G-белком рецептор (GPCR) со стромальным клеточным фактором-1 (SDF-1 или CXCL12), как единственный опубликованный лиганд. CXCR4 участвует во многих процессах развития и физиологических процессах, включая хоуминг стволовых клеток ( and Drost, 2012) и миграцию иммунных клеток (Campbell et al., 2003). Ось CXCR4-CXCL12 также играет роль во врожденном и приобретенном иммунитете, а также в различных патологических процессах, таких как метастазы злокачественных клеток, миграция лейкозных клеток, ревматоидный артрит и легочный фиброз (Nagasawa et al., 1996; Zou et al., 1998; Tachibana et al. 1998; Furze et al., 2008). Искусственные антагонисты CXCR4 способны мобилизовать гемопоэтические стволовые клетки (HSC), которые используют для иммуновосстановительной терапии после трансплантации органа или химиотерапии (Ratajczak and Kim, 2012; Schroeder and DiPersio, 2012). Кроме того, CXCR4 также представляет собой основной корецептор для проникновения ВИЧ-1 в клетки-мишени (Feng et al., 1996; Bleul et al., 1996). Использование корецептора CXCR4 является очень эффективным, и большая доля T-клеток CD4+ экспрессирует этот GPCR в лимфатических тканях in vivo. Тем не менее, передаются практически уникальные варианты ВИЧ-1, в которых используется рецептор C-C-хемокина 5 типа (CCR5), и их обнаруживают при хронической инфекции ВИЧ-1 (Alkhatib et al., 1996; Deng et al., 1996; Dragic et al., 1996). Предполагалось, что многие факторы способствуют неэффективной передаче CXCR4-тропных (X4) штаммов ВИЧ-1 (Margolis and Shattock, 2006). Однако механизм(ы), лежащие в основе эффективной регуляции X4 ВИЧ-1 у не страдающих иммунодефицитом индивидуумов, остаются плохо изученными.

Исследование антагонистов CXCR4 в последнее время стало обширной областью для проектов вследствие многих показаний, в частности попытки найти стратегию борьбы с пролиферацией, дифференцировкой и метастазами злокачественных клеток не являлись насколько успешными в клинических исследованиях, как и ожидалось. Разработку одной из групп соединений, а именно антагонистов CXCR4 AMD3100

(соединения бициклама: Hendrix and Flexner 2000), вынуждены были прекратить для длительных видов лечения вследствие токсических побочных эффектов. Хотя AMD зарегистрирован для однократных недлительных применений для мобилизации стволовых клеток, однако трудность заключается в поиске соответствующих антагонистов для направленного действия на CXCR4.

Сущность изобретения

Цель настоящего изобретения достигают посредством пептида, эффективного в блокировании инфекции X4-тропного ВИЧ-1 NL4-3 со значением IC₅₀ менее 50 мкМ, содержащего общую аминокислотную последовательность:

Z¹ X X⁰ X¹ X² X³ X⁴ X⁵ V X⁶ X⁷ X⁸ X⁹ Z²

за исключением пептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:16-28,

где

X=I, P или L, <E, если Z¹=0, то X=I, dL, dI, V, W, S, T, Val, Cap, β-L, β-I, Sul-L, Sul-I, Sul-V,

X ⁰=V или, если X=I, то X⁰ представляет собой V или d-V, d-L, d-I, d-M, d-P, β-V, β-L, β-I, β-M, β-P или Sul-V

X ¹=R, H или K;

X ²=Y, F, S или W;

X ³=A, T, C или S;

X ⁴ и X⁵=K или C при условии, что X⁴=C, то X⁵≠C и если X⁵=C, то X⁴≠C;

X ⁶=P, C или делеции, и X⁴ и X⁵=K;

X ⁷=Q, C или делеции;

X ⁸=C, V или делеции;

X ⁹=S, C или представляет собой делецию,

Z¹=0, L, Z² или <E, где Z²=0 или модификации N-концевого атома азота пептидной цепи, модификация которой образует совместно с аминогруппой N-концевой аминокислоты пептида группу, имеющую структуру -NR²R³, где R² и/или R³ независимо друг от друга представляет собой H или замещенную или незамещенную ацилалкильную, арильную, аралкильную, циклоалкильную и гетероциклоалкильную группу;

Z³=0, TPTE-Z⁴, TPT-Z⁴, TP-Z⁴, T-Z⁴ или Z⁴, где

Z⁴=0 или представляет собой модификацию C-концевой карбоксильной группы пептидной цепи, где модификация образует совместно с карбоксильной группой C-концевой аминокислоты пептида группу, имеющую структуру C(O)-O-R¹ или -C(O)-NR²R³, где R¹ представляет собой замещенную или незамещенную алкильную, арильную, аралкильную, циклоалкильную и гетероциклоалкильньную группа; и

где дополнительные сокращенные обозначения имеют следующее ниже значение:

Cap=капроновая кислота (C6-карбоновая кислота), <E=пироглутамат, Val=валериановая кислота (C5-карбоновая кислота) и Sul=сульфоновые аминокислоты.

Специалисту понятно, что термин "содержащий" или "имеющий" можно заменять "состоящий из", без добавления нового объекта.

Настоящее изобретение демонстрирует, что пептид по изобретению влияет на T-клеточную миграцию и мобилизация стволовых клеток, а также ингибирует бактериальные патогены. Таким образом, пептид по изобретению представляет собой природный антагонист CXCR4, который может предотвращать передачу штамма ВИЧ-1 X4 и играет роль в регуляции активности CXCR4 и антибактериальном иммунитете in vivo.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид по изобретению содержит общую аминокислотную последовательность

Z¹ X X⁰ R X² X³ X⁴ X⁵ V X⁶ X⁷ X⁸ X⁹ Z³

за исключением пептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 16-28,

где

X=I, или если Z¹=0, то X=I, dL, dI, V, W, S, T, Val, Cap, β-L, β-I, Sul-L, Sul-I, Sul-V,

X ⁰=V или d-V, d-L, d-I, d-M, d-P, β-V, β-L, β-I, β-M, β-P или Sul-V

X ²=Y или W;

X ³=T, C или S;

X ⁴ и X⁵=K или C при условии, что X⁴=C, то X⁵≠C и если X⁵=C, то X⁴≠C;

X ⁶=P, C или делеции, и X⁴ и X⁵=K;

X ⁷=Q, C или делеции;

X ⁸=C, V или делеции;

X ⁹=S, C или представляет собой делецию,

Z¹=0, L, Z² или <E, где Z²=0 или модификации N-концевого атома азота пептидной цепи, модификация которой образует совместно с аминогруппой N-концевой аминокислоты пептида группу, имеющую структуру -NR²R³, где R² и/или R³ независимо друг от друга представляют собой H или замещенную или незамещенную ацилалкильную, арильную, аралкильную, циклоалкильную и гетероциклоалкильную группу;

Z³=0 или Z⁴, где

Z⁴=0 или представляет собой модификацию C-концевой карбоксильной группы пептидной цепи, за исключением Aca, модификация которого образует совместно с карбоксильной группой C-концевой аминокислоты пептида группу, имеющую структуру C(O)-O-R¹ или -C(O)-NR²R³, где R¹ представляет собой замещенную или незамещенную алкильную, арильную, аралкильную, циклоалкильную и гетероциклоалкильную группу; и

где дополнительные сокращенные обозначения имеют следующее ниже значение:

Cap=капроновая кислота (C6-карбоновая кислота), Aca=аминокапроновая кислота, <E=пироглутамат, Val=валериановая кислота (C5-карбоновая кислота) и Sul=сульфоновые аминокислоты.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид по изобретению содержит следующую ниже последовательность аминокислот:

I V X¹ X²X³ X⁴ X⁵ V X⁶ X⁷ X⁸ X⁹

где

X ¹=R, H или K;

X ²=Y, F, S или W;

X ³=T, C или S;

X ⁴=K или C;

X ⁵=K или C;

X ⁶=P, или если X¹=R и X²=W и X³=S и X⁴=K и X⁵=K, то X⁶=C;

X ⁷=Q или C;

X ⁸=V или C;

X ⁹=S, C, или если X¹=R и X²=Y и X³=S и X⁴=K и X⁵=K, то X⁹ представляет собой делецию.

В еще одном варианте осуществления пептид по изобретению содержит следующую ниже последовательность аминокислот:

I V R X²X³ X⁴ X⁵ V X⁶ X⁷ X⁸ X⁹

где

X ²=Y или W;

X ³=T, C или S;

X ⁴=K или C;

X ⁵=K или C;

X ⁶=P,0 или если X¹=R и X²=W и X³=S и X⁴=K и X⁵=K, то X⁶=C;

X ⁷=Q или C;

X ⁸=V или C;

X ⁹=S, C, или если X¹=R и X²=Y и X³=S и X⁴=K и X⁵=K, то X⁹ представляет собой делецию.

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения пептид по изобретению выбран из группы, состоящей из пептида, содержащего по меньшей мере одну следующую ниже аминокислотную последовательность:

IVRFTKKVPQVS, 408I-419 Y411F

IVRWTKKVPQVS, 408I-419 Y411W

IVRYSKKVPQVS, 408I-419 T412S.

Следует отметить, что замена X²=Tyr на Trp или димеризация этих пептидов приводит более низкой IC₅₀, которые специалист не мог ожидать.

Еще один другой вариант осуществления изобретения содержит пептид по изобретению, содержащий по меньшей мере одну следующую ниже аминокислотную последовательность:

IVRYTKCVPQVS, 408I-419 K414C

IVRYSKKVPQC, 408I-418 SC

IVRWTKKVPQVC, 408I-419 WC01

IVRWTCKVPQVS, 408I-419 WC02

IVRWCKKVPQVS, 408I-419 WC03

IVRWSKKVPQCS, 408I-419 WSC01

IVRWSKKVPCVS, 408I-419 WSC02

IVRWSKKVCQVS, 408I-419 WSC03

IVRYTKKVPQCS, 408I-419 V418C.

Особенно подходящие пептиды по настоящему изобретению представляют собой димерные пептиды, состоящие из двух идентичных мономерных пептидов по изобретению, где пептиды содержат аминокислоту цистеин, где димерные пептиды являются связанными друг с другом через цистеиновый мостик, который образуется между мономерными пептидами. В конкретном димерном пептиде по изобретению мономерные пептиды, содержащие аминокислоту цистеин, выбраны из группы пептидов, содержащих следующую аминокислотную последовательность:

IVRYTKCVPQVS, 408I-419 K414C

IVRYSKKVPQC, 408I-418 SC

IVRWTKKVPQVC, 408I-419 WC01

IVRWTCKVPQVS, 408I-419 WC02

IVRWCKKVPQVS, 408I-419 WC03

IVRWSKKVPQCS, 408I-419 WSC01

IVRWSKKVPCVS, 408I-419 WSC02

IVRWSKKVCQVS, 408I-419 WSC03

IVRYTKKVPQCS, 408I-419 V418C.

Объектом настоящего изобретения также являются пептиды по изобретению для применения для лечения неврологических заболеваний, в частности инсульта, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза; в области иммунологии, в частности для лечения синдрома WHIM и ревматоидного артрита; в области онкологии, в частности для лечения злокачественных опухолей, в частности злокачественных опухолей с рецептором CRCX, таких как злокачественная опухоль печени, поджелудочной железы, предстательной железы или рак молочной железы; для лечения недостаточности мобилизации, пролиферации и миграции стволовых клеток, активации T-клеток, а также поддержания иммунобластов, таких как CTL/PD-1; для лечения ран, вызываемых ожогами; для антифиброзной терапии; лечения или профилактики шрамов; для лечения кардиологических нарушений, в частности сердечной недостаточности; для лечения нарушений обмена веществ, в частности диабета; где пептид является эффективным для блокирования инфекции X4-тропного NL4-3 HIC-1 со значением IC₅₀ менее 50 мкМ с формулой

Z¹ X X⁰ X¹ X² X³ X⁴ X⁵ V X⁶ X⁷ X⁸ X⁹ Z³

и где

X=I, P или L, <E, если Z¹=0, то X=I, dL, dI, V, W, S, T, Val, Cap, β-L, β-I, Sul-L, Sul-I, Sul-V,

X ⁰=V или, если X=I, то X⁰ представляет собой V или d-V, d-L, d-I, d-M, d-P, β-V, β-L, β-I, β-M, β-P или Sul-V

X ¹=R, H или K, в частности X¹=R;

X ²=Y, F, S или W;

X ³=A, T, C или S;

X ⁴ и X⁵=K или C при условии, что X⁴=C, то X⁵≠C и если X⁵=C, то X⁴ ≠ C;

X ⁶=P, C или делеции, и оба X⁴ и X⁵=K;

X ⁷=Q, C или делеции;

X ⁸=C, V или делеции;

X ⁹=S, C или представляет собой делецию,

Z¹=0, L, Z² или <E, где Z²=0 или модификацию N-концевого атома азота пептидной цепи, модификация которой образует совместно с аминогруппой N-концевой аминокислоты пептида группу, имеющую структуру -NR²R³, где R² и/или R³ независимо друг от друга представляют собой H или замещенную или незамещенную ацилалкильную, арильную, аралкильную, циклоалкильную и гетероциклоалкильную группу;

Z³=0, TPTE-Z⁴, TPT-Z⁴, TP-Z⁴, T-Z⁴ или Z⁴, где

Z⁴=0 или представляет собой модификацию C-концевой карбоксильной группы пептидной цепи, модификация которой образует совместно с карбоксильной группой C-концевой аминокислоты пептида группу, имеющую структуру C(O)-O-R¹ или -C(O)-NR²R³, где R¹ представляет собой замещенную или незамещенную алкильную, арильную, аралкильную, циклоалкильную и гетероциклоалкильную группу; и

где дополнительные сокращенные обозначения имеют следующее ниже значение:

Cap=капроновая кислота (C6-карбоновая кислота), <E=пироглутамат, Val=валериановая кислота (C5-карбоновая кислота) и Sul=сульфоновые аминокислоты.

Объектом настоящего изобретения также являются пептиды по изобретению для применения в лечении неврологических заболеваний, в частности инсульта, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза; в области иммунологии, в частности для лечения синдрома WHIM и ревматоидного артрита; в области онкологии, в частности для лечения злокачественных опухолей, в частности злокачественных опухолей с рецептором CRCX, таких как злокачественная опухоль печени, поджелудочной железы, предстательной железы или рак молочной железы; для лечения нарушений гемопоэза, в частности, для поддержки мобилизации, пролиферации и миграции стволовых клеток, активации T-клеток, а также поддержания иммунобластов, таких как CTL/PD-1; для лечения ран, в частности ран, вызываемых ожогом; для антифиброзной терапии; лечения или профилактики шрамов; для лечения кардиологических нарушений, в частности сердечной недостаточности; для лечения нарушений обмена веществ, в частности диабета; для лечения вирусных заболеваний, в частности инфекций ВИЧ-I, ВИЧ-2, цитомегаловируса, вируса простого герпеса (1 и 2 типа), вируса ветряной оспы, вируса гепатита A и гепатита B, вируса гриппа, вируса полиомиелита, риновируса, вируса краснухи, вируса кори, вируса бешенства, вируса саркомы Рауса, вируса Эпштейна-Барр и для лечения инфекций, вызываемых бактериями и грибами, в частности Pseudomonas, Candida, S. aureus; для лечения инфекционных процессов, аномальных инфекционных процессов; лечения нарушений роста, лечения неврологических заболеваний, нарушений каскада свертывания крови и гемопоэза, сосудистых заболеваний, заболеваний иммунной системы и для ускорения заживления ран и срастания костей.

Дополнительным объектом настоящего изобретения является способ получения по меньшей мере одного из пептидов по изобретению твердофазным синтезом.

Кроме того, объектом настоящего изобретения также является способ получения по меньшей мере одного из пептидов по изобретению, где предоставляют мономерные пептиды и связывают в окислительных условиях реакции, в которых можно окислять связи SH с получением связей S-S.

Подробное описание изобретения

Изобретение дополнительно подробно описано с использованием пептида SEQ ID NO 16 в качестве характерного репрезентативного пептида по изобретению. В дополнение к описанию настоящего изобретения на него также ссылаются в WO 2009/004054 A2, включенной посредством ссылки.

Пептид по изобретению является эффективным для блокирования инфекции X4-тропного NL4-3 HIC-1 со значением IC₅₀ менее чем 50 мкМ. Эти пептиды рассматривают как обладающие достаточным ингибирующем действием для подавления или ингибирования физиологических ответов, опосредованных активированным CXCR4. Пептиды по изобретению содержат общую аминокислотную последовательность

Z¹ X X⁰ X¹ X² X³ X⁴ X⁵ V X⁶ X⁷ X⁸ X⁹ Z²

за исключением пептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 16-28. Исключение пептидов из последовательностей SEQ ID NO: 16-28 обусловлено тем, что они описаны в WO 2009/004054 A2 и перекрываются с общей аминокислотной последовательностью пептидов по изобретению. Однако пептиды по изобретению, а также пептиды SEQ ID NO: 16-28 можно использовать в качестве лекарственных средств для применения для лечения неврологических заболеваний, в частности инсульта, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза; в области иммунологии, в частности для лечения синдрома WHIM и ревматоидного артрита; в области онкологии, в частности для лечения злокачественных опухолей, в частности злокачественных опухолей с рецептором CXCR4, таких как злокачественная опухоль печени, поджелудочной железы, предстательной железы или рак молочной железы; для лечения недостаточности мобилизации, пролиферации и миграции стволовых клеток, активации T-клеток, а также поддержания иммунобластов, таких как CTL/PD-1; для лечения ран, вызываемых ожогом; для антифиброзной терапии; лечения или профилактики шрамов; для лечения кардиологических нарушений, в частности сердечной недостаточности; для лечения нарушений обмена веществ, в частности диабета.

В формуле пептида по изобретению следующие ниже определения являются действительными:

X=I, P или L. Также <E, который представляет собой пироглутамат, может замещать I, P или L для защиты N-конца пептида от протеолитического действия. Альтернативно, если Z¹ не содержится на N-конце, аминокислоту можно выбирать из группы, состоящей из dL, dI, β-L, β-I, сульфоновых аминокислот (Sul), таких как Sul-L, Sul-I, Sul-V, V, W, S и T; или из капроновой кислоты (C6-карбоновой кислоты), валериановой кислоты (C5-карбоновой кислоты).

Другие положения аминокислотной последовательности являются такими, как указано ниже:

X ⁰=V или, если X=I, то X⁰ представляет собой V или d-V, d-L, d-I, d-M, d-P, β-V, β-L, β-I, β-M, β-P или Sul-V

X ¹=R, H или K, в частности X¹=R;

X ²=Y, F, S или W;

X ³=A, T, C или S;

X ⁴ и X⁵=K или C при условии, что X⁴=C, то X⁵≠C, и если X⁵=C, то X⁴≠C;

X ⁶=P, C или делеции, и оба X⁴ и X⁵=K;

X ⁷=Q, C или делеции;

X ⁸=C, V или делеции;

X ⁹=S, C или представляет собой делецию.

N-концевая группа Z¹, при наличии, представляет собой Z², или <E, где Z²=0 или модификации N-концевого атома азота пептидной цепи, модификация которой образует совместно с аминогруппой N-концевой аминокислоты пептида группу, имеющую структуру -NR²R³, где R² и/или R³ независимо друг от друга представляют собой H или замещенную или незамещенную ацилалкильную, арильную, аралкильную, циклоалкильную и гетероциклоалкильную группу;

C-концевая группа Z³=0, TPTE-Z⁴, TPT-Z⁴, TP-Z⁴, T-Z⁴, или Z⁴, где

Z⁴=0 или представляет собой модификацию C-концевой карбоксильной группы пептидной цепи, модификация которой образует совместно с карбоксильной группой C-концевой аминокислоты пептида группу, имеющую структуру C(O)-O-R¹ или -C(O)-NR²R³, где R¹ представляет собой замещенную или незамещенную алкильную, арильную, аралкильную, циклоалкильную и гетероциклоалкильную группу. Дополнительные сокращенные обозначения имеют следующее ниже значение:

Cap=капроновая кислота (C6-карбоновая кислота), <E=пироглутамат, Val=валериановая кислота (C5-карбоновая кислота) и Sul=сульфоновые аминокислоты.

В объем настоящего изобретения также входят ретро-инверсо-пептиды пептидов по изобретению, а также другие производные, стабилизирующие пептидную связь против пептидаз.

Термин производное означает полноразмерные фрагменты, включая усеченные варианты по N- и C-концам, пептид по изобретению, содержащий замены аминокислотных остатков, включая D-аминокислотные остатки и модифицированные аминокислотные остатки, а также пептиды, содержащие дисульфидные связи и удлинения на N- и C-концах.

Настоящее изобретение демонстрирует, что пептид по изобретению влияет на миграцию T-клеток и мобилизацию стволовых клеток, а также ингибирует бактериальные патогены. Таким образом, пептид по изобретению представляет собой природный антагонист CXCR4, который может предотвращать передачу штаммов ВИЧ-1 X4 и играет роль в регуляции активности CXCR4 и антибактериального иммунитета in vivo.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид по изобретению содержит следующую ниже последовательность аминокислот:

I V X¹ X²X³ X⁴ X⁵ V X⁶ X⁷ X⁸ X⁹

где

X ¹=R, H или K, в частности X¹=R;

X ²=Y, F, S или W;

X ³=T, C или S;

X ⁴=K или C;

X ⁵=K или C;

X ⁶=P, или если X¹=R и X²=W и X³=S и X⁴=K и X⁵=K, то X⁶=C;

X ⁷=Q или C;

X ⁸=V или C;

X ⁹=S, C, или если X¹=R и X²=Y и X³=S и X⁴=K и X⁵=K, то X⁹ представляет собой делецию.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения пептид по изобретению выбран из группы, состоящей из пептида, содержащего по меньшей мере одну следующую ниже аминокислотную последовательность:

IVRFTKKVPQVS, 408I-419 Y411F

IVRWTKKVPQVS, 408I-419 Y411W

IVRYSKKVPQVS, 408I-419 T412S.

Еще один другой вариант осуществления изобретения содержит пептид по изобретению, содержащий по меньшей мере одну следующую ниже аминокислотную последовательность:

IVRYTKCVPQVS, 408I-419 K414C

IVRYSKKVPQC, 408I-418 SC

IVRWTKKVPQVC, 408I-419 WC01

IVRWTCKVPQVS, 408I-419 WC02

IVRWCKKVPQVS, 408I-419 WC03

IVRWSKKVPQCS, 408I-419 WSC01

IVRWSKKVPCVS, 408I-419 WSC02

IVRWSKKVCQVS, 408I-419 WSC03

IVRYTKKVPQCS, 408I-419 V418C.

Эти аминокислоты используют для получения димеров, которые являются связанными посредством своих цистеинов. Объединяя эти пептиды, можно синтезировать гомо- или гетеродимеры.

Особенно пригодные пептиды по настоящему изобретению представляют собой димерные пептиды, состоящие из двух идентичных мономерных пептидов по изобретению, где пептиды содержат аминокислоту цистеин, где димерные пептиды являются связанными друг с другом через цистеиновый мостик, который образуется между мономерными пептидами. В конкретном димерном пептиде по изобретению мономерные пептиды, содержащие аминокислоту цистеин, выбраны из группы пептидов, содержащих следующую аминокислотную последовательность:

IVRYTKCVPQVS, 408I-419 K414C

IVRYSKKVPQC, 408I-418 SC

IVRWTKKVPQVC, 408I-419 WC01

IVRWTCKVPQVS, 408I-419 WC02

IVRWCKKVPQVS, 408I-419 WC03

IVRWSKKVPQCS, 408I-419 WSC01

IVRWSKKVPCVS, 408I-419 WSC02

IVRWSKKVCQVS, 408I-419 WSC03

IVRYTKKVPQCS, 408I-419 V418C.

Объектом настоящего изобретения также являются пептиды по изобретению для применения для лечения неврологических заболеваний, в частности инсульта, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза; в области иммунологии, в частности для лечения синдрома WHIM и ревматоидного артрита; в области онкологии, в частности для лечения злокачественных опухолей, в частности злокачественных опухолей с рецептором CRCX, таких как злокачественная опухоль печени, поджелудочной железы, предстательной железы или рак молочной железы; для лечения нарушений гемопоэза, в частности для поддержки мобилизации, пролиферации и миграции стволовых клеток, активации T-клеток, а также поддержания иммунобластов, таких как CTL/PD-1; для лечения ран, в частности ран, вызываемых ожогом; для антифиброзной терапии; лечения или профилактики шрамов; для лечения кардиологических нарушений, в частности сердечной недостаточности; для лечения нарушений обмена веществ, в частности диабета; для лечения вирусных заболеваний, в частности инфекций ВИЧ-I, ВИЧ-2, цитомегаловируса, вируса простого герпеса (1 и 2 типа), вируса ветряной оспы, вируса гепатита A и гепатита B, вируса гриппа, вируса полиомиелита, риновируса, вируса краснухи, вируса кори, вируса бешенства, вируса саркомы Рауса, вируса Эпштейна-Барр; и для лечения инфекций, вызываемых бактериями и грибами, в частности Pseudomonas, Candida, S. aureus; для лечения инфекционных процессов, аномальных инфекционных процессов; лечения нарушений роста, лечения неврологических заболеваний, нарушения каскада свертывания крови и гемопоэза, сосудистых заболеваний, заболеваний иммунной системы и для ускорения заживления ран и срастания костей.

Пептид по изобретению можно формулировать в виде лекарственного средства с подходящими фармацевтически приемлемыми носителями.

Пептид по изобретению можно вводить способом, общепринятым для пептидов парентеральным, внутривенным, внутримышечным, интраназальным, локальным-местным, подкожным или буккальным путем. Количество пептида, которое необходимо вводить, составляет от 1 мкг до 1 г в стандартной дозе в сутки.

Дополнительный объект настоящего изобретения представляет собой способ получения по меньшей мере одного из пептидов по изобретению твердофазным синтезом. Химический синтез пептида по изобретению можно проводить посредством общепринятого твердофазного синтеза, например, на синтезаторе пептидов 9050 (Applied Biosystems) с использованием известной F-moc-химии.

Кроме того, объект настоящего изобретения также представляет собой способ получения по меньшей мере одного из пептидов по изобретению, где мономерные пептиды получают и связывают в окислительных условиях реакции, в которых можно окислять связи SH с получением связей S-S.

Скрининг противовирусных средств проводили с использованием молекулярных клонов NL4-3 X4 ВИЧ-1. Для определения, зависела ли противовирусная активность от тропизма вируса к корецептору и для исключения возможности того, что загрязняющее средство обуславливало наблюдаемые эффекты, авторы в дальнейшем тестировали эффект химически синтезированного пептида SEQ ID NO 16 на различные штаммы ВИЧ-1. Синтетический пептид, как правило, ингибировал инфекцию штаммов X4 ВИЧ-1 со средней 50% ингибирующей концентрацией (IC₅₀) 15,8 мкг/мл (соответствующей 8,6 мкМ). Репликация NL4-3 ВИЧ-1 дикого типа (wt) в PBMC заметно подавлялась при концентрациях ≥4 мкг/мл. Следует отметить, что только ~1% содержащегося в больших количествах предшественника HSA необходимо преобразовывать в пептид пептида SEQ ID NO 16 для получения ~10 мкг/мл. Пептид пептида SEQ ID NO 16 не проявлял цитотоксические эффекты даже при очень высоких концентрациях. Дополнительные эксперименты подтверждают, что пептид также ингибирует инфекцию штаммов ВИЧ-2 X4 и SIV, хотя эффекты являлись относительно умеренными, т.к. эти вирусы используют многие корецепторы. Авторы выявили, что предварительная обработка клеток-мишеней вируса, но не вирионов, приводила к эффективному снижению инфекции ВИЧ, что подтверждает, что пептид SEQ ID NO 16 направленно воздействует на клетку. Кроме того, активность ингибирования постепенно снижалась, если пептид SEQ ID NO 16 добавляли после воздействия на клетки вирионов, и предшественник HSA не обладал антиретровирусным эффектом. Таким образом, данные демонстрирую, что фрагмент наиболее широко распространенного белка в плазме человека является природным и специфическим ингибитором штаммов ВИЧ-1 X4, который направленно воздействует на ранний этап жизненного цикла вируса.

Выявлено, что пептид SEQ ID NO 16 конкурирует за связывание CXCL12 с CXCR4 зависимым от дозы образом. Константа диссоциации (DC₅₀) составляла 8±3 мкМ, что соответствует значению K_I 3±1 мкМ. Таким образом, значение DC₅₀ пептида SEQ ID NO 16 является аналогичным значениям IC₅₀, получаемым в анализах ингибирования ВИЧ-1. Однако, как указано выше, эти концентрации можно легко получать протеолитическим расщеплением небольшой фракции широко распространенного предшественника HSA.

Анализировали, влияет ли пептид SEQ ID NO 16 на опосредованную CXCR4/CXCL12 миграцию клеток, которая играет ключевую роль в гомеостазе, иммунных ответах и метастазах различных злокачественных опухолей. Выявлено, что пептид SEQ ID NO 16 подавлял индуцируемую CXCL12 миграцию T-клеток Jurkat, а также CD34+ стволовых клеток человека. Аналогично, пептид SEQ ID NO 16 предотвращал инвазию опухолевых клеток in vitro. Таким образом, этот пептид может оказывать противовоспалительные, а также противоинвазивные и противометастатические эффекты.

Ось CXCL12-CXCR4 вовлечена в сохранение костным мозгом гемопоэтических стволовых клеток (HSC), которые широко используются для восстановления гемопоэза у пациентов, принесших трансплантацию (Mohty et al., 2011). CXCR4 человека и мыши являются высококонсервативными, и поисковые исследования на мышах выявили, что однократное и/п введение пептида SEQ ID NO 16 приводило к значительной мобилизации клеток-предшественники и нейтрофилов в периферические отделы. Трансплантация клеток, получаемых от обрабатываемых пептидом SEQ ID NO 16 мышей, приводила к повышенным срокам приживления трансплантата, дополнительно подтверждая эффективную мобилизацию стволовых клеток этим природным пептидом.

И/п введение пептида SEQ ID NO 16 значительно снижало CXCR4-зависимую инфильтрацию нейтрофилов, лимфоцитов и эозинофилов в дыхательные пути мышей после экспериментального заражения аллергеном OVA. Эта обработка также заметно снижала инфильтрацию макрофагов. В противоположность этому, ALB409-423, который не взаимодействует с CXCR4, не оказывал достоверных эффектов. Таким образом, пептид SEQ ID NO 16 представляет собой эффективный антагонист CXCR4 in vivo, который мобилизует стволовые клетки и обладает противовоспалительными эффектами на моделях на мышах.

Выявлено, что пептид SEQ ID NO 16 ингибировал Pseudomonas aeroginosa, грамотрицательный условно-патогенный микроорганизм, зависимым от дозы образом и являлся на 80% эффективным при концентрациях ≥5 мкМ. В сравнении наблюдали только умеренные эффекты против Staphylococus aureus, грамположительного бактериального патогена или Candida albicans, диплоидного гриба и возбудителя оппортунистических пероральных и генитальных инфекций. Таким образом, пептид SEQ ID NO 16 не только ингибирует штаммы ВИЧ-1 X4, а также обладает специфическими антибактериальными эффектами.

Взаимодействие пептида SEQ ID NO 16 с CXCR4 является очень специфическим, вследствие того, что активность большого числа других GPCR не подвергалась влиянию, и что этот пептид взаимодействует со второй внеклеточной петлей CXCR4. Точный процесс связывания пептида SEQ ID NO 16 с CXCR4 еще предстоит определить. Опубликовано, что CXCL12 сначала взаимодействует с N-концом CXCR4 для индукции конформационных изменений, которые затем обеспечивают взаимодействие лиганда со второй и третьей внеклеточными петлями GPCR (Brelot et al., 2000; Zhou et al., 2001; Huang et al., 2003).

SEQ ID NO Производное Последовательность IC₅₀ (мкМ) 16 408-423 LVRYTKKVPQVSTPTL 8,63 17 408-422 LVRYTKKVPQVSTPT 13,4 18 408-421 LVRYTKKVPQVSTP 14,0 19 408-420 LVRYTKKVPQVST 15,3 20 408-419 LVRYTKKVPQVS 5,49 21 408-418 LVRYTKKVPQV 26,8 22 408-417 LVRYTKKVPQ 19,8 23 408-415 LVRYTKKV 25,7 24 407-419 LLVRYTKKVPQVS 11,1 25 408I-419 IVRYTKKVPQVS 2,48 26 408-415T412A LVRYAKKV 11,2 27 408-415V409A LARYTKKV 32,9 28 408-416 LVRYTKKVP не определено 3 408I-419 R410H IVHYTKKVPQVS >100* 4 408I-419 R410K IVKYTKKVPQVS >100* 13 408I-419 Y411F IVRFTKKVPQVS 3,89 14 408I-419 Y411S IVRSTKKVPQVS >100* 15 408I-419 Y411W IVRWTKKVPQVS 1,54 5 408I-419 T412S IVRYSKKVPQVS 2,09 2 408I-419 K414C IVRYTKCVPQVS 5,87 6 408I-419 V418C IVRYTKKVPQCS 3,69 1 408I-418 SC IVRYSKKVPQC 2,94 7 408I-419 WC01 IVRWTKKVPQVC 1,65 8 408I-419 WC02 IVRWTCKVPQVS 2,10 9 408I-419 WC03 IVRWCKKVPQVS 1,82 10 408I-419 WSC01 IVRWSKKVPQCS 0,87 11 408I-419 WSC02 IVRWSKKVPCVS 0,31 12 408I-419 WSC03 IVRWSKKVCQVS 1,51 408I-419 K414C x2 (IVRYTKCVPQVS)₂ 1,05 408I-419 V418C x2 (IVRYTKKVPQCS)₂ 0,46 408I-419 WC01_x2 (IVRWTKKVPQVC)₂ 0,40 408I-419 WC02 × 2 (IVRWTCKVPQVS)₂ 0,32 408I-419 WC03 × 2 (IVRWCKKVPQVS)₂ 0,60 408I-418 SC × 2 (IVRYSKKVPQC)₂ 0,39 408I-419 WSC01 × 2 (IVRWSKKVPQCS)₂ 0,18 408I-419 WSC02 × 2 (IVRWSKKVPCVS)₂ 0,12 408I-419 WSC03 × 2 (IVRWSKKVCQVS)₂ не определено * вследствие IC₅₀>50 мкМ не пептид по изобретению

Примеры

Пептиды

Пептид SEQ ID NO 16 и различные его производные синтезировали общепринятым твердофазным синтезом на синтезаторе пептидов 9050 (Applied Biosystems) с использованием Fmoc-химии. Пептид очищали хроматографией RP и устанавливали его плотность и чистоту аналитической RP-ВЭЖХ и MALDI-MS.

Исходные растворы вируса

Молекулярные клоны ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV, отличающиеся тропизмом к корецептору, получали временной трансфекцией клеток 293T провирусной ДНК способом с использованием фосфата кальция (CalPhos™ Mammalian Transfection Kit, Clontech). После инкубации в течение ночи смесь для трансфекции заменяли средой DMEM, дополненной 10% FCS, и через 48 часов после трансфекции собирали исходные растворы вируса. Затем центрифугировали культуральный супернатант в течение 5 минут при 3000 об./мин. для удаления клеточного дебриса. Получаемый исходный раствор вируса количественно определяли ELISA антигена p24 (ВИЧ) или p27 (SIV). Исходные растворы вируса непосредственно использовали или хранили в виде аликвот при -80°C.

Анализ инфекции TZM-bl

Репортерные клетки TZM-bl, содержащие репортерный ген LacZ под контролем промотора ВИЧ-1, высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты для микротитрования (Greiner Bio-One). На следующие сутки клетки предварительно инкубировали с различными разведениями пептида SEQ ID NO 16 или его производных в течение 1 часа, а затем инфицировали ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV. Через 2 суток определяли скорости распространения инфекции с использованием одностадийного набора Tropix Gal-Screen, как рекомендовано производителем.

Анализ инфекции PBMC

Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из лейкоцитарного слоя, получаемого от DRK-Blutspendedienst Baden-, с использованием центрифугирования в градиенте плотности фиколла. 1×10⁶ PBMC на мл стимулировали 1 мкг/мл фитогемоагглютинина (PHA, Oxoid, №3085280) и 10 нг/мл интерлейкина 2 (IL-2, Strathmann, №9511192) в течение трех суток. Затем клетки осаждали и ресуспендировали в содержащей IL-2 среде. 2×10⁵ PBMC высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты для микротитрования, добавляли пептиды и инфицировали клетки 10-100 пг антигена p24 X4- или R5-тропных вирусов. Супернатанты, содержащие потомство вируса отбирали каждые 2-3 суток после инфекции. Продукцию вируса измеряли посредством ELISA антигена p24 (NIH AIDS reagent program). Средние значения антигена p24 (нг/мл) получали на основании инфекции в трех повторениях ± стандартное отклонение.

Жизнеспособность клеток

Для оценки цитотоксических эффектов клетки TZM-bl или предварительно стимулированные PBMC инкубировали с увеличивающимися концентрациями пептидов. Выживаемость клеток определяли с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (PROMEGA, G7571), как рекомендовано производителем. Значения получали на основании измерений в трех повторениях. Показатели жизнеспособности рассчитывали относительно уровней АТФ в PBS (без пептида), содержащем клетки (100%). Данные регистрировали с использованием люминометра через 10 минут после добавления реагента.

Пептид пептида SEQ ID NO 16 блокирует ранний этап инфекции

Мониторинг флуоресценции в режиме реального времени взаимодействий лигандрецептор

Моноклональные антитела (mAb) CXCR4 против человека (клон 12G5, IgG2a) или против CXCR7 человека (клон 9C4) приобретали от R&D Systems (Minneapolis, MN). Связывание неконъюгированных mAb против CXCR7 и против CXCR4 выявляли с использованием конъюгированного с PE Ab козы против F(ab')2 мыши (Dako, Glostrup, Denmark) и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences) с использованием программного обеспечения CellQuest. Хемокины CXCL12 человека и CXCL12-TexasRed синтезировали, как описано (Valenzuela-Fernandez, et al. 2001). Хемокин CXCL11 человека приобретали от Clinisciences SAS (France).

Эксперименты проводили с использованием клеток, стабильно экспрессирующих, eGFP-CXCR4, суспендированных в буфере HEPES-бычий сывороточный альбумин (10 мМ HEPES, 137,5 мМ NaCl, 1,25 мМ MgCl₂, 1,25 мМ CaCl₂, 6 мМ KCl, 10 мМ глюкозы, 0,4 мМ NaH₂PO₄, 0,1% бычьего сывороточного альбумина (масс./об.), pH 7,4) (как правило при 10⁶ клеток/мл). Регистрацию по времени флуоресценции, испускаемой при 510 нм (возбуждение при 470 нм), проводили при 21°C с использованием спектрофлуориметра и отбирали пробы каждые 0,3 секунд. Измерения флуоресценции связывания инициировали добавлением к 1 мл клеточной суспензии на 30 секунде 100 нМ CXCL12-TR. Для экспериментов в конкретном формате экспрессирующие клетки EGFP-CXCR4 предварительно инкубировали в течение 10 минут в отсутствие или в присутствие различных концентраций немеченых лекарственных средств. Затем добавляли CXCL12-TR (100 нМ) и регистрировали флуоресценцию до тех пор, пока не устанавливалось равновесие (300 секунд). Данные анализировали с использованием программного обеспечения Kaleidagraph 3.08 (Synergy Software, Reading, PA, USA).

Интернализация EGFP-CXCR4 или EGFP-CXCR7

кДНК CXCR7 человека клонировали в слиянии с EGFP-кДНК в модифицированный вектор pIRES Hyg 3 (Clonetech). Клетки HEK 293T, стабильно экспрессирующие EGFP-CXCR7, получали способом совместного осаждения фосфатом кальция-ДНК и оценивали на связывание mAb 9C4 в отсутствие или в присутствие 100 нМ CXCL12. Интернализацию рецепторов регистрировали, как описано в ссылке (Hachet-Haas et al., 2008) с использованием мечения клеточной поверхности EGFP моноклональным антителом против GFP мыши (Roche Molecular Biochemicals; разведение 1/100) в качестве первичного антитела и конъюгированного R-PE фрагмента F(ab')₂ козы AffiniPure против IgG мыши (Immunotech; 1/100) в качестве вторичного антитела. Окрашивание CXCR4 или CXCR7 количественно определяли анализом проточной цитометрии (10000 клеток на образец) на цитометре (FACScalibur, Becton-Dickinson). Среднюю интенсивность флуоресценции CXCR4 или CXCR7 рассчитывали с использованием программного обеспечения CELLQuest (Becton-Dickinson).

Проточная цитометрия

Участок связывания пептида SEQ ID NO 16 на CXCR4 оценивали анализом проточной цитометрии (FACSCalibur; Becton Dickinson) с использованием коммерческого mAb против CXCR4 человека (BD Pahrmingen, клон: 12G5 или 1D9) и mAb CCR5 (BD Pahrmingen, клон: CD195). 2×10⁵ T-клетки Jurkat инкубировали с пептидами при 4°C в течение 30 минут в неподлежащей сыворотке среде. После инкубации клетки промывали буфером FACS (PBS+1% FCS) центрифугированием, затем последовательно окрашивали меченым PE mAb против CXCR4 человека или mAb против CCR5 при 4°C. После промывания клетки фиксировали 4% параформальдегидом в буфере FACS в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем анализировали на проточном цитометре. Данные обрабатывали с использованием CELLQUEST (Becton Dickinson). Для анализа избирательности рецептора пептида SEQ ID NO 16 клетки-призраки (исходные, X4, Hi) собирали с использованием раствора для диссоциации клеток (неферментативным 1x; Sigma: C5914) и подготавливали для анализа FACS, как описано выше.

Анализ связывания [³⁵S]GTP[S]

Продукция рекомбинантных бакуловирусов. Описана продукция бакуловирусов, кодирующих CXCR4 человека, субъединицу a_I2 G-белка крысы и как субъединицу b₁ G-белка человека и субъединицу g₃ G-белка крупного рогатого скота (Moepps et al., 1997). [³⁵S]GTP[S] получали от Perkin-Elmer (Waltham, USA). CXCL12 получали от PeproTech (Rocky Hill, USA).

Культура клеток насекомых и мембранный препарат. Клетки Sf9 выращивали при 27°C в 59 см² чашках для культивирования клеток в среде TNM-FH (Sigma, T1032), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 0,5 мг/мл гентамицина. Для получения рекомбинантных рецепторов и гетеротримерного G_I2 клетки выращивали до плотности приблизительно 60%, инкубировали в течение 1 часа при 27°C в 2 мл на чашку среды, содержащей рекомбинантный бакуловирус(ы). Затем к клеткам добавляли 9 мл на чашку свежей среды и поддерживали в этой среде в течение 48 часов при 27°C. Для получения неочищенной мембранной фракции клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 600 мл на чашку ледяного лизирующего буфера, содержащего 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 1 мМ EDTA, 3 мМ GDP, 2 мг/мл ингибитора соевого трипсина, 1 мМ пепстатина, 1 мМ леупептина, 100 мМ PMSF и 1 мг/мл апротинина. Клетки гомогенизировали посредством пропускания под давлением суспензии 6 раз через 0,5 мм × 23 мм иглу, присоединенную к одноразовому шприцу. После 30 минут на льду лизат центрифугировали при 2450×g в течение 45 секунд для удаления неразрушенных клеток и ядер. Из получаемого супернатанта выделяли неочищенную мембранную фракцию центрифугированием при 26000×g в течение 30 минут при 4°C. Осадок промывали 300 мл лизирующего буфера, ресуспендировали в 300 мл свежего лизирующего буфера, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C.

Связывание [³⁵S]GTP[S] с мембранами инфицированных бакуловирусом клеток насекомых анализировали, как описано (Moepps et al., 1997). В кратком изложении, мембраны (10 мг белка/образца) инкубировали в течение 60 минут при 30°C в смеси (100 мл), содержащей 50 мМ триэтаноламина/HCl, pH 7,4, 1,0 мМ EDTA, 5,0 мМ MgCl₂, 10 мМ GDP и 1,05 нМ [³⁵S]GTP[S] (1250 Ки/ммоль). Инкубация завершали быстрым фильтрованием через нитроцеллюлозные мембраны с размером пор 0,45 мм (Advanced Microdevices, Ambala Cantonment, India). Мембраны промывали, сушили и определяли остаточную радиоактивность жидкостно-сцинтилляционным измерением. Неспецифическое связывание определяли как связывание, за которое не конкурировал 100 мМ немеченый GTP[S].

Скрининг антагонистов GPCR пептида SEQ ID NO 16

Эффект пептида SEQ ID NO 16 и производных на клеточную миграцию

Миграцию клеток Jurkat (ATCC) анализировали с использованием камер диаметром 6,5 мм с фильтрами с размером пор 5 мкм (Transwell, 24-луночный планшет для культивирования клеток, Coster, Boston, MA). 2×10⁵ клеток Jurkat суспендировали в 200 мкл среды для выращивания Т-клеток Optimizer SFM и добавляли клеточные суспензии в верхнюю камеру. Затем в нижнюю камеру добавляли 10 нМ CXCL12 (R&D System) и/или различных концентраций пептида SEQ ID NO 16 или его производных в 600 мкл среды для выращивания T-клеток SFM. Камеры с культурой клеток инкубировали в течение 150 минут в инкубаторе для культуры клеток при 37°C. После инкубации удаляли камеры отбирали 100 мкл супернатантов и подсчитывали клетки, которые мигрировали в нижний компартмент непосредственно с использованием гемоцитометра или анализировали с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo, как описано выше. Все значения представляют собой средние величины мигрировавших клеток относительно клеток, обрабатываемых только CXCL12, из эксперимента в трех повторениях ± SD.

Периферические гемопоэтические стволовые (PHS) клетки, выделяемые аферезом у индивидуумов, получавших гранулоцитарно-колониестимулирующий фактор (G-CSF), получали от Institute of Transfusion Medicine, University Hospital Ulm. Замороженные клетки аккуратно замораживали в 1/10 разведенном 10% буфере ACD-A (предоставляемом Institute of Transfusion Medicine) в PBS. 1×10⁵/200 мкл PHS клеток помещали в верхнюю камеру планшетов системы Трансвелл. Затем в каждую лунку помещали 10 нМ CXCL12 и/или различных концентраций пептида SEQ ID NO 16 или его производных в 600 мкл среды для культивирования. Через 3 часа измеряли хемотаксис с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo, как описано выше. Все значения представляют собой средние величины мигрировавших клеток относительно клеток, обрабатываемых только CXCL12, из эксперимента в трех повторениях ± SD.

Анализ инвазии злокачественных клеток

Клеточную инвазию злокачественных клеток анализировали с использованием камеры для инвазии Biocoat Matrigel (BD BioCoat™ Matrigel™ Invasion Chamber), как рекомендовано производителем. 5×10⁴ клеток DU145 (ATCC) суспендировали в 300 мкл не содержащей сыворотки RPMI (Gibco), содержащей 0,1% BSA (KPL), а затем добавляли в верхнюю камеру. В каждую нижнюю камеру добавляли 700 мкл не содержащей сыворотки среды с 100 нМ CXCL12 или без него и различные концентрации пептида SEQ ID NO 16. Камеры инкубировали в течение 24 часов при 37°C во влажной атмосфере 5% CO₂/95% воздуха. Неинвазирующие клетки удаляли с верхней поверхности мембраны посредством очистки сребком. Клетки, инвазировавшие к нижней части мембраны количественно определяли с использованием набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®, как описано выше.

Эффект антагонистов CXCL12 и CXCR4 на актиновый цитоскелет

Клетки Jurkat, предварительно инкубируемые средой, производными ALB или AMD3100 (все 545 мкМ), стимулировали CXCL12 (100 мкг/мл) при 37°C в течение указанного периода времени, фиксировали 5% формальдегидом (Carl Roth GmBH, Karlsruhe, Germany) и пермеабилизировали 0,1% сапонином (Carl Roth). F-актин окрашивали конъюгированным с AlexaFluor568 фаллоидином (Molecular Probes, Eugene, OR) с последующим анализом проточной цитометрии относительной интенсивности окрашивания.

Мобилизация клеток-предшественников в мышцах

Мышей C57Bl/6J (Janvier, Le Genest St. Isle, FR) содержали в общепринятом виварии Goethe-University Medical Center, Frankfurt со свободным доступом к корму и воде. Мыши получали и/п инъекции 200 мкл воды или нормального физиологического раствора, содержащего 10 мг/мл пептида SEQ ID NO 16. В указанные моменты времени собирали образцы крови после инъекции из защечного мешка после тщательной дезинфекции кожи. После гипотонического лизиса лейкоциты инкубировали в двух повторениях в насыщенной цитокинами коммерчески доступной полутвердой среде (3434, Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) в стандартных условиях. Подсчитывали КОЕ-C на 7 сутки, как описано ( et al., 2006). КОЕ-C нормализовали на объем инкубируемой крови. Все исследования на животных проводили с разрешения местного IACUC в соответствии с руководствами AAALAC.

Трансплантация мобилизованных клеток

Животным C57BL/8 инъецировали пептид SEQ ID NO 16 (2 мг и/п в физиологическом растворе) или контроли физиологическим раствором. Отдельно собирали периферическую кровь через 1 час после инъекции, подсчитывали, объединяли и конкурентно трансплантировали (660 мкл эквивалента крови) совместно 4×10⁵ клеток C57BL/6 CD45.1 BM реципиентам C57BL/6 Cd45.1.

Модель астмы на мышах

Мышей сенсибилизировали интраперитонеальной (и/п) инъекцией на сутки 0, 1 и 2 50 мкг овальбумина (OVA, Sigma-Aldrich, A5503), адсорбированного на 2 мг гидроксида алюминия (Sigma-Aldrich, 23918-6), в физиологическом растворе. Мышей сенсибилизировали антигеном посредством интраназальной (и/н.) инстилляции 10 мкг OVA в 25 мкл физиологического раствора (12,5 мкл/ноздря) или одного физиологического раствора для контрольных мышей на сутки 5, 6 и 7 под анестезией (50 мг/кг кетамина и 3,3 мг/кг ксилазина, и/п). Пептид SEQ ID NO 16 или ALB409-423 в физиологическом растворе вводили и/п (16 мкмоль/кг) за два часа до каждой сенсибилизации OVA. Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) и подсчеты отдельных видов клеток проводили через 24 часа после последней сенсибилизации OVA, как ранее описано (Rebber et al., 2012).

ЯМР-спектроскопия

Для регистрации спектров ЯМР получали 1 мМ раствор пептида SEQ ID NO 16 в 10 мМ Na-фосфате в H₂O/D₂O 10:1, доводимого до конечного pH 7,0 с использованием HCl. Спектры ¹H-ЯМР TOCSY и NOESY регистрировали при 800 МГц, 600 МГц и 500 МГц на спектрометрах Bruker. Использовали спектры, получаемые на оборудовании 800 МГц вследствие их лучшего качества. Спектры соотносили с внешним TSP и их регистрировали способом States-TPPI, включающего импульсную последовательность 3-9-19 Watergate для подавления сигналов воды (Jeener et al., 1979). В основном, получали значения 256 равноценно разделенного периода изменения во времени t₁, в среднем 16 переходов 2048 точек. Все матрицы данных во временных областях являюсь обнуленными до 4K в обоих измерениях, таким образом, обеспечивая цифровое разрешение 3,41 Гц/точку. Перед трансформацией Фурье применяли окно Лоренца-Гаусса с различными параметрами для обоих измерений t₁ и t₂ для всех экспериментов. Получали спектры NOESY (Griesinger et al., 1988) с временем смешивания (0,30 секунд) и регистрировали эксперименты TOCSY (Braunschweiler et al., 1983; Rucker et al., 1989) с использованием смешанных импульсов 0,060 секунд DIPSI₂ (Bartels et al., 1995). Эксперименты NOESY и TOCSY проводили при 298K.

Оценка кросс-пика NOESY и расчет структуры

Дисперсия ¹H химического сдвига в спектрах ЯМР обеспечивала простую однозначную оценку всех NH- и CH-альфа резонансов, а также абсолютное большинство протонов боковых цепей (97,7%), с использованием стандартной методологии, сочетающей спектроскопию TOCSY и NOESY. Последовательные связности остова устанавливали по NOE CH_i-NH_i+1 и NH_i-NH_i+1.

Список пиков спектров NOESY, регистрируемых при времени смешивания 0,30 секунд, получали посредством сбора пиков в интерактивном режиме с использованием программного обеспечения XEASY (, N. 1996). Объемы кросс-пиков NOESY определяли посредством алгоритма автоматического интегрирования пиков, peakint (Engh 1991), встроенного в XEASY. Для расчета структуры серию кросс-пиков 407 NOESY подвергали расчетам с использованием программы CYANA (Herrmann et al., 2002; Guntert et al., 2003; Guntert et al., 2004). Их этой серии сигналов 400 (98,2%) однозначно оценивали программой CYANA. Для 20 лучших отобранных конформер демонстрировали низкие значения целевой функции CYANA (со средней целевой функцией: 0,056). Трехмерную структуру пептида SEQ ID NO 16 определяли с использованием стандартного протокола комбинированной автоматической оценки NOE и расчета структуры программы CYANA (версия 2.1) (Herrmann et al., 2002; Guntert et al., 2003; Guntert et al., 2004). После семи циклов комбинированной атематической оценки NOESY и расчетов структуры проводили конечный расчет структуры. Расчет структуры начинался в каждом цикле из 100 случающим образом распределенных конформеров, и использовали стандартный режим имитации отжига. 20 конформеров с наиболее низкими конечными значениями целевой функции CYANA сохраняли для анализа и переходили к следующему циклу. В первых двух циклах применяли комбинацию с ограничением в пространстве ко всем дистантным ограничениям NOE, разделяющих по меньшей мере три остатка, с целью минимизации искажения структуры в результате ошибочных дистантных ограничений. Использовали параметры ковалентности Engh и Huber. Ограничения, которые включали вырожденные группы протонов (например, метилы), случайно вырождающихся до метиленов и эквивалентные протоны ароматического кольца расширяли до неопределенных дистантных ограничений между всеми соответствующими парами атомов водорода. Невырожденные диастереотопные пары периодически заменяли для минимальных значений целевой функции во время имитационного отжига в циклах 17. Временно применяли слабые ограничения на пары с углом вращения и на углы вращения боковых цепей между тетраэдрическими атомами углерода во время фаз высокой температуры и охлаждения режима имитации отжига в интересах разрешенных областей диаграммы Рамахандрана и ступенчатых положений ротамеров, соответственно. Список верхних дистантных связей для расчета конечной структуры состоит исключительно из однозначно оцениваемых верхних дистантных связей и не требует возможных замен диастереотопных пар.

Стабильность пептида SEQ ID NO 16 в сыворотке

В сыворотку человека вносили 1 мМ пептида SEQ ID NO 16 или улучшенными производными и инкубировали при 37°C. Затем каждые два часа отбирали образцы и непосредственно хранили при -20°C. Для оценки противовирусной активности инкубируемого пептида в сыворотке к 5×10⁴/100 мкл клеткам TZM-bl добавляли 10 мкл образцов. Затем клетки инфицировали 90 мкл NL4-3 ВИЧ-1 ,что приводило к 20-кратному разведению смесей пептида и сыворотки. Инфекционность измеряли через 2 суток после инфекции с использованием одностадийного набора Tropix Gal-Screen. Для оценки эффекта ингибиторов протеаз на деградацию пептида SEQ ID NO 16 перед добавлением 1 MM пептида SEQ ID NO 16 к сыворотке сначала дополняли первой смесью ингибиторов протеазы (1X Complete mini (Roche) и 1 мМ PMSF (Roche)).

Непрямой ELISA для детекции и количественного определения пептида SEQ ID NO 16

Поликлональную антисыворотку против пептида SEQ ID NO 16 получали иммунизацией куриц пептидом SEQ ID NO 16 (Davids Biotechnologie GmbH, Regensburg) и моноклональное антитело получали иммунизацией мышей (ViroPharmaceuticals GmbH & CoKG, Hannover), как описано в другом документе (ссылке). Для характеризации реактивности и специфичности поликлональных и моноклональных антител планшеты для ELISA (Corning costar) в течение ночи при 4°C покрывали 100 мкл серийно разведенного пептида SEQ ID NO 16, его производных (20 мкМ) или HSA (Sigma). На следующие сутки планшеты дважды промывали 200 мкл промывного буфера ELISA (KPL) и обрабатывали 150 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS для блокирования непокрытых поверхностей. После дополнительного промывания добавляли 100 мкл серийно разведенных моноклональных или поликлональных антител и инкубировали в течение 1 часа. Затем планшеты промывали и добавляли 100 мкл конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) вторичных Ab (против антител курицы или мыши) еще в течение 1 часа. Затем планшеты промывали 5 раз и добавляли 100 мкл субстрата пероксидазы SureBlue TMB 1-Component Microwell (KPL). Развитие окраски останавливали добавлением в каждую лунку 100 мкл 1н. HCl и регистрировали оптические плотности с использованием спектрофотометра для чтения микротитрационных планшетов (Molecular Devices; VMax Kinetic Microplate Reader) при 450 нм с 650 нм в качестве эталонной величины.

ССЫЛКИ

Alkhatib, G., Combadiere, C., Broder, C.C., Feng, Y., Kennedy, P.E., Murphy, P.M., and Berger, E.A. (1996). CC CKR5: a RANTES, MIP-1alpha, MIP-1beta receptor as a fusion cofactor for macrophage-tropic HIV-1. Science 272, 1955-1958.

Bleul, C.C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., and Springer, T.A. (1996). The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature 382, 829-833.

Brelot, A., Heveker, N., Montes, M., and Alizon, M. (2000). Identification of residues of CXCR4 critical for human immunodeficiency virus coreceptor and chemokine receptor activities. J. Biol. Chem. 275, 23736-23744.

Campbell, D.J., Kim, C.H., and Butcher, E.C. (2003). Chemokines in the systemic organization of immunity. Immunol Rev. 195, 58-71.

Deng, H., Liu, R., Ellmeier, W., Choe, S., Unutmaz, D., Burkhart, M., Di Marzio, P., Marmon, S., Sutton, R.E., Hill, C.M., et al. (1996). Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1. Nature 381, 661-666.

Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G.P., Martin, S.R., Huang, Y., Nagashima, K.A., Cayanan, C., Maddon, P.J., Koup, R.A., Moore, J.P., et al. (1996). HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature 381, 667-673.

Engh, R. A. and Huber, R. (1991) Accurate Bond and Angle Parameters for X-Ray Protein-Structure Refinement. Acta Crystallogr. A 47, 392-400.

Feng, Y., Broder, C.C., Kennedy, P.E., and Berger, E.A. (1996). HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor. Science 272, 872-877.

Furze, R.C., and Rankin, S.M. (2008). Neutrophil mobilization and clearance in the bone marrow. Immunology 125, 281-288.

Guntert, P. (2003) Automated NMR protein structure calculation. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 43, 105-125.

Guntert, P. (2004) Automated NMR structure calculation with CYANA. Methods Mol Biol 278, 353-378.

Hachet-Haas M, Balabanian K, Rohmer F, Pons F, Franchet C, Lecat S, Chow KY, Dagher R, Gizzi P, Didier B, Lagane B, Kellenberger E, Bonnet D, Baleux F, Haiech J, Parmentier M, Frossard N, Arenzana-Seisdedos F, Hibert M, Galzi JL. Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12. J Biol Chem. 2008 Aug 22;283(34):23189-99. doi: 10.1074/jbc.M803947200. Epub 2008 Jun 13.

Herrmann, T., Guntert, P. and Wuthrich, K. (2002) Protein NMR structure determination with automated NOE assignment using the new software CANDID and the torsion angle dynamics algorithm DYANA. J. Mol. Biol. 319, 209-227.

Huang, X., Shen, J., Cui, M., Shen, L., Luo, X., Ling, K., Pei, G., Jiang, H., and Chen, K. (2003). Molecular dynamics simulations on SDF-1alpha: binding with CXCR4 receptor. Biophys. J. 84, 171-184.

Margolis, L., and Shattock, R. (2006). Selective transmission of CCR5-utilizing HIV-1: the 'gatekeeper' problem resolved? Nat. Rev. Microbiol. 4, 312-317.

, R., and Drost, A.C. (2012). G protein-coupled receptor crosstalk and signaling in hematopoietic stem and progenitor cells. Ann. N Y Acad. Sci. 1266, 63-67.

Moepps B, Frodl R, Rodewald HR, Baggiolini M, Gierschik P. Two murine homologues of the human chemokine receptor CXCR4 mediating stromal cell-derived factor 1alpha activation of GI₂ are differentially expressed in vivo. Eur J Immunol. 1997 Aug;27(8):2102-12.

Mohty, M., and Ho, A.D. (2011). In and out of the niche: perspectives in mobilization of hematopoietic stem cells. Exp. Hematol. 39, 723-729.

Moon, K.A., Kim, S.Y., Kim, T.B., Yun, E.S., Park, C.S., Cho, Y.S., Moon, H.B., and Lee, K.Y. (2007). Allergen-induced CD11b+ CD11c(int) CCR3+ macrophages in the lung promote eosinophilic airway inflammation in a mouse asthma model. Int. Immunol. 19, 1371-1381.

Nagasawa, T., Hirota, S., Tachibana, K., Takakura, N., Nishikawa, S., Kitamura, Y., Yoshida, N., Kikutani, H., and Kishimoto, T. (1996). Defects of B-cell lymphopoiesis and bone-marrow myelopoiesis in mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1. Nature 382, 635-638.

Ratajczak, M.Z., and Kim, C. (2012). The use of chemokine receptor agonists in stem cell mobilization. Expert Opin. Biol. Ther. 12, 287-297.

, N. (1996) thesis, ETH .

Schroeder, M.A., and DiPersio, J.F. (2012). Mobilization of hematopoietic stem and leukemia cells. J. Leukoc. Biol. 91, 47-57.

Tachibana, K., Hirota, S., Iizasa, H., Yoshida, H., Kawabata, K., Kataoka, Y., Kitamura, Y., Matsushima, K., Yoshida, N., Nishikawa, S., et al. (1998). The chemokine receptor CXCR4 is essential for vascularization of the gastrointestinal tract. Nature 393, 591-594.

A, Palanche T, Amara A, Magerus A, Altmeyer R, Delaunay T, Virelizier JL, Baleux F, Galzi JL, Arenzana-Seisdedos F. Optimal inhibition of X4 HIV isolates by the CXC chemokine stromal cell-derived factor 1 alpha requires interaction with cell surface heparan sulfate proteoglycans. J Biol Chem. 2001 Jul 13;276(28):26550-8. Epub 2001 May 14.

Zhou, N., Luo, Z., Luo, J., Liu, D., Hall, J.W., Pomerantz, R.J., and Huang, Z. (2001). Structural and functional characterization of human CXCR4 as a chemokine receptor and HIV-1 co-receptor by mutagenesis and molecular modeling studies. J. Biol. Chem. 276, 42826-42833.

Zou, Y.R., Kottmann, A.H., Kuroda, M., Taniuchi, I., and Littman, D.R. (1998). Function of the chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development. Nature 393, 595-599.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая пептид и димерный пептид для блокирования инфекции X4-тропного NL4-3 ВИЧ-1 со значением IC₅₀ менее чем 50 мкМ, применение вышеуказанных пептидов для лечения неврологических заболеваний, применение вышеуказанных пептидов для лечения ран и способы получения вышеуказанных пептидов. В одном из вариантов пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

IVRFTKKVPQVS, 408I-419 Y411F; IVRWTKKVPQVS, 408I-419 Y411W; IVRYSKKVPQVS, 408I-419 T412S; IVRYTKCVPQVS, 408I-419 K414C; IVRYSKKVPQC, 408I-418 SC; IVRWTKKVPQVC, 408I-419 WC01; IVRWTCKVPQVS, 408I-419 WC02; IVRWCKKVPQVS, 408I-419 WC03; IVRWSKKVPQCS, 408I-419 WSC01; IVRWSKKVPCVS, 408I-419 WSC02; IVRWSKKVCQVS, 408I-419 WSC03; IVRYTKKVPQCS, 408I-419 V418C.

Изобретение расширяет арсенал средств, способных блокировать инфекцию X4-тропного NL4-3 ВИЧ-1. 6 н.п. ф-лы, 1 табл., 19 пр.

1. Пептид для блокирования инфекции X4-тропного NL4-3 ВИЧ-1 со значением IC₅₀ менее чем 50 мкМ, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

IVRFTKKVPQVS, 408I-419 Y411F

IVRWTKKVPQVS, 408I-419 Y411W

IVRYSKKVPQVS, 408I-419 T412S

IVRYTKCVPQVS, 408I-419 K414C

IVRYSKKVPQC, 408I-418 SC

IVRWTKKVPQVC, 408I-419 WC01

IVRWTCKVPQVS, 408I-419 WC02

IVRWCKKVPQVS, 408I-419 WC03

IVRWSKKVPQCS, 408I-419 WSC01

IVRWSKKVPCVS, 408I-419 WSC02

IVRWSKKVCQVS, 408I-419 WSC03

IVRYTKKVPQCS, 408I-419 V418C.

2. Димерный пептид для блокирования инфекции X4-тропного NL4-3 ВИЧ-1 со значением IC₅₀ менее чем 50 мкМ, состоящий из двух идентичных мономерных пептидов по п.1, где указанные мономерные пептиды являются связанными друг с другом через цистеиновый мостик.

3. Применение пептида по п. 1 или димерного пептида по п. 2 для лечения неврологических заболеваний, в частности инсульта, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рассеянного склероза; в области иммунологии, в частности для лечения синдрома WHIM и ревматоидного артрита; в области онкологии, в частности для лечения злокачественных опухолей, в частности злокачественных опухолей с рецептором CRCX, таких как злокачественная опухоль печени, поджелудочной железы, предстательной железы или рак молочной железы; для лечения недостаточности мобилизации, пролиферации и миграции стволовых клеток, для активации T-клеток, а также поддержания иммунобластов, таких как CTL/PD-1.

4. Применение пептида по п.1 или димерного пептида по п. 2 для лечения вирусных заболеваний, в частности инфекции ВИЧ-I, ВИЧ-2, цитомегаловируса, вируса простого герпеса (1 и 2 типа), вируса ветряной оспы, вируса гепатита A и гепатита B, вируса гриппа, вируса полиомиелита, риновируса, вируса краснухи, вируса кори, вируса бешенства, вируса саркомы Рауса, вирус Эпштейна-Барр; и для лечения инфекций, вызываемых бактериями и грибами, в частности Pseudomonas, Candida, S. aureus; для лечения инфекционных процессов, аномальных инфекционных процессов; лечения нарушений роста.

5. Способ получения пептида по п. 1 твердофазным синтезом.

6. Способ получения димерного пептида по п. 2, где мономерные пептиды получают и связывают в окислительных условиях реакции, в которых можно окислять связи SH с получением связей S-S-.