ОЛИГОНУКЛЕОТИД ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С МЫШЕЧНОЙ ДИСТРОФИЕЙ Российский патент 2018 года по МПК C12N15/113 A61K31/7088 A61K48/00 A61P21/00 

Область изобретения

Изобретение относится к области генетики человека, более конкретно, к способу конструирования единичного олигонуклеотида, который предпочтительно способен индуцировать пропускание двух или более экзонов пре-мРНК. Кроме того, изобретение относится к указанному олигонуклеотиду, к фармацевтической композиции, содержащей указанный олигонуклеотид, и к применению указанного олигонуклеотида, как указано в настоящем описании.

Уровень техники, к которому относится изобретение

Олигонуклеотиды являются перспективными в медицине для лечения генетических нарушений, таких как мышечная дистрофия. Мышечная дистрофия (MD) относится к генетическим заболеваниям, которые характеризуются прогрессирующей слабостью и дегенерацией скелетных мышц. Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) и мышечная дистрофия Беккера (BMD) являются наиболее распространенными детскими формами мышечной дистрофии, и они используются в настоящем описании для иллюстрации изобретения. DMD представляет собой тяжелое летальное нервно-мышечное нарушение, приводящее к потребности в инвалидной коляске в возрасте до 12 лет и пациенты DMD часто погибают в возрасте до тридцати лет вследствие дыхательной или сердечной недостаточности.

DMD вызывается мутациями в гене DMD; в основном делециями или дупликациями со сдвигом рамки считывания одного или нескольких экзонов, небольшими нуклеотидными вставками или делециями, или точечными нонсенс-мутациями, которые, как правило, приводят к отсутствию функционального дистрофина. В ходе последнего десятилетия появилась специально индуцируемая модификация сплайсинга для восстановления нарушенной рамки считывания транскрипта DMD в качестве перспективной терапии мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) (van Ommen G.J. et al., Yokota T., et al., van Deutekom et al., Goemans N.M., et al.). С использованием специфичных к последовательности антисмысловых олигонуклеотидов (AON), которые нацелены на конкретный экзон, фланкирующий или содержащий мутацию, и препятствуют его сигналам сплайсинга, может быть индуцировано пропускание этого экзона во время процессинга пре-мРНК DMD. Несмотря на получаемый в результате укороченный транскрипт, открытая рамка считывания восстанавливается, и образуется белок, который сходен с белками, встречающимися у пациентов с обычно более мягкой мышечной дистрофией Беккера. Индуцируемое AON пропускание экзонов обеспечивает специфический для мутации и, таким образом, потенциально персонализированный терапевтический подход для пациентов с DMD и определенных пациентов с тяжелой BMD. Поскольку большинство мутаций кластеризуются в области экзонов 45-55 в гене DMD, пропускание одного конкретного экзона в этой области может быть терапевтическим для субпопуляции пациентов с различными мутациями. Пропускание экзона 51 имеют наибольшие субпопуляции пациентов (приблизительно 13%), включая пациентов с делециями экзонов 45-50, 48-50, 50 или 52. В случае некоторых мутаций для восстановления открытой рамки считывания требуется пропускание более одного экзона. Например, для пациентов DMD с делецией с экзона 46 по экзон 50 в гене DMD, только пропускание обоих из экзонов 45 и 51 является корректирующим. Для лечения этих пациентов требуется введение двух олигонуклеотидов, один из которых нацелен на экзон 45, а другой из которых нацелен на экзон 51. Осуществимость пропускания двух или более последовательных экзонов с использованием комбинации AON, либо в коктейле, либо в доставляемых с помощью вирусов генных конструкциях, широко исследована (Aartsma-Rus A. et al., 2004; Béroud C., et al.; Van Vliet L., et al.; Yokota T., et al.; Goyenvalle A., et al.). Пропускание множества экзонов было бы применимым для совокупных субпопуляций пациентов, позволило бы имитировать делеции, о которых известно, что они ассоциированы с относительно мягкими фенотипами, и обеспечило бы инструмент для нацеливания на редкие мутации вне области горячей точки делеций в гене DMD. Однако недостатком разработки лекарственных средств, содержащих множество олигонуклеотидов, является то, что учреждение по контролю за оборотом лекарственных средств может рассматривать олигонуклеотиды с различными последовательностями как различные лекарственные средства, для каждого из которых требуются доказательства стабильной продукции, испытания токсичности и клинические испытания. Таким образом, существует потребность в одном молекулярном соединении, способном индуцировать пропускание по меньшей мере двух экзонов, чтобы упростить лечение совокупных подгрупп пациентов с DMD.

Описание изобретения

Изобретение относится к способу конструирования олигонуклеотида, где указанный олигонуклеотид способен связываться с областью первого экзона и с областью второго экзона в одной и той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Олигонуклеотиды, получаемые указанным способом, предпочтительно способны индуцировать пропускание указанного первого экзона и указанного второго экзона в указанной пре-мРНК. Предпочтительно, также индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами. Полученный транскрипт указанной пре-мРНК, где пропускаются указанные экзоны, находится в рамке считывания.

Олигонуклеотид

В первом аспекте изобретение относится к олигонуклеотиду, который способен связываться с областью первого экзона и с областью второго экзона в одной и той же пре-мРНК, где указанная область второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона.

Олигонуклеотид предпочтительно способен индуцировать пропускание первого и второго экзонов указанной пре-мРНК; более предпочтительно, индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный транскрипт находится в рамке считывания.

Пропускание экзона препятствует природным процессам сплайсинга, происходящим в эукариотической клетке. У высших эукариот генетическая информация для белков в ДНК клетки кодируется в экзонах, которые отделены друг от друга последовательностями интронов. Эти интроны в некоторых случаях являются очень длинными. Аппарат транскрипции эукариот образует пре-мРНК, которая содержит как экзоны, так и интроны, в то время как аппарат сплайсинга, часто уже во время происходящей продукции пре-мРНК, образует истинную кодирующую мРНК для белка путем удаления интронов и связывания экзонов, присутствующих в пре-мРНК, в ходе процесса, называемого сплайсингом.

Олигонуклеотид по изобретению, который способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и с областью второго экзона в той же пре-мРНК, следует рассматривать как олигонуклеотид, пригодный для связывания с областью первого экзона в пре-мРНК и пригодный для связывания с областью второго экзона в той же пре-мРНК. Такой олигонуклеотид по изобретению характеризуется его признаком связывания (т.е. способен связываться), когда его используют с или в комбинации с пре-мРНК, предпочтительно в клетке. В этом контексте выражение "способен к" может быть заменено на "может". Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что олигонуклеотид, способный связываться с областью первого экзона и способный связываться с областью второго экзона в одной и той же пре-мРНК, определяемый нуклеотидной последовательностью, определяет указанный олигонуклеотид структурно, т.е. указанный олигонуклеотид обладает такой последовательностью, которая обратно комплементарна последовательности указанной области указанного первого экзона и также обратно комплементарна последовательности указанной области указанного второго экзона в одной и той же пре-мРНК. Степень обратной комплементарности с указанными областями указанного первого и/или указанного второго экзона, которая необходима для олигонуклеотида по изобретению, может составлять менее 100%. Может быть допустимым определенное количество несоответствий нуклеотидов или один или два пропуска, как дополнительно описано в настоящем описании. Нуклеотидную последовательность области первого экзона, которая обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного второго экзона (или нуклеотидная последовательность области второго экзона, которая обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона), с которой способен связываться олигонуклеотид по изобретению, можно конструировать с использованием способа по изобретению, как пояснено ниже в настоящем описании. Предпочтительная пре-мРНК представляет собой пре-мРНК дистрофина. Предпочтительные комбинации первого и второго экзонов пре-мРНК дистрофина и предпочтительные области указанных первого и второго экзонов дистрофина определены в таблице 2. Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзонов в указанной пре-мРНК дистрофина; более предпочтительно, индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный транскрипт дистрофина находится в рамке считывания, предпочтительно, как указано в таблице 1.

Транскрипт находится в рамке считывания, когда он имеет открытую рамку считывания, которая обеспечивает продукцию белка. Состояние нахождения мРНК в рамке считывания можно оценивать с помощью анализа последовательности и/или анализа ОТ-ПЦР, как известно специалисту в данной области. Полученный белок, который образуется в результате трансляции транскрипта в рамке считывания, можно анализировать с помощью иммунофлуоресценции и/или анализа с использованием вестерн-блоттинга с использованием антител, которые перекрестно реагируют с указанным белком, как известно специалисту в данной области. В рамках настоящего изобретения олигонуклеотид, описанный в настоящем описании, может быть назван функциональным, если полученный транскрипт в рамке считывания идентифицируется с помощью ОТ-ПЦР и/или анализа последовательности, или если белок, образовавшийся с указанного транскрипта, идентифицируется с помощью иммунофлуоресценции и/или анализа с использованием вестерн-блоттинга, в соответствующей системе in vitro или in vivo в зависимости от типа транскрипта. Если транскрипт представляет собой транскрипт дистрофина, соответствующая система может представлять собой мышечную клетку или мышечную трубочку здорового донора или пациента с DMD, как пояснено в настоящем описании ниже.

В одном варианте осуществления область второго экзона (присутствующая в той же пре-мРНК в качестве области первого экзона) обладает по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичностью с областью первого экзона, как определено выше (предпочтительные области первого и второго экзонов дистрофина указаны в таблице 2). Процент идентичности можно оценивать по всей длине указанных первого и/или второго экзонов или на протяжении области из 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, как проиллюстрировано в настоящем описании для экзонов дистрофина. Для квалифицированного специалиста очевидно, что первый и второй экзоны, как описано в настоящем описании, представляют собой два различных экзона одной единственной мРНК или два различных экзона одной и той же пре-мРНК. Первый экзон, как указано в настоящем описании, может быть расположен выше (т.е. с 5'-стороны) второго экзона в одной и той же пре-мРНК, как указано в настоящем описании, или второй экзон может быть расположен выше указанного первого экзона. Предпочтительно, указанный первый экзон расположен выше указанного второго экзона. Специалисту в данной области очевидно, что олигонуклеотид по изобретению может быть исходно сконструирован так, чтобы он был способен связываться с областью первого экзона; ввиду идентичности области указанного первого и указанного второй экзонов, указанный олигонуклеотид также вторично может быть способен связываться с указанной областью указанного второго экзона. Возможно обратное конструирование: олигонуклеотид по изобретению может быть первично сконструирован так, чтобы он был способен связываться с областью второго экзона; ввиду идентичности области указанного первого и указанного второго экзонов, указанный олигонуклеотид также может быть вторично способен связываться с указанной областью указанного первого экзона.

Процент идентичности между областью первого и областью второго экзонов можно оценивать по всей области указанного первого экзона, где область может быть более короткой, более длинной или в равной степени длинной относительно части этой области, с которой олигонуклеотид по изобретению способен связываться. Область первого экзона и область второго экзона, как используют в рамках изобретения, также могут быть идентифицированы как область(и) идентичности. Предпочтительно область первого экзона, которая определяет идентичность с областью второго экзона, является в равной степени длинной или более длинной, чем часть этой области, с которой способен связываться олигонуклеотид по изобретению. Должно быть понятно, что олигонуклеотид по изобретению может быть способен связываться с меньшей частью или частично перекрывающейся частью указанных областей, использованных для оценки идентичности последовательностей указанных первого и/или второго экзонов. Таким образом, должно быть понятно, что олигонуклеотид, который способен связываться с областью первого и второго экзонов, может связываться с частью указанной области указанного первого экзона и указанного второго экзона. Указанная часть может иметь такую же длину, как и указанная область указанного первого и/или указанного второго экзонов. Указанная часть может быть более короткой или более длинной относительно указанной области указанного первого и/или указанного второго экзонов. Указанная часть может находиться в указанной области указанного первого и/или указанного второго экзонов. Указанная часть может перекрываться с указанной областью указанного первого и/или указанного второго экзонов. Это перекрывание может составлять 1, 2, 3, 4, 5 или более нуклеотидов на 5'- и/или на 3'-стороне области указанного первого и/или второго экзона. Олигонуклеотид может быть по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5 или более нуклеотидов длиннее или короче области указанного первого и/или указанного второго экзона и может находиться на 5'- или 3'-стороне указанной области первой и/или второй области.

Область, составляющая 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 или вплоть до 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, используемая для вычисления процента идентичности между первым экзоном и вторым экзоном, может представлять собой непрерывный участок, или она может прерываться одним, двумя, тремя, четырьмя или более пропусками при условии, что процент идентичности на протяжении всей области составляет по меньшей мере 50%.

Процент идентичности между областью первого экзона и областью второго экзона можно оценивать с использованием любой программы, известной специалисту в данной области. Предпочтительно, указанную идентичность оценивают следующим образом: наилучшее попарное выравнивание между первым и вторым экзонами с использованием сетевого инструмента EMBOSS Matcher с использованием параметров по умолчанию (матрица: EDNAFULL, штраф за внесение пропуска: 16, штраф за продолжение пропуска: 4).

Олигонуклеотид, как используют в рамках изобретения, предпочтительно относится к олигомеру, который способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным области или части области первого и второго экзонов в одной и той же пре-мРНК.

Олигонуклеотид, как определено в настоящем описании (т.е. который способен связываться с областью первого экзона и с областью другого экзона (т.е. второго экзона) в одной и той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона), также предпочтительно по меньшей мере на 80% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 45% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона. Более предпочтительно, указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона. Обратную комплементарность предпочтительно, но не обязательно, оценивают на протяжении всей длины олигонуклеотида.

Олигонуклеотид, охватываемый изобретением, может содержать по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Олигонуклеотид, охватываемый изобретением, может содержать не более 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 нуклеотидов. Длина олигонуклеотида по изобретению определяется общим количеством нуклеотидов, охватываемых указанным олигонуклеотидом, независимо от модификаций, присутствующих в указанном олигонуклеотиде. Как дополнительно рассмотрено ниже, нуклеотиды могут содержать определенные химические модификации, однако такие модифицированные нуклеотиды, тем не менее, считаются нуклеотидами в контексте настоящего изобретения. В зависимости от химии олигонуклеотида, оптимальная длина олигонуклеотида может отличаться. Например, длина 2'-O-метилфосфоротиоатного олигонуклеотида может составлять от 15 до 30. Если этот олигонуклеотид далее модифицировать, как проиллюстрировано в настоящем описании, оптимальная длина может быть укорочена до 14, 13 или даже менее.

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет не более 30 нуклеотидов для ограничения вероятности снижения эффективности синтеза, выхода, частоты или масштабируемости, снижения биодоступности и/или клеточного захвата и транспорта, снижения безопасности и для ограничения расходов. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид состоит из 15-25 нуклеотидов. Наиболее предпочтительно, олигонуклеотид, охватываемый изобретением, состоит из 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов. Длина олигонуклеотида по изобретению предпочтительно является такой, что функциональность или активность олигонуклеотида определяется индукцией по меньшей мере 5% пропускания первого и второго экзонов (и любого экзона(ов) между ними), или способствованием тому, что образуется по меньшей мере 5% транскрипта в рамке считывания, когда по меньшей мере 100 нМ указанного олигонуклеотида используют для трансфицирования соответствующей клеточной культуры in vitro. Оценка присутствия указанного транскрипта уже описана в настоящем описании. Соответствующая клеточная культура представляет собой клеточную культуру, где пре-мРНК, содержащая указанный первый и указанный второй экзоны, транскрибируется и сплайсируется в мРНК-транскрипт. Если пре-мРНК представляет собой пре-мРНК дистрофина, соответствующая клеточная культура содержит (дифференцированные) мышечные клетки. В этом случае образуется по меньшей мере 20% транскрипта в рамке считывания, когда используют по меньшей мере 250 нМ указанного олигонуклеотида.

Область первого экзона может иметь длину по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 или вплоть до 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов. Область первого экзона также может быть определена как составляющая по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% длины указанного экзона. Область первого экзона может быть названа областью идентичности.

Область второго экзона может составлять по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 или вплоть до 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов. Область второго экзона может быть определена как составляющая по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% от длины указанного экзона. Область второго экзона может быть названа областью идентичности.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению способен связываться с областью экзона U+1 (первый экзон) из пре-мРНК, где область другого экзона D-1 (второй экзон) в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного (U+1) экзона, где указанный олигонуклеотид предназначен для пропускания указанного U+1 и указанного D-1 экзонов (и дополнительного экзона(ов), предпочтительно расположенного между указанным первым и указанным вторым экзонами) указанной пре-мРНК, с образованием транскрипта в рамке считывания, в котором экзоны U и D сплайсированы вместе (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице 1). Олигонуклеотид по изобретению также обозначается в настоящем описании как соединение. Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно представляет собой антисмысловой олигонуклеотид (т.е. AON). Олигонуклеотид предпочтительно предназначен для пропускания указанных двух экзонов (т.е. указанного первого (U+1) и указанного второго (D-1) экзонов) указанной пре-мРНК, и где образовавшийся транскрипт (в котором U прямо сплайсирован с D) находится в рамке считывания (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице 1). Можно сказать, что указанный олигонуклеотид индуцирует пропускание указанных двух экзонов в одной единственной пре-мРНК. Необязательно, индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и образующийся транскрипт находится в рамке считывания.

Более предпочтительно, олигонуклеотид предназначен для пропускания указанных двух экзонов (т.е. указанного первого и указанного второго экзонов), и полного участка экзонов между указанным первым и указанным вторым экзонами в указанной пре-мРНК для удаления какой-либо мутации в указанном участке и для получения транскрипта, который является более коротким, но который обладает восстановленной открытой рамкой считывания, что обеспечивает продуцирование белка.

Без связи с какой-либо теорией, полагают, что вследствие по меньшей мере 50% идентичности или сходства последовательностей между указанными двумя экзонами, единственный олигонуклеотид по изобретению способен связываться и индуцировать пропускание обоих экзонов и предпочтительно всего участка экзонов между ними, чтобы получить более короткий транскрипт, который находится в рамке считывания. Таким образом, указанные два экзона могут быть соседними в пре-мРНК, или они могут быть разделены по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 экзонами. Область, охватывающая один или несколько экзонов, присутствующих между указанным первым и указанным вторым экзонами, также может быть названа участком (множества) экзонов или мультиэкзонным участком. Предпочтительно, первый экзон этого мультиэкзонного участка представляет собой первый экзон, определенный в настоящем описании выше, а последний экзон этого мультиэкзонного участка представляет собой второй экзон, определенный в настоящем описании ранее. Олигонуклеотид по изобретению также может быть определен как олигонуклеотид, который способен индуцировать пропускание указанных двух экзонов, или пропускание участка (множества) экзонов или пропускание указанного мультиэкзонного участка. В предпочтительном варианте осуществления пропускание как первого экзона, так и второго экзона индуцируют с использованием одного единственного олигонуклеотида по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления осуществляют пропускание более одного, более 2, более 3, более 4, более 5, более 6, более 7, более 8, более 9, более 10, более 11, более 12, более 13, более 14, более 15, более 16, более 17 экзонов, более 18, более 19, более 20, более 21, более 22, более 23, более 24, более 25, более 26, более 27, более 28, более 29, более 30, более 31, более 32, более 33, более 34, более 35, более 36, более 37, более 38, более 39, более 40, более 41, более 42, более 43, более 44, более 45, более 46, более 47, более 48, более 49, более 50 экзонов с использованием одного единственного олигонуклеотида, и, таким образом, это пропускание более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 экзонов проводят, не используя смесь или коктейль двух или более различных олигонуклеотидов, или не используя два или более различных олигонуклеотидов, которые могут быть связаны с помощью одного или нескольких линкера(ов), или не используя генную конструкцию, транскрибирующую два или более различных олигонуклеотидов. В одном варианте осуществления, таким образом, предусматривается, что изобретение охватывает один единственный олигонуклеотид и не содержит двух или более различных олигонуклеотидов, причем указанный единственный олигонуклеотид способен связываться с указанным первым и указанным вторым экзонами и способен индуцировать пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов в одной пре-мРНК, как проиллюстрировано в настоящем описании. В этом контексте квалифицированному специалисту будет понятно, что слово "единственный" не относится к количеству молекул, требуемому для индукции пропускания экзонов. "Единственный" относится к последовательности олигонуклеотида: изобретение охватывает одну единственную олигонуклеотидную последовательность и ее применение, и не включает две или более различных олигонуклеотидных последовательностей, причем указанная единственная олигонуклеотидная последовательность способна связываться с указанным первым и указанным вторым экзонами и способна индуцировать пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов в одной пре-мРНК, как объяснено в настоящем описании. Это изобретение представляет собой первое изобретение, позволяющее пропускание более чем одного экзона с помощью только одного единственного олигонуклеотида для лечения заболевания, вызываемого (редкой) мутацией в гене, при условии, что различные экзоны в указанном гене включают области, которые обладают по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей.

Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно используют в качестве части терапии на основе активности модулирования РНК, как определено в настоящем описании ниже. В зависимости от типа транскрипта, где присутствуют первый и второй экзоны, можно сконструировать олигонуклеотид для предупреждения, лечения или замедления данного заболевания.

Было показано, что нацеливание на два экзона в одной пре-мРНК с помощью одного олигонуклеотида, способного связываться с обоими экзонами, приводит к мРНК, лишенной экзонов-мишеней, и, кроме того, всего участка экзонов между ними. Преимуществом такого единственного олигонуклеотида, как определено в настоящем описании, является то, что можно лечить дефекты, вызванные различными мутациями в этом мультиэкзонном участке. Если выбрать два или более различных олигонуклеотидов для индукции пропускания двух или более экзонов, следует, например, учитывать, что каждый олигонуклеотид может обладать его собственным профилем PK, и что, таким образом, необходимо будет найти условия, где каждый из них будет сходным образом присутствовать в одной и той же клетке. Таким образом, другим преимуществом использования только одного единственного олигонуклеотида, способного связываться с двумя различными экзонами, как определено выше, является то, что значительно упрощается изготовление, исследование токсичности, поиск дозы и клиническое испытание, поскольку это может быть сведено к простому изготовлению и исследованию одного единственного соединения.

Ниже определены дополнительные признаки олигонуклеотида по изобретению.

В контексте изобретения, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с, является обратно комплементарным и/или способен ингибировать функцию по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в по меньшей мере указанном первом экзоне и/или указанном втором экзоне и/или влияет на структуру по меньшей мере указанного первого экзона и/или указанного второго экзона:

где указанный олигонуклеотид содержит последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной участку связывания серин-аргининового (SR) белка в указанном первом и/или втором экзоне,

и/или

где указанный олигонуклеотид способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным энхансеру сплайсинга экзонов (ESE), последовательности распознавания экзонов (ERS) и/или сайленсеру сплайсинга экзонов (ESS) в указанном первом и/или втором экзоне.

Более предпочтительно, указанный олигонуклеотид, который способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным области первого экзона пре-мРНК и/или области второго экзона пре-мРНК, способен специфически ингибировать по меньшей мере одну регулирующую сплайсинг последовательность и/или влиять на структуру по меньшей мере указанного первого и/или второго экзона в указанной пре-мРНК. Препятствование регулирующим сплайсинг последовательностям и/или структурам имеет преимущество, состоящее в том, что такие элементы располагаются в экзоне. Путем предоставления такого олигонуклеотида, как определено в настоящем описании, можно эффективно замаскировать по меньшей мере указанный первый и второй экзоны, и предпочтительно полный участок экзонов между ними, от аппарата сплайсинга. Отсутствие распознавания аппаратом сплайсинга этих экзонов, таким образом, приводит к пропусканию или исключению этих экзонов из конечной мРНК. Этот вариант осуществления сфокусирован только на кодирующих последовательностях. Полагают, что это позволяет способу быть более специфическим и, таким образом, надежным. Обратная комплементарность указанного олигонуклеотида с указанной областью указанного первого и/или второго экзона в пре-мРНК предпочтительно составляет по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

Таким образом, настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду для применения в качестве лекарственного средства для предупреждения, замедления, смягчения и/или лечения заболевания у индивидуума,

где указанный олигонуклеотид способен связываться с областью первого экзона и областью второго экзона, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона,

где указанный первый и указанный второй экзоны находятся в одной и той же пре-мРНК у указанного индивидуума,

где указанное связывание приводит к пропусканию указанного первого экзона и указанного второго экзона и предпочтительно к пропусканию мультиэкзонного участка, начинающегося с указанного первого экзона и охватывающего один или несколько экзонов, находящихся между указанным первым и указанным вторым экзонами, и в лучшем случае к пропусканию всего участка экзонов между указанным первым и указанным вторым экзонами, и

где получают транскрипт в рамке считывания, позволяющий продуцирование функционального или полуфункционального белка.

Предпочтительно, как проиллюстрировано в настоящем описании, указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание всего участка экзонов между указанным первым экзоном и указанным вторым экзоном.

Более предпочтительно, как объяснено в настоящем описании, указанное связывание указанного олигонуклеотида способно препятствовать по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в указанных областях указанных первого и второго экзонов, и/или вторичной структуре указанного первого и/или указанного второго экзонов, и/или вторичной структуре, охватывающей по меньшей мере указанный первый и/или указанный второй экзоны в указанной пре-мРНК. Предпочтительные регулирующие сплайсинг последовательности представлены в настоящем описании ниже.

Таким образом, один предпочтительный вариант осуществления относится к олигонуклеотиду по изобретению, который способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и/или с областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице 2), где указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание указанного первого и указанного второго экзонов в указанной пре-мРНК; что приводит к транскрипту, который находится в рамке считывания (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице в таблице 1 или 6). Указанный олигонуклеотид обеспечивает у указанного индивидуума функциональный или полуфункциональный белок, и указанный олигонуклеотид дополнительно содержит:

- последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого и/или второго экзона пре-мРНК, которая гибридизуется с другой частью первого и/или второго экзона пре-мРНК (закрытая структура), и/или

- последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области указанного первого и/или второго экзона пре-мРНК, которая не гибридизуется с указанной пре-мРНК (открытая структура).

Для этого варианта осуществления приводится ссылка на патентную заявку WO 2004/083446. Молекулы РНК обладают прочными вторичными структурами, по большей части вследствие спаривания оснований обратно комплементарных или частично обратно комплементарных участков в одной и той же РНК. Уже давно полагают, что структуры в РНК играют роль в функции РНК. Без связи с теорией, полагают, что вторичная структура РНК экзона играет роль в структурировании процесса сплайсинга. В ее структуре экзон распознается в качестве части, которая должна быть включена в мРНК. В одном варианте осуществления олигонуклеотид способен препятствовать структуре по меньшей мере указанного первого экзона и, возможно, также указанного второго экзона и, возможно, также участка экзонов между ними, и, таким образом, способен препятствовать сплайсингу указанного первого, и, возможно, также указанного второго экзона, и, возможно, также участка экзонов между ними, путем маскирования указанных экзонов от аппарата сплайсинга и тем самым обеспечения пропускания указанных экзонов. Без связи с теорией, полагают, что перекрывание с открытой структурой повышает эффективность инвазии олигонуклеотида (т.е. повышает эффективность, с которой олигонуклеотид может проникать в структуру), в то время как перекрывание с закрытой структурой повышает эффективность препятствования вторичной структуре РНК экзона. Было обнаружено, что длина частичной обратной комплементарности как с закрытой, так и с открытой структурой в значительной степени не ограничена. Авторы настоящего изобретения наблюдали высокую эффективность в случае олигонуклеотида с различной длиной обратной комплементарности в любой структуре. Термин "обратная комплементарность" используют в настоящем описании для обозначения участка нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с другим участком нуклеиновых кислот в физиологических условиях. Условия гибридизации определены в настоящем описании ниже. Таким образом, не является абсолютным требованием, чтобы все основания в области обратной комплементарности были способны спариваться с основаниями на противоположной цепи. Например, при конструировании олигонуклеотида может быть желательным включение, например, одного или нескольких остатков, которые не образуют пары оснований с основаниями на обратной комплементарной цепи. Несоответствия оснований могут быть до некоторой степени допустимыми, если в условиях в клетке участок нуклеотидов все еще способен гибридизоваться с обратно комплементарной частью. В контексте настоящего изобретения присутствие несоответствия в олигонуклеотиде по изобретению является предпочтительным, поскольку в одном варианте осуществления указанный олигонуклеотид является по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% обратно комплементарным области первого экзона и/или области второго экзона. Присутствие несоответствия в указанном олигонуклеотиде является предпочтительной характеристикой изобретения, поскольку указанный олигонуклеотид способен связываться с областью указанного первого и с областью указанного второго экзона, как определено в настоящем описании выше.

Другие преимущества обеспечения присутствия несоответствия оснований в антисмысловом олигонуклеотиде по изобретению определены в настоящем описании, и они сходны с преимуществами, обеспечиваемыми присутствием инозина (гипоксантина), и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований: избегание присутствия CpG, избегание или снижение потенциальной мультимеризации или агрегации, избегание квадруплексных структур, возможность конструирования олигонуклеотида с улучшенной кинетикой связывания РНК и/или термодинамическими свойствами.

Предпочтительно, обратная комплементарность олигонуклеотида области идентичности между указанными первым и/или вторым экзонами составляет от 45% до 65%, от 50% до 75%, но более предпочтительно от 65% до 100% или от 70% до 90%, или от 75% до 85%, или от 80% до 95%. Как правило, это обеспечивает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 несоответствий в олигонуклеотиде из 20 нуклеотидов. Таким образом, в олигонуклеотиде из 40 нуклеотидов может быть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований. Предпочтительно, в олигонуклеотиде из 40 нуклеотидов присутствует менее 14 несоответствий оснований. Количество несоответствий оснований является таким, что олигонуклеотид по изобретению все еще способен связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на область указанного первого экзона и на область указанного второго экзона, тем самым индуцируя пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов и индуцируя продукцию транскрипта в рамке считывания, как объяснено в настоящем описании. Предпочтительно, продукции транскрипта в рамке считывания достигают по меньшей мере с 5% эффективностью при использовании по меньшей мере 100 нМ указанного олигонуклеотида для трансфекции соответствующей клеточной культуры in vitro, как объяснено в настоящем описании выше.

Следует отметить, что изобретение охватывает олигонуклеотид, который не обладает никаким несоответствием оснований с областью первого экзона и который может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований с соответствующей областью второго экзона, как определено в настоящем описании. Однако изобретение также охватывает олигонуклеотид, который не имеет никакого несоответствия оснований с областью второго экзона и который может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований с соответствующей областью первого экзона, как определено в настоящем описании. Наконец, изобретение охватывает олигонуклеотид, который может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований с областью первого экзона и который может иметь 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 несоответствие оснований с соответствующей областью второго экзона, как определено в настоящем описании. Вновь, в рамках настоящего изобретения следует понимать, что количество несоответствий оснований в олигонуклеотиде по изобретению является таким, чтобы этот указанный олигонуклеотид все еще был способен связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на область указанного первого экзона и область указанного второго экзона, как пояснено в настоящем описании.

Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно не пересекает пропуск в выравнивании области первого экзона и области второго экзона, как определено в настоящем описании. Выравнивание предпочтительно проводят с использованием сетевого инструмента EMBOSS Matcher, как пояснено в настоящем описании выше. Однако в конкретных случаях возможно, что олигонуклеотид по изобретению должен пересекать пропуск, как упомянуто в настоящем описании выше. Предпочтительно, указанный пропуск представляет собой только один пропуск. Указанный пропуск предпочтительно охватывает менее 3 нуклеотидов, наиболее предпочтительно только один нуклеотид. Количество и длина пропусков являются такими, что олигонуклеотид по изобретению все еще способен связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на область указанного первого экзона и область указанного второго экзона, тем самым индуцируя пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов и индуцируя продукцию транскрипта в рамке считывания, как пояснено в настоящем описании.

Структуру (т.е. открытые и закрытые структуры) наилучшим образом анализируют в контексте пре-мРНК, где находится экзон. Такую структуру можно анализировать в истинной РНК. Однако в настоящее время возможно спрогнозировать вторичную структуру молекулы РНК (с наибольшими затратами энергии) достаточно тщательно с использованием моделирующих структуру программ. Неограничивающим примером подходящей программы является интернет-сервер Mfold (Zuker, M.).

Специалист в данной области способен спрогнозировать с приемлемой воспроизводимостью вероятную структуру экзона, учитывая нуклеотидную последовательность. Наилучшее прогнозирование осуществляют, когда программе предоставляют как последовательность указанного экзона, так и последовательности фланкирующих интронов. Как правило, не является необходимым моделирование структуры всей пре-мРНК.

Отжиг олигонуклеотида по изобретению может влиять на локальное сворачивание или 3D-структуру или конформацию РНК-мишени (т.е. область, охватывающую по меньшей мере первый и/или второй экзоны). Отличающаяся конформация может приводить к нарушению структуры, распознаваемой аппаратом сплайсинга. Однако, когда в первом и/или втором экзоне-мишени присутствуют потенциальные (скрытые) акцепторные и/или донорные последовательности сплайсинга, иногда образуется новая структура, определяющая отличающийся (нео-) экзон, т.е. с отличающимся 5'-концом, отличающимся 3'-концом или обоими из них. Этот тип активности находится в объеме настоящего изобретения, поскольку экзон-мишень исключается из мРНК. Присутствие нового экзона, содержащего часть указанного первого и/или второго экзона-мишени в мРНК, не изменяет тот факт, что экзон-мишень, как таковой, исключается. Включение нового экзона можно наблюдать в качестве побочного эффекта, который происходит только изредка. Существует две возможности, когда пропускание экзона используется для восстановления (части) открытой рамки считывания транскрипта, которая разрушается в результате мутации. Одной из них является то, что новый экзон является функциональным в отношении восстановления рамки считывания, в то время как в другом случае рамка считывания не восстанавливается. При выборе олигонуклеотида для восстановления открытой рамки считывания с помощью пропускания множества экзонов, безусловно, очевидно, что в этих условиях выбирают только те олигонуклеотиды, которые действительно приводят к пропусканию экзона, которое восстанавливает открытую рамку считывания данного транскрипта, с новым экзоном или без него.

Кроме того, в другом предпочтительном варианте осуществления предусматривается олигонуклеотид по изобретению, который способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и с областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона (предпочтительные области для экзонов дистрофина указаны в таблице 2 или таблице 6), где указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзонов указанной пре-мРНК; что приводит к транскрипту, который находится в рамке считывания (для DMD, предпочтительно, как в таблице 1 или таблице 6). Указанный олигонуклеотид обеспечивает у указанного индивидуума функциональный или полуфункциональный белок, и указанный олигонуклеотид дополнительно содержит: последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с, является обратно комплементарной для и/или способна ингибировать функцию одного или нескольких участков связывания серин-аргининового (SR) белка в РНК экзона из пре-мРНК.

В патентной заявке WO 2006/112705 авторы настоящего изобретения описали наличие корреляции между эффективностью внутреннего антисмыслового олигонуклеотида (AON) экзона в отношении индукции пропускания экзонов и присутствием предполагаемого участка связывания SR в заданном участке пре-мРНК указанного AON. Таким образом, в одном варианте осуществления получают указанный олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, включая определение одного или нескольких (предполагаемых) участков связывания для белка SR в РНК указанного первого и/или указанного второго экзона и получение соответствующего олигонуклеотида, который способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным указанной РНК и который по меньшей мере частично перекрывает указанный (предполагаемый) участок связывания. Термин "по меньшей мере частично перекрывает" определяют в настоящем описании как включающий перекрывание только одного нуклеотида участка связывания SR, а также множества нуклеотидов одного или нескольких указанных участков связывания, а также полное перекрывание одного или нескольких указанных участков связывания. Этот вариант осуществления, предпочтительно, дополнительно включает определение во вторичной структуре первого и/или второго экзона области, которая гибридизуется с другой частью указанного первого и/или второго экзона (закрытая структура), и области, которая не гибридизуется в указанной структуре (открытая структура), а затем получение олигонуклеотида, который по меньшей мере частично перекрывает один или несколько указанных (предполагаемых) участков связывания, и который перекрывает по меньшей мере часть указанной закрытой структуры и перекрывает по меньшей мере часть указанной открытой структуры, и который связывается с, нацеливается на, гибридизуется с и/или является обратно комплементарным первому и второму экзонам. Таким образом, авторы настоящего изобретения увеличивают вероятность получения олигонуклеотида, который способен препятствовать включению указанного первого и второго экзонов, и, если это применимо, полного участка экзонов между ними, из пре-мРНК в мРНК. Без связи с какой-либо теорией, в настоящее время полагают, что применение олигонуклеотида, направленного на участок связывания белка SR, приводит (по меньшей мере частично) к нарушению связывания белка SR с указанным участком связывания, что приводит к нарушенному или ухудшенному сплайсингу.

Предпочтительно, область первого экзона и/или область второго экзона в одной и той же пре-мРНК, с которой способен связываться олигонуклеотид по изобретению, содержит открытую/закрытую структуру и/или участок связывания белка SR, более предпочтительно указанная открытая/закрытая структура и указанный участок связывания белка SR частично перекрываются, и еще более предпочтительно указанная открытая/закрытая структура полностью перекрывает участок связывания белка SR, или участок связывания белка SR полностью перекрывает открытую/закрытую структуру. Это обеспечивает дальнейшее нарушение включения экзона.

Помимо консенсусных последовательностей участков связывания, множество (или даже все) экзонов содержат регулирующие сплайсинг последовательности, такие как последовательности энхансера сплайсинга экзонов (ESE), чтобы облегчить распознавание истинных участков сплайсинга сплайсингосомой (Cartegni L, et al. 2002; и Cartegni L, et al., 2003). Подгруппа факторов связывания, называемых белками SR, может связываться с этими ESE и привлекать другие факторы сплайсинга, такие как U1 и U2AF, в (слабо определенные) участки сплайсинга. Участки сплайсинга четырех из наиболее распространенных белков SR (SF2/ASF, SC35, SRp40 и SRp55) проанализированы детально (Cartegni L, et al. 2002 и Cartegni L, et al., 2003). Существует корреляция между эффективностью олигонуклеотида и наличием/отсутствием участка связывания SF2/ASF, SC35, SRp40 и SRp55 в части первого экзона, с которой связывается, гибридизуется и/или на которую нацеливается указанный олигонуклеотид. В предпочтительном варианте осуществления изобретение, таким образом, относится к олигонуклеотиду, который связывается с, гибридизуется с, нацеливается на и/или обратно комплементарен участку связывания для белка SR. Предпочтительно, указанный SR белок представляет собой SF2/ASF или SC35, SRp40 или SRp55. В одном варианте осуществления олигонуклеотид связывается с, гибридизуется с, нацеливается на и/или является обратно комплементарным участку связывания белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 в первом экзоне и участку связывания другого белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 во втором экзоне. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид связывается с, гибридизуется с, нацеливается на и/или является обратно комплементарным участку связывания белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 в первом экзоне и участку связывания сходного белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 во втором экзоне.

В одном варианте осуществления у пациента обеспечивают функциональный или полуфункциональный белок с использованием олигонуклеотида, который способен связываться с, нацеливаться на регуляторную последовательность РНК, присутствующую в первом и/или втором экзоне, которая требуется для правильного сплайсинга указанного экзона(ов) в транскрипте. Для правильного сплайсинга экзонов в транскрипте требуется несколько цис-действующих последовательностей РНК. В частности, идентифицированы дополнительные элементы, такие как энхансеры сплайсинга экзонов (ESE), для регуляции специфического и эффективного сплайсинга конститутивных и альтернативных экзонов. С использованием соединения, содержащего олигонуклеотид, который связывается или способен связываться с одним из дополнительных элементов в указанном первом и/или втором экзоне(ах), их регуляторная функция нарушается так, что экзоны пропускаются. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона, где указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзона в указанной пре-мРНК; где указанная область указанного первого экзона и/или указанная область указанного второго экзона содержит энхансер сплайсинга экзонов (ESE), последовательность распознавания экзонов (ERS) и/или последовательность энхансера сплайсинга (SES), и/или где указанный олигонуклеотид способен связываться с, нацеливаться на, способен ингибировать и/или является обратно комплементарным указанному энхансеру сплайсинга экзонов (ESE), последовательности распознавания экзонов (ERS) и/или последовательности энхансера сплайсинга (SES).

Ниже описаны предпочтительные химические структуры олигонуклеотида по изобретению.

Олигонуклеотид широко известен как олигомер, который имеет базовые характеристики гибридизации, сходные с природными нуклеиновыми кислотами. Гибридизация определена в разделе, посвященном определениям, в конце описания изобретения. В настоящей заявке термины "олигонуклеотид" и "олигомер" используют взаимозаменяемо. Для получения указанного олигонуклеотида по изобретению можно использовать различные типы нуклеозидов. Олигонуклеотид может содержать по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь и/или по меньшей мере одну модификацию сахара и/или по меньшей мере одну модификацию основания по сравнению с встречающимся в природе олигонуклеотидом на основе рибонуклеотида или дезоксирибонуклеотида.

"Модифицированная межнуклеозидная связь" указывает на присутствие модифицированной версии фосфодиэфира относительно встречающейся в природе РНК и ДНК. Примерами модификаций межнуклеозидной связи, которые совместимы с настоящим изобретением, являются фосфоротиоат (PS), хирально чистый фосфоротиоат, фосфородитиоат (PS2), фосфоноацетат (PACE), фосфоноацетамид (PACA), тиофосфоноацетат, тиофосфоноацетамид, фосфоротиоатное пролекарство, H-фосфонат, метилфосфонат, метилфосфонотиоат, метилфосфат, метилфосфоротиоат, этилфосфат, этилфосфоротиоат, боранофосфат, боранофосфоротиоат, метилборанофосфат, метилборанофосфоротиоат, метилборанофосфонат, метилборанофосфонотиоат и их производные. Другая модификация включает фосфорамидит, фосфорамидат, N3'→P5' фосфорамидат, фосфородиамидат, фосфортиоамидат, фосфоротиодиамидат, сульфамат, диметиленсульфоксид, сульфонат, метиленимино (MMI), оксалил- и тиоацетамидонуклеиновую кислоту (TANA); и их производные. В зависимости от длины, олигонуклеотид по изобретению может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 модификаций основной цепи. Также изобретение охватывает внесение в указанный олигонуклеотид более одной отличающейся модификации основной цепи.

Также изобретение охватывает олигонуклеотид, который содержит межнуклеозидную связь, которая может отличаться с точки зрения атомов нуклеозидов, которые связаны друг с другом, по сравнению со встречающейся в природе межнуклеозидной связью. В этом отношении, олигонуклеотид по изобретению может содержать по меньшей мере одну межнуклеозидную связь, сконструированную как мономеры, связанные 3'-3', 5'-5', 2'-3', 2'-5', 2'-2'. Нумерация положений может отличаться для других химических структур, однако идея сохраняется в объеме изобретения.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную модификацию. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению является полностью модифицированным посредством фосфоротиоата.

"Модификация сахара" указывает на присутствие модифицированной версии рибозильной части относительно рибозильной части во встречающихся в природе РНК и ДНК (т.е. фуранозильная часть), такой как бициклические сахара, тетрагидропираны, структуры морфолино, 2'-модифицированные сахара, 3'-модифицированные сахара, 4'-модифицированные сахара, 5'-модифицированные сахара и 4'-замещенные сахара. Примеры подходящих модификаций сахаров включают, но не ограничиваются ими, 2'-O-модифицированные нуклеотидные остатки РНК, такие как 2'-O-алкил или 2'-O-(замещенный)алкил, например 2'-O-метил, 2'-O-(2-цианоэтил), 2'-O-(2-метокси)этил (2'-MOE), 2'-O-(2-тиометил)этил, 2'-O-бутирил, 2'-O-пропаргил, 2'-O-аллил, 2'-O-(2-амино)пропил, 2'-O-(2-(диметиламино)пропил), 2'-O-(3-амино)пропил, 2'-O-(3-(диметиламино)пропил), 2'-O-(2-амино)этил, 2'-O-(3-гуанидино)пропил (как описано в патентной заявке WO 2013/061295, University of the Witwatersrand, включенной в настоящее описание в качестве ссылки), 2'-O-(2-(диметиламино)этил); 2'-O-(галогеналкокси)метил (Arai K. et al.), например, 2'-O-(2-хлорэтокси)метил (MCEM), 2'-O-(2,2-дихлорэтокси)метил (DCEM); 2'-O-алкоксикарбонил, например, 2'-O-[2-(метоксикарбонил)этил] (MOCE), 2'-O-[2-(N-метилкарбамоил)этил] (MCE), 2'-O-[2-(N,N-диметилкарбамоил)этил] (DMCE); 2'-O-[метиламинокарбонил]метил; 2'-азидо; 2'-амино и 2'-замещенный амино; 2'-галоген, например, 2'-F, FANA (2'-F арабинозилнуклеиновая кислота); карбо- и аза- модификации сахаров; 3'-O-алкил, например, 3'-O-метил, 3'-O-бутирил, 3'-O-пропаргил; 2',3'-дидезокси; и их производные.

Другая модификация сахара включает "мостиковые" или "бициклические" (BNA) модифицированные части сахаров нуклеиновой кислоты, такие, как встречаются, например, в закрытой нуклеиновой кислоте (LNA), ксило-LNA, α-L-LNA, β-D-LNA, cEt (2'-O,4'-C связанный этил) LNA, cMOEt (2'-O,4'-C связанный метоксиэтил) LNA, связанной этиленовым мостиком нуклеиновой кислоте (ENA), BNA^NC[N-Me] (как описано в Chem. Commun. 2007, 3765-3767 Kazuyuki Miyashita et al., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), CRN, как описано в патентной заявке WO 2013/036868 (Marina Biotech, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме); разомкнутой нуклеиновой кислоте (UNA) или других ациклических нуклеозидах, таких как описаны в патентной заявке США US 2013/0130378 (Alnylam Pharmaceuticals), включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме; 5'-метил-замещенных BNA (как описано в патентной заявке США 13/530218, которая включена в качестве ссылки в полном объеме); циклогексенилнуклеиновой кислоте (CeNA), алтриолнуклеиновой кислоте (ANA), гекситолнуклеиновой кислоте (HNA), фторированной HNA (F-HNA), пиранозил-РНК (p-РНК), 3'-дезоксипиранозил-ДНК (p-ДНК); или других модифицированных частях сахаров, таких как морфолино (PMO), катионный морфолино (PMOPlus), PMO-X; трициклоДНК; трицикло-PS-ДНК; и их производные. Производные BNA описаны, например, в WO 2011/097641, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Примеры PMO-X описаны в WO 2011150408, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В зависимости от длины, олигонуклеотид по изобретению может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 модификаций сахаров. Также изобретение охватывает внесение более одной отличающейся модификации сахаров в указанный олигонуклеотид.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию сахара, выбранную из 2'-O-метила, 2'-O-(2-метокси)этила, 2'-F, морфолино, мостикового нуклеотида или BNA, или олигонуклеотид содержит как мостиковые нуклеотиды, так и 2'-дезоксинуклеотиды (смешанные BNA/ДНК-меры). Было показано, что олигонуклеотиды, содержащие 2'-фтор (2-'F) нуклеотид, способны привлекать связывающий энхансер интерлейкина фактор 2 и 3 (ILF2/3) и тем самым способны индуцировать пропускание экзонов в пре-мРНК-мишени (Rigo F, et al., WO 2011/097614).

В другом варианте осуществления олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, содержит или состоит из LNA или ее производного. Более предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению модифицирован по его всей длине модификацией сахара, выбранной из 2'-O-метила, 2'-O-(2-метокси)этила, морфолино, мостиковой нуклеиновой кислоты (BNA) или смешанного BNA/ДНК-мера. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению является полностью 2'-O-метил-модифицированным.

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию сахара и по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. Такие модификации включают пептидно-нуклеиновую кислоту (PNA), модифицированную борным кластером PNA, окси-пептидно-нуклеиновую кислоту на основе пирролидина (POPNA), нуклеиновую кислоту на основе гликоля или глицерина (GNA), нуклеиновую кислоту на основе треозы (TNA), ациклическую нуклеиновую кислоту на основе треонинола (aTNA), олигонуклеотиды на основе морфолино (PMO, PPMO, PMO-X), катионные олигомеры на основе морфолино (PMOPlus, PMO-X), олигонуклеотиды с объединенными основаниями и остовами (ONIB), пирролидин-амидные олигонуклеотиды (POM); и их производные. В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит остов пептидно-нуклеиновой кислоты и/или остов морфолинофосфородиамидата или их производное. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению является 2'-O-метилфосфоротиоат-модифицированным, т.е. содержит по меньшей мере одну 2'-O-метилфосфоротиоатную модификацию, предпочтительно олигонуклеотид по изобретению является полностью 2'-O-метилфосфоротиоат-модифицированным. Предпочтительно, 2'-O-метилфосфоротиоат-модифицированный олигонуклеотид или полностью 2'-O-метилфосфоротиоат-модифицированный олигонуклеотид представляет собой РНК-олигонуклеотид.

Термин "модификация основания" или "модифицированное основание", как определено в настоящем описании, относится к модификации встречающегося в природе основания в РНК и/или ДНК (т.е. пиримидинового или пуринового основания) или к синтезированным de novo основаниям. Такое синтезированное de novo основание может рассматриваться как "модифицированное" по сравнению с существующим основанием.

В дополнение к модификациям, описанным выше, олигонуклеотид по изобретению может содержать дополнительные модификации, такие как различные типы нуклеотидных остатков нуклеиновой кислоты или нуклеотидов, как описано ниже. Для получения олигонуклеотида по изобретению можно использовать различные типы нуклеотидных остатков нуклеиновой кислоты. Указанный олигонуклеотид может иметь по меньшей мере одну модификацию основной цепи и/или сахара и/или по меньшей мере одну модификацию основания по сравнению с олигонуклеотидом на основе РНК или ДНК.

Олигонуклеотид может содержать природные основания пурины (аденин, гуанин) или пиримидины (цитозин, тимин, урацил) и/или модифицированные основания, как определено ниже. В контексте изобретения урацил может быть заменен тимином.

Модификация оснований включает модифицированную версию природных пуриновых и пиримидиновых оснований (например, аденин, урацил, гуанин, цитозин и тимин), таких как гипоксантин, оротовая кислота, агматидин, лизидин, псевдоурацил, псевдотимин, N1-метилпсевдоурацил, 2-тиопиримидин (например, 2-тиоурацил, 2-тиотимин), 2,6-диаминопурин, G-зажим и его производные, 5-замещенный пиримидин (например, 5-галогенурацил, 5-метилурацил, 5-метилцитозин, 5-пропинилурацил, 5-пропинилцитозин, 5-аминометилурацил, 5-гидроксиметилурацил, 5-аминометилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин, Super T), 5-октилпиримидин, 5-тиофенпиримидин, 5-октин-1-илпиримидин, 5-этинилпиримидин, 5-(пиридиламид), 5-изобутил, 5-фенил, как описано в патентной заявке US 2013/0131141 (RXi), включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме; 7-деазагуанин, 7-деазааденин, 7-аза-2,6-диаминопурин, 8-аза-7-деазагуанин, 8-аза-7-деазааденин, 8-аза-7-деаза-2,6-диаминопурин, Super G, Super A и N4-этилцитозин, или их производные; N2-циклопентилгуанин (cPent-G), N2-циклопентил-2-аминопурин (cPent-AP) и N2-пропил-2-аминопурин (Pr-AP), или их производные; и вырожденные или универсальные основания, такие как 2,6-дифтортолуол, или отсутствующие основания, такие как абазические участки (например, 1-дезоксирибоза, 1,2-дидезоксирибоза, 1-дезокси-2-O-метилрибоза; или производные пирролидина, в которых кислород кольца заменен азотом (азарибоза)). Примеры производных Super A, Super G и Super T могут быть найдены в патенте США 6683173 (Epoch Biosciences), который включен в настоящее описание в качестве ссылки. Было показано, что cPent-G, cPent-AP и Pr-AP снижает иммуностимулирующие эффекты при включении в миРНК (siRNA) (Peacock H. et al.), и сходные признаки были показаны для псевдоурацила и N1-метилпсевдоурацила (патентная заявка США 2013/0123481, modeRNA Therapeutics, включенная в настоящее описание качестве ссылки в полном объеме).

"Тимин" и "5-метилурацил" могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо. Аналогично, "2,6-диаминопурин" идентичен "2-аминоаденину", и эти термины могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо.

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один 5-метилцитозин и/или по меньшей мере один 5-метилурацил и/или по меньшей мере одно 2,6-диаминопуриновое основание, что следует понимать как то, что по меньшей мере одно из цитозиновых нуклеиновых оснований указанного олигонуклеотида модифицировано путем замены протона в положении 5 кольца пиримидина метильной группой (т.е. 5-метилцитозином), и/или что по меньшей мере одно из урацильных нуклеиновых оснований указанного олигонуклеотида модифицировано путем замены протона в положении 5 кольца пиримидина метильной группой (т.е. 5-метилурацил), и/или что по меньшей мере одно из адениновых нуклеиновых оснований указанного олигонуклеотида модифицировано путем замены протона в положении 2 аминогруппой (т.е. 2,6-диаминопурин), соответственно. В контексте изобретения выражение "замена протона метильной группой в положении 5 кольца пиримидина" может быть заменено выражением "замена пиримидина 5-метилпиримидином", причем пиримидин обозначает только урацил, только цитозин или оба из них. Аналогично, в контексте изобретения выражение "замена протона аминогруппой в положении 2 аденина" может быть заменено выражением "замена аденина 2,6-диаминопурином". Если указанный олигонуклеотид содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более остатков цитозина, урацила и/или аденина, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более остатков цитозина, урацила и/или аденина, соответственно, могут быть модифицированы таким путем. В предпочтительном варианте осуществления все остатки цитозина, все остатки урацила и/или все остатки аденина модифицированы таким путем или заменены 5-метилцитозином, 5-метилурацилом и/или 2,6-диаминопурином, соответственно.

Было обнаружено, что присутствие 5-метилцитозина, 5-метилурацила и/или 2,6-диаминопурина в олигонуклеотиде по изобретению имеет положительный эффект по меньшей мере на один из параметров или улучшение по меньшей мере одного из параметров указанного олигонуклеотида. В этом контексте параметры могут включать: аффинность и/или кинетику связывания, активность сайленсинга, биостабильность, (внутритканевое) распределение, клеточный захват и/или транспорт, и/или иммуногенность указанного олигонуклеотида, как объяснено ниже.

Поскольку известно, что несколько модификаций, упомянутых выше, увеличивает величину Tm и, таким образом, усиливает связывание определенного нуклеотида с его аналогом на его мРНК-мишени, эти модификации могут быть исследованы в отношении усиления связывания олигонуклеотида по изобретению как с областью первого экзона, так и с областью второго экзона, в контексте изобретения. Поскольку последовательности олигонуклеотида по изобретению могут не быть на 100% обратно комплементарными данной области первого экзона и/или второго экзона, увеличивающие Tm модификации, такие как мостиковый нуклеотид или BNA (такой как LNA) или модификация основания, выбранная из 5-метилпиримидинов и/или 2,6-диаминопурина, предпочтительно могут быть осуществлены в нуклеотидном положении, которое обратно комплементарно указанной первой и/или указанной второй области указанных экзонов.

Аффинность связывания и/или кинетика связывания или гибридизации зависят от термодинамических свойств AON. Они по меньшей мере частично определяются температурой плавления указанного олигонуклеотида (Tm; вычисляемая, например, с помощью калькулятора свойств олигонуклеотидов (http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html или http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) для одноцепочечной РНК с использованием базовой Tm и модели ближайшего соседа) и/или свободной энергией комплекса олигонуклеотида и экзона-мишени (с использованием RNA structure версии 4.5 или РНК mfold версии 3.5). Если Tm увеличивается, активность пропускания экзона, как правило, возрастает, однако ожидается, что, когда Tm является слишком высокой, AON станет менее специфичным к последовательности. Приемлемая Tm и свободная энергия зависят от последовательности олигонуклеотида. Таким образом, трудно привести предпочтительные диапазоны для каждого из этих параметров.

Активность олигонуклеотида по изобретению предпочтительно определяют следующим образом:

- смягчение одного или нескольких симптома(ов) заболевания, ассоциированного с мутацией, присутствующей в первом и/или во втором экзоне, и/или с мутацией, присутствующей в участке, начинающемся в указанном первом экзоне и оканчивающемся в указанном втором экзоне, предпочтительно смягчение одного или нескольких симптома(ов) DMD или BMD; и/или

- смягчение одной или нескольких характеристик клетки от пациента, предпочтительно мышечной клетки от пациента; и/или

- обеспечение у указанного индивидуума функционального или полуфункционального белка, предпочтительно функционального или полуфункционального белка дистрофина; и/или

- по меньшей мере частичное снижение продукции аберрантного белка у указанного индивидуума, предпочтительно по меньшей мере частичное снижение продукции аберрантного белка дистрофина у указанного индивидуума. Каждый из этих признаков и анализов для их оценки определен в настоящем описании ниже.

Ожидается, что предпочтительный олигонуклеотид по изобретению, содержащий 5-метилцитозин и/или 5-метилурацил и/или 2,6-диаминопуриновое основание, будет проявлять увеличенную активность по сравнению с соответствующей активностью олигонуклеотида без какого-либо 5-метилцитозина, без какого-либо 5-метилурацила и без какого-либо 2,6-диаминопуринового основания. Это различие в активности может составлять по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%. Биораспределение и биостабильность предпочтительно по меньшей мере частично определяются валидированным анализом лигирования при гибридизации, взятого из Yu et al., 2002. В одном варианте осуществления образцы плазмы или образцы гомогенизированной ткани инкубируют с конкретным улавливающим олигонуклеотидным зондом. После разделения, DIG-меченный олигонуклеотид лигируют с комплексом и проводят детекцию с использованием связанной с антителом против DIG пероксидазой. Некомпартментный анализ фармакокинетики проводят с использованием пакета программ WINNONLIN (модель 200, версия 5.2, Pharsight, Mountainview, CA). Проводят мониторинг уровней AON (мкг) на мл плазмы или мг ткани с течением времени для оценки площади под кривой (AUC), максимальной концентрации (Cmax), времени до достижения максимальной концентрации (Tmax), терминального времени полужизни и латентного периода всасывания (tlag). Такой предпочтительный анализ описан в экспериментальной части.

Олигонуклеотид может стимулировать врожденный иммунный ответ путем активации Toll-подобных рецепторов (TLR), включая TLR9 и TLR7 (Krieg A.M., et al., 1995). Активация TLR9, как правило, происходит вследствие присутствия неметилированных последовательностей CG, присутствующих в олигодезоксинуклеотидах (ODN), посредством имитации бактериальной ДНК, которая активирует врожденную иммунную систему посредством опосредуемого TLR9 высвобождения цитокинов. Однако 2'-O-метил-модификация может значительно снижать такой возможный эффект. Описано, что TLR7 распознает урациловые повторы в РНК (Diebold S.S., et al., 2006).

Активация TLR9 и TLR7 приводит к набору скоординированных иммунных ответов, которые включают врожденный иммунитет (макрофаги, дендритные клетки (DC) и NK-клетки) (Krieg A.M., et al., 1995; Krieg A.M., et al. 2000). В этот процесс вовлечено несколько хемокинов и цитокинов, таких как IP-10, TNFα, IL-6, MCP-1 и IFNα (Wagner H., et al., 1999; Popovic P.J., et al., 2006). Воспалительные цитокины привлекают дополнительные защитные клетки из крови, такие как T- и B-клетки. Уровни этих цитокинов можно исследовать с помощью исследования in vitro. В кратком изложении, цельную кровь человека инкубируют с возрастающими концентрациями олигонуклеотидов, после чего уровни цитокинов определяют с помощью стандартных коммерчески доступных наборов для ELISA. Снижение иммуногенности предпочтительно соответствует поддающемуся обнаружению снижению концентрации по меньшей мере одного из цитокинов, упомянутых выше, при сравнении с концентрацией соответствующего цитокина в анализе в клетке, обработанной олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере один 5-метилцитозин и/или 5-метилурацил и/или 2,6-диаминопурин, по сравнению с клеткой, обработанной соответствующим олигонуклеотидом, не имеющим 5-метилцитозинов, 5-метилурацилов или 2,6-диаминопуринов.

Таким образом, предпочтительный олигонуклеотид по изобретению имеет улучшенный параметр, такой как приемлемая или сниженная иммуногенность и/или лучшее биораспределение и/или приемлемая или улучшенная кинетика связывания РНК и/или термодинамические свойства по сравнению с соответствующим олигонуклеотидом без 5-метилцитозина, без 5-метилурацила и без 2,6-диаминопурина. Каждый из этих параметров можно оценивать с использованием анализов, известных специалисту в данной области.

Предпочтительный олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из молекулы РНК или модифицированной молекулы РНК. В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид является одноцепочечным. Однако квалифицированному специалисту будет понятно, что одноцепочечный олигонуклеотид может образовывать внутреннюю двухцепочечную структуру. Однако этот олигонуклеотид, тем не менее, называют одноцепочечным олигонуклеотидом в контексте настоящего изобретения. Одноцепочечный олигонуклеотид имеет несколько преимуществ по сравнению с двухцепочечным олигонуклеотидом миРНК: (i) ожидается, что его синтез будет более простым, чем синтез двух комплементарных цепей миРНК; (ii) существует более широкий диапазон химических модификаций, возможных для повышения захвата в клетки, более высокой (физиологической) стабильности и снижения потенциальных общих неблагоприятных эффектов; (iii) миРНК имеют более высокий потенциал для неспецифических эффектов (включая гены вне мишени) и улучшенную фармакологию (например, возможен меньший контроль эффективности и селективности схемы лечения или дозы); и (iv) миРНК с меньшей вероятностью будут действовать в ядре и не могут быть направлены против интронов.

В другом варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит абазический участок или абазический мономер. В контексте изобретения такой мономер может называться абазическим участком или абазическим мономером. Абазический мономер представляет собой нуклеотидный остаток или структурный элемент, который лишен нуклеинового основания, по сравнению с соответствующим нуклеотидным остатком, содержащим нуклеиновое основание. В рамках изобретения абазический мономер, таким образом, представляет собой часть структурного элемента олигонуклеотида, но лишенную нуклеинового основания. Такой абазический мономер может присутствовать, или может быть связан, или может быть присоединен, или может быть конъюгирован со свободным концом олигонуклеотида.

В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит 1-10 или более абазических мономеров. Таким образом, в олигонуклеотиде по изобретению может находиться 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более абазических мономеров.

Абазический мономер может представлять собой любой тип, известный и понятный квалифицированному специалисту, неограничивающие примеры которых представлены ниже:

В рамках настоящего изобретения, R₁ и R₂ независимо представляют собой H, олигонуклеотид или другой абазический участок(ки) при условии, что не оба из R₁ и R₂ представляют собой H и R₁ и R₂ не оба являются олигонуклеотидами. Абазический мономер(ы) может быть связан с любым или с обоими концами олигонуклеотида, как указано выше. Следует отметить, что олигонуклеотид, связанный с одним или двумя абазическим участком(ами) или абазическим мономером(ами), может содержать менее 10 нуклеотидов. В этом отношении олигонуклеотид по изобретению может содержать по меньшей мере 10 нуклеотидов, необязательно включающих один или несколько абазических участков или абазических мономеров на одном или обоих концах. Другие примеры абазических участков, которые охватываются изобретением, описаны в патентной заявке США 2013/013378 (Alnylam Pharmaceuticals), включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

В зависимости от длины олигонуклеотид по изобретению может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 модификаций оснований. Также изобретение охватывает внесение более одной определенной модификации оснований в указанный олигонуклеотид.

Таким образом, в одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит:

(a) по меньшей мере одну модификацию основания, выбранную из 2-тиоурацила, 2-тиотимина, 5-метилцитозина, 5-метилурацила, тимина, 2,6-диаминопурина; и/или

(b) по меньшей мере одну модификацию сахара, выбранную из 2'-O-метила, 2'-O-(2-метокси)этила, 2'-O-дезокси (ДНК), 2'-F, морфолино, мостикового нуклеотида или BNA, или олигонуклеотид содержит как мостиковые нуклеотиды, так и 2'-дезокси-модифицированные нуклеотиды (смешанные BNA/ДНК-меры); и/или

(c) по меньшей мере одну модификацию основной цепи, выбранную из фосфоротиоата или фосфородиамидата.

В другом варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит:

(a) по меньшей мере одну модификацию оснований, выбранную из 5-метилпиримидина и 2,6-диаминопурина; и/или

(b) по меньшей мере одну модификацию сахара, которая представляет собой 2'-O-метил; и/или

(c) по меньшей мере одну модификацию основной цепи, которая представляет собой фосфоротиоат.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию по сравнению со встречающимся в природе олигонуклеотидом на основе рибонуклеотида или дезоксирибонуклеотида, более предпочтительно

(a) по меньшей мере одну модификацию основания, предпочтительно выбранную из 2-тиоурацила, 2-тиотимина, 5-метилцитозина, 5-метилурацила, тимина, 2,6-диаминопурина, более предпочтительно, выбранную из 5-метилпиримидина и 2,6-диаминопурина; и/или

(b) по меньшей мере одну модификацию сахара, предпочтительно выбранную из 2'-O-метила, 2'-O-(2-метокси)этила, 2'-O-дезокси (ДНК), 2'-F, морфолино, мостикового нуклеотида или BNA, или олигонуклеотид содержит как мостиковые нуклеотиды, так и 2'-дезокси-модифицированные нуклеотиды (смешанные BNA/ДНК-меры), более предпочтительно модификация сахара представляет собой 2'-O-метил; и/или

(c) по меньшей мере одну модификацию основной цепи, предпочтительно выбранную из фосфоротиоата или фосфородиамидата, более предпочтительно модификация основной цепи представляет собой фосфоротиоат.

Таким образом, олигонуклеотид согласно этому варианту осуществления изобретения содержит модификацию основания (a) и отсутствие модификации сахара (b) и отсутствие модификации основной цепи (c). Другой предпочтительный олигонуклеотид согласно этому аспекту изобретения включает модификацию сахара (b) и отсутствие модификации основания (a) и отсутствие модификации основной цепи (c). Другой предпочтительный олигонуклеотид согласно этому аспекту изобретения содержит модификацию основной цепи (c) и отсутствие модификации основания (a) и отсутствие модификации сахара (b). Также предполагается, что настоящее изобретение охватывает олигонуклеотиды, не имеющие ни одной из упомянутых выше модификаций, а также олигонуклеотиды, содержащие две, т.е. (a) и (b), (a) и (c) и/или (b) и (c), или все три из модификаций (a), (b) и (c), как определено выше.

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению модифицирован по всей его длине одной или несколькими одинаковыми модификациями, выбранными из (a) одной из модификаций оснований; и/или (b) одной из модификаций сахара; и/или (c) одной из модификаций основной цепи.

С появлением технологии имитации нуклеиновых кислот стало возможным получать молекулы, которые обладают сходными, предпочтительно одинаковыми по типу характеристиками гибридизации, но не обязательно сходными количественными характеристиками, с самой нуклеиновой кислотой. Такие функциональные эквиваленты, безусловно, также являются пригодными для применения в рамках изобретения.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид содержит инозин, гипоксантин, универсальное основание, вырожденное основание и/или нуклеозид или нуклеотид, содержащие основание, способное образовывать качающуюся пару оснований или ее функциональный эквивалент. Применение инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, является высоко перспективным, как пояснено ниже. Инозин, например, является известным модифицированным основанием, которое может образовывать пару с тремя основаниями: урацил, аденин и цитозин. Инозин представляет собой нуклеозид, который образуется, когда гипоксантин связан с кольцом рибозы (также известным как рибофураноза) через β [бета]-N9-гликозидную связь. Инозин (I) обычно встречается в тРНК, и он необходим для надлежащей трансляции генетического кода в качающихся парах оснований. Качающаяся пара оснований может существовать между G и U, или между I с одной стороны и U, A или C с другой стороны. Это является фундаментальным при образовании вторичной структуры РНК. Ее термодинамическая стабильность сравнима с термодинамической стабильностью пары оснований Уотсона-Крика. Генетический код исправляет несоответствия в количестве аминокислот (20) для триплетных кодонов (64), с использованием модифицированных пар оснований в первом основании антикодона.

Первое преимущество использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, позволяет конструировать олигонуклеотид, который способен связываться с областью первого экзона из пре-мРНК и способен связываться с областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область из указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Иными словами, присутствие инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, позволяет связывание указанного олигонуклеотида с областью первого экзона и с областью второго экзона указанной пре-мРНК.

Второе преимущество использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, позволяет конструировать олигонуклеотид, который охватывает однонуклеотидный полиморфизм (SNP), без опасения, что полиморфизм нарушит эффективность отжига олигонуклеотида. Таким образом, в рамках изобретения использование такого основания позволяет конструирование олигонуклеотида, который можно использовать для индивидуума, имеющего SNP в участке пре-мРНК, на который нацелен олигонуклеотид по изобретению.

Третье преимущество использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, представляет собой случай, когда указанный олигонуклеотид в норме содержит CpG, если он сконструирован как являющийся комплементарным части первого экзона пре-мРНК, как определено в настоящем описании. Присутствие CpG в олигонуклеотиде обычно ассоциировано с увеличенной иммуногенностью указанного олигонуклеотида (Dorn A. and Kippenberger S.). Эта увеличенная иммуногенность является нежелательной, поскольку она может индуцировать разрушение мышечных волокон. Ожидается, что замена гуанина инозином в одном, двух или более CpG в указанном олигонуклеотиде обеспечит олигонуклеотид со сниженным и/или приемлемым уровнем иммуногенности. Иммуногенность можно оценивать в модели на животных путем оценки присутствия клеток CD4⁺ и/или CD8⁺ и/или инфильтрации воспалительных мононуклеоцитов в биоптате мышц указанного животного. Иммуногенность также можно оценивать в крови животного или человека, подвергаемого лечению олигонуклеотидом по изобретению, путем обнаружения присутствия нейтрализующего антитела и/или антитела, распознающего указанный олигонуклеотид, с использованием стандартного иммуноанализа, известного квалифицированному специалисту. Увеличение иммуногенности предпочтительно соответствует поддающемуся обнаружению увеличению по меньшей мере одного из этих типов клеток по сравнению с количеством каждого типа клеток в соответствующем биоптате мышц животного до обработки или лечения соответствующим олигонуклеотидом, имеющим по меньшей мере один инозин (гипоксантин) и/или универсальное основание и/или вырожденное основание и/или нуклеотид, содержащий основание, способное образовывать качающуюся пару оснований. Альтернативно, увеличение иммуногенности можно оценивать путем обнаружения присутствия или увеличения количества нейтрализующего антитела или антитела, распознающего указанный олигонуклеотид, с использованием стандартного иммуноанализа. Снижение иммуногенности предпочтительно соответствует поддающемуся обнаружению снижению по меньшей мере одного из этих типов клеток по сравнению с количеством соответствующего типа клеток в соответствующем биоптате мышц животного до лечения или после лечения соответствующим олигонуклеотидом, не имеющим инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований. Альтернативно, снижение иммуногенности можно оценивать по отсутствию или снижению количества указанного соединения и/или нейтрализующих антител с использованием стандартного иммуноанализа.

Четвертым преимуществом использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, является избегание или снижение потенциальной мультимеризации или агрегации олигонуклеотидов. Например, известно, что олигонуклеотид, содержащий мотив G-квартет, имеет тенденцию к образованию квадруплекса, мультимера или агрегата, образованного хугстиновским спариванием оснований четырех одноцепочечных олигонуклеотидов (Cheng A.J. и Van Dyke M.W.), что, безусловно, нежелательно: ожидается, что в результате этого эффективность олигонуклеотида снизится. Мультимеризацию или агрегацию предпочтительно оценивают стандартными способами полиакриламидного неденатурирующего гель-электрофореза, известными квалифицированному специалисту. В предпочтительном варианте осуществления менее 20% или 15%, 10%, 7%, 5% или менее от общего количества олигонуклеотида по изобретению обладает способностью к мультимеризации или агрегации, оцениваемой с использованием анализа, упомянутого выше.

Пятым преимуществом использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, таким образом, также является избегание квадруплексных структур, которая ассоциирована с антитромботической активностью (Macaya R.F., et al.), а также со связыванием с и ингибированием фагоцитарного рецептора макрофагов (Suzuki K., et al.).

Шестым преимуществом использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, является возможность конструирования олигонуклеотида с улучшенной кинетикой связывания РНК и/или термодинамическими свойствами. Кинетика связывания РНК и/или термодинамические свойства по меньшей мере частично определяются температурой плавления олигонуклеотида (Tm; вычисляемая с помощью калькулятора свойств олигонуклеотидов (http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html) для одноцепочечной РНК с использованием базовой Tm и модели ближайшего соседа) и/или свободной энергией комплекса AON и экзона-мишени (с использованием RNA structure версии 4.5). Если Tm является чрезмерно высокой, ожидается, что олигонуклеотид будет менее специфичным. Приемлемая Tm и свободная энергия зависят от последовательности олигонуклеотида. Таким образом, трудно привести предпочтительные диапазоны для каждого из этих параметров. Приемлемая Tm может находиться в диапазоне от 35 до 85°C, и приемлемая свободная энергия может находиться в диапазоне от 15 до 45 ккал/моль.

В зависимости от длины, олигонуклеотид по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 остатков инозина (гипоксантина) и/или универсальных оснований и/или вырожденных оснований и/или нуклеотидов, содержащих основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, или их функциональные эквиваленты.

Предпочтительно, указанный олигонуклеотид по изобретению содержит РНК, поскольку дуплексы РНК/РНК являются высокостабильными. Является предпочтительным, чтобы РНК-олигонуклеотид содержал модификацию, обеспечивающую РНК с дополнительным свойством, например, устойчивостью к эндонуклеазам, экзонуклеазам и РНК-азе H, дополнительной прочностью гибридизации, увеличенной стабильностью (например, в жидкостях организма), увеличенной или сниженной пластичностью, сниженной токсичностью, увеличенным внутриклеточным транспортом, тканевой специфичностью и т.д. Предпочтительные модификации описаны выше.

Таким образом, один вариант осуществления относится к олигонуклеотиду, который содержит по меньшей мере одну модификацию. Предпочтительный модифицированный олигонуклеотид является полностью 2'-O-метил-модифицированным. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит или состоит из гибридного олигонуклеотида, содержащего модификацию 2'-O-метил-фосфоротиоатным олигорибонуклеотидом и модификацию мостиковой нуклеиновой кислотой (BNA, как проиллюстрировано выше). В другом варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит или состоит из гибридного олигонуклеотида, содержащего модификацию 2'-O-метоксиэтилфосфоротиоатом и мостиковую нуклеиновую кислоту (BNA, как проиллюстрировано выше). В другом варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит или состоит из гибридного олигонуклеотида, содержащего модификацию мостиковой нуклеиновой кислотой (BNA, как проиллюстрировано выше) и модификацию олигодезоксирибонуклеотидом. Эта конкретная комбинация обладает лучшей специфичностью последовательности по сравнению с эквивалентом, состоящим только из мостиковой нуклеиновой кислоты, и обладает увеличенной эффективностью по сравнению с олигонуклеотидом, состоящим из модификации 2'-O-метилфосфоротиоатным олиго(дезокси)рибонуклеотидом.

Соединение, как описано в рамках изобретения, предпочтительно может обладать ионогенными группами. Ионогенные группы могут представлять собой основания или кислоты, и они могут быть заряженными или нейтральными. Ионогенные группы могут присутствовать в качестве пары ионов с соответствующим противоионом, который имеет противоположный заряд(ы). Примерами катионных противоионов являются натрий, калий, цезий, Tris, литий, кальций, магний, триалкиламмоний, триэтиламмоний и тетраалкиламмоний. Примерами анионных противоионов являются хлорид, бромид, йодид, лактат, мезилат, ацетат, трифторацетат, дихлорацетат и цитрат. Примеры противоионов описаны [например, Kumar L, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме]. Примеры применения двух- или трехвалентных противоионов, особенно Ca²⁺, описаны в качестве дополнительных положительных характеристик к определенным олигонуклеотидам в патентной заявке США 2012046348 (Replicor), которая включена в качестве ссылки в полном объеме. Предпочтительные двухвалентные или трехвалентные противоионы выбирают из следующего перечня или группы: кальций, магний, кобальт, железо, марганец, барий, никель, медь и цинк. Предпочтительным двухвалентным противоионом является кальций. Таким образом, настоящее изобретение охватывает приготовление, получение и применение композиции, содержащей олигонуклеотид по изобретению и любой другой противоион, определенный выше, предпочтительно кальций.

Такой способ получения указанной композиции, содержащей указанный олигонуклеотид и указанный противоион, предпочтительно кальций, может быть следующим: олигонуклеотид по изобретению можно растворять в фармацевтически приемлемом водном эксципиенте, и постепенно к растворенному олигонуклеотиду можно добавлять раствор, содержащий указанный противоион, чтобы хелатный комплекс олигонуклеотида оставался растворимым.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению приводят в контакт с композицией, содержащей такой противоион, предпочтительно Ca²⁺, для формирования хелатного комплекса олигонуклеотида, содержащего два или более идентичных олигонуклеотидов, связанных таким противоионом, как определено в настоящем описании. Композиция, содержащая хелатный комплекс олигонуклеотида, содержащий два или более идентичных олигонуклеотида, связанных противоионом, предпочтительно кальцием, таким образом, охватывается настоящим изобретением.

Способ конструирования олигонуклеотида

Таким образом, в следующем аспекте изобретения предусматривается способ конструирования олигонуклеотида, где указанный способ приводит к олигонуклеотиду, как определено выше.

Этот способ включает следующие стадии:

(a) идентификация комбинации в рамке считывания первого и второго экзона в одной и той же пре-мРНК, где область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с областью указанного первого экзона;

(b) конструирование олигонуклеотида, который способен связываться с указанной областью указанного первого экзона и указанной областью указанного второго экзона; и

(c) где указанное связывание приводит к пропусканию указанного первого экзона и указанного второго экзона, предпочтительно к пропусканию мультиэкзонного участка, начинающегося указанным первым экзоном и охватывающего один или несколько экзонов, присутствующих между указанным первым и указанным вторым экзонами, и, в лучшем случае, к пропусканию всего участка экзонов между указанным первым и указанным вторым экзонами.

На стадии b) такого способа указанный олигонуклеотид предпочтительно конструируют так, чтобы его связывание препятствовало по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в указанных областях указанного первого и/или второго экзонов в указанной пре-мРНК.

Альтернативно или в комбинации с препятствованием регулирующей сплайсинг последовательности, связывание указанного олигонуклеотида предпочтительно препятствует вторичной структуре, охватывающей по меньшей мере указанный первый и/или указанный второй экзоны в указанной пре-мРНК.

Олигонуклеотид, получаемый этим способом, способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзонов в указанной пре-мРНК. Предпочтительно индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно располагается между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный мРНК-транскрипт находится в рамке считывания. Олигонуклеотид предпочтительно способен индуцировать пропускание всего участка экзонов между указанным первым экзоном и указанным вторым экзоном. В одном варианте осуществления указанные области указанного первого экзона и указанного второго экзона содержат регулирующий сплайсинг элемент, так что связывание указанного олигонуклеотида способно препятствовать по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в указанных областях указанных первого и второго экзонов. Также предусматривается, что связывание указанного олигонуклеотида препятствует вторичной структуре, охватывающей по меньшей мере указанный первый и/или указанный второй экзоны в указанной пре-мРНК. Предпочтительная регулирующая сплайсинг последовательность содержит участок связывания серин-аргининового (SR) белка, энхансер сплайсинга экзонов (ESE), последовательность распознавания экзонов (ERS) и/или сайленсер сплайсинга экзонов (ESS).

Каждый признак этого способа уже определен в настоящем описании или известен квалифицированному специалисту.

Предпочтительные олигонуклеотиды

Предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению предназначен для применения в качестве лекарственного средства, более предпочтительно, указанное соединение предназначено для применения в модулирующих РНК терапевтических средствах. Более предпочтительно, указанное модулирование РНК приводит к коррекции нарушенной транскрипционной рамки считывания и/или к восстановлению экспрессии желаемого или ожидаемого белка. Таким образом, способ по изобретению и олигонуклеотид по изобретению можно в принципе применять к любому заболеванию, связанному с присутствием нарушающей рамку считывания мутации, что приводит к аберрантному транскрипту и/или к отсутствию кодируемого белка и/или к присутствию аберрантного белка. В предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению и олигонуклеотид по изобретению применяют к ассоциированным с заболеванием генам, содержащим повторяющиеся последовательности и, таким образом, области с относительно высокой идентичностью последовательности (т.е. по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80% идентичностью последовательности между областью второго экзона и областью первого экзона, как определено в настоящем описании). Неограничивающими примерами являются гены со спектрин-подобными повторами (поскольку ген DMD вовлечен в мышечную дистрофию Дюшенна, как описано в настоящем описании), Kelch-подобными повторами (как например, ген KLHL3, вовлеченный в семейную гиперкалиемическую гипертензию (Louis-Dit-Picard H et al.), ген KLHL6, вовлеченный в хронический лимфоцитарный лейкоз (Puente XS et al.), ген KLHL7, вовлеченный в пигментный ретинит (Friedman JS et al.), гены KLHL7/12, вовлеченные в синдром Шегрена (Uchida K et al.), ген KLHL9, вовлеченный в дистальную миопатию (Cirak S et al.), ген KLHL16 или GAN, вовлеченный в гигантскую аксональную невропатию (Bomont P et al.) , гены KLHL19 или KEAP1, вовлеченные в несколько злокачественных опухолей (Dhanoa BS et al.), ген KLHL20, вовлеченный в промиелоцитарный лейкоз (Dhanoa BS et al.) , или гены KLHL37 или ENC1, вовлеченные в опухоли головного мозга (Dhanoa BS et al.), FGF-подобными повторами, EGF-подобными повторами (как, например, ген NOTCH3, вовлеченный в CADASIL (Chabriat H et al.), гены SCUBE, вовлеченные в злокачественную опухоль или метаболическое заболевание костей, ген нейрексина-1 (NRXN1), вовлеченный в нейропсихиатрические нарушения и идиопатическую генерализованную эпилепсию (Moller RS et al.), ген Del-1, ген тенасцин-C (TNC), вовлеченный в атеросклероз и болезнь коронарных артерий (Mollie A et al.), ген THBS3 или ген фибриллина (FBN1), вовлеченный в синдром Марфана (Rantamaki T et al.), анкирин-подобными повторами (как, например, ген ANKRD1, вовлеченный в кардиомиопатию с дилятацией (Dubosq-Bidot L et al.), ген ANKRD2, ген ANKRD11, вовлеченные в синдром KBG (Sirmaci A et al.), ген ANKRD26, вовлеченный в тромбоцитопению (Noris P et al.) или диабет (Raciti GA et al.), ген ANKRD55, вовлеченный в рассеянный склероз (Alloza I et al.), или ген TRPV4, вовлеченный в дистальную спинальную мышечную атрофию (Fiorillo C et al.), HEAT-подобными повторами (как, например, ген, вовлеченный в болезнь Хантингтона), аннексин-подобными повторами, лейцин-богатыми повторами (как, например, гены NLRP2 и NLRP7, вовлеченные в идиопатическое привычное невынашивание беременности (Huang JY et al.)), ген LRRK2, вовлеченный в болезнь Паркинсона (Abeliovich A et al.), ген NLRP3, вовлеченный в болезнь Альцгеймера или менингит (Heneka MT et al.), ген NALP3, вовлеченный в почечную недостаточность (Knauf F et al.), или ген LRIG2, вовлеченный в урофациальный синдром (Stuart HM et al.), или доменами ингибитора сериновой протеазы (как, например, ген SPINK5, вовлеченный в синдром Незертона (Hovnanian A et al.), как описано в Andrade M.A. et al.

В контексте изобретения предпочтительной пре-мРНК или транскриптом является пре-мРНК или транскрипт дистрофина. Эта предпочтительная пре-мРНК или транскрипт предпочтительно являются человеческими. Заболевание, связанное с присутствием мутации, присутствующей в пре-мРНК дистрофина, представляет собой DMD или BMD, в зависимости от мутации. Предпочтительные комбинации и области первого и второго экзонов из пре-мРНК дистрофина, подлежащие применению в контексте изобретения, представлены в таблице 2.

В предпочтительном варианте осуществления соединение по изобретению используют для индукции пропускания экзона в клетке, в органе, в ткани и/или у пациента, предпочтительно у пациента с BMD или DMD или в клетке, органе, ткани, происходящих из указанного пациента. Пропускание экзона приводит к зрелой мРНК, которая не содержит пропущенного экзона, и, таким образом, когда указанный экзон кодирует аминокислоты, оно может приводить к экспрессии измененного, внутренне укороченного, но от частично до в большой степени функционального продукта дистрофина. Технология пропускания экзонов в настоящее время направлена на применение AON или транскрибирующих AON генных конструкций. Способы пропускания экзонов в настоящее время используют для борьбы с генетическими мышечными дистрофиями. Недавно авторами настоящего изобретения и другими исследователями были сообщены перспективные результаты в отношении терапии на основе индуцируемого AON пропускания экзонов, нацеленной на восстановление рамки считывания пре-мРНК дистрофина из мыши mdx и от пациентов с DMD (Heemskerk H., et al., Cirak S., et al., Goemans et al.). Путем направленного пропускания конкретного экзона тяжелый фенотип DMD (отсутствие функционального дистрофина) преобразуется в более мягкий фенотип BMD (экспрессия функционального или полуфункционального дистрофина). Пропускание экзона предпочтительно индуцируется связыванием AON, нацеленных на внутреннюю последовательность экзона.

Ниже изобретение иллюстрируется при помощи мутантной пре-мРНК дистрофина, где присутствуют первый и второй экзоны. Как определено в настоящем описании, пре-мРНК дистрофина предпочтительно означает пре-мРНК гена DMD, кодирующего белок дистрофина. Мутантная пре-мРНК дистрофина соответствует пре-мРНК пациента с BMD или DMD с мутацией по сравнению с пре-мРНК DMD дикого типа у здорового индивидуума, что приводит к (сниженным уровням) аберрантному белку (BMD), или к отсутствию функционального дистрофина (DMD). Пре-мРНК дистрофина также называют пре-мРНК DMD. Ген дистрофина также может быть называться геном DMD. Дистрофин и DMD могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо.

Пациент предпочтительно означает пациента, имеющего DMD или BMD, как определено в настоящем описании ниже, или пациента, предрасположенного к развитию DMD или BMD вследствие его (или ее) генетического фона. В случае пациента с DMD, используемое соединение предпочтительно корректирует мутацию, присутствующую в гене DMD указанного пациента и, таким образом, предпочтительно образует белок дистрофина, сходный с белком дистрофина пациента с BMD: указанный белок предпочтительно представляет собой функциональный или полуфункциональный дистрофин, как определено в настоящем описании ниже. В случае пациента с BMD, антисмысловой олигонуклеотид по изобретению предпочтительно модифицирует мутацию, присутствующую в гене BMD указанного пациента и предпочтительно образует дистрофин, который является более функциональным, чем дистрофин, который исходно присутствует у указанного пациента с BMD.

Как определено в настоящем описании, функциональный дистрофин предпочтительно представляет собой дистрофин дикого типа, соответствующий белку, имеющему аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO: 1. Функциональный дистрофин предпочтительно представляет собой дистрофин, который имеет действующий связывающий домен в его N-концевой части (первые 240 аминокислот на N-конце), цистеин-богатый домен (аминокислоты с 3361 по 3685) и C-концевой домен (последние 325 аминокислот на C-конца), причем каждый из этих доменов присутствует в дистрофине дикого типа, как известно квалифицированному специалисту. Аминокислоты, указанные в настоящем описании, соответствуют аминокислотам дистрофина дикого типа, указанным в SEQ ID NO: 1. Иными словами, функциональный или полуфункциональный дистрофин представляет собой дистрофин, который проявляет по меньшей мере в некоторой степени активность дистрофина дикого типа. "По меньшей мере в некоторой степени" предпочтительно означает по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% соответствующей активности функционального дистрофина дикого типа. В этом контексте активность функционального дистрофина предпочтительно представляет собой связывание с актином и взаимодействие с ассоциированным с дистрофином гликопротеиновым комплексом (DGC) или (DAGC) (Ehmsen J et al.). Связывание дистрофина с актином и с комплексом DGC можно визуализировать либо посредством ко-иммунопреципитации с использованием экстрактов тотального белка, либо посредством иммунофлуоресцентного анализа поперечных срезов из биоптата мышцы, предположительно являющейся дистрофичной, как известно квалифицированному специалисту.

Индивидуумы, страдающие DMD, как правило, имеют мутацию в гене, кодирующем дистрофин, которая препятствует синтезу полного белка, например, преждевременный стоп-кодон препятствует синтезу C-конца. При BMD ген дистрофина также содержит мутацию, однако эта мутация не нарушает открытую рамку считывания и синтезируется C-конец. В результате образуется (полу)функциональный или функциональный белок дистрофин, который обладает сходным типом активности с белком дикого типа, хотя и не обязательно сходным уровнем активности. Геном индивидуума с BMD, как правило, кодирует белок дистрофин, содержащий N-концевую часть (первые 240 аминокислот на N-конце), цистеин-богатый домен (аминокислоты с 3361 по 3685) и C-концевой домен (последние 325 аминокислот на C-конце), однако в большинстве случаев его центральный домен в форме стержня может быть короче, чем у дистрофина дикого типа (Monaco A.P., et al.).

Пропускание экзонов для лечения DMD, как правило, относится к обходу преждевременного стоп-кодона в пре-мРНК путем пропускания экзона, фланкирующего или содержащего мутацию. Это позволяет коррекцию открытой рамки считывания и синтез внутренне укороченного белка дистрофина, но включающего C-конец. В предпочтительном варианте осуществления у индивидуума, имеющего DMD и подвергаемого лечению олигонуклеотидом по изобретению, синтезируется дистрофин, который проявляет, по меньшей мере в некоторой степени, сходную активность с дистрофином дикого типа. Более предпочтительно, если указанный индивидуум является пациентом с DMD или предположительно является пациентом с DMD, (полу)функциональный дистрофин представляет собой дистрофин индивидуума, имеющего BMD: как правило, указанный дистрофин способен взаимодействовать как с актином, так и с DGC или DAGC (Ehmsen J., et al., Monaco A.P., et al.).

Центральный стержневой домен дистрофина дикого типа содержит 24 спектрин-подобных повтора (Ehmsen J., et al.). Во многих случаях центральный стержневой домен в BMD-подобных белках является более коротким, чем в дистрофине дикого типа (Monaco A.P., et al.). Например, центральный стержневой домен дистрофина, как предусматривается в настоящем описании, может содержать от 5 до 23, от 10 до 22 или от 12 до 18 спектрин-подобных повторов при условии, что он может связываться с актином и с DGC.

Смягчение одного или нескольких симптомов DMD или BMD у индивидуума с использованием соединения по изобретению можно оценивать с помощью любого из следующих анализов: продление времени до прекращения хождения, увеличение мышечной силы, повышение способности поднимать тяжести, улучшение времени вставания с пола, улучшение времени ходьбы на девять метров, улучшение времени подъема на четыре ступеньки, улучшение степени функции ног, улучшение легочной функции, улучшение сердечной функции, улучшение качества жизни. Каждый из этих анализов известен квалифицированному специалисту. В качестве примера, в публикации Manzur et al. (Manzur A.Y. et al.) приводится обширное пояснение каждого из этих анализов. Для каждого из этих анализов, когда выявляют поддающееся обнаружению улучшение или продление параметра, измеряемого в анализе, это предпочтительно означает, что один или несколько симптомов DMD или BMD смягчились у индивидуума с использованием соединения по изобретению. Поддающееся обнаружению улучшение или продление предпочтительно представляет собой статистически значимое улучшение или продление, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.). Альтернативно, смягчение одного или нескольких симптомов DMD или BMD можно оценивать посредством измерения улучшения функции, целостности и/или выживаемости мышечных волокон. В предпочтительном способе один или несколько симптомов пациента с DMD или BMD смягчается и/или одна или несколько характеристик одной или нескольких мышечных клеток от пациента с DMD или BMD улучшается. Такие симптомы или характеристики можно оценивать на клеточном, тканевом уровне или у самого пациента.

Смягчение одной или нескольких характеристик мышечной клетки от пациента с DMD или BMD можно оценивать с помощью любого из следующих анализов на миогенной клетке или мышечной клетке от этого пациента: сниженный захват кальция мышечными клетками, сниженный синтез коллагена, измененная морфология, измененный биосинтез липидов, сниженный окислительный стресс и/или улучшенная функция, целостность и/или выживаемость мышечных волокон. Эти параметры обычно оценивают с использованием иммунофлуоресцентных и/или гистохимических анализов поперечных срезов биоптатов мышц.

Улучшение функции, целостности и/или выживаемости мышечных волокон можно оценивать с использованием по меньшей мере одного из следующих анализов: поддающееся обнаружению снижение уровня креатинкиназы в крови, поддающееся обнаружению снижение некроза мышечных волокон в поперечном срезе биоптата мышцы, предположительно являющейся дистрофической, и/или поддающееся обнаружению повышение гомогенности диаметра мышечных волокон в поперечном срезе биоптата мышцы, предположительно являющейся дистрофической. Каждый из этих анализов известен квалифицированному специалисту.

Креатинкиназу можно выявлять в крови, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.). Поддающееся обнаружению снижение креатинкиназы может означать снижение на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с концентрацией креатинкиназы у того же пациента с DMD или BMD до лечения.

Поддающееся обнаружению снижение некроза мышечных волокон предпочтительно оценивают в биоптате мышц, более предпочтительно, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.), с использованием поперечных срезов биоптатов. Поддающееся обнаружению снижение некроза может представлять собой снижение, составляющее 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более от площади, где идентифицирован некроз с использованием поперечных срезов биоптатов. Снижение измеряют путем сравнения с некрозом, как оценивают у того же пациента с DMD или BMD до лечения.

Поддающееся обнаружению повышение гомогенности диаметра мышечных волокон предпочтительно оценивают в поперечном срезе биоптата, более предпочтительно, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.). Увеличение измеряют путем сравнения с гомогенностью диаметра мышечного волокна у того же пациента с DMD или BMD до лечения.

Предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению обеспечивает у указанного индивидуума (более высокие уровни) функциональный и/или (полу)функциональный белок дистрофин (как для DMD, так и для BMD) и/или способен, по меньшей мере частично, снижать продукцию аберрантного белка дистрофина у указанного индивидуума. В этом контексте, функциональный и/или полуфункциональный дистрофин может означать, что может образовываться несколько форм функционального и/или полуфункционального дистрофина. Этого можно ожидать, когда область с по меньшей мере 50% идентичностью между первым и вторым экзонами перекрывается с одной или несколькими другими областями с по меньшей мере 50% идентичностью между другими первым и вторым экзонами, и где указанный олигонуклеотид способен связываться с указанной перекрывающейся частью, так что несколько различных участков экзонов пропускается и продуцируется несколько различных транскриптов в рамке считывания. Эта ситуация иллюстрируется в примере 4, где один единственный олигонуклеотид по изобретению (PS816; SEQ ID NO: 1679) способен индуцировать продукцию нескольких транскриптов в рамке считывания, все из которых имеют общий экзон 10 в качестве первого экзона, и где второй экзон может представлять собой экзон 13, 14, 15, 18, 20, 27, 30, 31, 32, 35, 42, 44, 47, 48 или 55.

Более высокие уровни относятся к увеличению уровня функционального и/или (полу)функционального белка дистрофина по сравнению с соответствующим уровнем функционального и/или (полу)функционального белка дистрофина у пациента до начала лечения олигонуклеотидом по изобретению. Уровень указанного функционального и/или (полу)функционального белка дистрофина предпочтительно оценивают с использованием иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга (белок).

Снижение продукции аберрантной мРНК дистрофина или аберрантного белка дистрофина предпочтительно означает, что 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или менее от первоначального количества аберрантной мРНК дистрофина или аберрантного белка дистрофина все еще поддается обнаружению с помощью ОТ-ПЦР (мРНК) или иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга (белок). Аберрантную мРНК или белок дистрофина также обозначают в настоящем описании как менее функциональную (по сравнению с функциональным белком дистрофина дикого типа, как определено в настоящем описании ранее) или нефункциональную мРНК или белок дистрофина. Нефункциональный белок дистрофина предпочтительно представляет собой белок дистрофина, который не способен связывать актин и/или представителей белкового комплекса DGC. Нефункциональный белок дистрофина или мРНК дистрофина, как правило, не обладает или не кодирует белок дистрофина с интактным C-концом белка. В предпочтительном варианте осуществления используют способ пропускания экзонов (также называемый модулированием РНК или переключением сплайсинга).

Увеличение продукции функциональной и/или полуфункциональной мРНК и/или белка дистрофина предпочтительно означает, что такая функциональная и/или полуфункциональная мРНК и/или белок дистрофина поддаются обнаружению или увеличены по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с выявляемым количеством указанной мРНК и/или белка в начале лечения. Указанное выявление можно осуществлять с использованием ОТ-ПЦР (мРНК) или иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга (белок).

В другом варианте осуществления соединение по изобретению обеспечивает у указанного индивидуума функциональный или полуфункциональный белок дистрофина. Этот функциональный или полуфункциональный белок или мРНК дистрофина можно выявлять в качестве аберрантного белка или мРНК дистрофина, как пояснено в настоящем описании выше.

Посредством направленного совместного пропускания указанных двух экзонов (указанный первый и указанный второй экзоны) можно индуцировать пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный транскрипт дистрофина находится в рамке считывания (предпочтительно, как в таблице 1 или 6), фенотип DMD или тяжелой BMD преобразуется в более мягкий фенотип BMD или даже бессимптомный фенотип. Совместное пропускание указанных двух экзонов предпочтительно индуцируется связыванием олигонуклеотида с областью первого экзона в пре-мРНК дистрофина и связыванием олигонуклеотида с областью второго экзона в пре-мРНК дистрофина, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Предпочтительно, указанный первый и указанный второй экзоны дистрофина и области идентичности в них представлены в таблице 2 или 6. Указанный олигонуклеотид предпочтительно не обладает перекрыванием с последовательностями не экзонов. Указанный олигонуклеотид предпочтительно не перекрывается с участками сплайсинга, по меньшей мере не в той степени, в какой они присутствуют в интроне. Указанный олигонуклеотид, направленный на внутреннюю последовательность экзона, предпочтительно не содержит последовательность, обратно комплементарную соседнему интрону. Способ пропускания экзонов предпочтительно используют так, что отсутствие указанных двух экзонов, предпочтительно дополнительного экзона(ов), более предпочтительно расположенного между указанным первым и указанным вторым экзонами, из мРНК, продуцированной с пре-мРНК DMD, образует кодирующую область для (более высокой) экспрессии более (полу)функционального - хотя и более короткого - белка дистрофина. В этом контексте (как правило, у пациента с BMD), ингибирование включения указанных двух экзонов, предпочтительно дополнительного экзона(ов), расположенных между указанным первым и указанным вторым экзонами, предпочтительно означает, что:

- уровень исходной аберрантной (менее функциональной) мРНК дистрофина снижен по меньшей мере на 5% при оценке способом ОТ-ПЦР, или уровень соответствующего аберрантного белка дистрофина снижается по меньшей мере на 2% при оценке с помощью иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга с использованием антител против дистрофина; и/или

- транскрипт в рамке считывания, кодирующий полуфункциональный или функциональный белок дистрофин, поддается обнаружению или его уровень возрастает по меньшей мере на 5% при оценке способом ОТ-ПЦР (уровень мРНК) или по меньшей мере на 2% при оценке с помощью иммунофлуоресцентного анализа или вестерн-блоттинга с использованием антител против дистрофина (белковый уровень).

Снижение аберрантного менее функционального или нефункционального белка дистрофина предпочтительно составляет по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, и предпочтительно оно происходит одновременно или параллельно выявлению или увеличенной продукции более функционального или полуфункционального транскрипта или белка дистрофина. В этом контексте (как правило, у пациента с DMD), ингибирование включения указанных двух экзонов, предпочтительно дополнительного экзона(ов), расположенного между указанным первым и указанным вторым экзонами, предпочтительно означает, что у указанного индивидуума обеспечивается (более высокий уровень) более функциональный или (полу)функциональный белок или мРНК дистрофина.

После того, как у пациента с DMD обеспечивают (более высокие уровни) (более) функциональный или полуфункциональный белок дистрофина, причина DMD, по меньшей мере частично, смягчается. Таким образом, можно ожидать, что симптомы DMD в достаточной степени снижаются. Кроме того, настоящее изобретение относится к пониманию того, что пропускание всего участка из по меньшей мере двух экзонов дистрофина в пре-мРНК, содержащей указанные экзоны, индуцируется или усиливается при использовании единственного олигонуклеотида, направленного на (или способного связываться с, или гибридизоваться с, или являющегося обратно комплементарным или способного нацеливаться на) оба из внешних экзона указанного участка. В настоящей заявке, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению, таким образом, по меньшей мере на 80% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 45% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона, как определено в настоящем описании, где указанные первый и второй экзоны соответствуют наружным экзонам участка экзонов, подлежащего пропусканию. Более предпочтительно, указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 85%, 90% 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона. Увеличенная частота пропускания также увеличивает уровень более (полу)функционального белка дистрофина, продуцированного в мышечной клетки индивидуума с DMD или BMD.

Олигонуклеотид в соответствии с настоящим изобретением, который предпочтительно используют, предпочтительно является обратно комплементарным или способен связываться, или гибридизоваться, или нацеливаться на область первого экзона дистрофина, причем указанная область имеет по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, предпочтительно является обратно комплементарной или способна связываться, или гибридизоваться, или нацеливаться на область второго экзона дистрофина, причем указанная область имеет по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, где указанная область указанного второго экзона в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона.

В контексте изобретения олигонуклеотид может содержать или состоять из функционального эквивалента олигонуклеотида. Функциональный эквивалент олигонуклеотида предпочтительно означает олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, где один или несколько нуклеотидов заменены, и где активность указанного функционального эквивалента сохраняется по меньшей мере в некоторой степени. Предпочтительно, активность указанного соединения, содержащего функциональный эквивалент олигонуклеотида, представляет собой обеспечение функционального или полуфункционального белка дистрофина. Указанную активность указанного соединения, содержащего функциональный эквивалент олигонуклеотида, таким образом, предпочтительно оценивают путем количественного определения функционального или полуфункционального белка дистрофина. Функциональный или полуфункциональный дистрофин предпочтительно определяют в рамках настоящего изобретения как представляющий собой дистрофин, способный связываться с актином и представителями комплекса белков DGC и поддерживать структуру и гибкость мембран мышечных волокон. Оценка указанной активности соединения, содержащего функциональный олигонуклеотид или эквивалент, предпочтительно включает ОТ-ПЦР (для обнаружения пропускания экзона на уровне РНК) и/или иммунофлуоресценцию или анализ с использованием вестерн-блоттинга (для обнаружения экспрессии и локализации белка). Указанная активность предпочтительно сохраняется, по меньшей мере в некоторой степени, когда она соответствует по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% или более соответствующей активности указанного соединения, содержащего олигонуклеотид, из которого происходит функциональный эквивалент. На протяжении настоящей заявки, когда используют слово "олигонуклеотид", оно может быть заменено его функциональным эквивалентом, как определено в настоящем описании.

Таким образом, применение олигонуклеотида или его функционального эквивалента, содержащего или состоящего из последовательности:

которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого экзона дистрофина,

которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области второго экзона дистрофина,

и

где указанная область второго экзона в пре-мРНК дистрофина обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона, проявляет терапевтические результаты в отношении DMD посредством:

- смягчения одного или нескольких симптомов DMD или BMD; и/или

- смягчения одной или нескольких характеристик мышечной клетки от пациента; и/или

- обеспечения у указанного индивидуума функционального или полуфункционального белка дистрофина; и/или

- по меньшей мере частичного снижения продукции аберрантного белка дистрофина у указанного индивидуума.

Каждый из этих признаков уже определен в настоящем описании.

Предпочтительно, олигонуклеотид содержит или состоит из последовательности, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого экзона DMD или дистрофина, где область второго экзона DMD или дистрофина в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Указанные первый и второй экзоны предпочтительно выбирают из группы экзонов, включающей экзоны с 8 по 60, где участок экзонов, начинающийся с первого экзона и содержащий второй экзон в качестве последнего экзона, участок экзонов, начинающийся первым экзоном и содержащий второй экзон в качестве последнего экзона, когда он пропускается, обеспечивает транскрипт в рамке считывания. Предпочтительные комбинации экзонов в рамке считывания в мРНК дистрофина приведены в таблице 1, 2 или 6.

Без связи с какой-либо теорией, идентичность первого и второго экзонов дистрофина можно определять с помощью одного или нескольких из следующих аспектов. В одном варианте осуществления один или несколько интронов, присутствующих между первым экзоном и вторым экзоном, не являются чрезмерно большими. В этом контексте, чрезмерно большой интрон в гене дистрофина может составлять 70, 80, 90, 100, 200 т.п.н. или более; например, интрон 1 (~83 т.п.н.), интрон 2 (~170 т.п.н.), интрон 7 (~110 т.п.н.), интрон 43 (~70 т.п.н.), интрон 44 (~248 т.п.н.), интрон 55 (~119 т.п.н.) или интрон 60 (~96 т.п.н.). Кроме того, в следующем варианте осуществления может предусматриваться пример уже пациента с BMD, у которого экспрессируется укороченный белок дистрофин, где этот первый, этот второй экзон и участок экзонов от указанного первого экзона до указанного второго экзона удалены. Другим критерием может быть относительно большая применимость пропущенных экзонов для объединенных субпопуляций пациентов с DMD (и/или BMD) с конкретными соответствующими мутациями.

В предпочтительном варианте осуществления пропускается участок экзонов DMD в рамке считывания (более предпочтительно, полностью пропускается в одном транскрипте), где наружные экзоны определяются первым и вторым экзонами следующим образом:

- первый экзон представляет собой экзон 8, и второй экзон представляет собой экзон 19 (применимо для ~7% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 9, и второй экзон представляет собой экзон 22 (применимо для ~11% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 9, и второй экзон представляет собой экзон 30 (применимо для ~14% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 18 (применимо для ~5% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10 и второй экзон представляет собой экзон 30 (применимо для ~13% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 42 (применимо для ~16% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 47 (применимо для ~29% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 57 (применимо для ~72% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 60 (применимо для ~72% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 11, и второй экзон представляет собой экзон 23 (применимо для ~8% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 13 и второй экзон представляет собой экзон 30 (применимо для ~10% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 23, и второй экзон представляет собой экзон 42 (применимо для ~7% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 34 и второй экзон представляет собой экзон 53 (применимо для ~42% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 40, и второй экзон представляет собой экзон 53 (применимо для ~38% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 44, и второй экзон представляет собой экзон 56 (применимо для ~40% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 45, и второй экзон представляет собой экзон 51 (применимо для ~17% пациентов с DMD)

- первый экзон представляет собой экзон 45 и второй экзон представляет собой экзон 53 (применимо для ~28% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 45, и второй экзон представляет собой экзон 55 (применимо для ~33% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 45, и второй экзон представляет собой экзон 60 (применимо для ~37% пациентов с DMD), или

- первый экзон представляет собой экзон 56, и второй экзон представляет собой экзон 60 (применимо для ~2% пациентов с DMD).

Таким образом, в одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению индуцирует пропускание следующих экзонов дистрофина: экзоны с 8 по 19, экзоны с 9 по 22, экзоны с 9 по 30, экзоны с 10 по 18, экзоны с 10 по 30, экзоны с 10 по 42, экзоны с 10 по 47, экзоны с 10 по 57, экзоны с 10 по 60, экзоны с 11 по 23, экзоны с 13 по 30, экзоны с 23 по 42, экзоны с 34 по 53, экзоны с 40 по 53, экзоны с 44 по 56, экзоны с 45 по 51, экзоны с 45 по 53, экзоны с 45 по 55, экзоны с 45 по 60 или экзоны с 56 по 60.

Предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого экзона пре-мРНК дистрофина, так что обратно комплементарная часть составляет по меньшей мере 30% длины указанного олигонуклеотида по изобретению, более предпочтительно по меньшей мере 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% или еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, или еще более предпочтительно 98% и наиболее предпочтительно вплоть до 100%. В этом контексте первый экзон предпочтительно представляет собой экзон 8, 9, 10, 11, 13, 23, 34, 40, 44, 45 или 56 пре-мРНК дистрофина, как определено в настоящем описании. Указанный олигонуклеотид может содержать дополнительные фланкирующие последовательности. В более предпочтительном варианте осуществления длина указанной обратно комплементарной части указанного олигонуклеотида составляет по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Можно использовать несколько типов фланкирующих последовательностей. Предпочтительно, фланкирующие последовательности используют для модификации связывания белка с указанным олигонуклеотидом или для модификации термодинамического свойства указанного олигонуклеотида, более предпочтительно для модификации аффинности связывания РНК-мишени. В другом предпочтительном варианте осуществления дополнительные фланкирующие последовательности являются обратно комплементарными последовательностям пре-мРНК дистрофина, которые не присутствуют в указанном экзоне.

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид содержит или состоит из последовательности, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и является обратно комплементарной по меньшей мере области первого и области второго экзона дистрофина, присутствующей в пре-мРНК дистрофина, где указанные первый и второй экзоны выбраны из группы экзонов 8 (SEQ ID NO: 2), 9 (SEQ ID NO: 3), 10 (SEQ ID NO: 4), 11 (SEQ ID NO: 1761), 13 (SEQ ID NO: 1762),18 (SEQ ID NO: 5), 19 (SEQ ID NO: 6), 22 (SEQ ID NO: 7), 23 (SEQ ID NO: 8), 30 (SEQ ID NO: 9), 34 (SEQ ID NO: 1763), 40 (SEQ ID NO: 1764), 42 (SEQ ID NO: 11), 44 (SEQ ID NO: 1765), 45 (SEQ ID NO: 12), 47 (SEQ ID NO: 10), 51 (SEQ ID NO: 1760), 53 (SEQ ID NO: 13), 55 (SEQ ID NO: 14), 56 (SEQ ID NO: 15), 57 (SEQ ID NO: 1744) или 60 (SEQ ID NO: 16) и указанные области имеют по меньшей мере 10 нуклеотидов. Однако указанные области также могут иметь по меньшей мере 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов. Для предпочтительных экзонов, указанных выше, квалифицированный специалист способен идентифицировать область первого экзона и область второго экзона с использованием способов, известных в данной области. Более предпочтительно используют сетевой инструмент EMBOSS Matcher, как пояснено выше. Еще более предпочтительно, предпочтительные области идентичности первого и второго экзонов дистрофина, с которыми олигонуклеотид по изобретению предпочтительно связывается и/или для которых он является, по меньшей мере частично, обратно комплементарным, представлены в таблице 2. Обратная комплементарность в этом контексте предпочтительно составляет по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%. Предпочтительная олигонуклеотидная последовательность, подлежащая применению в рамках изобретения, способна связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на и/или является обратно комплементарной области идентичности между указанными первым и вторым экзонами, предпочтительно из таблицы 2, и имеет длину по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов, более предпочтительно менее 40 нуклеотидов или более предпочтительно менее 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно менее 25 нуклеотидов и наиболее предпочтительно от 20 до 25 нуклеотидов. Обратная комплементарность в этом контексте предпочтительно составляет по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

В одном варианте осуществления предпочтительный олигонуклеотид является таким, что первый и второй экзоны дистрофина являются такими, как указано в таблице 1, 2 или 6, и указанный олигонуклеотид способен связываться с соответствующими областями первого и второго экзонов, как указано в таблице 2 или 6 и как определяется SEQ ID NO: 17-1670, 1742, 1743 или 1766-1777.

Предпочтительные олигонуклеотиды описаны в таблице 3 и содержат или состоят из SEQ ID NO: 1671-1741. Другие предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1778-1891, как описано в таблице 6. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат SEQ ID NO: 1671-1741 или 1778-1891 и имеют на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов больше или на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов меньше, чем их точный SEQ ID NO, как указано в таблице 3 или 6. Эти дополнительные нуклеотиды могут присутствовать на 5'- или 3'-стороне данного SEQ ID NO. Эти отсутствующие нуклеотиды могут представлять собой нуклеотиды, присутствующие на 5'- или 3'-стороне данного SEQ ID NO. Каждый из этих олигонуклеотидов может иметь любую химическую структуру, как определено в настоящем описании ранее или их комбинации. В каждом из олигонуклеотидов, указанных в настоящем описании с помощью SEQ ID NO, U может быть заменен на T.

Более предпочтительные олигонуклеотиды приведены ниже.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 8 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 19, предпочтительная область экзона 8 содержит или состоит из SEQ ID NO: 17, и предпочтительная область экзона 19 содержит или состоит из SEQ ID NO: 18. Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1722 или 1723 или содержит SEQ ID NO: 1722 или 1723, и имеет длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 13, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 101, и предпочтительная область экзона 13 содержит или состоит из SEQ ID NO: 102.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 14, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 103, и предпочтительная область экзона 14 содержит или состоит из SEQ ID NO: 104.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 15, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 105, и предпочтительная область экзона 15 содержит или состоит из SEQ ID NO: 106.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 18, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 109, и предпочтительная область экзона 18 содержит или состоит из SEQ ID NO: 110. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681, 1778, 1812, 1813, 1884-1886, 1890 или 1891 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1814 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1815-1819 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1820, 1824 и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1826, 1782, 1832 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1821, 1825, 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1822 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1823, 1781, 1829, 1830, 1831 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов,

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1887 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1888 или 1889 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1827 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1828 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 18, другая предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1766, и другая предпочтительная область экзона 18 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1767. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1783, 1833, 1834, 1835 и имеющую длину 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 18, другая предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1768, и другая предпочтительная область экзона 18 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1769. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1673 или 1674 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 20, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 111, и предпочтительная область экзона 20 содержит или состоит из SEQ ID NO: 112.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 27, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 121, и предпочтительная область экзона 27 содержит или состоит из SEQ ID NO: 122.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 30, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 127, и предпочтительная область экзона 30 содержит или состоит из SEQ ID NO: 128. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681, 1812, 1813, 1884-1886, 1890 или 1891 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1814 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1675 или 1676 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1677 или 1678 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1784, 1836 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1786, 1838 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1785, 1837 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 30, другая предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1772, и другая предпочтительная область экзона 30 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1773. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1688, 1689, 1839, 1840, 1841, 1842, 1843 или 1844 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1845, 1846, 1847, 1848 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1849, 1850 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1787, 1851 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 31, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 129, и предпочтительная область экзона 31 содержит или состоит из SEQ ID NO: 130.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 32, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 131, и предпочтительная область экзона 32 содержит или состоит из SEQ ID NO: 132.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 35, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 137, и предпочтительная область экзона 35 содержит или состоит из SEQ ID NO: 138.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 42, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 151, и предпочтительная область экзона 42 содержит или состоит из SEQ ID NO: 152.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 44, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 153, и предпочтительная область экзона 44 содержит или состоит из SEQ ID NO: 154.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 47, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 157, и предпочтительная область экзона 47 содержит или состоит из SEQ ID NO: 158.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 48, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 159, и предпочтительная область экзона 48 содержит или состоит из SEQ ID NO: 160.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 55, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 167, и предпочтительная область экзона 55 содержит или состоит из SEQ ID NO: 168.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 57, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 169, и предпочтительная область экзона 57 содержит или состоит из SEQ ID NO: 170.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 60, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 173, и предпочтительная область экзона 60 содержит или состоит из SEQ ID NO: 174.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1673 или содержит SEQ ID NO: 1673 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1675 или содержит SEQ ID NO: 1675 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1677 или содержит SEQ ID NO: 1677 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1679 или содержит SEQ ID NO: 1679 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид содержит последовательность оснований SEQ ID NO: 1679 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Необязательно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 из U в SEQ ID NO: 1679 заменены на T. В предпочтительном варианте осуществления все U в SEQ ID NO: 1679 заменен/заменены на T. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1679, содержит любую из химических структур, определенных в настоящем описании выше: модификацию основания и/или модификацию сахара и/или модификацию основной цепи.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1681 или содержит SEQ ID NO: 1681 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1684 или содержит SEQ ID NO: 1684 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1685 или содержит SEQ ID NO: 1685 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1686 или содержит SEQ ID NO: 1686 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1688 или содержит SEQ ID NO: 1688 и имеет длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид содержит последовательность оснований SEQ ID NO: 1688 и имеет длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Необязательно, 1, 2, 3, 4, 5, 6 из U в SEQ ID NO: 1688 заменен/заменены на T. В предпочтительном варианте осуществления все U в SEQ ID NO: 1688 заменены на T. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1688, содержит любую из химических структур, определенных в настоящем описании выше: модификацию основания и/или модификацию сахара и/или модификацию основной цепи.

Для каждого из олигонуклеотидов, соответствующих SEQ ID NO: 1673, 1675, 1677, 1679, 1681, 1684, 1685, 1686 и 1688, первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10. Однако второй экзон дистрофина представляет собой экзон 13, 14, 15, 18, 20, 27, 30, 31, 32, 35, 42, 44, 47, 48, 55, 57 или 60. Это означает, что при использовании любого из этих олигонуклеотидов может произойти образование нескольких транскриптов в рамке считывания, каждый из которых приводит к продукции укороченного, но (полу)функционального белка дистрофина.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 11 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 23, предпочтительная область экзона 23 содержит или состоит из SEQ ID NO: 191, и предпочтительная область экзона 23 содержит или состоит из SEQ ID NO: 192. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1794, 1861, 1795, 1862 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1796, 1863, 1797, 1864 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1798, 1865, 1799, 1866 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 13 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 30, предпочтительная область экзона 13 содержит или состоит из SEQ ID NO: 285, и предпочтительная область экзона 30 содержит или состоит из SEQ ID NO: 286. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1808, 1867, 1809, 1868, 1810, 1869, 1858, 1873 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов,

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1811, 1870, 1859, 1874 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1856, 1871, 1860, 1875 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1857, 1872 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 23 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 42, предпочтительная область экзона 23 содержит или состоит из SEQ ID NO: 776, и предпочтительная область экзона 42 содержит или состоит из SEQ ID NO: 777. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1698-1703.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 34 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 53, предпочтительная область экзона 34 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1294, и предпочтительная область экзона 53 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1295. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1800, 1876, 1801, 1877 и имеющую длину 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1802, 1878, 1803, 1879 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 40 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 53, предпочтительная область экзона 40 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1477, и предпочтительная область экзона 53 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1478. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1804, 1880 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1805, 1881 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 44 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 56, предпочтительная область экзона 44 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1577, и предпочтительная область экзона 56 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1558. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1806, 1882, 1807, 1883 и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 51, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1567, и предпочтительная область экзона 51 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1568. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1730-1731.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 53, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1569, и предпочтительная область экзона 53 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1570. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1732-1737.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 55, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1571, и предпочтительная область экзона 55 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1572. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1704-1719, 1788, 1852, 1789, 1853.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1706 или содержит SEQ ID NO: 1706 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1706 и имеющий длину 25 нуклеотидов, состоит из SEQ ID NO: 1706.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1707 или содержит SEQ ID NO: 1707 и имеет длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1707 и имеющий длину 25 нуклеотидов, состоит из SEQ ID NO: 1706.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1713 или содержит SEQ ID NO: 1713 и имеет длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1713 и имеющий длину 25 нуклеотидов, состоит из SEQ ID NO: 1710.

Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1788, 1852, 1789, 1853 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 55, другая предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1774, и другая предпочтительная область экзона 55 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1775. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1790, 1854, 1792, 1855 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 60, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1577, и предпочтительная область экзона 60 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1578. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1738-1741.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 56 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 60, предпочтительная область экзона 56 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1742, и предпочтительная область экзона 60 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1743. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1720-1721.

Более предпочтительный олигонуклеотид содержит:

(a) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1673 или 1674 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(b) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1675 или 1676 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(c) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1677 или 1678 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(d) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(e) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1684-1686 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(f) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1688 или 1689 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(g) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1704-1706 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов,

(h) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1707-1709 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(i) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1710, 1713-1717 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Еще более предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

(a) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681, 1778, 1812, 1813, 1884-1886, 1890 или 1891 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или SEQ ID NO: 1814 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(b) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1688, 1689 или 1839-1844 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(c) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1673 или 1674 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(d) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1675 или 1676 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(e) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1677 или 1678 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(f) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1684-1686 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(g) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1704-1706 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(h) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1707-1709 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(i) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1710, 1713-1717 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(j) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1815-1819 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(k) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1820, 1824, и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(l) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1826, 1782, 1832 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(m) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1821, 1825, 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(n) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1822 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(o) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1823, 1781, 1829, 1830, 1831 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(p) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1783, 1833, 1834, 1835 и имеющую длину 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(q) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1887 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(r) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1888 или 1889 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(s) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1827 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(t) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1828 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(u) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1784, 1836 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(v) или последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1786, 1838 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(w) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(x) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1785, 1837 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(y) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1845, 1846, 1847, 1848 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(z) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1849, 1850 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(a1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1787, 1851 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(b1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1788, 1852, 1789, 1853 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(c1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1790, 1854, 1792, 1855 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(d1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1794, 1861, 1795, 1862 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(e1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1796, 1863, 1797, 1864 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(f1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1798, 1865, 1799, 1866 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(g1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1808, 1867, 1809, 1868, 1810, 1869, 1858, 1873 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(h1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1811, 1870, 1859, 1874 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(i1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1856, 1871, 1860, 1875 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(j1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1857, 1872 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(k1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1800, 1876, 1801, 1877 и имеющую длину 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(l1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1802, 1878, 1803, 1879 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(m1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1804, 1880 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(n1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1805, 1881 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(o1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1806, 1882, 1807, 1883 и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Олигонуклеотид по изобретению, который содержит или состоит из последовательности, определяемой номером SEQ ID, также охватывает олигонуклеотид, содержащий последовательность оснований, определяемую этим SEQ ID. Олигонуклеотиды, имеющие модифицированную основную цепь (т.е. модифицированные части сахаров и/или модифицированные межнуклеозидные связи), относительно олигонуклеотидов, определяемых SEQ ID, также охватываются изобретением. Каждое основание U в SEQ ID NO олигонуклеотида, как определено в настоящем описании, может быть модифицировано или заменено на T.

Композиция

В следующем аспекте предусматривается композиция, содержащая олигонуклеотид, как описано в предыдущем разделе под названием "Олигонуклеотид". Эта композиция предпочтительно содержит или состоит из олигонуклеотида, как описано выше. Предпочтительная композиция содержит один единственный олигонуклеотид, как определено выше. Таким образом, понятно, что пропускания по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзона достигают с использованием одного единственного олигонуклеотида, а не с использованием коктейля различных олигонуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления указанная композиция предназначена для применения в качестве лекарственного средства. Таким образом, указанная композиция представляет собой фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция обычно содержит фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент. В предпочтительном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению содержит соединение, как определено в настоящем описании, и необязательно дополнительно содержит фармацевтически приемлемый состав, наполнитель, консервант, солюбилизатор, носитель, разбавитель, эксципиент, соль, адъювант и/или растворитель. Такой фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель, консервант, солюбилизатор, разбавитель, соль, адъювант, растворитель и/или эксципиент может быть найден, например, в Remington. Соединение, как описано в рамках изобретения, обладает по меньшей мере одной ионогенной группой. Ионогенная группа может представлять собой основание или кислоту, и она может быть заряженной или нейтральной. Ионогенная группа может присутствовать в качестве пары ионов с соответствующим противоионом, который имеет противоположный заряд(ы). Примерами катионных противоионов являются натрий, калий, цезий, Tris, литий, кальций, магний, триалкиламмоний, триэтиламмоний и тетраалкиламмоний. Примерами анионных противоионов являются хлорид, бромид, йодид, лактат, мезилат, ацетат, трифторацетат, дихлорацетат и цитрат. Примеры противоионов описаны (Kumar L., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению приводят в контакт с композицией, содержащей такие ионогенные группы, предпочтительно Ca²⁺, с получением хелатного комплекса олигонуклеотида, содержащего два или более идентичных олигонуклеотидов, связанных таким мультивалентным катионом, как уже определено в настоящем описании.

Фармацевтическую композицию, кроме того, можно составлять, чтобы дополнительно способствовать повышению стабильности, растворимости, всасывания, биодоступности, фармакокинетики и клеточного захвата указанного соединения, в частности, составов, содержащих эксципиенты или конъюгаты, способные образовывать комплексы, наночастицы, микрочастицы, нанотрубки, наногели, гидрогели, полоксамеры или плюроники, полимерсомы, коллоиды, микропузырьки, везикулы, мицеллы, липоплексы и/или липосомы. Примеры наночастиц включают полимерные наночастицы, золотые наночастицы, магнитные наночастицы, частицы на основе диоксида кремния, липидные наночастицы, наночастицы на основе сахаров, белковые наночастицы и пептидные наночастицы.

Предпочтительная композиция содержит по меньшей мере один эксципиент, который может далее способствовать усилению нацеливания и/или доставки указанной композиции и/или указанного олигонуклеотида к и/или в мышцу и/или клетку. Клетка может представлять собой мышечную клетку.

Другая предпочтительная композиция может содержать по меньшей мере один эксципиент, классифицируемый как второй тип эксципиента. Второй тип эксципиента может включать или содержать конъюгатную группу, как описано в настоящем описании, для усиления нацеливания и/или доставки композиции и/или олигонуклеотида по изобретению к ткани и/или клетке и/или в ткань и/или клетку, например, такую как мышечная ткань или клетка. Оба типа эксципиентов можно комбинировать в одну единственную композицию, как определено в настоящем описании. Предпочтительные конъюгатные группы описаны в части, посвященной определениям.

Квалифицированный специалист может выбирать, комбинировать и/или адаптировать один или несколько из описанных выше или других альтернативных эксципиентов и систем для доставки для составления и доставки соединения для применения в рамках настоящего изобретения.

Такую фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить в эффективной концентрации в установленные моменты времени животному, предпочтительно млекопитающему. Более предпочтительным млекопитающим является человек. Соединение или композиция, как определено в настоящем описании, могут быть пригодны для прямого введения в клетку, ткань и/или орган in vivo у индивидуумов, предпочтительно указанные индивидуумы страдают или имеют риск развития BMD или DMD, и их можно вводить прямо in vivo, ex vivo или in vitro. Введение можно осуществлять системным и/или парентеральным путями, например, внутривенным, подкожным, внутрижелудочковым, интратекальным, внутримышечным, интраназальным, энтеральным, интравитреальным, внутрицеребральным, эпидуральным или пероральным путем.

Предпочтительно, такая фармацевтическая композиция по изобретению может быть инкапсулирована в форме эмульсии, суспензии, пилюли, таблетки, капсулы или мягкой желатиновой капсулы для пероральной доставки, или она может быть в форме аэрозоля или сухого порошка для доставки в дыхательные пути и легкие.

В одном варианте осуществления соединение по изобретению можно использовать вместе с другим соединением, уже известным тем, что его используют для лечения указанного заболевания. Такие другие соединения можно использовать для замедления прогрессирования заболевания, для снижения аномального поведения или движений, для снижения воспаления мышечной ткани, для улучшения функции, целостности и/или выживаемости мышечных волокон и/или для улучшения, увеличения или восстановления сердечной функции. Примерами являются, но не ограничиваясь ими, стероид, предпочтительно (глюко)кортикостероид, ингибитор ACE (предпочтительно периндоприл), блокатор рецептора ангиотензина II типа 1 (предпочтительно лозартан), ингибитор фактора некроза опухоли-альфа (TNFα), ингибитор TGFβ (предпочтительно декорин), рекомбинантный бигликан человека, источник mIGF-1, ингибитор миостатина, манноза-6-фосфат, антиоксидант, ингибитор ионных каналов, ингибитор протеаз, ингибитор фосфодиэстеразы (предпочтительно ингибитор PDE5, такой как силденафил или тадалафил), L-аргинин, блокаторы дофамина, амантадин, тетрабеназин и/или кофермент Q10. Это комбинированное применение может представлять собой последовательное применение: каждый компонент вводят в отдельной композиции. Альтернативно, каждое соединение можно использовать вместе в одной композиции.

Применение

В следующем аспекте предусматривается применение композиции или соединения, как описано в настоящем описании, в качестве лекарственного средства или части терапии, или применения, в которых соединение проявляет его активность внутриклеточно.

В предпочтительном варианте осуществления соединение или композиция по изобретению предназначены для применения в качестве лекарственного средства, где лекарственное средство предназначено для профилактики, замедления, смягчения и/или лечения заболевания, как определено в настоящем описании, предпочтительно DMD или BMD.

Способ профилактики, замедления, смягчения и/или лечения заболевания

В следующем аспекте предусматривается способ профилактики, замедления, смягчения и/или лечения заболевания, как определено в настоящем описании, предпочтительно DMD или BMD. Указанное заболевание можно предупреждать, лечить, замедлять или смягчать у индивидуума, в клетке, ткани или органе указанного индивидуума. Способ включает введение олигонуклеотида или композиции по изобретению указанному индивидууму или субъекту, нуждающемуся в этом.

Способ по изобретению, где олигонуклеотид или композиция, как определено в настоящем описании, могут быть пригодными для введения в клетку, ткань и/или орган in vivo индивидуумам, предпочтительно индивидуумам, страдающим BMD или DMD или имеющим риск развития такого заболевания, можно проводить in vivo, ex vivo или in vitro. Индивидуум или субъект, нуждающиеся в этом, предпочтительно представляют собой млекопитающее, более предпочтительно человека.

В одном варианте осуществления в способе по изобретению концентрация олигонуклеотида или композиции находится в диапазоне от 0,01 нМ до 1 мкМ. Более предпочтительно, используемая концентрация составляет от 0,02 до 400 нМ, или от 0,05 до 400 нМ, или от 0,1 до 400 нМ, еще более предпочтительно от 0,1 до 200 нМ.

Диапазоны доз олигонуклеотида или композиции по изобретению предпочтительно выбирают, исходя из исследований с возрастающей дозой в клинических испытаниях (применение in vivo), для которых существуют строгие требования протокола. Олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, можно использовать в дозе, которая находится в диапазоне от 0,01 до 200 мг/кг, или от 0,05 до 100 мг/кг, или от 0,1 до 50 мг/кг, или от 0,1 до 20 мг/кг, предпочтительно от 0,5 до 10 мг/кг.

Диапазоны концентрации или дозы олигонуклеотида или композиции, приведенные выше, являются предпочтительными концентрациями или дозами для применений in vitro или ex vivo. Квалифицированному специалисту будет понятно, что в зависимости от типа используемого олигонуклеотида, клетки-мишени, подлежащей лечению, гена-мишени и его уровней экспрессии, используемой среды и условий трансфекции и инкубации, концентрация или доза указанного используемого олигонуклеотида может далее варьировать и может требовать дальнейшей оптимизации.

Определения

"Идентичность последовательностей", как известно в данной области, представляет собой взаимосвязь между двумя или более последовательностями нуклеиновой кислоты (полинуклеотид или нуклеотид), как определяют путем сравнения последовательностей. В данной области процент "идентичности" или "сходства" указывает на степень родственности последовательностей нуклеиновой кислоты при определении по соответствию цепей таких последовательностей. "Идентичность" может быть заменена в настоящем описании "сходством". Предпочтительно, процент идентичности определяют путем сравнения всей SEQ ID NO, как определено в настоящем описании. Однако также можно использовать часть последовательности. Часть последовательности в этом контексте может означать по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% данной последовательности или SEQ ID NO.

"Идентичность" и "сходство" можно без труда вычислить известными способами, включая, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; и Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988).

Предпочтительные способы определения идентичности разработаны так, чтобы обеспечить наибольшее соответствие между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности и сходства закодированы в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные программы для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают, например, пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984)), BestFit и FASTA (Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Семейство программ BLAST 2.0, которое можно использовать для поиска сходства в базах данных, включает, например, BLASTN для нуклеотидных последовательностей запроса против нуклеотидных последовательностей из баз данных. Семейство программ BLAST 2.0 является общедоступным от NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Также для определения идентичности можно использовать хорошо известный алгоритм Смита-Ватермана.

Предпочтительные параметры для сравнения нуклеиновых кислот включают следующие параметры: алгоритм: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); матрица сравнений: совпадение = +10, несовпадение = 0; штраф за пропуск: 50; штраф за продолжение пропуска: 3. Доступен в качестве программы Gap от Genetics Computer Group, расположенной в Madison, Wis. Выше приведены параметры по умолчанию для сравнений нуклеиновых кислот.

Другим предпочтительным способом определения сходства и идентичности последовательностей является способ с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453, Kruskal, J.B. (1983), обзор сравнения последовательностей: D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley).

Другим предпочтительным способом определения сходства и идентичности последовательностей является способ с использованием EMBOSS Matcher и алгоритма Waterman-Eggert (локальное выравнивание двух последовательностей; [Schoniger и Waterman, Bulletin of Mathematical Biology 1992, Vol. 54 (4), pp. 521-536; Vingron and Waterman, J. Mol. Biol. 1994; 235(1), p1-12]). Можно использовать следующие web-сайты: http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html или http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/matcher. Определения параметров, используемых в этом алгоритме, находится на следующем web-сайте: http://emboss.sourceforge.net/docs/themes/AlignFormats.html#id. Предпочтительно используют параметры по умолчанию (матрица: EDNAFULL, штраф за пропуск: 16, штраф за продолжение пропуска: 4). Emboss Matcher обеспечивает наилучшее локальное выравнивание между двумя последовательностями, однако также предоставляются альтернативные выравнивания. В таблице 2 представлено наилучшее локальное выравнивание между двумя различными экзонами, предпочтительно экзонами дистрофина, которые предпочтительно используют для конструирования олигонуклеотидов. Однако также можно идентифицировать альтернативные выравнивания и, таким образом, альтернативные области идентичности между двумя экзонами, и их можно использовать для конструирования олигонуклеотидов, что также является частью настоящего изобретения.

На протяжении заявки слова "связывается", "нацеливается", "гибридизуется" могут использоваться взаимозаменяемо, когда их используют в контексте олигонуклеотида, который обратно комплементарен области пре-мРНК, как определено в настоящем описании. Аналогично, выражения "способен связываться", "способен нацеливаться" и "способен гибридизоваться" могут использоваться взаимозаменяемо для указания на то, что олигонуклеотид имеет определенную последовательность, которая позволяет связывание, нацеливание или гибридизацию с последовательностью-мишенью. Когда последовательность-мишень определена в настоящем описании или известна в данной области, квалифицированный специалист способен сконструировать все возможные структуры указанного олигонуклеотида с использованием принципа обратной комплементарности. В этом отношении будет понятно, что допустимо ограниченное количество несоответствий или пропусков в последовательности между олигонуклеотидом по изобретению и последовательностями-мишенями в первом и/или втором экзонах при условии, что связывание не изменяется, как рассмотрено выше. Таким образом, олигонуклеотид, который способен связываться с определенной последовательностью-мишенью, может считаться олигонуклеотидом, который обратно комплементарен последовательности-мишени. В контексте изобретения "гибридизуется" или "способен гибридизоваться" используют для физиологических условий в клетке, предпочтительно в клетке человека, если нет иных указаний.

Как используют в рамках изобретения, "гибридизация" относится к спариванию комплементарных олигомерных соединений (например, антисмысловое соединение и его нуклеиновая кислота-мишень). Не ограничиваясь конкретным механизмом, наиболее распространенный механизм образования пар вовлекает образование водородных связей, которое может представлять собой образование водородных связей по типу Уотсона-Крика, Хугстина или обратному хугстиновскому типу между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями (нуклеиновые основания). Например, природное основание аденин представляет собой нуклеиновое основание, комплементарное природному нуклеиновому основанию тимину, 5-метилурацилу и урацилу, которые образуют пару путем образования водородных связей. Природное основание гуанин представляет собой нуклеиновое основание, комплементарное природным основаниям цитозину и 5-метилцитозину. Гибридизация может происходить в различных условиях.

Аналогично, "обратную комплементарность" используют для указания на две нуклеотидных последовательности, которые способны гибридизоваться друг с другом, в то время как одна из последовательностей ориентирована от 3' к 5', а другая ориентирована в обратном направлении, т.е. от 5' к 3'. Таким образом, нуклеозид A на первой нуклеотидной последовательности способен образовывать пару с нуклеозидом A* на второй нуклеотидной последовательности через их соответствующие нуклеиновые основания, и нуклеозид B, расположенный в 5'-положении от упомянутого выше нуклеозида A в первой нуклеотидной последовательности, способен образовывать пару с нуклеозидом B*, который расположен в 3'-положении от упомянутого выше нуклеозида A* во второй нуклеотидной последовательности. В контексте настоящего изобретения первая нуклеотидная последовательность, как правило, представляет собой олигонуклеотид по изобретению, и вторая нуклеотидная последовательность представляет собой часть экзона из пре-мРНК, предпочтительно пре-мРНК дистрофина. Олигонуклеотид предпочтительно называют обратно комплементарным области экзона (первого и/или второго экзона), когда указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% обратно комплементарен указанной области указанного первого и/или второго экзона. Предпочтительно, обратная комплементарность составляет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

В контексте изобретения эксципиенты включают полимеры (например, полиэтиленимин (PEI), полипропиленимин (PPI), производные декстрана, бутилцианоакрилат (PBCA), гексилцианоакрилат (PHCA), сополимер молочной и гликолевой кислоты (PLGA), полиамины (например, спермин, спермидин, путресцин, кадаверин), хитозан, поли(амидоамины) (PAMAM), поли(сложный эфир-амин), поливиниловый эфир, поливинилпирролидон (PVP), полиэтиленгликоль (PEG) циклодекстрины, гиалуроновую кислоту, коломиновую кислоту и их производные), дендримеры (например, поли(амидоамин)), липиды {например, 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний пропан (DODAP), диолеоилдиметиламмоний хлорид (DODAC), производные фосфатидилхолина [например, 1,2- дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC)], производные лизо-фосфатидилхолина [например, 1-стеароил-2-лизо-sn-глицеро-3-фосфохолин (S-LysoPC)], сфингомиелин, 2-{3-[бис-(3-аминопропил)амино]пропиламино}-N-дитетрацедилкарбамоилметилацетамид (RPR209120), производные фосфоглицерина [например, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин, натриевая соль (DPPG-Na), производные фосфатицидной кислоты [1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатицидная кислота, натриевая соль (DSPA), производные фосфатидилэтаноламина [например, диолеоил-фосфатидилэтаноламин (DOPE), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DSPE), 2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPhyPE)], N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний (DOTAP), N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний (DOTMA), 1,3-диолеоилокси-2-(6-карбоксиспермил)пропиламид (DOSPER), (1,2-димиристоилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмоний (DMRIE), (N1-холестерилоксикарбонил-3,7-диазанонан-1,9-диамин (CDAN), диметилдиоктадециламмоний бромид (DDAB), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицерол-3-фосфохолин (POPC), (b-L-аргинил-2,3-L-диаминопропионовая кислота-N-пальмитил-N-олеиламид тригидрохлорид (AtuFECT01), производные N,N-диметил-3-аминопропана [например, 1,2-дистеароилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DSDMA), 1,2-диолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DoDMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-3-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA), производные фосфатидилсерина [1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин, натриевая соль (DOPS)], холестерин}, белки (например, альбумин, желатины, ателлоколлаген) и пептиды (например, протамин, PepFects, NickFects, полиаргинин, полилизин, CADY, MPG).

В контексте изобретения конъюгатные группы выбирают из группы, состоящей из нацеливающих частей, повышающих стабильность частей, усиливающих захват частей, усиливающих растворимость частей, улучшающих фармакокинетику частей, улучшающих фармакодинамику частей, повышающих активность частей, репортерных молекул и лекарственных средств, где эти части могут представлять собой пептиды, белки, углеводы, полимеры, производные этиленгликоля, витамины, липиды, полифторалкильные части, стероиды, холестерин, флуоресцентные части и радиоактивно меченые части. Конъюгатные группы необязательно могут быть защищенными и они могут быть связаны с олигонуклеотидом по изобретению прямо или через двухвалентный или поливалентных линкер.

Конъюгатные группы включают части, которые усиливают нацеливание, захват, растворимость, активность, фармакодинамику, фармакокинетику или которые снижают токсичность. Примеры таких групп включают пептиды (например, глутатион, полиаргинин, пептиды RXR (см., например, Antimicrob. Agents Chemother. 2009, 53, 525), полиорнитин, TAT, TP10, pAntp, полилизин, NLS, пенетратин, MSP, ASSLNIA, MPG, CADY, Pep-1, Pip, SAP, SAP(E), транспортан, буфорин II, полимиксин B, гистатин, CPP5, NickFects, PepFects), vivo-porter, белки (например, антитела, авидин, Ig, трансферрин, альбумин), углеводы (например, глюкоза, галактоза, манноза, мальтоза, мальтотриоза, рибоза, трегалоза, глюкозамин, N-ацетилглюкозамин, лактоза, сахароза, фукоза, арабиноза, талоза, сиаловая кислота, гиалуроновая кислота, нейрамидиновая кислота, рамноза, квиновоза, галактозамин, N-ацетилгалактозамин, ксилоза, ликсоза, фруктоза, манноза-6-фосфат, 2-дезоксирибоза, глюкал, целлулобиоза, хитобиоза, хитотриоза), полимеры (например, полиэтиленгликоль, полиэтиленимин, полимолочная кислота, поли(амидоамин)), производные этиленгликоля (например, триэтиленгликоль, тетраэтиленгликоль), водорастворимые витамины (например, витамин B, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C), жирорастворимые витамины (например, витамин A, D, D2, D3, E, K1, K2, K3), липиды (например, пальмитил, миристил, олеил, стеарил, батил, глицерофосфолипид, глицеролипид, сфинголипид, церамид, цереброзид, сфингозин, стерин, пренол, эруцил, арахидонил, линолеил, линоленил, арахидил, бутирил, сапеинил, элаидил, лаурил, бегенил, нонил, децил, ундецил, октил, гептил, гексил, пентил, DOPE, DOTAP, терпенил, дитерпеноид, тритерпеноид), полифторалкильные части (например, перфтор[1H,1H,2H,2H]-алкил), одобренные лекарственные средства с ММ<1500 Да, которые обладают аффинностью к конкретным белкам (например, NSAID, такие как ибупрофен (больше описано в патенте США 6656730, включенном в настоящее описание в качестве ссылки), антидепрессанты, противовирусные средства, антибиотики, алкилирующие средства, амебицидные средства, аналгетики, андрогены, ингибиторы ACE, снижающие аппатит средства, антациды, противогельминтные средства, антиангиогенные средства, антиадренергетики, антиангинальные средства, антихолинергетики, антикоагулянты, противосудорожные препараты, противодиабетические средства, противодиарейные средства, антидиуретики, антидоты, противогрибковые средства, противорвотные средства, средства против головокружения, противоподагрические средства, антигонадотропные средства, антигистамины, антигиперлипидемические средства, антигипертензивные средства, противомалярийные средства, средства против мигрени, средства против злокачественной опухоли, антипсихотические средства, противоревматические средства, антитиреоидные средства, антитоксины, противокашлевые средства, анксиолитические средства, контрацептивы, стимуляторы ЦНС, хелаторы, сердечно-сосудистые средства, противозастойные средства, дерматологические средства, диуретики, отхаркивающие средства, диагностические средства, желудочно-кишечные средства, анестетики, глюкокортикоиды, антиаритмические средства, иммуностимулирующие средства, иммунодепрессивные средства, слабительные средства, лепростатические средства, метаболические средства, средства, действующие на органы дыхательной системы, муколитики, мышечные релаксанты, нутрицевтические средства, сосудорасширяющие средства, тромболитические средства, утеротонические средства, сосудосуживающие средства), природные соединения с ММ<2000 Да (например, антибиотики, эйкозаноиды, алкалоиды, флавоноиды, терпеноиды, кофакторы ферментов, поликетиды), стероиды (например, преднизон, преднизолон, дексаметазон, ланостерин, холевая кислота, эстран, андростан, прегнан, холан, холестан, эргостерин, холестерин, кортизол, кортизон, дефлазакорт), пентациклические тритерпеноиды (например, 18β-глицирретиновая кислота, урсоловая кислота, амирин, карбеноксолон, эноксолон, ацетоксолон, бетулиновая кислота, азиатиковая кислота, эритродиол, олеанолевая кислота), полиамины (например, спермин, спермидин, путресцин, кадаверин), флуоресцентные части (например, FAM, карбоксифлуоресцеин, FITC, TAMRA, JOE, HEX, TET, родамин, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, CW800, BODIPY, AlexaFluors, Dabcyl, DNP), репортерные молекулы (например, акридины, биотины, дигоксигенин, (радио)изотопно меченые части (например, с ²H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁸F, ³²P, ³⁵S, ⁵⁷Co, ^99mTc, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁵³Gd)) и их комбинации. Такие конъюгатные группы могут быть присоединены прямо к соединениям по изобретению или через линкер. Этот линкер может быть двухвалентным (обеспечивающим конъюгат 1:1) или поливалентным, обеспечивающим олигомер с более чем одной конъюгатной группой. Методики связывания такой конъюгатной группы, либо прямо, либо через линкер, с олигомером по изобретению известны в данной области. Также в контексте изобретения находится применение наночастиц, с которыми ковалентно связаны олигонуклеотиды по изобретению, таким образом, такие конструкции называют сферическими нуклеиновыми кислотами (SNA), например, как описано в J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 12192 (Hurst et al., включенная в настоящее описание в качестве ссылки).

В настоящем документе и в его формуле изобретения глагол "содержать" и его спряжения используют в неограничивающем значении для обозначения того, что объекты после этого слова включены, однако объекты, конкретно не упомянутые, не исключены. Кроме того, глагол "состоять из" может быть заменен на "по существу состоять из", что означает, что олигонуклеотид или композиция, как определено в настоящем описании, могут содержать дополнительный компонент(ы) помимо компонентов, конкретно указанных, причем указанный дополнительный компонент(ы) не изменяет уникальной характеристики изобретения. Кроме того, указание на элемент в единственном числе не исключает возможности того, что присутствует более одного элемента, если контекст явно не требует, чтобы существовал один и только один из элементов. Таким образом, форма единственного числа обычно означает "по меньшей мере один".

Слова "приблизительно" или "примерно", когда их используют применительно к числовой величине (приблизительно 10), предпочтительно означают, что величина может представлять собой данную величину, равную 10, или отличается менее чем на 1% от этой величины.

Каждый вариант осуществления, как указано в настоящем описании, может быть комбинирован с другим, если нет иных указаний. Все патентные и литературные ссылки в настоящем описании включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Следующие примеры представлены только для иллюстративных целей, и они не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения никоим образом.

Примеры

Таблицы 1-3

Таблица 1
Перечень возможных комбинаций экзонов в транскрипте гена DMD, для которых экзон U (вышележащий) имеет непрерывную открытую рамку считывания с экзоном D (нижележащий), если экзоны с U+1 (первый экзон) по D-1 (второй экзон), и любые экзоны между ними, удалены из транскрипта. Первый экзон ("U") Второй экзон ("D") 1 8,20,22,51,53,59,62,64,65,67,76,79 2 5,6,9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,
42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 3 6,9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,
30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,
50,52,54,56,58,60,61,68,70

4 9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,
30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,
43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 5 9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,
43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 6 12,18,44,46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 7 20,22,51,53,59,62,64,65,67,76,79 8 11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,
32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,
47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 9 13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,
33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,
49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 10 13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,
33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,
49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 11 18,44,46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 12 15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,
35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,
52,54,56,58,60,61,68,70 13 16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,
54,56,58,60,61,68,70 14 17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,
56,58,60,61,68,70 15 19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,
38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,
58,60,61,68,70 16 19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,
38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,
58,60,61,68,70 17 44,46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78

18 21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,
39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,
60,61,68,70 19 22,51,53,59,62,64,65,67,76,79 20 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,
40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,
61,68,70 21 51,53,59,62,64,65,67,76,79 22 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,
42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,
70 23 26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,
43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 24 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,
45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 25 28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,
47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 26 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,
49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 27 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,
50,52,54,56,58,60,61,68,70 28 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,
52,54,56,58,60,61,68,70 29 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,
54,56,58,60,61,68,70 30 33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,
56,58,60,61,68,70 31 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,
58,60,61,68,70 32 35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,
60,61,68,70 33 36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,
61,68,70 34 37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,
68,70

35 38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 36 39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 37 40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 38 41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 39 42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 40 43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 41 45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 42 45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 43 46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 44 47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 45 55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 46 49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 47 50,52,54,56,58,60,61,68,70 48 52,54,56,58,60,61,68,70 49 52,54,56,58,60,61,68,70 50 53,59,62,64,65,67,76 51 54,56,58,60,61,68,70 52 59,62,64,65,67,76 53 56,58,60,61,68,70 54 57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 55 58,60,61,68,70 56 63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 57 60,61,68,70 58 62,64,65,67,76,79 59 68,70 60 68,70 61 64,65,67,76,79 62 66,69,71,72,73,74,75,77,78 63 67,76,79 64 67,76,79 65 69,71,72,73,74,75,77,78 66 76,79 67 70 68 71,72,73,74,75,77,78

70 73,74,75,77,78 71 74,75,77,78 72 75,77,78 73 77,78 74 77,78

Таблица 2
Перечень областей экзонов: участки последовательности с (частично) высокой идентичностью или сходством последовательности (по меньшей мере 50%) между двумя различными экзонами дистрофина, идентифицированные в качестве наилучшего попарного выравнивания с помощью EMBOSS Matcher с использованием параметров по умолчанию (матрица: EDNAFULL, штраф за пропуск: 16, штраф за продолжение пропуска: 4) (http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_matcher/nucleotide.html). Пропускание этих экзонов, и предпочтительно любых экзонов между ними, может привести к транскрипту DMD в рамке считывания (как в таблице 1) Экзоны-мишени Выравнивание EMBOSS SEQ ID NO 8
19 AGAUAAGAAGUCCA
||.|.||||||.||
AGCUGAGAAGUUCA 17
18 8
21 ACCUAUCCAGAUAAG-AAGUCCAUCUUAAUGUACA
||..|||....|||| |||||..|..|.||||.||
ACAAAUCAUUUUAAGCAAGUCUUUUCUGAUGUGCA 19
20 8
50 UUUGCCUCAACAAGUGAG--CAUUGAAGCC
|||.|.||||.|..|||| ||..|.||||
UUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCC 21
22 8
52 GAAGCCAUCCAGGAAGUGGAA
|.|.|.||.|||||..|||||
GCAACAAUGCAGGAUUUGGAA 23
24

8
58 CAAGUGAGCAUUGAA
||||.|.|.||||||
CAAGAGGGAAUUGAA 25
26 9
10 CUAGCACAGGGAUA
|.||||||.|||.|
CAAGCACAAGGAGA 27
28 9
12 GUCAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAAC
|.|.|.|||.||.|...|.|.||.|||||
GACUGGCUAACAAAAACAGAAGAAAGAAC 29
30 9
13 UCUAGCACAGGGAUAUGAGAG
|||||.|||.|.|.|.|..||
UCUAGAACAAGAACAAGUCAG 31
32 9
14 ACACAGGCUGCUUAUGUCACCACCUCUGAC
|.|||..||.||.|..|..|.||.|||.||
AGACAUCCUUCUCAAAUGGCAACGUCUUAC 33
34 9
15 UCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAA
|.|||..||.||.|.|.|||.||
UUUAGUGCAUGGCUUUCAGAAAA 35
36 9
16 UAUGCCUACACACAGGCUGCUUAUGUCACCAC
|||.|...||.|||.|.| |||.|.|||.|||
UAUUCACUCAAACAAGAU-CUUCUUUCAACAC 37
38

9
18 GAUAUGAGAGAACUUC
|||||.|..|||||||
GAUAUAACUGAACUUC 39
40 9
20 CACCACCUCUGACCCUACA
||||.|.||.||.||.|||
CACCCCAUCAGAGCCAACA 41
42 9
22 CUUA-UGUCACCACCUCUGA
|||| |||||||..||.|||
CUUAGUGUCACCGACUAUGA 43
44 9
23 UAUGUCACCACCUCUG
|||.|||.||||.|||
UAUCUCAGCACCACUG 45
46 9
25 CAGGGAUAUG-AGAGAACUUCUUCCC
|||.|||||. |||.|| |||..|||
CAGUGAUAUUCAGACAA-UUCAGCCC 47
48 9
26 UAAGCCUCGAUUCAAGAGCUAU
||||||||.|.. ||||.||||
UAAGCCUCCAGA-AAGAUCUAU 49
50 9
27 ACCACCUCUGACCCUACAC
||.|||..||.|.||.|||
ACUACCAGUGGCUCUGCAC 51
52

9
28 GGAUAUGAGAGAACUUCU
|||..||||..||..|||
GGAGCUGAGGAAAUCUCU 53
54 9
29 AGGGAUAUGAGAGAACUUCUUCCCCU
|||.|..|||||.|..|..|||.|.|
AGGAACUUGAGACAUUUAAUUCUCGU 55
56 9
30 CAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUUCUUCCCCUAAGCCUCGAUUC
|||||| ||.||||....|||.|.|.|.| |.|.|.|||.||..||.||
CAGUCU-GCCCAGGAGACUGAAAAAUCCU-UACACUUAAUCCAGGAGUC 57
58 9
31 GGUCAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUUCUUC
|.|||||.|||.| ||.||||...|||.|..||
GAUCAGUUUAGAA----GAAAUGAAGAAACAUAAUC 59
60 9
32 UUCUUCCCCUAAGCCUCGAUUCAAGAGCUAUGCCUACA
||.||||...||.|..|.|.|...||||...|.|||||
UUAUUCCAGAAACCAGCCAAUUUUGAGCAGCGUCUACA 61
62 9
33 CCCUAAGC-CUCGAUUCAAGAG
|||.|||. ||.|||..|||||
CCCAAAGAACUUGAUGAAAGAG 63
64 9
34 GGGAUAUGAGAGAACUUCUUCCCCUAAGCCUCGAUUCAAGAGCUAUGCCUACACACA--GGCUG
|.||.|||...|||.||.| |||.||||...|||....|.|...|||.||..|||.| |||||
GAGAAAUGCUUGAAAUUGU-CCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGACAGAAUGGCUG 65
66

9
35 AGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUU
||..||.|||||.|.||.|||||..|||
AGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGCCUU 67
68 9
36 UCAGUCUAGCACAG----GGAU--AUGAGAGAA
||||.||..||||. |||| ||.||||||
UCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGAGAA 69
70 9
38 CAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUUCUU
||||.||.|.|| |||||...|.||.|.|||
CAGUUUAACUCA--GAUAUACAAAAAUUGCUU 71
72 9
40 CAGGCUGCUUAUGUC
|||||||.|.||.||
CAGGCUGAUGAUCUC 73
74 9
41 CCACCUCUGACCC
|||.|||.||.||
CCAACUCAGAUCC 75
76 9
42 GAUAUGAGAGAACUUCU
||..||..|.|||||||
GAAGUGGAACAACUUCU 77
78 9
44 GGGAUAUGAGAGAACU
|.|||.|||.|||.||
GCGAUUUGACAGAUCU 79
80

9
46 GUCAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUUCUU
|||||..|..||.||.|||.|.|..|||.||.||
GUCAGAAUUUCAAAGAGAUUUAAAUGAAUUUGUU 81
82 9
47 UCCCCUAAGCCUCGA
||||.||||||..||
UCCCAUAAGCCCAGA 83
84 9
48 GAUUCAAGAGCUAUGCCU-ACACACAGG
|.|||.||||||.|.||| |.|.|||.|
GUUUCCAGAGCUUUACCUGAGAAACAAG 85
86 9
49 GGUCAGUCUAG-CACAGGGAUAUGAGAGAACUUCU
|.|||..|||. ||...||||.||..|||..||.|
GUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGAUUUU 87
88 9
51 CACGGUCAGUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUU
|.|.|.|||..|...||.|||.|..||.|||||||
CUCUGGCAGAUUUCAACCGGGCUUGGACAGAACUU 89
90 9
53 CUACACACAGGCUG
|.|||||..|||||
CAACACAAUGGCUG 91
92 9
57 GUCUAGCACAGGGAUAUGAGAGAACUUCU
|||| ||||.....|.||...||||||||
GUCU-GCACCUUUCUCUGCAGGAACUUCU 93
94

9
59 CAGGCUGCUUAUGUCACCAC
|||||||...|.||||..||
CAGGCUGAGGAGGUCAAUAC 95
96 9
60 CACCUCUGACCCUACA
||.||||.|||.||.|
CAGCUCUCACCGUAUA 97
98 10
12 UGAUGUGGAAGUGGUGAAAGACCAGUUUCAUACUCAUGAG
||||.|.||||...|.|||..|||..|.||....|||.||
UGAUCUUGAAGACCUAAAACGCCAAGUACAACAACAUAAG 99
100 10
13 UCAAACAGCUUUAGAAGAAGUA
||||..||.|.|||||.|||.|
UCAAGAAGAUCUAGAACAAGAA 101
102 10
14 CAAACAGCUUUAGAAGAAGU-AUUAUCG-UGGCUUCUUU
||||||.||.||||.|.|.. |..|.|| |||.||||||
CAAACAUCUGUAGAUGGACAGAAGACCGCUGGGUUCUUU 103
104 10
15 ACAGCUUUAGAAGAAGUAUUAUCGUGGCUUC
|.||.|..|.|.|||.|.|||||..|.||||
AAAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUC 105
106 10
16 AGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGU
|.|.||.|..||.|.|..|..|||| ||..||||.||||
ACUCAAACAAGAUCUUCUUUCAACA-CUGAAGAAUAAGU 107
108

10
18 AUUUGGAAGCUC-CUGAAGACAAGUCAUUUGGCAG
|||||.||.||. |.||||..|.|..|.||..|||
AUUUGCAAUCUUUCGGAAGGAAGGCAACUUCUCAG 109
110 10
20 AUCAAACA-GCUUUAGAAGAAGU
|||||||| ||.|.||||.||.|
AUCAAACAAGCCUCAGAACAACU 111
112 10
22 GACACAUUGCAAGCA
|||||.||||.|.||
GACACUUUGCCACCA 113
114 10
23 UGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGU
||||.|.|.||.|.| .||||||.|||..||.||||||.|
UGAAAUUAGCCGGAA---AUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAU 115
116 10
25 AAACCUG-GACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGUAUUAUC
|.||.|| |||.|...|||||.|.|||.|.|...|||...|||
AGACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACACUCAGUGGGAUC 117
118 10
26 CUGCUGAGGACACAUUGCAAGCACAAGGAGAGAU
||.|.||.||...|..|.|||||...|.||||||
CUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGAU 119
120 10
27 ACAGCUUUAGAAGAAG
|.||||..||||||.|
AGAGCUAAAGAAGAGG 121
122

10
28 AAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUU--UAGAAGAAGUAUUAUCGUGGCUUCUUUCUGCUGAGGACACAUUGCAAGC
|.||.|||| |..|.||||||..|. ||.|.||||||..||.....|||....|..|||| |.|||||.|..||
AUACUUGGA--GAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGA--AAACAUUCCUGGC 123
124 10
29 CUAAUGA-UGUGGAAGUGGUGAAA
|||||.| ||.||||.|.|.||.|
CUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACA 125
126 10
30 GACAAGUCAUUUGGCAGUUCAUUGAUGGAGAGUGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAG
|||||| ||.|||||||.|.|| |.||.||..||..|||||.....|||||...||...||||
GACAAG-CAGUUGGCAGCUUAU--------AUUGCAGACAAGGUGGACGCAGCUCAAAUGCCUCAGGAAG 127
128 10
31 GACAAGUCAUUUGGCAGUUCAUUGAUGGAGAG-UGAAGUAA
||||||||||. ||.|||.|...|.|||. |||||.||
GACAAGUCAUG----AGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAAA 129
130 10
32 ACAAGUCAUUUGGCAGUUCAUUGAUGGAGAGU-GAAGUAAA--CCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAA---GAAGUAUUAUCGU
|||||..|.|..|..|.|..|.||||.||.|. ||.|.|.. ||||.|..|..|.||||.|| |.|.||| ||||||.||..||
ACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGAG-UGUGGAACAGGAAGUAGUACAGU 131
132 10
33 UGAUGUGGAAGUGGUGA--AAGAC
|||.||||||.|||||| |||||
UGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGAC 133
134

10
34 CUAAUGAUGUGGAAGUGGUGAA-AGACCAG
|||..|||.|||||.||...|| |||.|||
CUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAG 135
136 10
35 AAACAGCUUUAG--AAGAAGUA
||||||.|||.| ||||||.|
AAACAGUUUUGGGCAAGAAGGA 137
138 10
36 AAGCACAAGGAGAGAUUUCUAAUGA-UGUGGA
||.||||.|||.|..|||.....|| ||||||
AAACACAUGGAAACUUUUGACCAGAAUGUGGA 139
140 10
37 GAAGUAAACCUGGA
|||.|||..|||||
GAAUUAAGACUGGA 141
142 10
38 UGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGU
|||||.|| .||||.|..|.|.|..|||.|.||.||.||.|
UGAAGGAA--UUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAUU 143
144 10
39 AUUGAUGGAGAGUGAAGUAAACCU
||||.||.|.||.|.||..|||.|
AUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUU 145
146 10
40 UGAGGACACAUUGCAAGCACAAGG----AGAGAUUUCUAAUGAUGUGGAAGUGGUGAAAGA
|||||.|.||..|.|...|.|||| |||.||||||.||.| ||||.|...||..||||
UGAGGUCUCAAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCA-GUGGUAUCAGUACAAGA 147
148

10
41 GCUGAGGACACAUUGCAAGCACAAGGAGAGAUU-UCUAAUGAUGUGG
|||||...||....|.|.|||....|||.|.|| |||.|.||||.||
GCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAGCUGAGGGCUUGUCUGAGGAUGGGG 149
150 10
42 CUGAAGACAAGUCAUUUGGCAGUUCAUUGAUGGAGAGUGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUU-AGAAGAAGUAUUAUC-GUGG-----CUUCUUUCUGCUGAGGACACAU-UGC-//
|||||||||.| |.|||||.|.||..|| |||.....|..|.|.| .|.|||.|..||||..||..|.| |.|||...|||||.| |||| |||||...||||...|||...| |||
CUGAAGACAUG-CCUUUGGAAAUUUCUU-AUGUGCCUUCUACUUA--UUUGACUGAAAUCACUCAUGUCUCACAAGCCCUAUUAGAAGUGGAACAACUUCUCAAUGCUCCUGACCUCUGUGCU// //AAGCACAAGGAGAGAUUUCU
|||..|...|| ||||.|||
//AAGGACUUUGA-AGAUCUCU 151
152 10
44 CGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGUAUUAUC-GUGGCUUCUUUCUGCUGAGGACACAUUGCAAGCACAAGGAGAGAUUUCUAAUGAUGUGGAAGUGGUGAAAGACCAGU
||||.|||....|.|.|| ||||..|.|.||| ||||||.......||||| |||..||...|| |.|...|.|.|||.||.|..||..||||...|..|||.||.|..
CGUUUUCAUUAUGAUAUA-AAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGA--ACAGUUUCUCAG-AAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUACAAAU 153
154 10
46 AAGUAAACCUGGACCGU-UAUCAAACAGCUUUAGAAGAA---GUAUUAUCGUGG
|||.|.|.||.|.|.|. |.|||||.||.||||.|.||| ||.||||.||.|
AAGAAUAUCUUGUCAGAAUUUCAAAGAGAUUUAAAUGAAUUUGUUUUAUGGUUG 155
156

10
47 AAGCUCCUGAAGACAAGUC
||||||..|.||||||.||
AAGCUCAAGCAGACAAAUC 157
158 10
48 UGGAAGCUCCUGAAGACAAGUCAUUUGGCAGUU
|.|||||||. ||.|.|||.|.||.|||||.|
UUGAAGCUCA--AAUAAAAGACCUUGGGCAGCU 159
160 10
49 GAGAGUGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGAAGAAGUAUUAUC
||.|.||||.||....|..|...|.|.|||.|.|.|.|.|||||..|.||.||
GAAACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGAUUUUGUC 161
162 10
51 UUCAUUGAUGGAGAGUGAAGUAAACCUGGACCGUUAUCAAACAGCUUUAGA-AGAAGUAUUAUCG--UGGCUUCUUUCUGCU-GAGGACACAUUGCAAGCACAAGGAGAGAU
|||.||||||..|.|.|.|......|||| |.|.|.||||.|.|..||.|| ||||.| ||.|| |||||| |.|||||| ||..|.....|..||.||||..|.|.|||
UUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGCUCUGG-CAGAUUUCAACCGGGCUUGGACAGAACU--UACCGACUGGCUU-UCUCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCACAGAGGGUGAU 163
164 10
53 GAGAGAUUUCU-AAUGAUGUGGAAGUGGUGAAAGACCAGUUUCAUA
||.|||.|||. |||.|...|||.|..||..||||.||..||||.|
GAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGA 165
166 10
55 CAGCUUUAGAAGAA
|.|||||.||||||
CUGCUUUGGAAGAA 167
168

10
57 CAUUUGGAAGCUCCUGAAGACAAGU
|||||||||||...|...|||.|||
CAUUUGGAAGCCAGUUCUGACCAGU 169
170 10
59 CUUUCUGCUGAGGACACA
||..||.|||||||.|.|
CUGCCUCCUGAGGAGAGA 171
172 10
60 CAUUUGGAAGCUCCUGAAG
||..||||||||.|||.||
CAGAUGGAAGCUUCUGCAG 173
174 11
12 AUCAGAAGAUGAA------GAA--ACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAUUCAAGAUGGGAAUGCCUCAGGGUAGCUAGCAUGGAAAAACAAA
|||||||..|||| ||| ||||....||||.|.||||.|||....|.|.....|.|..||.|..|||||..|| |.||....|.|||.|.|.||
AUCAGAAACUGAAAGAGUUGAAUGACUGGCUAACAAAAACAGAAGAAAGAACAAGGAAAAUGGAGGAAGAGCCUCUUGG-ACCUGAUCUUGAAGACCUAA 175
176 11
13 AGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAUU-CAAGAUGG
|||||||..|||| .|||.|||||....|.|.|||...||.|.|. ||.|.|||
AGAAGAUCUAGAA---CAAGAACAAGUCAGGGUCAAUUCUCUCACUCACAUGGUGG 177
178 11
14 GAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGA
||||...||||....|||.|.|..||||.||
GAUGGGCAAACAUCUGUAGAUGGACAGAAGA 179
180

11
15 UAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAG-CAGAUGAAUCUCCUAAAUUCAAGAUGGGAAUGCCUCAGGGUAGCUAGCAUGGAAAAAC
|.||||||.|.|||||..|.|. |.||||||. ||.|..|.|..|.| |.|||||...||||. .|...||.|.||.|.|.||||||
UUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGU-GAACAAGAUUCACACAACUGGCUU----UAAAGAUCAAAAUGA--AAUGUUAUCAAGUCUUCAAAAAC 181
182 11
16 AAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGA-UGAAUCUCCUAAAUUCAAGAU
||||||..|.|.|.||.|.|||.| ||.||...||.||. ||||||
AAGAAAAAGCAAUCCAUGGGCAAACUGUAUUCACUCAAA-CAAGAU 183
184 11
18 AGGAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAA
|||.||.||.|||||.....||||||
AGGCAACUUCUCAGACUUAAAAGAAA 185
186 11
20 CGGGUUGGUAAUAUUCUACAA-UUGGGAAGUAAGCUGAUUGGAACAGGAAA-AUUAUCAGAAGA
|.|||.|.|...|||||.|.| |||..||||.||....|| |||.||... |.||||||||.|
CCGGUGGAUCGAAUUCUGCCAGUUGCUAAGUGAGAGACUU--AACUGGCUGGAGUAUCAGAACA 187
188 11
22 CCAUCAGGGCCGGGUU
||||||||.|..||.|
CCAUCAGGACAUGGGU 189
190 11
23 CUGAUUGGAACAGGAAAAUU--AUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCU
||||....|.|.|||||..| |||||||..||||||||.|||.|.||....|.|||.|. ||||||
CUGAAAUUAGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGC-UCUCCU 191
192

11
24 GAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUC
|||..|||||.|. ||.||.|||||.||||.|
GAUUCAGAAAUUC---UAAAAAAGCAGCUGAAAC 193
194 11
25 GUUGGUAAUAUUCU-ACAAUUGGGA--AGUAAGCUGAUUGGAACAGGAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACA
||..||.||||||. ||||||..|. |||......|.||..| |.|||..|...||||||||.||||| |||||.|.|
GUCAGUGAUAUUCAGACAAUUCAGCCCAGUCUAAACAGUGUCA-AUGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAA--UGAAGCAGA 195
196 11
26 CAGGAAAAU-UAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAA
|||.||.|| ||||||| ||||.|..|| ||.|..|||..|||.||.|||
CAGAAAGAUCUAUCAGA-GAUGCACGAA-UGGAUGACACAAGCUGAAGAA 197
198 11
27 AAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAU
||||.||.|......||..|.|||.|.|..||||.|||||.|.|
AAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGCGAAAGUGAAACUCCUUACU 199
200 11
28 GAAGAUGAAGAAA---CUGAAGUACAAGA
|.||.|||.|||| ||||.||.|.|||
GGAGCUGAGGAAAUCUCUGAGGUGCUAGA 201
202 11
29 GCUGAUUGGAACAGGAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCA--GAUGAAUCUCCUAAAUUCAA
||..|||||.|||| |...||.||||.|..|.||..|..||.|..|.| |.|| ||.|||..|...|.|||.||
GCAUAUUGGCACAG--ACCCUAACAGAUGGCGGAGUCAUGGAUGAGCUA-AUCAAUGAGGAACUUGAGACAUUUAA 203
204 11
31 AAGCUGAUUGGAACAGGAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUA-CAAGAGCAGAUGAA
||.||||||.||..||..|....|||||...| ||||||| |||||.| ||..|.|||..|||
AAUCUGAUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUUUA-GAAGAAA-UGAAGAAACAUAAUCAGGGGAA 205
206

11
32 AUUGGGAAGUAAGCUGAUUGGAACAGGAA
|||||.||..|||. |..|||||||||||
AUUGGAAACAAAGA-GUGUGGAACAGGAA 207
208 11
33 AAAAUUAUCAG--AAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAA
||||.|.|.|| ||| ||||| .|||||||..||..|..|||.||
AAAAGUCUGAGUGAAG-UGAAG--UCUGAAGUGGAAAUGGUGAUAAA 209
210 11
34 UGGAACAGGAAAAUU-AUCAGAAGAUGAAGAAA
|||||..|..|||.. |||||.||.|||||.||
UGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAA 211
212 11
35 AGAUGAAGAAACUGAAG
||||..||||||.||||
AGAUUGAGAAACAGAAG 213
214 11
36 AUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUG
|||||| ||..|||||||...||.| ||.||.|||.|
AUCAGA-GAAAAAGAAACCCCAGCA-AAAAGAAGACG 215
216 11
37 AUGGAUUUGACAGCC
||.|||||| |||||
AUCGAUUUG-CAGCC 217
218 11
38 AAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCU
||||||....|||......||..|||||.|.||..||..|.|||||||
AAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCU 219
220

11
39 AGAAGAUGA-AGAAACUGAAG-UACAAGAGCAGAUG
||||...|| ||.||.|.||| ||.||.|||||.||
AGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAGCUG 221
222 11
40 AGUACAAGAG-CAGA-UGA--AUCUCCUAAAUU
|||||||||| |||. ||| |||||||.||.|
AGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAU 223
224 11
41 GAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAU
||||.|.|||.|.|..||.|||| ||||.| ||||.||.|||||
GAAAUUGAUCGGGAAUUGCAGAA---GAAGAA--AGAGGAGCUGAAU 225
226 11
42 UAUCAGAAGAUGAAGAA
|||.|||||..|||.||
UAUUAGAAGUGGAACAA 227
228 11
44 ACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAUUCAAGAUGGGAAUGCCUCAGGGUAGCUAGCAUGGAAAA-ACAAA
|||..|||.||..|.|.||..|.| ||||....|||.|||.||..|.|..|.||||..||| |||||
ACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGA---AAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUACAAA 229
230 11
46 GAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAUUCAA
||||.||||.||.|.||.. |.||..||.|||||
GAAGAACAAAAGAAUAUCU-UGUCAGAAUUUCAA 231
232 11
47 CAGAAGAUGAAGA--AACUGAAGUACAAG----AGCAGAUGAAUCUCC
|||||||..|||| ||||..|..|.||| ||||||..|||||||
CAGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCC 233
234

11
48 AACUGAAGUACAAG-AGCAGAUGAAUCUCCUAAAUUCAAGA
|.||||...||||| ||.|..||||.||| ||||..||||
ACCUGAGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUC--AAAUAAAAGA 235
236 11
49 GGAACAGGAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAG
|.|||.|.||.|..|....|||.|.||.||.|.||.||..|||||
GAAACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAG 237
238 11
51 AUGAAUCUCCUAAAUUCAAGAUGGGAAUGCC
|.|||.||.|.|..|.|||..|.|.||||||
AGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCC 239
240 11
53 GAAAAUUAUCAGAAGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCA
||||....||||||...|..|.| ||||||||||||.||
GAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGA--UGAAGUACAAGAACA 241
242 11
55 AGAUGAAGAAACUGAAGUACAAGAGCAGAUGAAUC
|||.||....|..|.||||.||||||.||||||.|
AGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAAC 243
244 11
57 GGAAGUAAGCUGAUUGGAACAGGAAAAUUAUCAGAAGAU--GAAGAA-ACUGAAGUACA
||.||..|.|| |||||| ||..|.||..|||.||.| ||||.| |..||.|||||
GGCAGGCACCU-AUUGGA---GGCGACUUUCCAGCAGUUCAGAAGCAGAACGAUGUACA 245
246

11
59 UCAGGGCCGGGUUGGUAAUAUUCUACAAUUGGGAAGUAAGCUGAUUGGAACAGGAAAAUU- AUCAGAAGAUGAAGAAACU----GAAGUACAAGAGCAGAUGAAUCUCCUAAAU-//
|||...|.|.||.||.||.|||..||.. |.|.|..|||||.|||.|.||.|||||. ||.|||...|..|.|.||| |||.|.||||||...|.|.||...||..|.
UCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCU----GCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAAGACUCCAGGAACUUCAAGAGGCCACGGAUGAGCUGG ACC// //UCAAGAUGGGAAUGCCUCAGGGUAGCUAG
|||||.||.|.....||.|||..|.|.||
//UCAAGCUGCGCCAAGCUGAGGUGAUCAAG 247
248 11
60 CCUAAAUUCAAGAUGGGA
|||.||..|.||||||.|
CCUGAACACCAGAUGGAA 249
250 12
17 ACAUAGAGUUUUAAUGGA
|||.|.|..|.|||||||
ACAGACAACUGUAAUGGA 251
252 12
43 GCUAACAAAAAC-AGAAGAAAGAACAAGG
|.||||||||.. |.|||.|...||||||
GUUAACAAAAUGUACAAGGACCGACAAGG 253
254 12
45 CAAAAACAGAAGAAAGAA-----CAAGGAAAAUGGAGGAAG
||||||||||.|..||.| ||.|.|||||.| |||||
CAAAAACAGAUGCCAGUAUUCUACAGGAAAAAUUG-GGAAG 255
256

12
54 UUACAUAGAGUUUUAAUGGAUCUCC-AGAAUCA
|.|||.|||.|.|.||||..|||.. ||||.||
UAACAGAGAAUAUCAAUGCCUCUUGGAGAAGCA 257
258 12
56 GAUCUCCA----GAAUCAGAAACUGAAAGAGUUGA--AUGACUGGCUA-ACAAAAACAGAAGAAAGAAC
||.||||| |||...|||.||.|.|.||.||. ||.||...||. |..|||||||...|||.|.|
GACCUCCAAGGUGAAAUUGAAGCUCACACAGAUGUUUAUCACAACCUGGAUGAAAACAGCCAAAAAAUC 259
260 13
15 UCACGCAACUGCUGCUUUGGAAGAACAA
||||.|||||| |||||. ||||.|||
UCACACAACUG--GCUUUA-AAGAUCAA 261
262 13
16 AAGAAGAUCUAGAACAAGAACAAG
|||..||||||||| |||||.|||
AAGCGGAUCUAGAA-AAGAAAAAG 263
264 13
18 AAUCUAGUGGAGAUCACGCAACUGCU--GCUUUGGAAGAACAACUUAA
|||||...|||....|.||||||.|| |..||..|||||.||.|.||
AAUCUUUCGGAAGGAAGGCAACUUCUCAGACUUAAAAGAAAAAGUCAA 265
266 13
20 AUCUAGUGGAGAUCACG-CAACUGCUGCU
|.|.|.|||||...|.| |||||.|||||
AACAAUUGGAGCAGAUGACAACUACUGCU 267
268 13
22 AGUCAGGGUCAAUUCUCUC
||||||...|.|..|||||
AGUCAGAAACCAAACUCUC 269
270

13
23 GCUUCAAGAAGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAG-GGUCAAUUCUCUCAC
||||.|..|||.|||... |||||.|||...|| ||.|.||.||.||.|
GCUUUACAAAGUUCUCUG-CAAGAGCAACAAAGUGGCCUAUACUAUCUC 271
272 13
24 ACAUGG-UGGUGGUAGUUGAUG
|.|||| |||..|.||||||||
AAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUG 273
274 13
25 AGAAGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAGGGU
|||||||..||||..|.....||.|||.||
AGAAGAUAAAGAAUGAAGCAGAGCCAGAGU 275
276 13
26 CUUCAAGAAGAUCUA
||.||..||||||||
CUCCAGAAAGAUCUA 277
278 13
27 UCAAGAAGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAGGGUCAAUUCUCUCACUCA
|.|||||||.....|||||.||.|||..|..||.||....||.|||.|
UAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGCGAAAGUGAAACUCCUUACUGA 279
280 13
28 CAUGGUGGUGGUAGUUGAUG--AAUCUAGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUG-GAAGAACAACUUAA
||||.|||....||||..|| |..||.|..||.|.||..|||.|| |||... ||||.|.||.||||
CAUGUUGGCAUGAGUUAUUGUCAUACUUGGAGAAAGCAAACAAGUG--GCUAAAUGAAGUAGAAUUUAA 281
282 13
29 CAUGGUGGUGGUAGUUGAUGA
|||||..|.|.||.|..||||
CAUGGAUGAGCUAAUCAAUGA 283
284

13
30 UCACUCACAUGGUGGUGGUAGUUGAUGAAUCUAGUGGAGAUC-ACGCAACU
|||.|.|||.|..|.|||.||.|.|| |.|..||...||.|. |||||.||
UCAUUGACAAGCAGUUGGCAGCUUAU-AUUGCAGACAAGGUGGACGCAGCU 285
286 13
31 AGAAGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAGGG
||||||..| |||.||..|.|| ||||||
AGAAGAAAU-GAAGAAACAUAA-UCAGGG 287
288 13
32 GAUGAAUCUAGUGGA---GAUCACGCAACUGC-UGCUUUGGAA
|||||.|.|||..|| ||..|.|||..||| |||.||||||
GAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAA 289
290 13
34 GCAACUGCUGCUUUGGAA
|||.||.|.|.|.|||||
GCAGCUACAGAUAUGGAA 291
292 13
35 UCAAGAAGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAGGGUCAAUUCUCUCACUCACAUGGUGGUGGUAGUUGAUGAAUCUAGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUGGAAGAACAACUUA
||||.||||..|.||..||.|..|.||.....|.||...|.||||..|..|.|..|.||.. ||||..|...|..|||..|..|.|.|...|.||. |||||||..||||.|
UCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGCC-UUGAAAACAGUUUUGGGCAAGAAGGAGACGUUGG--UGGAAGAUAAACUCA 293
294 13
36 UUGAUGAAUCUAGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUG-GAAGAACAACUUAAG
|.||||||||. ||||..|.|.|||..|.||.... |||||....||||||
UGGAUGAAUCA----GAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAGACGUGCUUAAG 295
296

13
37 GAAUCUAGUGGAGAUCACGCAAC
||.||||...|.||.||.|||.|
GACUCUACACGUGACCAAGCAGC 297
298 13
38 AUCUAGAACAAGAACAAGUCA
||||..||.|.|||.|..|||
AUCUGAAAGAGGAAGACUUCA 299
300 13
39 GAUGAAUCUAGUGGAGAUCACGC---AACUGCUGCUUUGGAAGA-ACAACUUAA
||..||.|.||.|||.||.|.|. |||.||.|||.|...||| |.|||.|||
GAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAGCUGUUACAGACAAAACAUAA 301
302 13
40 AGAUCUAGAACAAGAACAAGUCAGGGUC---AAUUCUCUCACUCACAUGGUGGUGGUAGUUGAUGAAUCUAGUGGA-GAUCACGC-AACUGCU
||.|||..||.|||||.|| |||.|| ||.|.||||| ||| |||||...|||..|.||..|..|..|| ||||.|.. ||.||||
AGGUCUCAAAGAAGAAAAA---AGGCUCUAGAAAUUUCUCA-UCA----GUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCU 303
304 13
41 AGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUGGAAG
|||||||...||.||..|.|.|||..|.|||
AGUGGAGCCAACUCAGAUCCAGCUCAGCAAG 305
306 13
42 UGAUGAAUCUAG--UGGAGAUCACGCAACUGCUGC-UUUGGAA
|||.|||.|.|. |||.|||.||..||....||| |||||||
UGAAGAAACGAUGAUGGUGAUGACUGAAGACAUGCCUUUGGAA 307
308

13
44 AGUUGAUGAAUCUAGUGGAGAUCA----CGCAACUGCUGCUUUGGAAGA-ACAACUU
||.|..|.|||| |||||..|.|| |..|||.|.|.||..|.|||| ||||.||
AGAUAUUUAAUC-AGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUU 309
310 13
46 CUUCAAGAAGAUCUAGAACAAG
||..|||||.|.||.||.||||
CUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAG 311
312 13
47 GUGCUUCAAGAAGAUCU--AGAACAAGAACAAGU
|||||.|.|.|||..|. |||.|||||..||.|
GUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACU 313
314 13
48 AGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUGG
||.|.||.|.|..||.||||||||.|||
AGAGCAGUUAAAUCAUCUGCUGCUGUGG 315
316 13
49 UAGAACAAGAACAAGUCAG
|.|.|||||.|.||..|||
UUGUACAAGGAAAAACCAG 317
318 13
51 GGUCAAUUCUCUCACUCACAUGGUGGUGGUAGUUGAUGAAUCUAGUGGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUGGAAGAA
|.||||.|.....|.|||||..| ||||.|.||.|.|||. ||.|.|||.||||...|..||.|..|...|.||||
GAUCAAGUUAUAAAAUCACAGAG-GGUGAUGGUGGGUGAC-CUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAGAA 319
320 13
53 GAUCUAGAACAAGAACA
|||..||.|||||||||
GAUGAAGUACAAGAACA 321
322

13
55 GCUGCUUUGGAAGAA
|||||||||||||||
GCUGCUUUGGAAGAA 323
323 13
57 UUCAAGAAGAUCUAGAACAAGAACAA
|||.||.||.|| ||||..|||||.|
UUCCAGCAGUUC-AGAAGCAGAACGA 324
325 13
59 GGAGAUCACGCAACUGCUGCUUUGGAAGAACAACUUAAG
||.||||.|...|.||...||.|..||||.||.||..||
GGCGAUCUCCUCAUUGACUCUCUCCAAGAUCACCUCGAG 326
327 13
60 GCAACUGCUGCUUUGGAAGAACAACUUAAG
|.||.|||..||.||.||||. |||.|.||
GAAAUUGCGCCUCUGAAAGAG-AACGUGAG 328
329 14
15 ACGUCUUACUGAAGAACA
|.|.|||.|.|||.||.|
AUGGCUUUCAGAAAAAGA 330
331 14
16 AUCGAUGGGCAAAC
|||.||||||||||
AUCCAUGGGCAAAC 332
333 14
18 UUCUCAAAUGGCAACGUCUUACUGAAGAA
|.||.||.|.|||| ||||.|.||||.|
UCCUGAAUUUGCAA--UCUUUCGGAAGGA 334
335

14
20 CAAAUGGCAACGUCUUACUGAAGA
||.|||.|||| |..|.|||||.|
CAGAUGACAAC-UACUGCUGAAAA 336
337 14
22 UAUUGGGAGAUCGAUGGGCAAACAUCUGUAGAUGG
|||..|||||.| |||.|... ||||.|.|.||||
UAUCAGGAGACC-AUGAGUGC-CAUCAGGACAUGG 338
339 14
23 UUUACAAGACAUCCUUCUCAAAUGGCAAC
||||||| |..|| |||..||..|||||
UUUACAA-AGUUC--UCUGCAAGAGCAAC 340
341 14
24 AAGACAUCCUUCUCAAAUGGCAACGUCUUACUGAAGAA
||||.||...|..|..|.|...|.||.||.||||||.|
AAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUUUCUGAAGGA 342
343 14
25 UGUAGAUGGACAGAAGA
||.||.|||.|||||||
UGAAGGUGGGCAGAAGA 344
345 14
27 AAAUGGCAACGUCUUACUGA
|||..|.|||..||||||||
AAAGUGAAACUCCUUACUGA 346
347 14
28 GCAAACAUCUG--UAGAUGGA
|||||||..|| ||.|||.|
GCAAACAAGUGGCUAAAUGAA 348
349

14
29 AUCGAUGGGCAAA
||.||||.||.||
AUGGAUGAGCUAA 350
351 14
30 CAGAAGACCGCUGGGUUCUUUUACAAG
|||.||.||......|||.||.|||||
CAGGAGUCCCUCACAUUCAUUGACAAG 352
353 14
31 UUUUACAAGACAU
|||.|||||.|||
UUUGACAAGUCAU 354
355 14
32 UGUAGAUGGACAGAAGA
|.||||||.|..|||||
UUUAGAUGAAGUGAAGA 356
357 14
33 AACGUCUUACUGAAG
||.||||.|.|||||
AAAGUCUGAGUGAAG 358
359 14
34 AAAUGGCAACGUCUU-ACUGAA
||||| ||.||||| ||.|||
AAAUG--AAUGUCUUGACAGAA 360
361 14
35 CAGAAGACCGCUGGGUUCUUUU
|||||||..|.|....||||||
CAGAAGAGUGGUUAAAUCUUUU 362
363

14
36 CAAAUGGCAACGUCUUAC
||.||||.|||.|.|.||
CACAUGGAAACUUUUGAC 364
365 14
37 AUCGAUGGGCAAACAUCUGUAGAUGGACAGAAGACCG
||||||..|||..|||.|. |.|..||...|||||.|
AUCGAUUUGCAGCCAUUUC-ACACAGAAUUAAGACUG 366
367 14
38 UCUCAAAUGGCAACGUCUUACUGAAGA
|||.|||..|.||....|.|.|.||||
UCUGAAAGAGGAAGACUUCAAUAAAGA 368
369 14
39 GAAGACCGCUGGGUUCUUUUACAAGACAUCCUUCUCAAAUGGCAACGUCUUAC
||||||.....||.|..|.||.|||| ||..||...||..||..||..|||||
GAAGACAAUGAGGGUACUGUAAAAGA-AUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUAC 370
371 14
40 ACGUCUUACUGAAGAACA
|.||||.|..||||||.|
AGGUCUCAAAGAAGAAAA 372
373 14
41 GGGAGAUCGAUGGGCAAA
||||.||.|| |.|||||
GGGAAAUUGA-GAGCAAA 374
375 14
42 AAGACAU-CCUUCUCAAAU
||||||| ||||...||||
AAGACAUGCCUUUGGAAAU 376
377

14
44 AAAUGGCAACGUCUUACUGAAGA
|||||||..|||.||..|.|.||
AAAUGGCGGCGUUUUCAUUAUGA 378
379 14
46 UAGAUGGACAGAAGA
||||.|.|||.||||
UAGAAGAACAAAAGA 380
381 14
47 UUCUCAAAUGGCAACGUCUUACUGAAGAAC
||||||||.....|..|...||||.||.||
UUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGAC 382
383 14
48 AUUGGGAGAUCGAUGGGCAAACAUCUGUAGAUGGAC
|.|.|||.||..||...|||.||.....|||.||||
AGUUGGAAAUUUAUAACCAACCAAACCAAGAAGGAC 384
385 14
49 AUGGGCAAACAUCUGUAGAUGGACAGA
|.|||||. |||.||||.|.|||.|.|
AAGGGCAG-CAUUUGUACAAGGAAAAA 386
387 14
51 UGGACAGAAG--ACCG-CUGGGUUCUUUUACAAGACAUCCUUCUCAAAUGGCA
|||||||||. |||| ||||.||..|.|.|..||.....||.|.||||..||
UGGACAGAACUUACCGACUGGCUUUCUCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCACA 388
389 14
53 UGGGUUCUUUUACAAGACAUCCUUCUCAAAUGG---CAACGUCUUACUGAA
||||.|....|||||||...|||||..||..|| ||||...|.|.||||
UGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAA 390
391

14
55 CAAAUGGCAACGUCUUACUGAA
|||.||.|||.|||.|||.|.|
CAACUGCCAAUGUCCUACAGGA 392
393 14
57 CUUUUACAAGACAUCCUUCUCAAAUGGCAACGUCU
|.|||..|||.||....|..|.|.|||.|.|||||
CAUUUGGAAGCCAGUUCUGACCAGUGGAAGCGUCU 394
395 14
59 GAUGGGCAAACAUCUGUAGAUG
||..||||.|.|....||||||
GACUGGCAGAGAAAAAUAGAUG 396
397 14
60 CUGUAGAUGGACAGAAGACC-GCUGGGUUCUUUUACA
||.|.||.|..|.|||.||| |.|||...|||.|.||
CUCUGGAAGACCUGAACACCAGAUGGAAGCUUCUGCA 398
399 15
16 AGAAAAAGAAGAUGCAGUG---AACAAGAUUCACACAA
||||||||.| ||.||..| |||...||||||.|||
AGAAAAAGCA-AUCCAUGGGCAAACUGUAUUCACUCAA 400
401 15
18 CACAACUGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAA
||||.||||.||....|.|||.|| |...||||....||||.|.||
CACAGCUGGAUUACUCGCUCAGAA-GCUGUGUUGCAGAGUCCUGAA 402
403 15
20 AAAGAAGAU-GCAGUGAACAAGAUUCACA-CAACUG
||.|.|||| |||...||||||..|||.| ||||||
AAUGCAGAUAGCAUCAAACAAGCCUCAGAACAACUG 404
405

15
23 AACUGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAU
||.|.||...|||.|||||...|||.|
AAUUAGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUU 406
407 15
24 UUCAGAAAAAGAAGAUG---CAGUGAACA
|||..||||||.||.|| |||||.|.|
UUCUAAAAAAGCAGCUGAAACAGUGCAGA 408
409 15
25 UUUUAGUGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACA-AGAUUCACACAACUGGCUUUAAAGAUCAA-AAUGAA
|||||||...||...||||||.||...||.. ||||..|.| ||..|||...||...|.....|||||.|| ||||||
UUUUAGUCAGUGAUAUUCAGACAAUUCAGCC-CAGUCUAAACAGUGUCAAUGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAA 410
411 15
26 AUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAG
|||..||.|||||| |.||.||.||.||..|||
AUGAAUUACAGAAA--GCAGUUGAAGAGAUGAAG 412
413 15
27 AGAAAAAGAAGAUGCAGUGAA
|.|||||||||....||||||
ACAAAAAGAAGCGAAAGUGAA 414
415 15
28 CACACAACUGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAAAAACU
||.||||.|||||..|...|..|.|||..||..|||..|...||..|||.|.|
CAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUU 416
417 15
29 AGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACA
|||.|||......||..||||||.||.|
AGAGGAUAACCCAAAUCAGAUUCGCAUA 418
419

15
30 UUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCA
||.||||.||.|..||.||||...|.|.|..|||
UUGCAGACAAGGUGGACGCAGCUCAAAUGCCUCA 420
421 15
31 AAAAUGAAAUGUUAU----CAAGUCUUCAAA
|||||..|||.|.|| ||||||.|.|.|
AAAAUCCAAUCUGAUUUGACAAGUCAUGAGA 422
423 15
32 GCCUUUUUAGUGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUG
|||..|||.|.|||..|..|.||..|||..||||||
GCCAAUUUUGAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGAUG 424
425 15
33 UUCAGAAAAAGAAGAUGCA
|.|||||||||.|||.|.|
UACAGAAAAAGCAGACGGA 426
427 15
34 CAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACAACUGGCUUUAAAGAU-CAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAAAAACUGGC
||||||.| |||...||||.....|.||.|....||.||.|....||||| |.|||.||||||. |.|||||.|.|.|.||||
CAGAAAGA-AAGCAACAGUUGGAGAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGA----AUGUCUUGACAGAAUGGC 428
429 15
35 UUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACA
||.|||||.|||||.||||....|..||..|||||.|
UUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUAUCACAGA 430
431

15
36 UGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGA
||.|||..|...||||||||||....|||..|| ||||
UGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAACCCCAGCAAA-AAGA 432
433 15
37 UUUAAAGAUCAAAAUGAA
|||||||....||.||||
UUUAAAGGCAGAACUGAA 434
435 15
38 UGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUG-AACA-AGAUUCACACAACUGGCUUUAA
|.|||..|||| |||..|...|..|||||. |||. ||||..|||.||.|.||||.||
UCCAUUCCUUU--GAAGGAAUUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAUUGCUUGAA 436
437 15
39 UCAGAAAAAGA-AGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACAACUGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAG
|.|||.||||. |||.|.|.|.||.| |.|.|||.|.|...|||.||| |||||...||||.|.|||||
UGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGA----UAAAACAGCAGCUGUUACAGA-CAAAACAUAAUGCUCUCAAG 438
439 15
40 AAAGAAGAUGCAGUGAACAAGA---UUCACACAACUGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAAAAACUGG
||||||||...|..|..|.||| |||.||..|.|||..|. ||..|||.|.|.|...|.||.|..||.|.|||..||.|
AAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUC--AGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCUUG 440
441 15
41 UUUCAGAAAAAGAAGAUGCAG-UGAA
||.|||||.|||||...|.|| ||||
UUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAA 442
443

15
42 GGCUUUAAAGAUC
|.||||.||||||
GACUUUGAAGAUC 444
445 15
44 UUUUUAGUGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACAACUG-GCUUUA--AAGAU-CAAAAUG-AAAUGUUAUC
|.||||.|...|||||..|||||...|||.|.....|.|..||||..||.|...||| |..||. ||.|| |.||||. |||||.||||
UAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAAUACAAAUGGUAUC 446
447 15
46 AAGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAAAAA
||||.|||||..|.||.||.|||....||||||.|
AAGAACAAAAGAAUAUCUUGUCAGAAUUUCAAAGA 448
449 15
47 AAGAUCAAAAUGAAA-UGUUAUCAAGUCUUCAAA
|||||.||..||||| |....|||||....||||
AAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAA 450
451 15
48 GCUUUCAGAAAAAGAAGAUGCAGUGAA
||||..|||....||||| |||||.||
GCUUGAAGACCUUGAAGA-GCAGUUAA 452
453 15
49 GAAAAAGAAGAUGCAGUGAACAAGAUUCACACAACUGGCUUU
||||..|||...|||||. ||||.| |.|||||.||.|.|
GAAACUGAAAUAGCAGUU--CAAGCU--AAACAACCGGAUGU 454
455

15
51 UGGCUUUAAAGAUCAAAAUGAAAUGUU-AUCAAG
||.|.||.|.|||...||.||.|||.| ||||||
UGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAG 456
457 15
53 UUCAGAAAAAGAAG-AUGCAGUG-AACAAGAUUCACACAACUGGCUUUAA-AGAUCAAAAUGAAAUGUUAUCAAGUCUUCAAAA-ACUGGC
|||||||..||..| |||.|||. ||.||.|....||.|||.||....|| ||.|.| ||||||||||| |||..|||||.| |.||||
UUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGA--AUGAAAUGUUA--AAGGAUUCAACACAAUGGC 458
459 15
55 UUUAGUGCAUGGCUUUCAGAAAAAGAA
|||..|||.||||||.|||||...|||
UUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAA 460
461 15
57 UUCAGAAAAAGAA-GAUGCA
|||||||..|||| ||||.|
UUCAGAAGCAGAACGAUGUA 462
463 15
59 UGGCUUUCAGAAAAAGA-AGAUG
||.||..||||.|||.| |||||
UGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUG 464
465 15
60 UCAGAAAAAGAAGAUG
||.||||.||||..||
UCUGAAAGAGAACGUG 466
467

16
18 AAAAGAAAAAG-CAAU
||||||||||| ||||
AAAAGAAAAAGUCAAU 468
469 16
20 UAAGUCAGUGACCCAGAAGACGGAAGCAUGGCUGGAUAACUUUGCCCGGUGUUGGGAUAAUUUAGUCCAAAAACUUGAAAAGAGUACAGC
|||||.||.|||..|...|.|.|.||.|| |.|.|.|||.| |.....||...|||||....|.|||.||.|.||..|||..|||.|
UAAGUGAGAGACUUAACUGGCUGGAGUAU--CAGAACAACAU---CAUCGCUUUCUAUAAUCAGCUACAACAAUUGGAGCAGAUGACAAC 470
471 16
22 AAGUCAGUGACCCAGAAGACGGAAGCAUGG
||.|.||||.|.|.||..|.|.||.|||||
AACUUAGUGUCACCGACUAUGAAAUCAUGG 472
473 16
23 AAAAGCAAUCCAUGGGCAAACUGUAUUCACUCAAACAAGAUC
||||||.| .|.|.||||| ||.||..||||..|.||..||
AAAAGCUA--GAGGAGCAAA-UGAAUAAACUCCGAAAAAUUC 474
475 16
24 ACCCAGAAGACGGAAGCAUGGCUGGA
||||.|||||. |.|.|||||||.|
ACCCUGAAGAA--AUGGAUGGCUGAA 476
477 16
25 AAGACGGAAGCAUGGCUGGAUAACUUUGCCCGGUGUUGGGAUAAUUUAGUCCAAAAACUUGAAA
||||..||||||..||..||. |||||...|.|....||.|....|.||.||.|||||.|.|
AAGAAUGAAGCAGAGCCAGAG---UUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACA 478
479

16
26 GGGCAAACUGUAUUCACUCAAACAAGAUCU
|.|.||||||||..| |||.|..|||||||
GAGAAAACUGUAAGC-CUCCAGAAAGAUCU 480
481 16
27 UUAAAAGCGGAUCUAGAAA
||||||..|||.||.||||
UUAAAAAAGGAACUUGAAA 482
483 16
28 GAAAAAGCAAUCCAUGGGCAAACUGUAUU
||.|||||||.|.|..|||.||.||.|.|
GAGAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGU 484
485 16
29 CAGAAGACGGAAGCAUGGCUG
||||.|.||||..|||||.||
CAGAUGGCGGAGUCAUGGAUG 486
487 16
30 CCCAGAAGACGGAAGCAU
|||||.||||.|||..||
CCCAGGAGACUGAAAAAU 488
489 16
31 AGAAAAGAAAAAGCA-AUCCAUGGGCA
|||||.|||.||.|| |..||.|||.|
AGAAAUGAAGAAACAUAAUCAGGGGAA 490
491 16
32 UUAGUCCAAAAAC
|||.||||.||||
UUAUUCCAGAAAC 492
493

16
33 CCAAA-AACUUGA--AAAGAGUA-CAGC
||||| ||||||| |||||||| ||||
CCAAAGAACUUGAUGAAAGAGUAACAGC 494
495 16
34 CGGAUCUAGAAAAGAAAAAGCAAUC
|.|||.|.|||..||.||||..|||
CAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUC 496
497 16
36 GGAUCUAGAAAAGAAAAAGCAAUCC
||||..|..|.||||||||.||.||
GGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAACCC 498
499 16
37 AAAAGCGGA-UCUAGAAAAGAAAAAGCA--AUCCAUG--GGCAAACUG
|||.|.||| ||||.|...||..||||| |..|.|| |||||||.|
AAAGGUGGACUCUACACGUGACCAAGCAGCAAACUUGAUGGCAAACCG 500
501 16
38 AUUCACUCAAACAAGAUCUUCUUUCAACACUGAAGAAU--AAGUCAG
|.|||...|.||||.|..|.|||..|.|||||.||..| ||.||||
ACUCAGAUAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUUCAG 502
503 16
39 AACUGUAUUCACUCAAACAAGAU-CUUCUUUCAACACUGAAGAAUAAGUCAGUGA
||..|.|||....||||.|.||. |..|||.|||||..|||..|.|..|.||.||
AAAAGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGA 504
505 16
40 AAAAGCGGAUCUAGAAA
||||..||.||||||||
AAAAAAGGCUCUAGAAA 506
507

16
41 CAGAAGACGGAAGCAUGGCUGGAU
|||||||.|.|||....||||.||
CAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAU 508
509 16
42 ACUGUAUUCACUCA
||||.|.|||||||
ACUGAAAUCACUCA 510
511 16
44 ACUGAAGAAUAAGUCAGUGACCCAGAA-GACGGAA
||.||||...|| ||||..|.||||| |||..||
ACAGAAGCUGAA--CAGUUUCUCAGAAAGACACAA 512
513 16
46 AAAAGCGGAUCUAGAAAAGAAAAAGC
|||||.|.|.|.|..|||..||||||
AAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGC 514
515 16
47 AAAAACUUGAAAAGA
|.|||||||||||.|
AUAAACUUGAAAAUA 516
517 16
48 AGCAAUCCAUGGGCAAACUGUAUUCACUCAAAC-AAGA
||.||||..|.||.||..|.||..||..||||| ||||
AGGAAUCAGUUGGAAAUUUAUAACCAACCAAACCAAGA 518
519 16
49 UUUCAACACUGAAGAAUAAGUCAGUGACCCAG
|||..|||..|||.||..||.||.|.|.||||
UUUGUACAAGGAAAAACCAGCCACUCAGCCAG 520
521

16
51 GCAAACUGUAUUCACUCAAACAAGAUCUUCUUUCAACACUGAAG
|.||||||...||.| |||||.|||..|.|..||..|..|||.|
GGAAACUGCCAUCUC-CAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUG 522
523 16
53 AAAGAAAAAGCAAUCCAUGGGCAAA
|.||.|.|.||||||||...|.|||
ACAGUAGAUGCAAUCCAAAAGAAAA 524
525 16
55 GAAGAAU--AAGUCAGUGACCCAGAAGACGGAAGCAUGGC
|||||.| |||..|||.|...||..||.|.||..|||||
GAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAACAAUGGC 526
527 16
57 UUCACUCAAACAAGAUCUUCUUU--CAACA-CUGAAGAAUAAGUCAGUGACCCAGAAGAC
|||.||..|..||..|||..|.| |.||| |||||..||.|...|.|.|.||.|.||.|
UUCUCUGCAGGAACUUCUGGUGUGGCUACAGCUGAAAGAUGAUGAAUUAAGCCGGCAGGC 528
529 16
59 GCAAUCCAUGGGCAAACUGU--AUUCACUCAAAC-AAGAUCUUCUUUCAACACUGAAG
|||..||.|||||.|.||.. |||.||||...| ||||||..||....|.|.|.|||
GCAGCCCGUGGGCGAUCUCCUCAUUGACUCUCUCCAAGAUCACCUCGAGAAAGUCAAG 530
531 16
60 CAGAAGACGGAAGCAU
||..|||.||||||.|
CACCAGAUGGAAGCUU 532
533 17
18 AUCACUAACACAGACAACUGUAAUGGAAA
||.|||..|.|||| |.||||..||.|.|
AUUACUCGCUCAGA-AGCUGUGUUGCAGA 534
535

17
20 GAACUUCCACCACCACCUCCCCAAAAGA
|||..||||.| |||||.|||||..|||
GAAAAUCCAAC-CCACCACCCCAUCAGA 536
537 17
22 CCACCACUCAGCCAUCA
||||||.|..||.||||
CCACCAAUGCGCUAUCA 538
539 17
23 CACCACCUCCCCAAAAGAAGAGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAAAUUAG
||.||||.|....||||| ||.|..||..|..|.|...|||||||||||
CAGCACCACUGUGAAAGA-GAUGUCGAAGAAAGCGCCCUCUGAAAUUAG 540
541 17
24 UGUGGAUUCUGAAAUUAGGAAAA
||.||||||.||||||...||||
UGGGGAUUCAGAAAUUCUAAAAA 542
543 17
25 AAACAGU---AACUACGGUGACCACAAGGGAA
||||||| ||..|.||||..||.|||..||
AAACAGUGUCAAUGAAGGUGGGCAGAAGAUAA 544
545 17
27 AAGAGGAACUUCCACCACCACCUCCCCAAAAGAAGAGGC
||.||||||||..|.|.|.|.|..||.|..|..||.|||
AAAAGGAACUUGAAACUCUAACCACCAACUACCAGUGGC 546
547 17
28 AACACAGACAACUG--UAAUGGAAACAGUAACUACGGUGACCACAAGGGAACAGAU-CCUGGUAAAGC
||..||.||||.|| |||..|||..||.|..||...|.|..||.|..|||.|.|| |||||...|||
AAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGAGC 548
549

17
29 UCCUGGUAAAGCAUGCUCAA-GAGGAACUU
||.|||...||| |..|||| |||||||||
UCAUGGAUGAGC-UAAUCAAUGAGGAACUU 550
551 17
30 AAAAGAAGAGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAAA
||.|||..|..|||..|.|...|||..||||||
AACAGAGCAUCCAGUCUGCCCAGGAGACUGAAA 552
553 17
31 AGGGAACAGAUCCUGGUAAAGCAUGCU
|.|.||||.|..|.||..|||.|.|||
AAGAAACAUAAUCAGGGGAAGGAGGCU 554
555 17
32 CUGUAAUGGAAACAGUAACUACGGUGACCACAAGG-GAACAGAUCCUGGUAAAGCAU
|||.|.||||||||...|.|..||. ||...|||. |.||||...|.|.||||.|||
CUGCAUUGGAAACAAAGAGUGUGGA-ACAGGAAGUAGUACAGUCACAGCUAAAUCAU 556
557 17
33 AGAAGAGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAAAUUAGGAAAAG
|.||.||.|.||.|...|||.|.||||||.| |||||.|
AUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGU--GGAAAUG 558
559 17
34 AGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAAAUU
|.||..|.||.|.|||||||||||.||
AUGCCUAGUAAUUUGGAUUCUGAAGUU 560
561 17
35 CACCUCCCCAAAAGAAGAG
||||||||.|..|||||||
CACCUCCCGAGCAGAAGAG 562
563

17
36 CCAAAAGAAGAGG
|.|||||||||.|
CAAAAAGAAGACG 564
565 17
37 CAGACAACUGUAAUGGAAACAGUAACUACGGUGACCAC
|||..|||| |.||||.|| ||..||||||||||
CAGCAAACU-UGAUGGCAA-----ACCGCGGUGACCAC 566
567 17
38 UGGAUUCUGAAAUU
||||..||||||||
UGGAGGCUGAAAUU 568
569 17
39 AAAGAAGAGGCAGAUUACUGUG--GAUUCUGAAAUUAGGAAAAG
|||||.|||.||..||||.... ||.||..|.||.||..||||
AAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAG 570
571 17
40 CAAAAGAAGAGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAAAU
||..|.|||||||||..|..||... |.|||||||
CAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUC-UCCUGAAAU 572
573 17
41 CAGAUCCUGGUAAAGCAUGCUCAAGAGGAA
|||||||.|.|.| |||.||.|..|.||.|
CAGAUCCAGCUCA-GCAAGCGCUGGCGGGA 574
575 17
42 AAAAGAAGAGGCAGAUUACUGUGGA
|||.||.||.|..|||.||||..||
AAACGAUGAUGGUGAUGACUGAAGA 576
577

17
44 AAGAGGCAGAUUACUGUGGAUUCUGAA
||||..||.|||.|||.|.|||..|||
AAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAA 578
579 17
46 GAAGAGGCAGAUUACUGUG
||.||.||||||.||..||
GAGGAAGCAGAUAACAUUG 580
581 17
47 GACCACAAGGG-AACAGAUCCUGGUAAAGCAUGCUCAAGAGGA
|.|||.|||.| ||.|.|..||.| |||..|.|||||||..||
GCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUG-AAAAUAAGCUCAAGCAGA 582
583 17
48 UACUGUGGAU-UCUGAAAUUAGGAA
|.||||||.| |||...||||||||
UGCUGUGGUUAUCUCCUAUUAGGAA 584
585 17
49 ACCA-CCACUCAGCCA
|||| |||||||||||
ACCAGCCACUCAGCCA 586
587 17
51 AAACAGUAACUACGGUGACCACAA
|.||.||.|||..|||||| ||||
AGACUGUUACUCUGGUGAC-ACAA 588
589 17
53 CCAUCACUAACACAGACAACUGU--AAUGGAA
||.|||..|.|..||.||||.|| ||||.||
CCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAA 590
591

17
55 CUCCCCAAAAGAAGAGGC
||.|||..|||.|.||||
CUACCCGUAAGGAAAGGC 592
593 17
57 AGCAUGCUCAAGAGGAACUUC
|.|.|.|||...|||||||||
ACCUUUCUCUGCAGGAACUUC 594
595 17
59 GUGACCACAAGGGAACA--GAUCCUGGUAAAGCAUGCUCAAGAGG
|.|.|||.||.|..||. |.|.||...||||||.|||.|.||||
GAGCCCAGAAUGUCACUCGGCUUCUACGAAAGCAGGCUGAGGAGG 596
597 17
60 UUUCACAGGCUGUCACCACCACUCAGCCAUCACU-AACAC
|.||||.|..|..|..||.|||||.|..|...|| |||||
UCUCACCGUAUAACCUCAGCACUCUGGAAGACCUGAACAC 598
599 18
43 GAAGCUGUGUUGCAGAGUCCUGAAUUUGCAAU
||||||.|.|..||| ||..||||.||||
GAAGCUCUCUCCCAG----CUUGAUUUCCAAU 600
601 18
45 GAGUCCUGAAUUUGCAAUCUUUCGGAAGGAAGGCAACU---UCUCAGACUUAAAAGAAA
||..|||||||.|||..|. .|.|.|||...||||.. |.||||||..||||.|.|
GAAGCCUGAAUCUGCGGUG--GCAGGAGGUCUGCAAACAGCUGUCAGACAGAAAAAAGA 602
603 18
54 UAAAAGAAAAAGUCAAU
|||.|||.||..|||||
UAACAGAGAAUAUCAAU 604
605

18
56 GAUGUUGAUAUAAC-UGAACUUCA
||.|||...||||| |||||||||
GACGUUUGGAUAACAUGAACUUCA 606
607 19
20 AGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCCCUGGUGGAACAGAUGGUG
|.|.||||.|.|..|||.....|..||||.||.||.|....|.||||||.|..||..||
AAUGCAGAUAGCAUCAAACAAGCCUCAGAACAACUGAACAGCCGGUGGAUCGAAUUCUG 608
609 19
22 UCAGAAAACUGCAAGA-UGCCAGCAGAUCA
||||.|.|| ||.|| |||||.|||..||
UCAGGAGAC--CAUGAGUGCCAUCAGGACA 610
611 19
23 AGCGAGAAAAAGC--UGAGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCC--CUGGUGGAACA
|||..||||.|.| |.||||.||.|..|||.||...||.||..|.|||....|||...|| |||||.||.||
AGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCUCUCCUCCCAGCUGGUUGAGCA 612
613 19
24 AUCAGCU-CAGGCCCUGGUGGAACAGAUGG-UGAA
||||..| ||..|||||..|.||..||||| ||||
AUCACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAA 614
615 19
25 AGAGCGAGAAAAAGCUGAGA-AGUUCAGAAA--ACUGCAAGA
|||||.|||....|||..|| |.||.|||.| |||..||||
AGAGCCAGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAACUCAAAGA 616
617

19
26 GCCAUAGAGCGAGAAAAAGCUGAGAAGUUC--AGAAAACUGCAAGAUGCCAGCA-GAUC-AGCUCAG-- GCCCUGGUGGA--ACAGAUGGUGAA
||||.|.|| |||.....|..|.||.|||. |||||||||.|||...||||.| |||| |.|..|| ||.|...|||| |||.|.|.||||
GCCAGAAAG- GAGGCCUUGAAGGGAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUCCAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAA 618
619 19
28 AGCUGAGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAU
|||||||.|..||....|..|||.||||
AGCUGAGGAAAUCUCUGAGGUGCUAGAU 620
621 19
29 AGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCCCUGGUGGAACAGAUGGUGAA
||||.| |||.||..||.|||.|||| |||||||||.|.|
AGAUUC--GCAUAUUGGCACAGACCCU-----AACAGAUGGCGGA 622
623 19
30 CAUAGAGCGAGAAAAAGCUGAGAAGUUCAGAAAACUG-CAAGAUGCCAGCAGAUCA
|||..|..||.||..||.|| |.||.|.|.|...|.| ||||.||...||||.|||
CAUUCAUUGACAAGCAGUUG-GCAGCUUAUAUUGCAGACAAGGUGGACGCAGCUCA 624
625 19
31 AGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAG
|.|.|.||..|||||||.|.||
ACAAGUCAUGAGAUCAGUUUAG 626
627 19
32 AGAAAACUGCAAGAUGCCAGCA
|.||||.|.|||||||.|..||
AAAAAAUUACAAGAUGUCUCCA 628
629

19
33 AGAAAAAGCUGA-GAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCU
|||||||||.|| |||..||..|||... |..||||..||...|.|||||
AGAAAAAGCAGACGGAAAAUCCCAAAGAA-CUUGAUGAAAGAGUAACAGCU 630
631 19
34 CAUAGAGCGAGAAAAAGCUG-AGAAGUUCAGAAAACUG
||.|.||..||.||.||.|| ||||.|.|...|||.||
CAGAAAGAAAGCAACAGUUGGAGAAAUGCUUGAAAUUG 632
633 19
35 AGCUGAGAAGU-UCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCCCUGGUGGAACAGAUGGUGAAUG
|.||||..||| |||.|.|..|...|||.|||...|.|.|||.|..||.|..|..|||...|.|||||.|.|
ACCUGAAGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGCCUUGAAAACAGUUUUGGGCAAGAAGGAGACGUUGGUGGAAG 634
635 19
37 GCUGAGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAG
|.|||..|.|.|||.|||.|...|||..||...|..||||
GGUGACCACUGCAGGAAAUUAGUAGAGCCCCAAAUCUCAG 636
637 19
38 AGCAGAUCAGCUCAG
|||||.|.|.|||||
AGCAGUUUAACUCAG 638
639 19
39 CAUAGA-GCGAGAAAAAGCUGAGAAGUUCAGA--AAACUGCA
||.||| |.||||||..|....|||.|..||| ||||.|||
CACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCA 640
641 19
40 CGAGAAAAAGCUGAGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCCCUGGU-GGAACAGAUGGUGAA
|.|||||...||.|..|||... |..|.|.|||||.||..||.|||.|.|||..|...||.| |||..|.||.|..||
CUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGU-AUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAA 642
643

19
41 CAGAUC-AGCUCAG---GCCCUGGUGGAACA
|||||| ||||||| ||.||||.||.|.|
CAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUGGCGGGAAA 644
645 19
42 GUGGAACAGAUGGUGAAUG
||||||||..|..|.||||
GUGGAACAACUUCUCAAUG 646
647 19
44 CAUAGAGCGAGAAAAAGCUGAGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCA
||.|.||..|.|||...||||||| ||..|||.| |||.|.||.|.|
CAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAA-UUGGGAACA-UGCUAAAUACAA 648
649 19
46 AGAAAAAGCUGAGAAGUUCA
||||||...||||.|..|||
AGAAAAGCUUGAGCAAGUCA 650
651 19
47 AGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUG--CCAGCAGAUCAGCUCAGGC
|.|||..|||||.| |||||||. |..|.|.||.||||||.||
AUAAGCCCAGAAGA--GCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGC 652
653 19
49 AGCAGAUCA-GCUCAGGCCCUGG---UGGAACAGAUGGUG
|||||.||| |||.|....|.|| |||||.||||..||
AGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGAUUUUG 654
655 19
53 GAAAAAGCUGAGAAGUUCAGAAAACUG-CAAGAUGCCAGC
|||.||||||||.||.||..|..||.| |.|||..|.|||
GAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAGCCAAGC 656
657

19
55 AGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAG
|||||.|.|.|.||||||.|....||..|||
AGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAG 658
659 19
57 GCAAGAUGCCAGCAGAUCAG
||.|..|.|||||||.||||
GCGACUUUCCAGCAGUUCAG 660
661 19
59 AACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCUCAGGCCCU
||||.|||||.|||| |.|||.|||| ||.|||
AACUUCAAGAGGCCA-CGGAUGAGCU--GGACCU 662
663 19
60 AGAAGUUCAGAAAACUGCAAGAUGCCAGCAGAUCAGCU
|.||..||||.|..|||.|||| ||.|.|.|.|||.|
AUAACCUCAGCACUCUGGAAGA--CCUGAACACCAGAU 664
665 20
21 AACCCACCACCCCAUCAGAGC-CAACAGCAAUUAAAAGUCAGUUAAAAAUU
||..||.|...|.|||||..| ||||..|||.|..|| |..|||||||||
AAGUCAACCGGCUAUCAGGUCUUCAACCUCAAAUUGAA-CGAUUAAAAAUU 666
667 20
50 ACAACAAUUGGAGC
||.||.||||||||
ACCACUAUUGGAGC 668
669 20
52 CAAUUGGAGCAGAUGACAACUACUGCUGAAAACUGGUUGAAAAUCCAACCCACCACCCCAUCA-GAGCCAACAGCAAUUA
||.|||||..|..|.|..||..||||..||||.| ||||||.|.|..|||.|| |||| |||.|.|.|.||||.|
CAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGCCCAAAAUU---UGAAAAACAAGACCAGCA----AUCAAGAGGCUAGAACAAUCA 670
671

20
58 ACUGAACAGCCGGUGGAUCGAAU
||.||.|||||..||||..||.|
ACAGAGCAGCCUUUGGAAGGACU 672
673 21
22 CAACCGGCUAUCAGG
|||...|||||||||
CAAUGCGCUAUCAGG 674
675 21
23 UCAAAGCAUAGCCCUGAAAGAGA
||..||||...|..|||||||||
UCUCAGCACCACUGUGAAAGAGA 676
677 21
24 GAUUAA-AAAUUCAAAGCAUAGCCCUGAAAGAG
||||.| ||||||.||..|.....||||||.||
GAUUCAGAAAUUCUAAAAAAGCAGCUGAAACAG 678
679 21
25 CAUUUUAAGCAA-GUCUUUUCUGAUGUGCAGGCCAGAGAGAAAGAGCUACAGACA
||.|.|||.||. |||..|...|.||.||||...|.|.||||.||...|.||.||
CAGUCUAAACAGUGUCAAUGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAAGCAGAGCCA 680
681 21
26 AGAAAGAGCUA-CAGACA
|||||||.||| ||||.|
AGAAAGAUCUAUCAGAGA 682
683 21
27 CUGAAAGAGAAAGGACAAG
|||||.|.||||.| ||||
CUGAAUGGGAAAUG-CAAG 684
685

21
28 AUUAAAAAUUCAAAGCA
|||.|||.||.|||.||
AUUUAAACUUAAAACCA 686
687 21
29 GAUUAAAAAUUCAAAGCAUAGCCC
|||...|.|||||.||.|||.|||
GAUGCGACAUUCAGAGGAUAACCC 688
689 21
30 CCUCAAAUUGAACGAUUAAAAAUUCAAAGCAUA
|||||.|||.|..||..|..|.||...|||.||
CCUCACAUUCAUUGACAAGCAGUUGGCAGCUUA 690
691 21
31 AAGUCUUUUCUGAUGUG-CAGGCCA-GAGA
||.||...||||||.|| ||.|.|| ||||
AAAUCCAAUCUGAUUUGACAAGUCAUGAGA 692
693 21
32 UGAAGUC-AACCGGCUAUCAGGUCUUCAACCUCAAAUUGAACGAUUAAAAAUUCAAAGCAUAGCCCUGAAAGA
||||||. ||..||..||.|.|.||..| |.|||.||||.|| |..||||....|..|.|.|.||| |||||
UGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGA-CGUCAGAUUGUAC-AGAAAAAGCAGACGGAAAAUCCC--AAAGA 694
695 21
33 AAAAAUUCAAAGCAUAGCCCUGAAAGA---
GAAAGGACAAGGACCCAUGUUCCUGGAUGCAGACUUUGUGGCCUUUACAAAU
|.||||.|...|.||.|.||.|.|||| ||||||| ||.|| |||| ||.|| ||||.|...||||...||||.||
AGAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGA-AAUGA---AUGU--CUUGA--CAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAU 696
697

21
34 GUGGCCUUUACAAAUCAUUUUAAGCAAG
|.||||||.| |||...||||..|||||
GAGGCCUUGA-AAACAGUUUUGGGCAAG 698
699 21
35 UUUGUGGCCUUUACAAAUCAUUUUAAG
||||..|||.||.||.|.....|||||
UUUGCAGCCAUUUCACACAGAAUUAAG 700
701 21
36 CUGAAAGAGAAAG
|||||||||.|||
CUGAAAGAGGAAG 702
703 21
39 AAAAAUUCAAAGCAUAGCCCUGAAAGAGAAAGGACA
|||.|.|||.||...||. |||||.||.||||.|
AAAGAAUCACAGAUGAGA---GAAAGCGAGAGGAAA 704
705 21
40 AGCCCUGAAAGAGAAAGGACAA
|||||.||.|. |||||||.||
AGCCCAGAGAU-GAAAGGAAAA 706
707 21
41 AAGCAUAGCCCUGAAAGAGAAAGGACAAGGACCCAUGUUCCUGGAUGCAGACUUUG
||||...|.|..||||..||.||.|.|....|.||..|||...||..|| ||||||
AAGCGCUGGCGGGAAAUUGAGAGCAAAUUUGCUCAGUUUCGAAGACUCA-ACUUUG 708
709 21
42 AGCCCUGAAAGAGAAAGGACAAGGACCCA-UGUUCCUGGAUGCAGACUUUGUGGCCUUUACAAAUCAUUUUAAGCAAG
||||||...|||....|.||||...|.|| ||.|||||....|.|...|.. ||.||||..|.|||..||||||||||
AGCCCUAUUAGAAGUGGAACAACUUCUCAAUGCUCCUGACCUCUGUGCUAA-GGACUUUGAAGAUCUCUUUAAGCAAG 710
711

21
44 ACAAGGACCCAUGUUCCUG
|.||.|||.||..||||||
AGAAAGACACAAAUUCCUG 712
713 21
46 UUACAAAUCAUUUUAA--GCAAGUCUUUUCUGAUGUGCAGGCCAGAGAGAA-AGAGCUA
||.||||....||||| |.|..|.||||.||.| ||.|||....|||.|| |..||||
UUUCAAAGAGAUUUAAAUGAAUUUGUUUUAUGGU-UGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUA 714
715 21
47 AGCCCUGAAAGAGAAAG
|||||.||| |||.|||
AGCCCAGAA-GAGCAAG 716
717 21
48 UUCAACCUCAAAUUGAA
||.||.|||||||..||
UUGAAGCUCAAAUAAAA 718
719 21
49 UGGAUGCAGACUUUGU
||||.| |||.|||||
UGGAAG-AGAUUUUGU 720
721 21
51 CCAUGUUCCUGGAUG
||||.|||||.||||
CCAUCUUCCUUGAUG 722
723 21
53 AAUUGAACGAUUAAAAAUUCAAAGCAUAGCCCUGAAAGAGAAAGGACAAG
|||..||.|.|.||..||||||..||..|.| ||.|||..||.|.|.|||
AAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGC-UGGAAGCUAAGGAAGAAG 724
725

21
55 CCCAUGUUCCUGGAUGCAGACUUUGUGGCCU---UUACAAA
|||.||..|||||| |.|.|||.|.|||| |||||.|
CCCCUGGACCUGGA---AAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGA 726
727 21
57 GAUGAAGUCAACCGGCUAUCAGGUCUU
||||||.|.|.|||||...||..|.||
GAUGAAUUAAGCCGGCAGGCACCUAUU 728
729 21
59 GGCCUUUAC-AAAUCAUUUUAAGCAAGUCUUUUCUGA
|||.|.||| |||.||...|.||.|.|||..|.||||
GGCUUCUACGAAAGCAGGCUGAGGAGGUCAAUACUGA 730
731 21
60 CCCUGAAAGAGAAAG
|.|||||||||||.|
CUCUGAAAGAGAACG 732
733 22
50 GGGUCCAGCAGUCAGAAACCAAACUC
|||...|||||.|.|| ||.|.|||
GGGCAAAGCAGCCUGA--CCUAGCUC 734
735 22
52 CACCAAUGCGCUAUCAGGAGACCAUGAGUGCC
||.||||||...||..|||....|.|.||.||
CAACAAUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCC 736
737 22
58 CGCUAUCAGGAGACCA
|.|||.||||||.|||
CUCUACCAGGAGCCCA 738
739

23
24 AAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGG
|||..||..||.|...|||||||||.||.||
AAUCACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGG 740
741 23
25 GAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGA
||.|..|.|..|||||.|..|||||.||.|
GAGACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAA 742
743 23
26 CUGAAAUUAGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAU--UGAGGGACGCUGGAAGAAG
|||.||....||.||||.|||.||||||..|..|.|||.. |||...|.|||| ||||||
CUGUAAGCCUCCAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUG-AAGAAG 744
745 23
27 CUCAGCACCACUGUGAAAGAGAUGUCGAAGA
|||.||||.|...||||.|.||..|..||||
CUCUGCACUAGGCUGAAUGGGAAAUGCAAGA 746
747 23
28 AGAGCAACAAAGUGGC
|.|||||..|||||||
AAAGCAAACAAGUGGC 748
749 23
29 AUCAAUCAG-AAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCU
||||||.|| ||.||||...|.||.|....||.||||.|.|.||
AUCAAUGAGGAACUUGAGACAUUUAAUUCUCGUUGGAGGGAACU 750
751 23
30 AAAUUG-AGGGACGCUGGAAGAAGCUC
|.|||| ||..|.|.||||.|.|||||
AUAUUGCAGACAAGGUGGACGCAGCUC 752
753

23
31 AUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGAC
|||||. ||.||||||||..||..||
AUCAGU-UUAGAAGAAAUGAAGAAAC 754
755 23
32 AGUUCUCUGCAAGAGCAACAAAGUG
|.||..|||||...|.|||||||.|
ACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGAG 756
757 23
33 AAAUUAGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAA
|||..||.|||||| |||....||||.||||.||||
AAAGCAGACGGAAA-AUCCCAAAGAACUUGAUGAAA 758
759 23
34 AAGAAAGCGCCCUCUGAAAUUA-GCCGGAAAUAU--CAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCUCUCCUCCCAGCUGGUUGAGCAUUGUCAAAAGCU//
||||||||..|...||.|...| ||..|||||.. |..|.|||.....|||.||.|||..|.|. ||..||||...||.....|..|.|.|...|.||||.||||.
AAGAAAGCAACAGUUGGAGAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCU-UGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAG---// //AGAGGAGCAAAUGAAUAAACUCCGAAAAAUU
|||..||||..||||..||..||.|..||||
//AGAUCAGCAGUUGAAGGAAUGCCUAGUAAUU 760
761 23
35 CCACUGUGAAAGAGAUGUCGAA---GAAAGCGCCCUCUGAA
|.|||...||||||||...||| |||.|.||.| |||||
CUACUCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCAC-CUGAA 762
763

23
36 ACAAAGUGGCCUAUACUAUCUCAG-CACCACUG--UGAAAGAGAUGUCGAAGAAAGCGCCCUCUGAAAUUAGCCG
|||||||||...||.|...||.|. |||...|| ||||..||| |...||||||.| ||..|..|||..||.||
ACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGA-GAAAAAGAAACC-CCAGCAAAAAGAAGACG 764
765 23
37 AUAUCAAUCAGAAUU
||.|||..|||||||
AUUUCACACAGAAUU 766
767 23
38 UUUGAAGAAAUUG
|||||||.|||||
UUUGAAGGAAUUG 768
769 23
39 AAAGCUAGAGGAGCAAAUGAAUAAAC
|||||.||||||...||.||..||||
AAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAAC 770
771 23
40 GAAAUAUCA-AUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCUCUCCUCCCA-GCU-GGUUGAGCAUUGUCAAAA
|||||.||. |||||...|...||.|...||||.|.|||| |.|.||||||...| ||| ||.||| |||||..||||
GAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUG----AUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGA-CAUUGAAAAAA 772
773

23
41 AUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACG--CUGGAAGAAGCUCUCCUCCCAGCUGGUUGAGCAUUGUCAAAAGCUAGAGGAGCAA
|.||..|||.|.|.|||.||||...||..||.| |||.|.|.||..|.....|.||||| .|.|| |||||..|.|.|.|.|..||||
AAAUUGAUCGGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAGCUG--AGGGC-UUGUCUGAGGAUGGGGCCGCAA 774
775 23
42 ACUGUGAAAGAGAUGUC-GAAGAAAGCGCCCUCUGAAAUU
||..|||..|.||||.| |||||.|. |||.|..||||||
ACGAUGAUGGUGAUGACUGAAGACAU-GCCUUUGGAAAUU 776
777 23
44 GAAAUUAGCCGGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGAC--GCUGGAAGAAGCU
||||| |.|||...|.||| |.|..||.|.||||.|||.|...|. |||...|||||||
GAAAU--GGCGGCGUUUUCA-UUAUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCU 778
779 23
46 GCUAGAGGAGCAAAUGAAUAAACUCCGAAAAAUUCA
||||||.||.||||.|||||...|...|.||.||||
GCUAGAAGAACAAAAGAAUAUCUUGUCAGAAUUUCA 780
781 23
47 GGAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGC
||||.|.||||.|| |||..|.||||.||..||||.|
GGAAUUCUCAAACA--AUUAAAUGAAACUGGAGGACCC 782
783

23
48 GAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCUCUCCUCCCAGCUGGUUGAGCAUUGUCAAAAGCUAGAGGAGCAAAUGAAUAAACUCC
|.|||||||||.| |.|....|.|||..||....| ||||.|...|..|...|.||.|.||.||.|||||..|.|||.|.||.|
GGAGAAAUUGAAG--CUCAAAUAAAAGACCUUGGGC-AGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCAUCUGC 784
785 23
49 UGUGAAAGAGAUGUCGAAGAAAGCGC
||||.|||||||.|.|...||||.||
UGUGGAAGAGAUUUUGUCUAAAGGGC 786
787 23
51 UUCUCUGCAAGAGCAA
||||||||..||.|||
UUCUCUGCUUGAUCAA 788
789 23
53 GAAAUAUCAAUCAGAAUUUGAAGAAAUUGAGGGACGCU--GGAAGAAGCU
|||||.|.|| ||.|||..|...|||.|..|||.||| ||||||||||
GAAAUGUUAA--AGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCU 790
791 23
55 UUUGAAGAAAUUGAGGGACGCUGGAAGAAGCUCUCCUCCCAGCUGGUUGAGCAUUGUCAAAAGCU-AGAGGAGCAAAUGAAUAAACUCCGAA
||.|||||||.|.|..||.....|.|..||.||.||....|.||||...||..|..|.....||| |.||.||| ||||..||||.|.||
UUGGAAGAAACUCAUAGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGC---UGAAACAACUGCCAA 792
793

23
57 UUCUCUGCAAGAGC
|||||||||.||.|
UUCUCUGCAGGAAC 794
795 23
59 CUCCUCCCAGCUGGUUGAGCAUUGUCAAAAGCUAGAGGAGCAAAUGAAUAAACUCCGAAAAAUUCA
||.|.|.|.||||..|| |||..| |||..||||.|||....|..|.|.|||||...||.||||
CUGCACUCCGCUGACUG-GCAGAG---AAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAAGACUCCAGGAACUUCA 796
797 23
60 GAAGAAAGCGC-CCUCUGAAA
|.|||||..|| |||||||||
GGAGAAAUUGCGCCUCUGAAA 798
799 24
25 AUUCAGA-AAUUCUAAAAAAGCAGCUGAAACAGUG
||||||| ||||| |...|||...||||||||
AUUCAGACAAUUC----AGCCCAGUCUAAACAGUG 800
801 24
26 UGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUG
||.|..||||||||.|..|||.|||.|
UGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAAG 802
803 24
27 UAAAAAAGCAGCU-GAAAC
||||||||.|.|| |||||
UAAAAAAGGAACUUGAAAC 804
805 24
28 ACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUU-UCUGAAG
||.||.||.|.|||||.|.||...||||.|| |.|||.|...| |||||.|
ACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGA-GCUGAGGAAAUCUCUGAGG 806
807

24
29 ACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUUUCUGAAGGAGGAA
|||.||||| ||.|.||||..|..|.|.| ||||...|..|.||.||||||
ACAGACCCU-AACAGAUGGCGGAGUCAUG--GAUGAGCUAAUCAAUGAGGAA 808
809 24
30 AAAAGCAGCUGAAACAGUGCA
|||||..|||..|||||.|||
AAAAGUUGCUUGAACAGAGCA 810
811 24
31 UGGCUGAAGUUGAUGUU
||.||.|..||||||||
UGUCUCAGAUUGAUGUU 812
813 24
32 UGAAGGAGGAAUGGCCUGCCCUUGGGGAUUCAGAAAUUCUAAAAAAGCAGCUGAAACAGU
|||||..|.|.|.||||||..| |||..||.|.|.|.|..||.||.|..|...|||||
UGAAGAUGCACUUGCCUGCAUU---GGAAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGUAGUACAGU 814
815 24
33 ACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUUUCUGAAGGAGGAAUGG
|.|.||.|.|||.|..||..|||||| ||.|| ||||||..|.|||||
AACUUGUAUAAAAGUCUGAGUGAAGU-GAAGU----CUGAAGUGGAAAUGG 816
817 24
34 GAAUGGCCUGCCCUUGGGGAUUCAGAAAUUCUAAAAA----AGCAGCUGAAACAGUGC
|||||||..||...|...|||...|||.|...|||.| |||||.||||..|.|||
GAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAUGC 818
819 24
35 AGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUUUCU--GAAGGAGGAAUGGCCU
|||||..||.|| ||.|..|||.|..|.||. ||.|.||||..|||||
AGAAACAGAAGG-UGCACCUGAAGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGCCU 820
821

24
36 AAUCACAUACAAAC
||.|||||..||||
AAACACAUGGAAAC 822
823 24
38 ACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAU------GUUUUUCUGAAGGAGGAA
|||.|.|...|.||||..|.|||| |||||||.||.|. ||...||||||.||||||
ACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGA-GGCUGAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAAAGAGGAA 824
825 24
39 UAAAAAAGCAGCUGAAACAG
|||||.||||||||..||||
UAAAACAGCAGCUGUUACAG 826
827 24
40 GAAAUGGAUGGCUGAAGUUGA
||||||..|||.|||..||||
GAAAUGCUUGGAUGACAUUGA 828
829 24
41 AAAAAGCAGCUGAAA-CAGUGC
|||.||.|||||||. ||||||
AAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGC 830
831 24
42 CAUACAAACCCUGAAGAAAUG--GAUGG
||.||...||.||||||||.| |||||
CACACUGUCCGUGAAGAAACGAUGAUGG 832
833 24
44 AUCACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAU--GUUUUUCUGAAGGA
||.|.|||.|.|...|.||..|.|||.|..|.||||.|||. ||||.||.|||.||
AUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGA 834
835

24
46 AUGGAUGGCUGAAGUUGAU
||||.|||..||||..|||
AUGGUUGGAGGAAGCAGAU 836
837 24
47 UUUCUGAAGGAGGAAUGGCC--UGCCCUUGGGGAUUCAGAAAUUCUAAAA--AAGCAGCUGAAACAGUGC
||.|||..|||.||.|.||| |||.|..|||.||||..|||...|.||| ||.|.|..|.|.|.||||
UUACUGGUGGAAGAGUUGCCCCUGCGCCAGGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGC 838
839 24
48 GAAAUUCUAAAAAAGCAGCUGAAACA
|||...||..||.|||||.|.||.||
GAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCA 840
841 24
49 CUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGAUGUUUUUCUGAAGG
||.||.||..||||| ||.|...||| |||.|||.||||
CUAAACAACCGGAUG--UGGAAGAGAU-UUUGUCUAAAGG 842
843 24
51 UGCCCUUGGGGAU-UCA--GAAAUUCUAAAAAAGCAG
||.|||||.|||| ||| ||.||..|.|..||||||
UGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAG 844
845 24
53 AAUCACAUACAAACCCUGAAGAAAUGGAUGGCUGAAGUUGA-UGUUUUUCUGAAGGA
||..||| |.||..|||..||||..||| |||...|||||| ||...|..|.|||||
AAGUACA-AGAACACCUUCAGAACCGGA-GGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGA 846
847 24
55 AGGAAUGGCCUGCCCUUGGGGAUUCAGAAAUUCUAAAAAAGCAGCUGAAACAGUG
|||||.|||. |||.|..||.||..|.....|||||.|||.|.|||||||.||
AGGAAAGGCU---CCUAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAACAAUG 848
849

24
57 UUCUGAAG-GAGGAAUGGCCUGCCCUUGGGGAUUCAGAAA-UUCUAAAAAAGC---AGCUGAAACA
||||||.. |.||||..|.||||.|.|.....|.|||.|| ||||......|| ||||||||.|
UUCUGACCAGUGGAAGCGUCUGCACCUUUCUCUGCAGGAACUUCUGGUGUGGCUACAGCUGAAAGA 850
851 24
59 UUCUAAAAAAGCAG-CUGA
|||||..||||||| ||||
UUCUACGAAAGCAGGCUGA 852
853 25
26 CUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACACUC-AGUGGGAUCACA
|||||||.|||..|. |||..|||.|||| ||..|.||.|||
CUUGAGAGAGAUUUU---GAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACA 854
855 25
27 AAAGAACUUAACACUC
||.||||||.|.||||
AAGGAACUUGAAACUC 856
857 25
29 AGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGAC-AGAACUCAAA
|.|.||||.|.|||.| ||.|||. |.|||.||||
AAAAUUUGAUGCGACA-UUCAGAGGAUAACCCAAA 858
859 25
30 GCUUCGAGACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACACUCAGU
||.||.||.||....|....|||.|||.|.|.|.|||||.|.|
GCAUCCAGUCUGCCCAGGAGACUGAAAAAUCCUUACACUUAAU 860
861 25
31 ACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACACUCAGUGGGA
|.||.||| ||||.|.||..|||.||| ||||.||.|
AGUUUAGA-AGAAAUGAAGAAACAUAA---UCAGGGGAA 862
863

25
32 UAUUCAGACAAUUCAGCCCAGUCUAAACAGUGUCAAUGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAAG
|||||. |.||..|||||.|.|.|.|.|||.|||.|. |||...|..|||.|||.....||||||
UAUUCC-AGAAACCAGCCAAUUUUGAGCAGCGUCUAC-AAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAG 864
865 25
33 UGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAAGCAGAGCCAGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAA---CUCAAAGAACUUAA
|||||..|....|..||||||||.||.|. |.|||| |||....||.|....||||.||| |.||||||||||.|
UGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGAC----GUCAGA--UUGUACAGAAAAAGCAGACGGAAAAUCCCAAAGAACUUGA 866
867 25
34 AAGAUAAAGAAUGAAGCAG
||.|.||||||.|.|.|||
AACAGAAAGAAAGCAACAG 868
869 25
35 AGGUGGGCAGAAGAUAAA
|.||.||..|||||||||
ACGUUGGUGGAAGAUAAA 870
871 25
36 GAAUGAAGCAGAGCCAGAG
|.|||||.|||||..|.||
GGAUGAAUCAGAGAAAAAG 872
873 25
37 CAGUGAUAUUCAGACAAUUCAGCCCAGUCUAAACAGUGUCAA
||..|||.|.|||.||.|||| |.|||..|.||.|.||..||
CAUCGAUUUGCAGCCAUUUCA-CACAGAAUUAAGACUGGAAA 874
875

25
38 CAGAGUUUGCUUCGAG-ACUUGAGACAGAACU
||.|..||||||..|. |||.|||.|.|||.|
CAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAU 876
877 25
39 AUUCAGACAAUUCAGCCCAGUCUAAACAGUGUCAAUG-AAGGUGGGCAGAAGAUA-AAGAAUGAAGCAGAG
||..|||||||. ||...|.|.|||| ||..|...|| ||.|.||..|.||..|| ||.||.|||.||.||
AUGAAGACAAUG-AGGGUACUGUAAA-AGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAG 878
879 25
40 AGACAGAA--CUCAAAGAACUUAACACUCAGUGGGAUCA
|||.|.|| |||.|..||.||..|| |||||||.||||
AGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCA-UCAGUGGUAUCA 880
881 25
41 GUGAUAUUCAGA-CAAUUCAGCCCAGUCUAAACAGUGUCAA
|.||.|||.||| |||.|..||.||||.|..| ||..||||
GGGAAAUUGAGAGCAAAUUUGCUCAGUUUCGA-AGACUCAA 882
883 25
42 ACAGUGUCAAUGAAGGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAAG
|||.||||..|||||....|..||.|.|.|.||.|||||
ACACUGUCCGUGAAGAAACGAUGAUGGUGAUGACUGAAG 884
885 25
44 UCUAAACAGUGUCAAUGAA-GGUGGGCAGAAGAUAAAGAAUGAAGCAGA--GCCAGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGA
|.||||.|...|.|||.|. ||....||||||.|.||.|.|....|||| |.||.|..||.|| ||||.|||.||
UAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCU--GAGAAUUGGGA 886
887 25
46 GACAGAACU-CAAAGA-ACUUAA
|.|||||.| |||||| |.||||
GUCAGAAUUUCAAAGAGAUUUAA 888
889

25
47 CAGCCCAGUCU-AAACAGUGUCAAUGAAGGUGG
|||...|.||| |||||.| |.||||||..|||
CAGGGAAUUCUCAAACAAU-UAAAUGAAACUGG 890
891 25
48 CUUGAGACAGAACUCAAAGAACUUAACACUCAGUGGGAUCACAUG
|||||.|.|.|.||..||||.|||.|....||||...||||..||
CUUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCAUCUG 892
893 25
49 CAGCCCAGUCUAAACA
|||..||..|||||||
CAGUUCAAGCUAAACA 894
895 25
51 AGUUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAACUCAAAGA
||.||.|..|..|.|||| |||||||||.|..||
AGAUUUCAACCGGGCUUG-GACAGAACUUACCGA 896
897 25
53 UCAAAGAACUUAACACUCAGUGGGAUCA
|.|||||| ||.|.|.||||||||||.|
UGAAAGAA-UUCAGAAUCAGUGGGAUGA 898
899 25
55 AGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAA-CUCAAAGAACU
|.|||||..|.|..|.||| |||||| ||.|||.||||
AAAGUUUCUUGCCUGGCUU---ACAGAAGCUGAAACAACU 900
901 25
57 AAGAUAAAGAAUGAAGCAG
|||||.|.||||.||||.|
AAGAUGAUGAAUUAAGCCG 902
903

25
59 AGAGCC-AGAGUUUGCUUCGAGACUUGAGACAGAACUCAAAGAACUU-AACACUCAGUGGGAUCACAUGUGCCAACA
|||||| |||.|.|...|||.....|..||.||.|..|..||.|..| ||.|||.|||||||..|..||..||..||
AGAGCCCAGAAUGUCACUCGGCUUCUACGAAAGCAGGCUGAGGAGGUCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGCA 904
905 26
27 AGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGA-UGAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGAUGAAG
||||.||||||||...|...|.|.|||... |||..|.|||||||..| |||.| |.|.||..|||...|.||.|.|||
AGCUAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGC-GAAAGUGAAACUCCUUACUGAGU--CUGUAAAUAGUGUCAUAGCUCAAG 906
907 26
28 UGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGAU
|||...|||.|||.||..||||||..|.||..|..|.|.....|.||.|||.||.||
UGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGAGCUGAGGAAAU 908
909 26
29 CUAUCAGA-GAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAAGAA-GAGUAUCUUGAGAGA
|||.|||| |..|.|...|||||||| |||.|..|| |||.|.|||||||.|
CUAACAGAUGGCGGAGUCAUGGAUGA-----GCUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACA 910
911 26
31 GAAAGCAGUU--GAAGAGAUGAAG
||.|.||||| |||||.||||||
GAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAG 912
913 26
32 UAUGCCAGAAAGGAGGCCUUGAAGGGAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUCCAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCAC
|||.|||||||..||.|..|...|.|..|..|..|.||.|..|||||. |......||||..|....||||||||
UAUUCCAGAAACCAGCCAAUUUUGAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGA-UGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCAC 914
915 26
33 UAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGAUGA
|||||||.||....||||.|..||...|.|||.|||..|.|||
UAUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGUGGAAAUGGUGA 916
917

26
34 AGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUG---AAGAA---GAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAA---UAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAA-AGCAGUUGAAGAGAUG
|||.||||..|||....|..|..|||.|| |||.| ||.|.||||||.|||.....||.. ||.|.|..|..|..|||...|.|||. |||||||||||..|||
AGAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAUG 918
919 26
35 GAGGCCUUGAAGGGAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUCCAGAAAGAUCUA-UCAG
|||||||||||...||.|||||..||.|..|..|...|...|.|||||..| ||||
GAGGCCUUGAAAACAGUUUUGGGCAAGAAGGAGACGUUGGUGGAAGAUAAACUCAG 920
921 26
36 AAGGGAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUC--CAGAAAG---AUCUAUCAGA--GAUGCACGAAUGGAUGACACA-AGCUGAAGAA
|.||.|..|||.||..|.|.|||...||.| ||.|||| |||..||||. ||..|||...|||||||..|| ||...|||||
AUGGAAACUUUUGACCAGAAUGUGGACCACAUCACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAA 922
923 26
37 AGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAA
|.|.|||..|.||.||||||.|.||..||
AAAGGCAGAACUGAAUGACAUACGCCCAA 924
925

26
38 UCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAAG
|||||..|.||..|||.|.|...||.|...||.|..||...||...||.|.| |||||.|.|||.. .||.||.||..|.||||
UCAGAUAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUUCAGCAGGGGG----UGAAUCUGAAAGA--GGAAGACUUCAAUAAAG 926
927 26
39 GAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAA
|.|||||....|.||.|||||||..|||.|| |||||||.|
GCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAGCUG--UUACAGACA 928
929 26
40 GAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUCCAGAAAGAUCU-AUCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAAGA
|||||.|..|..||.....|||.|||.|||||..||| |||||.|.| |..|.|..|.||..||.|||||.||
GAGGUCUCAAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGU--AUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGA 930
931 26
41 GAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGAUGAA
|||||.|||||.......||.|||.||||
GAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAA 932
933 26
42 UUUGGAGAAAACUGUAAGC
||||.|||...||.|||||
UUUGAAGAUCUCUUUAAGC 934
935

26
44 AGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCUC--CAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCACGAA-UGGAUGACACAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGA
||.|.||..||.||.||...||.|. ||..|.|||.||. |||.||..|...| |||.|.|||.||||||||.| ||.|||. |||.|||
AGAUCUGUUGAGAAAUGGCGGCGUUUUCAUUAUGAUAUAA-AGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACA---GUUUCUC-AGAAAGA 936
937 26
46 AGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUU
|.||||.|||||||..||| ||||..||.|.| |..|.|||||||
AAAAGAAUAUCUUGUCAGA-AUUUCAAAGAGA----UUUAAAUGAAUU 938
939 26
47 AUGACACAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAG--AGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGA
||.|..|.||..||..||||..|.|||||.|. ||.|...|.|.|.|||.||||||..||
AUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGGA 940
941 26
48 UCCAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAA
|||||| |.|.||.|.||||..||.|.|...|| ..|||||.||..|.|..|.||||.|. |..||||| ||||..|..||.||..|..| |.|||||||.||
UCCAGA--GCUUUACCUGAGAAACAAGGAGAAAU---UGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGC---AGCUUGAA---AAAAAGCUUGAAGACCUUGA-AGAGCAGUUAAA 942
943 26
49 CAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUAC-AGAAAGCAG
||||||.||.||..|.||.|.|| ||||||||||..||.|...|..||..||.|..|. |.|||.|||
CAAGCUAAACAACCGGAUGUGGA-AGAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAG 944
945

26
51 AUGACACAAGCUGAAGAAGAGU-AUCUUGAGAGAGAUUUUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAA
||.|||.|.|.|||.|..|.|| |.|||||| ||.||.....|.||.|...||.||..|||
AUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAG-GAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAGAA 946
947 26
53 UGAA-UAUAA-AACUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAA-GAGAUG
|||| ||.|| |||.||....|||....||..|.|||||||| ||.|||
UGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUG 948
949 26
55 GAAAGGAGGCCUUGAAGGGAGGUUUGGAGAAAACUGUAAGCCU-CCAGAAAGAUCUAUCAGAGAUGCACGAAUGGAUGACACAAGCUGAA
||.|||..||.|||.|.|.|..|... |||..||||.||...| ||.....||.||...|.||.|.|..|..|||.|.|||.||||||||
GAGAGGCUGCUUUGGAAGAAACUCAU-AGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAA 950
951 26
57 GAUGAAUUACAGAAAGCAG
||||||||| ||...||||
GAUGAAUUA-AGCCGGCAG 952
953 26
59 CAAGCUGAAGAAGAGUAUCUUGAGAGAGAUU--UUGAAUAUAAAACUCCAGAUGAAUUACAGAAAGCAGUUGAAGAGA
||.|||||.||.|...||..||||.|.||.. |||||..|..| |||| |.|||.|..||||.|..|.|.||.||||
CAGGCUGAGGAGGUCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGCA-CUCC-GCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGA 954
955 27
28 ACAAGAGGCCUUAAAAAAG--GAACUUGAAACUCUAACCAC
|||||.||| |.||..||| |||.||.||..|..||||||
ACAAGUGGC-UAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCAC 956
957

27
29 UAAAAAAGGAACUUGAAAC
|.||..||||||||||.||
UCAAUGAGGAACUUGAGAC 958
959 27
30 AGCUCAAGCUCCACCUGUAGCACA
|||||||...||.|..|.|||.||
AGCUCAAAUGCCUCAGGAAGCCCA 960
961 27
31 AAAAGAAGCGAAAGUGAAACUCCUUACUGAGUCUGUAAAUAGUGUCAUAGCUCAAGCUCCACCUGUAGCACA
|||.||| ||||...||.|.....|..|||.|||...|.||.|||.|..|||| |.|..| |||.|||||
AAAUGAA--GAAACAUAAUCAGGGGAAGGAGGCUGCCCAAAGAGUCCUGUCUCA-GAUUGA--UGUUGCACA 962
963 27
32 AGUGGCUCUGCACUAGGCUGAAUGGGAAAUGCAAGACUUUGGAA
||||....||||||.|.|||.||.|||||.. ||||.|.|||||
AGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACA-AAGAGUGUGGAA 964
965 27
33 UGUAAAUAGUGUCAUAG-CUCAAGCUCCACCUGUA--GCACAAGAGGCCUUAAAA----AAGGAACUUGA
||.||||.|||..|.|| ||..|..||....|||| |.|.|||..|.|..|||| ||.||||||||
UGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGACGUCAGAUUGUACAGAAAAAGCAGACGGAAAAUCCCAAAGAACUUGA 966
967 27
34 AAGAAGCGAAAG----UGAAACUCCUUACUGAGU
||||.||||||| ||||..||.|.||.||.|
AAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGACAGAAU 968
969 27
35 ACUGAGUCUG-UAAAUAGUGUC---AUAGCUCAAGCUCCACCUGUAGCACAAGAGGCCUUAAA
|||.|||||. |.||||||..| ||||||.. |.||.||.| ||||.|||||...|||||
ACUCAGUCUUCUGAAUAGUAACUGGAUAGCUGU--CACCUCCCG-AGCAGAAGAGUGGUUAAA 970
971

27
36 AGAGCUAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAG
||||..||||||. .||||.||||||||||
AGAGAAAAAGAAA--CCCCAGCAAAAAGAAG 972
973 27
37 AGUGUCAUAGCUCAAGC-UCCACCUGUAGC
|.|.|||.|||||||.| ||.|..||.|||
AAUCUCAGAGCUCAACCAUCGAUUUGCAGC 974
975 27
38 GGCUGAAUGGGAAAU-GCAAGACUU
||.|||||..||||. |.|||||||
GGGUGAAUCUGAAAGAGGAAGACUU 976
977 27
39 AAAGAAGAGGC--CCAACAA-AAAGAAGCGAAAGUGAAA
|||||.|||.| |..|||| ||||||.|..|..|||.|
AAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGA 978
979 27
40 AAAAAAGGAACUUGAAACU-CUAACCA
||||||||..||.||||.| ||.|.||
AAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCA 980
981 27
41 UGAAUGGGAAAUGCA
|||..|||||.||||
UGAUCGGGAAUUGCA 982
983 27
42 GAAACUCCUUACUGAGUCUGUAAAUAGUGUCAUAGCUCAAGCUCCACCUGUAGCACAAGAGGCCUUAAAAAAGGAAC
||||.|.|||| ||.|.||...|.|..|.|.| ||.||....|.|.|||..||||||.....|||.||..|||||
GAAAUUUCUUA-UGUGCCUUCUACUUAUUUGA---CUGAAAUCACUCAUGUCUCACAAGCCCUAUUAGAAGUGGAAC 984
985

27
44 UCUGUAAAUAGUGUCAUAGCUCAAGCUCCAC
|.|.|||..||||.| ||.|..|||||..||
UAUUUAAUCAGUGGC-UAACAGAAGCUGAAC 986
987 27
46 AGCUAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGCGAAAGUGAAACUC
|.||..|.|||||...||||.|||||||..|...|.|.||.||
ACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAGUC 988
989 27
47 AGAAGCGAAAGUGAAACU
|||||.|.|||..|||||
AGAAGAGCAAGAUAAACU 990
991 27
48 AGAGCUAAAGAAGAGGCCCAACAAAAA---GAAGCGAAAGUGAAACUCCUUACUGAGUCUGUAAAUA
||||||..|...|||...|||..|.|| |||||..||.|.|||..||||....||..||.|||.|
AGAGCUUUACCUGAGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGCAGCUUGAAAAAA 992
993 27
49 AGCUAAAGAAGAGGCCCAACAAAAAGAAGCGAAAGUGAAA
|.||.||..||..|..|||...|||.||.||.|.|||.||
AACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAA 994
995 27
51 UUAAAAAAGGAACUUGAAACUCUAACCACCAACUACCA
|||..||.|.||||...|.|||.||.|...||.|.|||
UUACUAAGGAAACUGCCAUCUCCAAACUAGAAAUGCCA 996
997 27
53 AGCUAAAGAAGAGGCCCAACA
||||||.|||||.||..|.||
AGCUAAGGAAGAAGCUGAGCA 998
999

27
55 ACCAACUACCAGUGGCUCUGCACUAGGCUGAAUGGGAAAUGCAAGACU
|.|||||.|||.||.| ||.||..|.||| |...|.||.|.|||.||
AACAACUGCCAAUGUC-CUACAGGAUGCU--ACCCGUAAGGAAAGGCU 1000
1001 27
57 ACCAGUGGC----UCUGCAC
||||||||. |||||||
ACCAGUGGAAGCGUCUGCAC 1002
1003 27
59 CUGCACUAGGCUGAAUGGGAAA
|||||||..|||||.|||.|.|
CUGCACUCCGCUGACUGGCAGA 1004
1005 27
60 AAGCGAAAGUGAAACUCCUUACUGA
|||.|||.||||..|.|.|.|.|||
AAGAGAACGUGAGCCACGUCAAUGA 1006
1007 28
29 AUUGUCAUACUUGGAGAAAGCA-AACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUU
|||..||||.|.|.|.|.|.|. ||||..||||..|.|.|.|.|..|..|||.|....|...|||..|.|||||
AUUCGCAUAUUGGCACAGACCCUAACAGAUGGCGGAGUCAUGGAUGAGCUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACAUU 1008
1009 28
30 GUUGGCAUGAGUUAUUGUCAUACUUGGAGAAAGCAAA-CAAGUGGCUAA
|||||||.....||||| ||.||..||.|.|.|||.. |||.||.||.|
GUUGGCAGCUUAUAUUG-CAGACAAGGUGGACGCAGCUCAAAUGCCUCA 1010
1011 28
31 AAAUGAAGUAGAAU
||||||||.|..||
AAAUGAAGAAACAU 1012
1013

28
32 AGAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACA
||||||.||. |.|....||.||||||| |||..|..||||.....||.||.|||||
AGAAAGUAAG-AUGAUUUUAGAUGAAGU-GAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACA 1014
1015 28
33 ACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAA
|.||..|.||.|.||||||..|.|.|.||.|..|||
AUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGUGGAAA 1016
1017 28
34 AGAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUG
||||||||| ||..|||..|||||
AGAAAGCAA-CAGUUGGAGAAAUG 1018
1019 28
35 AGCAAACAAGUGGCUAAAU
||||.|..|||||.|||||
AGCAGAAGAGUGGUUAAAU 1020
1021 28
36 GAGAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAA
||||||...||......||.|||.||||..|...||||
GAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAGACGUGCUUAA 1022
1023 28
37 AGAAUUUAAACUUAAAA
||||||.|.|||..|||
AGAAUUAAGACUGGAAA 1024
1025 28
38 CUAAAUGAAGUAGAAUUUAA
||.||.||.|.|||.||.||
CUGAAAGAGGAAGACUUCAA 1026
1027

28
39 AAACAAGUG--GCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGA
|||.||.|| ||.||..|.||...|.||..|||..|.||.|||.||
AAAGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAGA 1028
1029 28
40 GGCUAAAUGAAGUAGAA------UUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGA--GCUGAGGAAAUCUCUGAGGUGCUAG
|.||.||.||||.|.|| |..|||.||...|.||.||..|.||.|.|..|.||. |||||.||..|| ||||..||||.|
GUCUCAAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUC-CUGAAAUGCUUG 1030
1031 28
41 CUGAAAACAUUCC-UGGCGGAGCUGAGGAAAUCUCUGAGG
|||||..||.|.| |.|...||||||||...|.|||||||
CUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAGCUGAGGGCUUGUCUGAGG 1032
1033 28
42 CUGAGGAAAUCUCUGAGGUGC
||..||||||.|||.|.||||
CUUUGGAAAUUUCUUAUGUGC 1034
1035 28
44 GUUUGGGCAUGUUGGCAUGAGUUAUUGUCAUACUUGGAGAAAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUG
|||..|..|||..|||.|.. |.|||.|.||| |..|||.|...||..|||||||||..||||..|||......||.|.||..||..|| |||||||
GUUGAGAAAUGGCGGCGUUU-UCAUUAUGAUA--UAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAA---AUUCCUG 1036
1037

28
46 AUGAGUUAUUGUCAUACUUGGAGAAAGCAAACAAG-UGGCUA
||||.||..|.|.||..||||||.|||||.|.||. |.||||
AUGAAUUUGUUUUAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUA 1038
1039 28
47 AAGCAAACAAGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAA
||||..|.|||.| |.|.||.||.|.|||..|||.||.||
AAGCCCAGAAGAG-CAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAA 1040
1041 28
48 AAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGAGCU-GAGGAAAUCUCUGAGGUGCUAGA
||..|||.||||.||.||..|.|||. ||||.| |||.|.|.|||| ||..|||....|||.|..||.||
AAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAU-----AAAAGA--CCUUGGGCAGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGA 1042
1043 28
49 AAAUGAAGUAGAAUUUAAACUUAAA
||.||||.|||.|.||.||..||||
AACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAA 1044
1045 28
51 CUUGGAGAAAGCAAACA-AGUGGCUAAAUGAAGUAGAAUUUAAACU-UAAAACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGAGCU-GAGGAAAUCUCUGAGGUGCU
||||||.|.|.|..||. |.|||||...|....|.|| |.||..| |||||.|||.||......|..|||..||.|| |||||.|||...|||.||.|
CUUGGACAGAACUUACCGACUGGCUUUCUCUGCUUGA--UCAAGUUAUAAAAUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAU 1046
1047 28
53 AGUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGAAAACAUUC-CUGGCGGAGCUGAGGAAAUCUCUGAG
|||.||||. |||..|.|||..|.|.||.|||.|. |||| .||||.|||||....|||||
AGUUGAAUG-AAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGG--AAGCUAAGGAAGAAGCUGAG 1048
1049

28
55 AAACUUAAA-ACCACUGAAAACAUUCCUGGCGGAGCUGAGGAAAUCUCU
|||||.|.| |..||||.||...||||....|||.|||...||.|.|||
AAACUCAUAGAUUACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCU 1050
1051 28
57 GCUAAAUGAAGUAGAAUUUA
|||.||.||.|..|||||.|
GCUGAAAGAUGAUGAAUUAA 1052
1053 28
59 GUAGAAUUUAAACUUAAAACCACUGA
|.|.||||.||.||..|..||.||||
GAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGA 1054
1055 29
30 CUUGAAAAUUUGAUGCGACAUUCAGAGGAUAACCCAAAUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACCCUAACA
||||||.|....||.|....|.|..||||.|....|||.....|.|.|.||.|.....||.||||.|||
CUUGAACAGAGCAUCCAGUCUGCCCAGGAGACUGAAAAAUCCUUACACUUAAUCCAGGAGUCCCUCACA 1056
1057 29
31 AGUCAUG-GAUGAGCU---AAUCAAUGAGGAA
||||||| |||.||.| ||..|||||.|||
AGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAA 1058
1059 29
32 ACAUUCAGAGGAUAACCCAAAUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACC
|.|.|.|.|.|||..|.|.|...||.||||..||||. ||.|.|||
AAAAUUACAAGAUGUCUCCAUGAAGUUUCGAUUAUUC-CAGAAACC 1060
1061 29
33 AAAAUUUGAUGCGACAUUCAGAG
|.||.||||||..|.|.|.|.||
AGAACUUGAUGAAAGAGUAACAG 1062
1063

29
34 CAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACCCUAACAGAUGGCGGAGU
|||||..|.| ||||.||.|||....|.|||.||..|||.|
CAGAUAUGGA-AUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAU 1064
1065 29
35 AACAGAUGGCGGAGUCAUGGAUGAGCUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACAUUUAA
||||||.||.|.| |.|| |.||| .||||..||||.|...|||.|.||.||
AACAGAAGGUGCA--CCUG-AAGAG--UAUCACAGAGGUAGGAGAGGCCUUGAA 1066
1067 29
36 CACUUGAAAA--UUUGAUGCGACAUUCAGAGGAUAACCCAAAUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACCCUAACAGAUG
|||.||.||| |||||...|| ||...||..|.|.|.||||...||| |||...|||..|.||.||....||||
CACAUGGAAACUUUUGACCAGA-AUGUGGACCACAUCACAAAGUGGAU---CAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUG 1068
1069 29
37 GCAUAUUGGCACAGACCCUAA-CAGAUGGCGGAGUCAUGGAUGAGC
|.|.|||.|.|.||.|||.|| |..|..||..|..|||.|||..||
GGAAAUUAGUAGAGCCCCAAAUCUCAGAGCUCAACCAUCGAUUUGC 1070
1071 29
38 AGGAACUUGAGACAUUUAAUUC
|||||.|.|||...|||||.||
AGGAAUUGGAGCAGUUUAACUC 1072
1073 29
39 GAGUCAUGGAUGAGCUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACA
||.|||..||||||..||.....||||||.|..|||.|
GAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUA 1074
1075 29
40 UCACUUGAAAA--UUUGAUGCGACAUUCAGA
||.|.|||||. ||.||| ||||||.|.|
UCUCCUGAAAUGCUUGGAU--GACAUUGAAA 1076
1077

29
41 ACCCAAAUCAGAUUC
|.||||.||||||.|
AGCCAACUCAGAUCC 1078
1079 29
42 CACAGACCCUAACAGAUG
||||..|||||..|||.|
CACAAGCCCUAUUAGAAG 1080
1081 29
44 AUUCAGAGGAUAACCCAA----AUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGAC-CCUAACAGAUGG
|.||||.||.||||..|| |.|||.|||.||.|..|.||||.|. |||.|.|..|||
AAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGG 1082
1083 29
46 GAUGAGCUAAUCAAUGAGGAACUUGAGACAUUUAA
||..|||.|.|.||.||..|.||||||..|.|.||
GAGCAGCAACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAGUCAA 1084
1085 29
47 ACUUGAAAAUUUGAU---GC-GACA----UUCAGAGGAUAA
||||||||||..|.| || |||| |.|||.||||||
ACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGGAUAA 1086
1087 29
48 UCACUUGAAAAUUU
|||.|||.||||||
UCAGUUGGAAAUUU 1088
1089 29
49 AGCUAAUCAAUGAGGAACUUGA-GACAUUU
||||||.|||.. |||..|.|| ||.||||
AGCUAAACAACC-GGAUGUGGAAGAGAUUU 1090
1091

29
51 AACUUGAGA---CAU-UUAAUUCUCGUUGGAGGGAACUAC
||||.||.| ||| ||..||...||||||||.|.||.|
AACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGC 1092
1093 29
53 UUGAGACAUUUAAUUCUCGUUGGAGGGAACUACAUGAAGA
||||.|.|.||.|...||..|||...|||.||||.|||.|
UUGAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACA 1094
1095 29
55 CUUGAAAA-UUUGAUGC--GACAUUCAGAGGAUAACCCAAAUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACCC-UAACAGAUGGC
||.||||| |||..||| |.|.|.||||.|.|.|..|||.|...|.|..|.||..||.....|||| |||...|.|||
CUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGC 1096
1097 29
57 AUUUGAUGCGACAUUC
|||.||.|||||.|||
AUUGGAGGCGACUUUC 1098
1099 29
59 GAAAAUUUGAUGCGACAUUCAGAGGAUAACCC----AAAUCAGAUUCGCAUAUUGGCACAGACCCUAACAGAUGGCGGAGUC-AUGGAUGAGCU
|||||.||||..|..||.||.|..||....|. |||..||||..|....||| |.||||.|.|..|..|....|||.| |.|||||||||
GAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUG--AAAGACUCCAGGAACUUCAAGAGGCCACGGAUGAGCU 1100
1101 30
31 UAAGGAGGCAAAAGUUGCUUGAACAGAGCAUCCAGUCU
|||..|||..||.|..||| |..||.||..|||.||||
UAAUCAGGGGAAGGAGGCU-GCCCAAAGAGUCCUGUCU 1102
1103

30
32 ACAAGCAGUUGGCAGCUUAUAUUGCAGACAAGGUG
|.|.|||.|||.|.|| ||||.|.||||.|.|
AGAUGCACUUGCCUGC----AUUGGAAACAAAGAG 1104
1105 30
33 AGGAGACUGAAAAAUCCUUACA-CUUAAUCCAGGAGUCCC-----UCACAUUCAUUGACAAGCAGUUGGCAGC
||.||||.|||||..||..|.| |||.||..|.||||..| |.|.|||...|.|.||..||.|||.|||
AGCAGACGGAAAAUCCCAAAGAACUUGAUGAAAGAGUAACAGCUUUGAAAUUGCAUUAUAAUGAGCUGGGAGC 1106
1107 30
34 UUGACA-AGCAGUUGGCAGCUU---AUAUUGCA--GACAAGGUGGAC-GCAGCUCAA---AUGCCU
|||||| |...|.||||||||. ||||.|.| |||||.|.|..| ||||.|.|| ||||||
UUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAUGCCU 1108
1109 30
35 GUAAGGAGGCAAAAGUUGCUUGAACAGAGCAUCCAGUCUGCCCAGGAG--ACUGAAAA
|.|||.||| |.|.||||.|.|||.|.|. |..||||||.|..|..|| ||||.|.|
GCAAGAAGG-AGACGUUGGUGGAAGAUAA-ACUCAGUCUUCUGAAUAGUAACUGGAUA 1110
1111 30
36 ACAAGCAGUUGGCAGCUUAUAUUGCAGACAAGGUGGACG-CAGCUCAAA-UGCCUCA
|.||.||..|||.|.||| |||...|.||.||||||. ||.|.|||| ||..|||
AGAAACACAUGGAAACUU---UUGACCAGAAUGUGGACCACAUCACAAAGUGGAUCA 1112
1113 30
37 CAAAAGUUGCUUGAAC
|||||.||||||||||
CAAAAAUUGCUUGAAC 1114
1115 30
38 CAGCUUAUAUUGCAGACAA
||||...|.||.|||||||
CAGCAGCUGUUACAGACAA 1116
1117

30
39 CAGCUUAUAUUGCAGACAA
||||...|.||.|||||||
CAGCAGCUGUUACAGACAA 1116
1117 30
40 CAUUGACAAGCAGUUGGC-AGCUUA
||||||.||..|.||.|| |||.||
CAUUGAAAAAAAAUUAGCCAGCCUA 1118
1119 30
41 GUGGACGCAGCUCAAAUGC--CUCAGGAAGCCCAG
|||||..||.||||.||.| |||||.||||.|.|
GUGGAGCCAACUCAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUG 1120
1121 30
42 CCAGUCUGCCCAGGAGACUGAAAAAUCCUUACACUUAAUCCAGGAGUCCCUCA
||..|.|||..||||...||||.|...|||..|...|. |||||||.||.|
CCUCUGUGCUAAGGACUUUGAAGAUCUCUUUAAGCAAG---AGGAGUCUCUGA 1122
1123 30
44 CUCAAAUGCCUCAGGA
|.|||||.|||.||.|
CACAAAUUCCUGAGAA 1124
1125 30
46 CUUGAACAGAGCAUCCAGU
||.|||.||||||.|.|.|
CUGGAAAAGAGCAGCAACU 1126
1127 30
47 UGCUUGAACAGAGCAUCCAGUCUGCCCAGGAGACUGAAAAAUCCUUACACUUAA--UCCAGGAGUC
||||||.| ||.|| |||..|..||||||.|||...|.|.|..|||..|..||| ||.||.||.|
UGCUUGUA-AGUGC-UCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGAC 1128
1129

30
48 AUUGACAAGCAGUUGGCAGCUUAUA
|||...||.|||||||.|..|||||
AUUAGGAAUCAGUUGGAAAUUUAUA 1130
1131 30
49 UGUAAGGAGGCAAAAGUUG--CUUGAACAGAGCAUCCAGUCUGCC
|.|||.| ||||..|.||| |..|.|.|.|.||.|||.||.|||
UCUAAAG-GGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAGCCACUCAGCC 1132
1133 30
51 GCUUGAACAGAGCAUCCAGUCUGCC
|||||.|||||.|.|.|.|.|||.|
GCUUGGACAGAACUUACCGACUGGC 1134
1135 30
53 GGAGGCAAAAGUUGCUUGAA
||||||||.|||||..||||
GGAGGCAACAGUUGAAUGAA 1136
1137 30
55 GCAAAAGUUGCUUG
|.|||||||.||||
GGAAAAGUUUCUUG 1138
1139 30
57 AAAAAUCCUUACA
|||||||||.|.|
AAAAAUCCUGAGA 1140
1141 30
59 UGAACAGAGCAUCCAGUCUGCCC
|||.||..|.||||.|.|.||||
UGAUCAAGGGAUCCUGGCAGCCC 1142
1143

30
60 UGACAAGCAGUUGGCAGCUUAU
|||..|.|||.|||.|||||.|
UGAACACCAGAUGGAAGCUUCU 1144
1145 31
32 ACAAGUCA-UGAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAAACA
|||||..| |.||||.|.||||||.|||.||||||..||
ACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCA 1146
1147 31
33 AAGUCAUGAGAUCAGUUU--AGAAGAAAUGAAGAAACAUAAUCAGGGGAAGGAGGCUGCCCAAAGAGU
|||.|..||..||||.|| |.|..|||.|.|||...|.||||. .||.||...||...|||||||
AAGACUGGACGUCAGAUUGUACAGAAAAAGCAGACGGAAAAUCC---CAAAGAACUUGAUGAAAGAGU 1148
1149 31
34 GAUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUU-UAGAAGAAAUG
||.|||||| |.||||||||.. |.||||.||||
GAAUUGACA----AAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAUG 1150
1151 31
35 AGAAGAAAUGAAGAAACAUAA
|.||||.||..|||||||.||
AAAAGAGAUUGAGAAACAGAA 1152
1153 31
36 UUUAGAAGAAAUGAAGAAACAUAAUC
|||.||.|||....|||||.|.||.|
UUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAAC 1154
1155 31
37 CAAUCUGAUUUGACAAGU-CAUGAGAUCAGUUUAG
|||.|.|...||||.|.| ||.||.||.|||..||
CAAACCGCGGUGACCACUGCAGGAAAUUAGUAGAG 1156
1157

31
38 UCCAAUCUGAUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAAACAU
||||.|| .|||| |||..||..||.|||||||....|.||..|.|||.||
UCCAUUC--CUUUG--AAGGAAUUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAU 1158
1159 31
39 AUGAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAAACAUAAUCAG
||||||..|....|||.|||||.||||.|.|..|.|||
AUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAG 1160
1161 31
40 UCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAAAU-GAAGAAACAUAAUC
||.|||.|| |.||.||.||.|| |||.|||.||.|.|
UCCUGAAAU--GCUUGGAUGACAUUGAAAAAAAAUUAGC 1162
1163 31
41 AUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGA
|.||||.|....||..|.|||||||.|||||
AAUUGAGAGCAAAUUUGCUCAGUUUCGAAGA 1164
1165 31
42 GAAGAAAUGAAGA
|||||||.||.||
GAAGAAACGAUGA 1166
1167 31
44 AAGAAAUGAAGAAACAUAAUCAGGGG---AAGGAGGCUGCCCA
|.||.||.||||.|..|||||||.|| |..||.||||..||
AUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACA 1168
1169 31
46 UAGAAGAAAUGAAGAA
||||||||...|||||
UAGAAGAACAAAAGAA 1170
1171

31
47 AAGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGAAACAU---AAUCAGGGGAAGGAGGC
||||..|...||.||...||||||.....|.||||.| |||.||...|||.||.|
AAGUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGAC 1172
1173 31
48 AAAUCCAAUCUGAUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAAA---UGAAGA
||||..||.||.|..|.|.|...|.||.| |||.||..||.||| ||||||
AAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGG--CAGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGA 1174
1175 31
49 GGGGAAG-GAGGCUGCCCAAAGAG
|.||||| ||...||.|.||||.|
GUGGAAGAGAUUUUGUCUAAAGGG 1176
1177 31
51 UCUGAUUUGACAAGUCAUGAGAUCA
||||.||...|||||.||.|.||||
UCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCA 1178
1179 31
53 GGAAGGAGGCUGCCCAAAGAGU
|||||||||.|.||.|.|.|||
GGAAGGAGGGUCCCUAUACAGU 1180
1181 31
55 UAGAAGAAAUGAAGAAACA
||.||||..|||.||||||
UAAAAGAGCUGAUGAAACA 1182
1183 31
57 AUUUGACAAGUCAUGAGAUCAGUUUAGAAGAA
|||.||...|.|.|...|.|||||.|||||.|
AUUGGAGGCGACUUUCCAGCAGUUCAGAAGCA 1184
1185

31
59 UAAUCAGGGGAAGGAGGCUGCCC
|.||||.||||....|||.||||
UGAUCAAGGGAUCCUGGCAGCCC 1186
1187 31
60 AUCAGUUUAGAAGAAAUGAAGA
|.||.|.|.|||||..||||.|
AGCACUCUGGAAGACCUGAACA 1188
1189 32
33 UGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGUAGUACAGUCACAGC
||||||||||....|..|| |.|.|||..|.|||||.||. ||...|..|.||||||..|.|||
UGAAGUGAAGUCUGAAGUG---GAAAUGGUGAUAAAGACUGG---ACGUCAGAUUGUACAGAAAAAGC 1190
1191 32
34 GUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAU---UGGAAACAAAGAGUGUGGAA
|||||||| ..|.|.|||.||||..| ||||.|.|.|| |||.|.|.|....|.|||||
GUAAGAUG---CGAAAGGAAAUGAAUGU---CUUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAA 1192
1193 32
35 AAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGU
|||.|.|||.||.|.|||||.|.||
AAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGU 1194
1195 32
36 AUUCCAGAAAC-CAGCCAA-- UUUUGAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGA
||.|||||||| ||...|| ||||||.|||..|.|..|..|.|..|..|.|....|...|.|.|...|.|..|..|||..||.||..||.|.|||||
AUACCAGAAACACAUGGAAACUUUUGACCAGAAUGUGGACCACAUCACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGA 1196
1197

32
37 UCACAGCUAAAUCAUUG
|||.||||.||.|||.|
UCAGAGCUCAACCAUCG 1198
1199 32
38 GAGUGUGGAACAGGAAG
||.|.||.||.||||||
GAAUCUGAAAGAGGAAG 1200
1201 32
39 GGAAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGUAGUACAGUCACAGCUAAAU
|||||.||||| |..|||||.|..|..|||||.||.|.|..|||
GGAAAUAAAGA---UAAAACAGCAGCUGUUACAGACAAAACAUAAU 1202
1203 32
40 UACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUG-CAUUGGAAACAAA
|||||||. |.|.|.|||| |||....|||| |||| |||..|| |||||.|||.|||
UACAAGAG-GCAGGCUGAU----GAUCUCCUGAA-AUGC--UUGGAUGACAUUGAAAAAAAA 1204
1205 32
41 GCAUUGGAAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGUAGUAC--AGUCACAGCUAAAUCAUUGUGUG
|.||||.|.|..||||..|.|||.|.|.|.|.|||.| ||.|| ||||.|....||||.||
GAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCA-AGCUGAGGGCUUGUCUG 1206
1207 32
42 AAGUAA-GAUGAUUUUAGAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAA
|||.|| ||||||..| |||||. |||||| |.||||| |||||||
AAGAAACGAUGAUGGU-GAUGAC-UGAAGA----CAUGCCU---UUGGAAA 1208
1209

32
44 GUUUCGAUUAUUCCAGAAACCAGCCAAUUUUGAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAU GAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGC--AUUGGAAACA
||||..|||||...|.|||. |..|||.|.|||.|.|||..||||..| ||..|.|||....||| |||..||..|.||||. |||||.||||
GUUUUCAUUAUGAUAUAAAG-----AUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAAGCU--GAACAGUUUCUCAGAA----AGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACA 1210
1211 32
46 AUGAAGUUUCGAUUAUUCCAGA--AACCAGCCAAUUUUGAGCAGCGUCUACAAGAAA
||.|..||.|.|.|||.|||.. ||||.|..||. |||||||..|||.||||||
AUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAA---GAGCAGCAACUAAAAGAAA 1212
1213 32
47 GAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGAUGA
|||||...|..||..||||.||||.|.|
GAGCAAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCA 1214
1215 32
48 AGAAAGUAAGAUGAUUUUA-GAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGAGUGUGGAACAGGAAGUAGUACAGUCACAGCUAAAUCAU
|||||..|.||..|.||.| |.|.||.|.|| |..|..|.|.|.|| |.||||.||||..||..||.|..|||| || |||.||||||||
AGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAA-AGACCUUGGGCAGC--UUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGAAG-AG--------CAGUUAAAUCAU 1216
1217 32
49 AGAAACCAGCCAAU
|.||||||||||.|
AAAAACCAGCCACU 1218
1219

32
51 UUGAGCAGCGUCUACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGAAGU-GAAGAU
||||.||...|.||.||..|...|.|.||||..|.|.|||..| ||.|||
UUGAUCAAGUUAUAAAAUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAU 1220
1221 32
53 UGGAAACAAAG--AGU-GUGGAACAGGAAGUAGUACAGUC-ACAGCUAA
|||||.|.||| ||. |..||.||||...|||.||||.| |.|||.||
UGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAGCCAA 1222
1223 32
55 CAGAAACCA--GCCAAUUUUGAGCAGCGU-CUACAAGAAAGUAAGAUGAUUUUAGAUGA
|.|||||.| ||||||.|....|||..| ||||..|.|||.|| |.|.|..||||.||
CUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAA-AGGCUCCUAGAAGA 1224
1225 32
57 AGCCAAUUUUGAGCAGCG
|||||.||.|||.|||.|
AGCCAGUUCUGACCAGUG 1226
1227 32
59 GAUGAAGUGAAGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGA
||..||.||||..||||||...|||..|.|.|.|.|||.|
GAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAA 1228
1229 32
60 AGAUGCACUUGCCUGCAUUGGAAACAAAGAGUGUGGAAC
||..|.|.|||| ||.|..||||.|.|..|||.|..||
AGGAGAAAUUGC--GCCUCUGAAAGAGAACGUGAGCCAC 1230
1231 33
34 ACUUGUAUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGUGG
|.|||.|..||.|.|| |||.|..||.|.||||||||.|
AGUUGAAGGAAUGCCU-AGUAAUUUGGAUUCUGAAGUUG 1232
1233

33
35 AAUCCCAAAGAACUUGAUGAAAGAGUAACAGCUUUGAAAUUGCAUUAUAAUGAGCUGGGAG
|.||..|||||..|||| ||||.||.|...||.....||..|.||.|.| |||.|.||||
ACUCAAAAAGAGAUUGA-GAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUAUCACA--GAGGUAGGAG 1234
1235 33
38 AGCAGACGGAAAAUCCCAAAGA-----ACUUGAUGAAAGA
|||||..||..||||..||||| ||||.|..|||||
AGCAGGGGGUGAAUCUGAAAGAGGAAGACUUCAAUAAAGA 1236
1237 33
39 AACUUGUAUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGACGUCAGAUUGUACAGAAAAAGCAGA
|||||..|..||||..|.|..||.|.||.......||.||||||...|||||| ||..|||.|..||||||.|||.||.|
AACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAA------ACAGCAGCUGUUACAGACAAAACAUA 1238
1239 33
40 GAAGUGAAGUCUGAA-GUGGAAAU--GGUGAUAAAGACUGGACGUCAGAUUGUA-CAGAAAAAG---CAGACGGAAAAUCCC---AAAGAACUUGAUGAAAGAGUAACA
||..|||.||||.|| |..||||. ||...||.|.|.|...|.|||| |.||| |||.|.||| |||.|.||..|||.| |||....|.|||||.|..|.||.|
GAUUUGAGGUCUCAAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAG-UGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAAA 1240
1241 33
41 UCAGAUU--GUACAGAAAAAGCAGACGGAAAAU
||||||. |..|||.||..||.|.|||.||||
UCAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUGGCGGGAAAU 1242
1243

33
42 UGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGA
|||||.....|||.||.|.|.|||||.|
UGAAGAAACGAUGAUGGUGAUGACUGAA 1244
1245 33
44 AAAGA-ACUUGAUGAAAGAGUAACAG
||||| |.||.||.|..|..||||||
AAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAG 1246
1247 33
46 AACUUGUAUAAAAGUCUGAGUGAAGUGAAG
||||...|.|||||..||||. ||||.|||
AACUAAAAGAAAAGCUUGAGC-AAGUCAAG 1248
1249 33
47 GGAAAAUCCCAAAGAACUUGAUGAAA---GAGUAACAGCU-UUGAAAUUGC
||.||.||.||||.||.|..|||||| |||.|.|.|.. |||.||.|||
GGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUUGUAAGUGC 1250
1251 33
48 AAAAUCCCAAAGAACUUGAUGA
||||.|...||||.|||||.||
AAAAGCUUGAAGACCUUGAAGA 1252
1253 33
49 CUGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAGACUGGACGUCAGA--UUGUACA--GAAAAAGCAGAC
|.||.|||||| |.|||...|.||..|.|.|||. ||||||| ||||||.|||.|
CGGAUGUGGAA---GAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAGCC 1254
1255 33
51 CAGACGGAAAAUCCCAAAGAACUUGAUGAAAGAG-UAACAGCUUUG--AAAUUGCA
||.||...||||.|||.....|||||||...||| ||.|.|||.|| |.|||.||
CAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGCUCUGGCAGAUUUCA 1256
1257

33
53 AGAACUUGAUGAAAGAGU---AACAGCUUUGAAAU--UGCAUUAUAAUGAGCUGGGAGCAAAG
|||||..||.|.||.||| |..|..|.|.|||. |.||..|.|||| |||||.|||.|||
AGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUG-GCUGGAAGCUAAG 1258
1259 33
55 AAAGAACUUGAUGAAAGAGUAACA
|||||.|| |||||||.|.|..||
AAAGAGCU-GAUGAAACAAUGGCA 1260
1261 33
57 GAAGUGAAGUCUGA--AGUGGAA
||||..|..||||| |||||||
GAAGCCAGUUCUGACCAGUGGAA 1262
1263 33
59 AGUCUGAGUGAAGUGAAGUCUGAAGUGGAAAUGGUGAUAAAG-ACUGGACGUCAGAUUGU-ACAGAAAAAGC----AGACG---GAAAAUCCCAAAGAACUUGAUGA
||.||||| ||.||.||..||||...|||||...|||....| ||| |..|.||.||. |.|||||||.. ||||. ||||..|.|.|.||||||.|.||
AGGCUGAG-GAGGUCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGCACU---CCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAAGACUCCAGGAACUUCAAGA 1264
1265 33
60 CAAAGAACUUGAU-GAAAGAGUAACAGCUUUGAAAUU
|||.||.||||.| |..||..||.||..||.|..|||
CAAUGACCUUGCUCGCCAGCUUACCACUUUGGGCAUU 1266
1267 34
35 GCUACAGAUAUGGA-AUUGACAAAGAGAUCA-GCAGUUGAAG
|||||..|.|..|| |||||.|||.|||... |||..|||||
GCUACUCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAG 1268
1269

34
36 GAAAGGAAAUGAAUGUCUUGAC-AGAAUG
||||...|..|||..|.||||| ||||||
GAAACACAUGGAAACUUUUGACCAGAAUG 1270
1271 34
37 GAAAUGAAUGUCUUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACA
|||.||||||.|.|......|..|.|||...|||||
GAACUGAAUGACAUACGCCCAAAGGUGGACUCUACA 1272
1273 34
38 AGAAAUGCUUGAA--AUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUG
|.||.|||||||| |.||.....|.|.||.|...|||...|||||.|... |.||.|.|.||...| ||.|||||||
AAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAA-AGAGGAAGACUUCAA--UAAAGAUAUG 1274
1275 34
39 AAGGAAAUGAAUGUCUUG-ACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGAAUGC
|||..|||||..||..|| |.|..|....|.|||...|..............||||||| |||| |||.|||..|||.||
AAGACAAUGAGGGUACUGUAAAAGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGA-AUCA-CAGAUGAGAGAAAGC 1276
1277 34
41 GAUAUGGAAUUGACAAAGAG--AUCAGCAGUUGAAGGAA-UGCCUAG
|||..|||||||...||||. |..||.||.||||.|.| |||.|||
GAUCGGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAG 1278
1279 34
42 AAAUUGUCCCGUAAGAUGCGA--AAGGAAAUGAAUG
|.|.|||||...||||..||| |.||..||||.||
ACACUGUCCGUGAAGAAACGAUGAUGGUGAUGACUG 1280
1281 34
44 AGAAAUGCUUGA-AAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGA
|.||||.|.||| ||||| |.||.||||.|||...||....|.||||.|
ACAAAUUCCUGAGAAUUG----GGAACAUGCUAAAUACAAAUGGUAUCUUAA 1282
1283

34
46 AAAUGAAUGUCUUGACAGAAU
|||.||||.|||||.||||||
AAAAGAAUAUCUUGUCAGAAU 1284
1285 34
47 AAAGCAACAGUUGGAGAAAUGCUUGAAAUUG-UCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCUUGACAGAAUGG-CUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAG
||.|.|||.|..|||....||||||.||.|| ||||.||||....|||..|.|| ||....|||||.|..|.|. |..|||| |||.||.|....|.||.||||
AAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUUGUAAGUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAA-GAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAG--ACAAAUCUCCAGUGGAUAAAG 1286
1287 34
48 UUGGAGAAAUGCUUGAA
|||.|.|||.|||||||
UUGAAAAAAAGCUUGAA 1288
1289 34
49 CAGAUAUGGAA------UUGACAAAGAGAUCAGCAGUUG---AAGGAAUGCCUAGUAAUUUGGAUUCUGAAG
|.|||.||||| |||.|.|| ||..|||||.||| ||||||...|.||..|.|..|....|||||
CGGAUGUGGAAGAGAUUUUGUCUAA-AGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAGCCACUCAGCCAGUGAAG 1290
1291 34
51 AGGAAUGCCUAGUAAUUUGGAUUCUGAAGUUGCCUG
||.||||||...|...||| ||..||.||.|.||||
AGAAAUGCCAUCUUCCUUG-AUGUUGGAGGUACCUG 1292
1293

34
53 GAAAGAA---AGCAACAGUUGGA-GAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAA--GAUGCGAAAG------GAAAUG---AAUGUCUUGACAGAAUGGCUGGCAGCUACAGA
||||||| ||.|.||||.||| |||.|.|..|||....|.|.|.|. ||.||.|.|| |||||| ||.|..|..|||.|||||||||.|||||..||
GAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGA 1294
1295 34
55 ACAGUUGGAGAAAUGCUUGAAAUUGUCCCGUAAGAUGCGAAAGGAAAUGAAUGUCU
||||..|..||||....||..|.|||||...|.|||||.|...|.||.|||.|.||
ACAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGCU 1296
1297 34
57 GGCUGGCAGCUACAGAUAUGGAAUUGACAAAGAGAUCAGCAGUUGAAGGA
|||.||||.|||..|.....||.||..||.. ||.||||.||..|||.||
GGCAGGCACCUAUUGGAGGCGACUUUCCAGC-AGUUCAGAAGCAGAACGA 1298
1299 34
59 UGGAAUUGACAAAGAGAUCAG-CAGUUGAAGGAAUGCCUAGUAAUUU
|||.|..||.|||.||||.|| |..|||||.||.| |.||.||.||
UGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAAGACU--CCAGGAACUU 1300
1301 34
60 AGUAAUUUGGAUUCUGAA
||.||||..|..||||||
AGAAAUUGCGCCUCUGAA 1302
1303 35
36 GCAAGAAGGAGACGU
||||.|||.||||||
GCAAAAAGAAGACGU 1304
1305

35
37 UGGGCAAGAAGGAGACGUUGGUGGAAGA
||..||||.||.|.|| |||.|||.|.|
UGACCAAGCAGCAAAC-UUGAUGGCAAA 1306
1307 35
38 GCUACUCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGG-UGCACCUGA--AGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGCCUUGAAAACAGUUUUG
|.||..||||||..|.||||...||.|.||| ||.|..|.| ||.|.||.|....|..||..||.|.|||.||.|.||.|.||
GAUAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAAAGAGGAAGACUUCAAUAAAGAUAUG 1308
1309 35
39 GCUACUCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGA----AGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAG
|.||||..|||||| ||||....|.|||.|...||.||.| |.||.||||||||.|...||.||
GGUACUGUAAAAGA-AUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAG 1310
1311 35
40 CUCAAA-AAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUAUCACAGAGGUAGGAGAGGC
|||||| ||||.|....|....||||..|.|.|.|.|...|||||| |||..||||||
CUCAAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCA-----GUACAAGAGGC 1312
1313 35
41 GAGUAUCACAGAGGUAGGA-GAGGCCUUGAAAACAGUUU-UGGGCAAGAAGGAGACGUUGGUGGAAGAU
|.|.||..||||.|.||.| ||||...||||..||||.. |.||||||..| ||...|||...||.|||
GGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAGCUG-AGGGCUUGUCUGAGGAU 1314
1315 35
42 GGCCUUGAAAACAGUUUUGGGCAAGAAGGAGACGUUG
|.|.|||||.|....|||..|||||| ||||.|..||
GACUUUGAAGAUCUCUUUAAGCAAGA-GGAGUCUCUG 1316
1317

35
44 AAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGU----GCACCUGAAGAGUAUCACAGA
|.|||||.|||. ||.|||..|.| |.|.|||||.|||.||.||||
AUAAAGAUAUUU--AAUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGA 1318
1319 35
46 GCUACUCAAA-AAGAGAUUGAGAAACAGAAG
||.|||.||| ||.||.|||||.||...|||
GCAACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAGUCAAG 1320
1321 35
47 UGGAAGAUAAACUCAGUCUUCUGAAUAGUAACUGGAUA
|.|||.||||.||||..|.....|||....|.||||||
UUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGGAUA 1322
1323 35
48 UGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUA--UCACAGAGGUAGGAGAGGCCUUGAAAACAGUUUUG
|||||||| ||||.|.|..|||||...| |.|.|||..|.||..|| ||||||||.|...|||
UGAGAAAC--AAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGACCUUGGGCAG--CUUGAAAAAAAGCUUG 1324
1325 35
49 AACAGUUUUGGGCAAGAAGGAGACGUUGGUGGAAGAUAAACUCAGUC
||.||.|||.|.|.|.|.||...|.||.||..|||..|||..|||.|
AAGAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAGCC 1326
1327 35
51 AAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGAAGAGUAUCACAGAGGU
||||..|.|..|.|..|..|..||||..|.|||.|| |||||..|||.|
AAAAUCACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGA-UAUCAACGAGAU 1328
1329 35
53 AAACAGAAGGUGCA--CCUGAAGAGUAUCACAGA
|.||||.||.|||| ||..||||..||||||||
AUACAGUAGAUGCAAUCCAAAAGAAAAUCACAGA 1330
1331

35
55 AAAAGAGAUUGAGAAACA
|||||||.|...||||||
AAAAGAGCUGAUGAAACA 1332
1333 35
57 UAGGAGAGGCCUUGAAAACAGUUUUGGGCAAGAAGGA
|.||||..|.|||...|.|||||..|....||||.||
UUGGAGGCGACUUUCCAGCAGUUCAGAAGCAGAACGA 1334
1335 35
59 UCAAAAA-GAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCAC-CUGAAGAGUAUCACAGAGG--UAGGAGAGGCC-UUGAAA
||||.|. |||...||.|||..|||..||||| |.|..||.|..||.|||.. |||..|||.|| ||||||
UCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCCUUGAAA 1336
1337 35
60 UCAAAAAGAGAUUGAGAAACAGAAGGUGCACCUGA
||.|..|||.||||.|...|.|||.|.|.||.|||
UCGAGGAGAAAUUGCGCCUCUGAAAGAGAACGUGA 1338
1339 36
37 ACUUUUGACCAGAAUGUGGAC----CACAUCACAAAG
||.|..|.||| ||.|||||| |||.|.||.|||
ACAUACGCCCA-AAGGUGGACUCUACACGUGACCAAG 1340
1341 36
38 AGGCUGACA--CACUUUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAG
|||||||.| ||.....||.||||||.||.|.|...|.||..||..|||.|.|.|
AGGCUGAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAAAGAGGAAGACUUCAAUAAAGAUAUG 1342
1343 36
39 AUGAAUCAGAGAAAA-AGAAACCCCAGCAAAAAGAAGA
|.||||||.|||..| |||||.|......|||..||||
AAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGA 1344
1345

36
40 UUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAA
|||||||| ||..||||||.||
UUGGAUGA--CAUUGAAAAAAAA 1346
1347 36
41 GAAUCAGAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAG
||||...||||.||||||....|||..||.|.||
GAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAG 1348
1349 36
42 AGAAUGUGGACCACAUCACAAAG
||||...|.||.||.||.|||.|
AGAAGUGGAACAACUUCUCAAUG 1350
1351 36
44 AGUGGAUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAACCCCAGCAAAAAGAAGACGUGCUUAA
|||||.|.|...|.||||| |||.|||. |||||.|.|.|.|||..||.|..||..|...||.||||.||
AGUGGCUAACAGAAGCUGA-ACAGUUUC-------UCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGGGAACAUGCUAAA 1352
1353 36
46 AAACCCCAGCAAAAAGAAGACGUGCUUAAG
|||...||||||..|.||||...||||.||
AAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGCUUGAG 1354
1355 36
47 AAAAGAAACCCCAGCAAAAAGA
||||.||.|.|.||||.|.|.|
AAAAUAAGCUCAAGCAGACAAA 1356
1357 36
48 GAAACACAUGGAAACUUUUGACCA
|||.||..||||||.||.|.||||
GAAUCAGUUGGAAAUUUAUAACCA 1358
1359

36
49 AAAAAGAAACCCCAGCAA
|.||.||||..|||||.|
ACAAGGAAAAACCAGCCA 1360
1361 36
51 UGGACCACAUCACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGA
|.||..|.||||...||..|||||| ||.||.||
UUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAU-CAAGCAGA 1362
1363 36
53 CAGAAACACAUGGAAACUUUUGACCAGAAUGU
|||||.|..| ||.|||..||||....|||||
CAGAACCGGA-GGCAACAGUUGAAUGAAAUGU 1364
1365 36
55 CAGAAUGUGGACCACAUCACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGA
|||||..||.|.||..|..|||.|| |.|.||||.||..||.|.|..|||
CAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGU----CCUACAGGAUGCUACCCGUAAGGA 1366
1367 36
57 UGUGGACCACAUCACAAAGUGGAUCAUUCAGGCUGACA--CACUU-UUGGAUG
||||| |.|||.|..||||..|||.|.|.|.||.|.|| |||.| |||||.|
UGUGG-CUACAGCUGAAAGAUGAUGAAUUAAGCCGGCAGGCACCUAUUGGAGG 1368
1369 36
59 ACCAGAAUGUGGACCACAUCACAAAGUGG--AUCAUUCAGGCUGACACACUUUUGGAUGAAUCAGAGAAAAAGAAA
|.|||..||.|||...||..||..||||| |..|||.|..||| |||.|...||..|| .||||||||||.|.|
AGCAGGCUGAGGAGGUCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUG-CACUCCGCUGACUG--GCAGAGAAAAAUAGA 1370
1371 36
60 GAAUACCAGAAA--CACAUGGAAACUUUUG
|||.|||.|||. ||.||||||.|||.||
GAAGACCUGAACACCAGAUGGAAGCUUCUG 1372
1373

37
38 GAUUUGCAGCCAUUUCACACAGAAUUA
||.|||.|||..|||.||.||||..||
GAAUUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUA 1374
1375 37
39 UUAAAGGCAGAACUGAAUG
|||.||.||.|||..||||
UUACAGACAAAACAUAAUG 1376
1377 37
40 AAAUUAGUAGAGCC--CCAAAUCUCAGAGCUCAA
|||||||.. |||| ||..|.|.|||||.|.||
AAAUUAGCC-AGCCUACCUGAGCCCAGAGAUGAA 1378
1379 37
41 AGUAGAGCCCCAAAUCUCAGA----GCUCAACCAUCGAUUUGCAGCCAUUUCACACAGAAUU
|||.||||| |.|||||| |||||.|.|.||.|. ||.|..|.||.|.|...||||
AGUGGAGCC----AACUCAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUG-GCGGGAAAUUGAGAGCAAAUU 1380
1381 37
42 AUUAGUAGAGCCCCAAAU-CUCAGAGCUC
|||||.||.|...|||.| ||||..||||
AUUAGAAGUGGAACAACUUCUCAAUGCUC 1382
1383 37
44 AGAGCCCCAAAUCUCAGAG
|.||.|.|||||..|.|||
AAAGACACAAAUUCCUGAG 1384
1385 37
46 AGAGCUCAACCAUCGAUUUGCAGCCAUUUCACACAGAAUUAA
|||.|..||..||...||..|||. ||||||.|.|||.||||
AGAACAAAAGAAUAUCUUGUCAGA-AUUUCAAAGAGAUUUAA 1386
1387

37
47 CAUACGCCCAAAGGUGGACUCUACACGUGA
||||.|||||.|.|.|.|...||.||.|||
CAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGA 1388
1389 37
48 UUUGCAGCCAUUUCACACAGAAUUAAG
|||.|||...|||..|..||||..|||
UUUCCAGAGCUUUACCUGAGAAACAAG 1390
1391 37
49 GCAGCCAUUUCACACAGAA
|||||..||..|||..|||
GCAGCAUUUGUACAAGGAA 1392
1393 37
53 AAAUCUCAGAGCUCAA
|||||.||||...|||
AAAUCACAGAAACCAA 1394
1395 37
55 CAAGCAGCAAACUUGAUGGCAAACCGCGGUGACCACUGCAGGAAAUUAGUAGAGC
||.|..||.|.|...|.||.||..|.|...||..|||.||.|..|.||..|||||
CAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGCUCCUAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGC 1396
1397 37
57 GUUUAAAGGCAGAACUGAAUGACAUACG
|||.|.|.||||||| ||...|||||.|
GUUCAGAAGCAGAAC-GAUGUACAUAGG 1398
1399 37
59 GCAAACUUGAUGGCAAACCGCGGUGACCACUGCAGGAAAUUAGUAGAGCCCC
|.|||.||||......||..||.||||......||.|||.|||..|||.|||
GAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGAGACCC 1400
1401

37
60 ACGUGA-CCAAG-CAGCAAACUUGAUGGCAAACCGCGGUGACCACUGCAGGAAAUUAG-UAGAGCCCCA-AAUCUCAGAGCUC
|||||| |||.| ||...|.||||.|.||.| |.|.||||||...||.|.|.|| |....||..| ||.|||||..|||
ACGUGAGCCACGUCAAUGACCUUGCUCGCCA-----GCUUACCACUUUGGGCAUUCAGCUCUCACCGUAUAACCUCAGCACUC 1402
1403 38
39 UAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGCUGAAAUU-CAGCAGGGGGUGA---AUCUGAAAGAGGAAGACUUCAAUAAAGAUA
|.||.||.|||||.|..||..| ||||.| ||.|| ||.||..|..|.| ||..||.|.||..|||... ||||||||||
UGUAAAAGAAUUGUUGCAAAGA--GGAGAC--AACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGA-AAUAAAGAUA 1404
1406 38
40 AGGCU---GAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAA--AGAGGAAGACU
||||| ||||||...||...|..|.|||.|.| |||||.||.||
AGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCU 1407
1408 38
41 AAUUGGAGCAGUUUA----ACUCAGAUAUACAAAAAUU
||||.|..||||||. |||||..|.|.||.|||||
AAUUUGCUCAGUUUCGAAGACUCAACUUUGCACAAAUU 1409
1410 38
42 UUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAA
||.||||.|.||.|..||||||
UUAAGCAAGAGGAGUCUCUGAA 1411
1412

38
44 GAAUUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAUUGCU
|||...||.|||||| ||||||.|.|||.|||||.||
GAAGCUGAACAGUUU--CUCAGAAAGACACAAAUUCCU 1413
1414 38
46 AAAAUUGCUUGAA--CCACUGGAGGCUGAAAUUCAGCAG
||.||||||.|.| |||||.||..|||.||...|||||
AACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAG 1415
1416 38
47 AAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGG
||.||||...|||| ||||||||
AACAAUUAAAUGAA--ACUGGAGG 1417
1418 38
48 UUGAAGGAAUUG--GAGCAGUUUAA
||||||...||| ||||||||.||
UUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAA 1419
1420 38
49 GAAUCUGAAAGAGGA
|||.||||||.||.|
GAAACUGAAAUAGCA 1421
1422 38
51 AAAUUCAGCAGGGGGUGA
|||.||| |||.||||||
AAAAUCA-CAGAGGGUGA 1423
1424 38
53 UUGAAGGAAUU--GGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUGGAGGC
|||||.||||| |.|.||||...|. ||..|||||.||...|||.|.. ||.||||||
UUGAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAU---GAAGUACAAGAACACCUUCAGA-ACCGGAGGC 1425
1426

38
55 AUUGGAGCAGUUUAACUCAGAUAUACAAAAAUUGCUUGAACCACUG---GAGGCUGAAA
|.||.|.|||||...|...||..|..||||.||.||||.....||. ||.|||||||
ACUGCAACAGUUCCCCCUGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAAA 1427
1428 38
57 GAAAUUCAGCAGGGGGUGAAUCUGAAAGAGGAAGACUUCA
|||.|||.|..|.||.|..|.||||||||.||.||.||.|
GAACUUCUGGUGUGGCUACAGCUGAAAGAUGAUGAAUUAA 1429
1430 38
59 AGGGGGUGAAU-CUGAAAGAGGAAGACUUCAA
|||.|||.||| ||||..| ||||.|.||.||
AGGAGGUCAAUACUGAGUG-GGAAAAAUUGAA 1431
1432 38
60 UCUGAAAGAGGAAG
||||||||||.|.|
UCUGAAAGAGAACG 1433
1434 39
40 GAGAGGAAAUAAAGAUAAA
||||.||||..||.|||||
GAGAUGAAAGGAAAAUAAA 1435
1436 39
41 AGAGGAGACAACUUACAACAA----AG-AAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAU
||.||||.|||||.|.|.|.| || ||.|.|.| |.|.||||..|||||.||||
AGUGGAGCCAACUCAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUG--GCGGGAAAUUGAGAGCAAAU 1437
1438 39
44 AGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAGCUGUUA-CAGA
|.||.|||||||||....|.|||..|.|| ||||
AUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGA 1439
1440

39
46 AACUUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAG
|||.|..||.|.||.|.||...|..||| |||||..|||.||.|.|||
AACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAAAGA-AAAGCUUGAGCAAGUCAAG 1441
1442 39
47 AGGGUACUGUAAAAGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAA-UCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAGCUGUUACAGACAAAAC
||||.|.|.|.|||.||||.....||||.||||....|.|.|....|||.. ||.||.|.|.....|||.|..|| |||||..|.||| |..||||....||||||||.|
AGGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUUGUAAGUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAG---AUAAACUUGAAA-AUAAGCUCAAGCAGACAAAUC 1443
1444 39
48 GAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUAAAACAGCAG
||||||....|||.||.|.|||.|.|||.|..||
GAGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAG 1445
1446 39
49 UGUAAAAGAAUUGUUGCAAAGAGGAGACAACUUACAACAAAGAAUCA
||.||.|||.||..|..||||.|.||......|||||..||.||.||
UGGAAGAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCA 1447
1448 39
51 AAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAAUAAAGAUA
|.|.|||||||||.| |.||..|.|.|.|....|.|.||||
AUAAAAUCACAGAGG-GUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUA 1449
1450

39
53 AAUGAAGA--CAAUGAGGGUACUGUAAAAGAAUUGUUGCA-AAGAGGAGACAAC-- UUACAACAAAGAAUCACAGAUGAGAGAAAGCGAGAGGAAA-UAAAGAUAAAAC--AGCAGCUGUUA
|||..||| ||.|| ||.|...|||.|||||....|.|| ||..||||.|||| ||..|..|||...|.|..|||...|.|.|..|...||||. |||.||..||.| |||||.|.|||
AAUUCAGAAUCAGUG- GGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAG CUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUA 1451
1452 39
55 GAAGACAAUGAGGGUACUGUAAAAGAAUUGUUGCAA
||||||....||||. ||||||||..||.||.||
GAAGACUCCAAGGGA---GUAAAAGAGCUGAUGAAA 1453
1454 39
57 GUUACAGACAAAACAUAAUG
|.|||||...|||.||.|||
GCUACAGCUGAAAGAUGAUG 1455
1456 39
59 CAAAGAAUCACAGAUGAGA
||.||||..|.||||||||
CAGAGAAAAAUAGAUGAGA 1457
1458 39
60 UGAGAGAAAGCGAGAG
|||.|||.|.||.|||
UGAAAGAGAACGUGAG 1459
1460 40
41 AUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAAAAAAUUAGC
|.|||...||..|||.|...||.|||||.|..|||||.||
AGCUCAGCAAGCGCUGGCGGGAAAUUGAGAGCAAAUUUGC 1461
1462

40
42 AAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAU
|.|.|.|.||.|.|||||||||.||
AGACAUGCCUUUGGAAAUUUCUUAU 1463
1464 40
44 AGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGG-UAUCAGUA
|.|.|.||.|.||.|.|.|||||||| ||.|||.|
AUGAUAUAAAGAUAUUUAAUCAGUGGCUAACAGAA 1465
1466 40
46 AUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAAAAAAUUAGCCAG---
CCUACCUGAGCCCAGAGAUGAAAGGAAAAUAAA
||||..|..|...|||.|||||.||. |.|.|.||..|.||.|| ||.||.|||.||..||.|.||...|.||.||||
AUGAAUUUGUUUUAUGGUUGGAGGAA--- GCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACUAAA 1467
1468 40
47 AAAGAAGAAAAAAGGCUCUAGAA-AUUUCUCAUCAGUGG
|||...|||||.|.||||.||.| |....||..||||||
AAACUUGAAAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGG 1469
1470 40
48 AAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAAAAAAUUA
|||.|||||.| |||.|||||.|..|.|||
AAAAGCUUGAA-GACCUUGAAGAGCAGUUA 1471
1472 40
49 UUGAAAAAAAAUUAGCCAGCCUACCUGAGCCCAGAGAUG
|||.|.||..|..|.||||||. ||.|||| ||.||.|
UUGUACAAGGAAAAACCAGCCA--CUCAGCC-AGUGAAG 1473
1474

40
51 UGGAUGACAUUGA
|||.||||.||||
UGGGUGACCUUGA 1475
1476 40
53 AAUUUCUCAUCAGUGGUAUCA-GUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUGACAUUGAAAA
||||....||||||||.||.| ||||||||. ||...|.|..|.|....|.||...|||.||||.||...|||
AAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAA-CACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAA 1477
1478 40
55 UUGAGGUCUCAAAGA-AGAAAAAAGGCUCUAGAAA
|.||.|.|||.|||. ||.||||..|||...||||
UAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAUGAAA 1479
1480 40
57 AGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUC
||..|.||||.|.||||||.|.|
AGCCAGUUCUGACCAGUGGAAGC 1481
1482 40
59 AAGAAAAAAGGCUCUAGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCUCCUGAAAUGCUUGGAUG ACAUUGAAAAAAAAUUAGCCAGC--//
|.||||...||||...||..|...|..|.|||||.|..|.|..||...|||..|.|.|||....|.||.|....|.|||||.|......|||.|.| ||||.
ACGAAAGCAGGCUGAGGAGGUCAAUACUGAGUGGGAAAAAUUGAACCUGCACUCCGCUGACUGGCAGAGAAAAAUAGAUG AGACCCUUGAAAGACU--CCAGGAA// //CUACCUGAGCCCAGAGAUGAAAGGAAAAUAAAG
||.|..|||.|||..|||||...|.|..|.|||
//CUUCAAGAGGCCACGGAUGAGCUGGACCUCAAG 1483
1484

40
60 AGAAAUUUCUCAUCAGUGGUAUCAGUACAAGAGGCAGGCUGAUGAUCU
|||||||.|.|.||. |.|..||.||..|||.||.|...||||.||
AGAAAUUGCGCCUCU---GAAAGAGAACGUGAGCCACGUCAAUGACCU 1485
1486 41
42 AAGAAAGAGGAG---CUGAA
|||.|||||||| |||||
AAGCAAGAGGAGUCUCUGAA 1487
1488 41
44 AAUUUGCUCAGUUUCG----AAGACUCAACUU
||..||..|||||||. |||||.|||.||
AAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUU 1489
1490 41
46 GAAGAAAG-AGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAG
|||.|.|| ||.|.||.||.|.|..||.|..|||||
GAAAAGAGCAGCAACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAG 1491
1492 41
47 GGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUG--CAGUGCGU
|||||||....||.||..||..|.|.|||.|.| |.||||.|
GGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUU 1493
1494 41
48 AGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAA
|.|||.|||||..|.||||.||
ACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAA 1495
1496 41
49 CAGAUCCAGCUCAGCAAGCGCUGGCGGGAAA
|||.||.||||.|.|||.||...|.||.|.|
CAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGA 1497
1498

41
53 AAUUGCAG-AAG--AAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAG--CUGAGG---GCUUGUCUGA-GGAUGG-- GGCCGCAAUGGCAGUGGAGCCAACUCAGA
|||.||.| ||| |||.|||| |||||| ||||..|.||||..|| |.|||. |||||..|.| |||.|| ||.|.|.||. ||||.||..|||..||.|
AAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGA--AGCUGA-- GCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAGCCAAGCUUGAGUCAUGGAAGGAGGGUCCCUAUA-CAGUAGAUGCAAUCCAAA 1499
1500 41
55 UUGCAGAAGAAGAAAGA
||.||||||..||||.|
UUACAGAAGCUGAAACA 1501
1502 41
57 UCGGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCA
||.||..|.||...||..||||||.|| |||||..||...|.|||||
UCUGGUGUGGCUACAGCUGAAAGAUGA--UGAAUUAAGCCGGCAGGCA 1503
1504 41
59 CGGGAAUUGCAGAAGAAGAAAGAGGAGCUGAAUGCAGUGCGUAGGCAAGCUGAGG
|.||||.|.||..||...|..||.||||||.|......||...|.||||||||||
CAGGAACUUCAAGAGGCCACGGAUGAGCUGGACCUCAAGCUGCGCCAAGCUGAGG 1505
1506 41
60 GAGCCAACUCA--GAUCCAGCUCAGCAAGC
||||||..||| ||.|..|||| ||.|||
GAGCCACGUCAAUGACCUUGCUC-GCCAGC 1507
1508 42
44 CUAUUAGAAGUGGAACAACUUCUCA
|||..|||||..|||||..||||||
CUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCA 1509
1510

42
46 UGAAAUCACUCAUGUCUCACAAGCCCUAUUAGAAGUGGAACAACU
|.|.||..||..|.||.|||..|..|....|.|||.|.|.|||||
UAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAGCAACU 1511
1512 42
47 UCUCACAAGCCCUAUUAGAAGUGGAACAACUUCUCAAU
||.||.|||||| |..|||....||..|||||...|||
UCCCAUAAGCCC-AGAAGAGCAAGAUAAACUUGAAAAU 1513
1514 42
48 UAAGGACUUUGAAGAUCUCUUUAAGCA
|.|.|||.|||||||.|..||.||.||
UGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCA 1515
1516 42
49 CACACUGUCCGUGAAG
|||.|.|.|.||||||
CACUCAGCCAGUGAAG 1517
1518 42
51 AGAAACGAUGAUGGUGA-UGAC--UGAAGACAU
|.|.|.|.||||||||. |||| |||.||.||
ACAGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUAU 1519
1520 42
53 CACACUGUCCGUGAAGAAACGAUGAUGGUGAUGA---CUGAAGACAUGCC
||||.||.|.|..|...||.||.||.|.|||..| ||.|.||||.|||
CACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGAGCAGGUCUUAGGACAGGCC 1521
1522 42
55 AGAAG-UGGAACAACUUCUCAAUGCUCCU
||||| ||.|||||||.| ||||| ||||
AGAAGCUGAAACAACUGC-CAAUG-UCCU 1523
1524

42
57 GAAAUUUCUUAUGUGCCUUCUACUUA
|.||.||||..||||.||.|..||.|
GGAACUUCUGGUGUGGCUACAGCUGA 1525
1526 42
59 ACUGUCCGUGAAGAAACGAUGA
||||.|.|.|||.||..|||||
ACUGGCAGAGAAAAAUAGAUGA 1527
1528 42
60 AGAAGUGGAACAACUUCUCAAUGCUCCUGACCUCUGUGCUAAGGACUUUG
||||...||.|.||.| |||||..|.||..|.|.. |||.|..||||||
AGAACGUGAGCCACGU--CAAUGACCUUGCUCGCCA-GCUUACCACUUUG 1529
1530 43
44 AAUGGGAAAAAGUUAA---CAAAAUGUA
|.||||||.|.|.||| ||||..|||
AUUGGGAACAUGCUAAAUACAAAUGGUA 1531
1532 43
46 GAAGACAGCAGCAUUGCAAAGUGCAACGCCUGUGGAA
|||.|.||||||| .|.||..|.||.||.||.|.||
GAAAAGAGCAGCA--ACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAA 1533
1534 43
47 AAGAUAGUCUACAACA-AAGCUCAGG
||||||..||..||.| |||||||.|
AAGAUAAACUUGAAAAUAAGCUCAAG 1535
1536 43
48 GCUCUCUCCCAGCUUGAUUUCCAAUGGGAAAAAGUUAACAAAAUGUACAAGGACCGACAA
|.|.|||||.|....||.| ||.|.|||||....||||.||....||.|.||..|||.|
GUUAUCUCCUAUUAGGAAU--CAGUUGGAAAUUUAUAACCAACCAAACCAAGAAGGACCA 1537
1538

43
49 AAAGUUAACAAAAUGUACAAGGACCGACAAG
||||...|..|..||||||||||...||.||
AAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAG 1539
1540 43
51 UUGCAAAGUGCAAC--GCCUGUGGAAAGGGUGAAGCUACAGGAAGCUCUCUCCCAGCUUGAU
|.|||.|.|.|||| |.|| ||||.||.....|.|.||.|| ||.||.|.|||||||
UGGCAGAUUUCAACCGGGCU-UGGACAGAACUUACCGACUGG-----CUUUCUCUGCUUGAU 1541
1542 43
53 CAGCUUGAUUUCCAAUGGGAAAAAGUUAACAAAAUGUACAAGGA
||.|||.|...||...||.||.|..|.||..||||||..|||||
CACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGA 1543
1544 43
55 UGCAACGCCUGUGGAAAGGGU
|||.||.|.|..|||||||.|
UGCUACCCGUAAGGAAAGGCU 1545
1546 43
57 GGUGAAGCUACAG
||||..|||||||
GGUGUGGCUACAG 1547
1548 43
59 AAUGGGAAAAAGUUAAC
|.|||||||||.|.|||
AGUGGGAAAAAUUGAAC 1549
1550 43
60 CUGUGGAAAGGGUGAAG-CUACA-GGAAGCU
||.|||||....||||. |.|.| |||||||
CUCUGGAAGACCUGAACACCAGAUGGAAGCU 1551
1552