ОЛИГОНУКЛЕОТИД ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С МЫШЕЧНОЙ ДИСТРОФИЕЙ Российский патент 2023 года по МПК C12N15/113 A61K48/00 A61K31/7088 A61P21/00 

Область изобретения

Изобретение относится к области генетики человека, более конкретно, к способу конструирования единичного олигонуклеотида, который предпочтительно способен индуцировать пропускание двух или более экзонов пре-мРНК. Кроме того, изобретение относится к указанному олигонуклеотиду, к фармацевтической композиции, содержащей указанный олигонуклеотид, и к применению указанного олигонуклеотида, как указано в настоящем описании.

Уровень техники, к которому относится изобретение

Олигонуклеотиды являются перспективными в медицине для лечения генетических нарушений, таких как мышечная дистрофия. Мышечная дистрофия (MD) относится к генетическим заболеваниям, которые характеризуются прогрессирующей слабостью и дегенерацией скелетных мышц. Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) и мышечная дистрофия Беккера (BMD) являются наиболее распространенными детскими формами мышечной дистрофии, и они используются в настоящем описании для иллюстрации изобретения. DMD представляет собой тяжелое летальное нервно-мышечное нарушение, приводящее к потребности в инвалидной коляске в возрасте до 12 лет и пациенты DMD часто погибают в возрасте до тридцати лет вследствие дыхательной или сердечной недостаточности.

DMD вызывается мутациями в гене DMD; в основном, делециями или дупликациями со сдвигом рамки считывания одного или нескольких экзонов, небольшими нуклеотидными вставками или делециями, или точечными нонсенс-мутациями, которые, как правило, приводят к отсутствию функционального дистрофина. В ходе последнего десятилетия появилась специально индуцируемая модификация сплайсинга для восстановления нарушенной рамки считывания транскрипта DMD в качестве перспективной терапии мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) (van Ommen G.J. et al., Yokota T., et al., van Deutekom et al., Goemans N.M., et al.). С использованием специфичных к последовательности антисмысловых олигонуклеотидов (AON), которые нацелены на конкретный экзон, фланкирующий или содержащий мутацию, и препятствуют его сигналам сплайсинга, может быть индуцировано пропускание этого экзона во время процессинга пре-мРНК DMD. Несмотря на получаемый в результате укороченный транскрипт, открытая рамка считывания восстанавливается, и образуется белок, который сходен с белками, встречающимися у пациентов с обычно более мягкой мышечной дистрофией Беккера. Индуцируемое AON пропускание экзонов обеспечивает специфический для мутации и, таким образом, потенциально персонализированный терапевтический подход для пациентов с DMD и определенных пациентов с тяжелой BMD. Поскольку большинство мутаций кластеризуются в области экзонов 45-55 в гене DMD, пропускание одного конкретного экзона в этой области может быть терапевтическим для субпопуляции пациентов с различными мутациями. Пропускание экзона 51 имеют наибольшие субпопуляции пациентов (приблизительно 13%), включая пациентов с делециями экзонов 45-50, 48-50, 50 или 52. В случае некоторых мутаций для восстановления открытой рамки считывания требуется пропускание более одного экзона. Например, для пациентов DMD с делецией с экзона 46 по экзон 50 в гене DMD, только пропускание обоих из экзонов 45 и 51 является корректирующим. Для лечения этих пациентов требуется введение двух олигонуклеотидов, один из которых нацелен на экзон 45, а другой из которых нацелен на экзон 51. Осуществимость пропускания двух или более последовательных экзонов с использованием комбинации AON, либо в коктейле, либо в доставляемых с помощью вирусов генных конструкций, широко исследована (Aartsma-Rus A. et al., 2004; Béroud C., et al.; Van Vliet L., et al.; Yokota T., et al.; Goyenvalle A., et al.). Пропускание множества экзонов было бы применимым для совокупных субпопуляций пациентов, позволило бы имитировать делеции, о которых известно, что они ассоциированы с относительно мягкими фенотипами, и обеспечило бы инструмент для нацеливания на редкие мутации вне области горячей точки делеций в гене DMD. Однако недостатком разработки лекарственных средств, содержащих множество олигонуклеотидов, является то, что учреждение по контролю за оборотом лекарственных средств может рассматривать олигонуклеотиды с различными последовательностями как различные лекарственные средства, для каждого из которых требуются доказательства стабильной продукции, испытания токсичности и клинические испытания. Таким образом, существует потребность в одном молекулярном соединении, способном индуцировать пропускание по меньшей мере двух экзонов, чтобы упростить лечение совокупных подгрупп пациентов с DMD.

Описание изобретения

Изобретение относится к способу конструирования олигонуклеотида, где указанный олигонуклеотид способен связываться с областью первого экзона и с областью второго экзона в одной и той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Олигонуклеотиды, получаемые указанным способом, предпочтительно способны индуцировать пропускание указанного первого экзона и указанного второго экзона в указанной пре-мРНК. Предпочтительно, также индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами. Полученный транскрипт указанной пре-мРНК, где пропускаются указанные экзоны, находится в рамке считывания.

Олигонуклеотид

В первом аспекте изобретение относится к олигонуклеотиду, который способен связываться с областью первого экзона и с областью второго экзона в одной и той же пре-мРНК, где указанная область второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона.

Олигонуклеотид предпочтительно способен индуцировать пропускание первого и второго экзонов указанной пре-мРНК; более предпочтительно, индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный транскрипт находится в рамке считывания.

Пропускание экзона препятствует природным процессам сплайсинга, происходящим в эукариотической клетке. У высших эукариот генетическая информация для белков в ДНК клетки кодируется в экзонах, которые отделены друг от друга последовательностями интронов. Эти интроны в некоторых случаях являются очень длинными. Аппарат транскрипции эукариот образует пре-мРНК, которая содержит как экзоны, так и интроны, в то время как аппарат сплайсинга, часто уже во время происходящей продукции пре-мРНК, образует истинную кодирующую мРНК для белка путем удаления интронов и связывания экзонов, присутствующих в пре-мРНК, в ходе процесса, называемого сплайсингом.

Олигонуклеотид по изобретению, который способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и с областью второго экзона в той же пре-мРНК, следует рассматривать как олигонуклеотид, пригодный для связывания с областью первого экзона в пре-мРНК и пригодный для связывания с областью второго экзона в той же пре-мРНК. Такой олигонуклеотид по изобретению характеризуется его признаком связывания (т.е. способен связываться), когда его используют с или в комбинации с пре-мРНК, предпочтительно в клетке. В этом контексте выражение "способен к" может быть заменено на "может". Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что олигонуклеотид, способный связываться с областью первого экзона и способный связываться с областью второго экзона в одной и той же пре-мРНК, определяемый нуклеотидной последовательностью, определяет указанный олигонуклеотид структурно, т.е. указанный олигонуклеотид обладает такой последовательностью, которая обратно комплементарна последовательности указанной области указанного первого экзона и также обратно комплементарна последовательности указанной области указанного второго экзона в одной и той же пре-мРНК. Степень обратной комплементарности с указанными областями указанного первого и/или указанного второго экзона, которая необходима для олигонуклеотида по изобретению, может составлять менее 100%. Может быть допустимым определенное количество несоответствий нуклеотидов или один или два пропуска, как дополнительно описано в настоящем описании. Нуклеотидную последовательность области первого экзона, которая обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного второго экзона (или нуклеотидная последовательность области второго экзона, которая обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона), с которой способен связываться олигонуклеотид по изобретению, можно конструировать с использованием способа по изобретению, как пояснено ниже в настоящем описании. Предпочтительная пре-мРНК представляет собой пре-мРНК дистрофина. Предпочтительные комбинации первого и второго экзонов пре-мРНК дистрофина и предпочтительные области указанных первого и второго экзонов дистрофина определены в таблице 2. Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзонов в указанной пре-мРНК дистрофина; более предпочтительно, индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный транскрипт дистрофина находится в рамке считывания, предпочтительно, как указано в таблице 1.

Транскрипт находится в рамке считывания, когда он имеет открытую рамку считывания, которая обеспечивает продукцию белка. Состояние нахождения мРНК в рамке считывания можно оценивать с помощью анализа последовательности и/или анализа ОТ-ПЦР, как известно специалисту в данной области. Полученный белок, который образуется в результате трансляции транскрипта в рамке считывания, можно анализировать с помощью иммунофлуоресценции и/или анализа с использованием вестерн-блоттинга с использованием антител, которые перекрестно реагируют с указанным белком, как известно специалисту в данной области. В рамках настоящего изобретения олигонуклеотид, описанный в настоящем описании, может быть назван функциональным, если полученный транскрипт в рамке считывания идентифицируется с помощью ОТ-ПЦР и/или анализа последовательности, или если белок, образовавшийся с указанного транскрипта, идентифицируется с помощью иммунофлуоресценции и/или анализа с использованием вестерн-блоттинга, в соответствующей системе in vitro или in vivo в зависимости от типа транскрипта. Если транскрипт представляет собой транскрипт дистрофина, соответствующая система может представлять собой мышечную клетку или мышечную трубочку здорового донора или пациента с DMD, как пояснено в настоящем описании ниже.

В одном варианте осуществления область второго экзона (присутствующая в той же пре-мРНК в качестве области первого экзона) обладает по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичностью с областью первого экзона, как определено выше (предпочтительные области первого и второго экзонов дистрофина указаны в таблице 2). Процент идентичности можно оценивать по всей длине указанных первого и/или второго экзонов или на протяжении области из 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, как проиллюстрировано в настоящем описании для экзонов дистрофина. Для квалифицированного специалиста очевидно, что первый и второй экзоны, как описано в настоящем описании, представляют собой два различных экзона одной единственной мРНК или два различных экзона одной и той же пре-мРНК. Первый экзон, как указано в настоящем описании, может быть расположен выше (т.е. с 5’-стороны) второго экзона в одной и той же пре-мРНК, как указано в настоящем описании, или второй экзон может быть расположен выше указанного первого экзона. Предпочтительно, указанный первый экзон расположен выше указанного второго экзона. Специалисту в данной области очевидно, что олигонуклеотид по изобретению может быть исходно сконструирован так, чтобы он был способен связываться с областью первого экзона; ввиду идентичности области указанного первого и указанного второй экзонов, указанный олигонуклеотид также вторично может быть способен связываться с указанной областью указанного второго экзона. Возможно обратное конструирование: олигонуклеотид по изобретению может быть первично сконструирован так, чтобы он был способен связываться с областью второго экзона; ввиду идентичности области указанного первого и указанного второго экзонов, указанный олигонуклеотид также может быть вторично способен связываться с указанной областью указанного первого экзона.

Процент идентичности между областью первого и областью второго экзонов можно оценивать по всей области указанного первого экзона, где область может быть более короткой, более длинной или в равной степени длинной относительно части этой области, с которой олигонуклеотид по изобретению способен связываться. Область первого экзона и область второго экзона, как используют в рамках изобретения, также могут быть идентифицированы как область(и) идентичности. Предпочтительно область первого экзона, которая определяет идентичность с областью второго экзона, является в равной степени длинной или более длинной, чем часть этой области, с которой способен связываться олигонуклеотид по изобретению. Должно быть понятно, что олигонуклеотид по изобретению может быть способен связываться с меньшей частью или частично перекрывающейся частью указанных областей, использованных для оценки идентичности последовательностей указанных первого и/или второго экзонов. Таким образом, должно быть понятно, что олигонуклеотид, который способен связываться с областью первого и второго экзонов, может связываться с частью указанной области указанного первого экзона и указанного второго экзона. Указанная часть может иметь такую же длину, как и указанная область указанного первого и/или указанного второго экзонов. Указанная часть может быть более короткой или более длинной относительно указанной области указанного первого и/или указанного второго экзонов. Указанная часть может находиться в указанной области указанного первого и/или указанного второго экзонов. Указанная часть может перекрываться с указанной областью указанного первого и/или указанного второго экзонов. Это перекрывание может составлять 1, 2, 3, 4, 5 или более нуклеотидов на 5’- и/или на 3’-стороне области указанного первого и/или второго экзона. Олигонуклеотид может быть по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5 или более нуклеотидов длиннее или короче области указанного первого и/или указанного второго экзона и может находиться на 5’- или 3’-стороне указанной области первой и/или второй области.

Область, составляющая 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 или вплоть до 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, используемая для вычисления процента идентичности между первым экзоном и вторым экзоном, может представлять собой непрерывный участок, или она может прерываться одним, двумя, тремя, четырьмя или более пропусками при условии, что процент идентичности на протяжении всей области составляет по меньшей мере 50%.

Процент идентичности между областью первого экзона и областью второго экзона можно оценивать с использованием любой программы, известной специалисту в данной области. Предпочтительно, указанную идентичность оценивают следующим образом: наилучшее попарное выравнивание между первым и вторым экзонами с использованием сетевого инструмента EMBOSS Matcher с использованием параметров по умолчанию (матрица: EDNAFULL, штраф за внесение пропуска: 16, штраф за продолжение пропуска: 4).

Олигонуклеотид, как используют в рамках изобретения, предпочтительно относится к олигомеру, который способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным области или части области первого и второго экзонов в одной и той же пре-мРНК.

Олигонуклеотид, как определено в настоящем описании (т.е. который способен связываться с областью первого экзона и с областью другого экзона (т.е. второго экзона) в одной и той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона), также предпочтительно по меньшей мере на 80% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 45% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона. Более предпочтительно, указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона. Обратную комплементарность предпочтительно, но не обязательно, оценивают на протяжении всей длины олигонуклеотида.

Олигонуклеотид, охватываемый изобретением, может содержать по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Олигонуклеотид, охватываемый изобретением, может содержать не более 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 нуклеотидов. Длина олигонуклеотида по изобретению определяется общим количеством нуклеотидов, охватываемых указанным олигонуклеотидом, независимо от модификаций, присутствующих в указанном олигонуклеотиде. Как дополнительно рассмотрено ниже, нуклеотиды могут содержать определенные химические модификации, однако такие модифицированные нуклеотиды, тем не менее, считаются нуклеотидами в контексте настоящего изобретения. В зависимости от химии олигонуклеотида, оптимальная длина олигонуклеотида может отличаться. Например, длина 2’-O-метилфосфоротиоатного олигонуклеотида может составлять от 15 до 30. Если этот олигонуклеотид далее модифицировать, как проиллюстрировано в настоящем описании, оптимальная длина может быть укорочена до 14, 13 или даже менее.

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению имеет не более 30 нуклеотидов для ограничения вероятности снижения эффективности синтеза, выхода, частоты или масштабируемости, снижения биодоступности и/или клеточного захвата и транспорта, снижения безопасности и для ограничения расходов. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид состоит из 15-25 нуклеотидов. Наиболее предпочтительно, олигонуклеотид, охватываемый изобретением, состоит из 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов. Длина олигонуклеотида по изобретению предпочтительно является такой, что функциональность или активность олигонуклеотида определяется индукцией по меньшей мере 5% пропускания первого и второго экзонов (и любого экзона(ов) между ними), или способствованием тому, что образуется по меньшей мере 5% транскрипта в рамке считывания, когда по меньшей мере 100 нМ указанного олигонуклеотида используют для трансфицирования соответствующей клеточной культуры in vitro. Оценка присутствия указанного транскрипта уже описана в настоящем описании. Соответствующая клеточная культура представляет собой клеточную культуру, где пре-мРНК, содержащая указанный первый и указанный второй экзоны, транскрибируется и сплайсируется в мРНК-транскрипт. Если пре-мРНК представляет собой пре-мРНК дистрофина, соответствующая клеточная культура содержит (дифференцированные) мышечные клетки. В этом случае образуется по меньшей мере 20% транскрипта в рамке считывания, когда используют по меньшей мере 250 нМ указанного олигонуклеотида.

Область первого экзона может иметь длину по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 или вплоть до 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов. Область первого экзона также может быть определена как составляющая по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% длины указанного экзона. Область первого экзона может быть названа областью идентичности.

Область второго экзона может составлять по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 или вплоть до 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов. Область второго экзона может быть определена как составляющая по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% от длины указанного экзона. Область второго экзона может быть названа областью идентичности.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению способен связываться с областью экзона U+1 (первый экзон) из пре-мРНК, где область другого экзона D-1 (второй экзон) в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного (U+1) экзона, где указанный олигонуклеотид предназначен для пропускания указанного U+1 и указанного D-1 экзонов (и дополнительного экзона(ов), предпочтительно расположенного между указанным первым и указанным вторым экзонами) указанной пре-мРНК, с образованием транскрипта в рамке считывания, в котором экзоны U и D сплайсированы вместе (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице 1). Олигонуклеотид по изобретению также обозначается в настоящем описании как соединение. Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно представляет собой антисмысловой олигонуклеотид (т.е. AON). Олигонуклеотид предпочтительно предназначен для пропускания указанных двух экзонов (т.е. указанного первого (U+1) и указанного второго (D-1) экзонов) указанной пре-мРНК, и где образовавшийся транскрипт (в котором U прямо сплайсирован с D) находится в рамке считывания (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице 1). Можно сказать, что указанный олигонуклеотид индуцирует пропускание указанных двух экзонов в одной единственной пре-мРНК. Необязательно, индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и образующийся транскрипт находится в рамке считывания.

Более предпочтительно, олигонуклеотид предназначен для пропускания указанных двух экзонов (т.е. указанного первого и указанного второго экзонов), и полного участка экзонов между указанным первым и указанным вторым экзонами в указанной пре-мРНК для удаления какой-либо мутации в указанном участке и для получения транскрипта, который является более коротким, но который обладает восстановленной открытой рамкой считывания, что обеспечивает продуцирование белка.

Без связи с какой-либо теорией, полагают, что вследствие по меньшей мере 50% идентичности или сходства последовательностей между указанными двумя экзонами, единственный олигонуклеотид по изобретению способен связываться и индуцировать пропускание обоих экзонов и предпочтительно всего участка экзонов между ними, чтобы получить более короткий транскрипт, который находится в рамке считывания. Таким образом, указанные два экзона могут быть соседними в пре-мРНК, или они могут быть разделены по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 экзонами. Область, охватывающая один или несколько экзонов, присутствующих между указанным первым и указанным вторым экзонами, также может быть названа участком (множества) экзонов или мультиэкзонным участком. Предпочтительно, первый экзон этого мультиэкзонного участка представляет собой первый экзон, определенный в настоящем описании выше, а последний экзон этого мультиэкзонного участка представляет собой второй экзон, определенный в настоящем описании ранее. Олигонуклеотид по изобретению также может быть определен как олигонуклеотид, который способен индуцировать пропускание указанных двух экзонов, или пропускание участка (множества) экзонов или пропускание указанного мультиэкзонного участка. В предпочтительном варианте осуществления пропускание как первого экзона, так и второго экзона индуцируют с использованием одного единственного олигонуклеотида по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления осуществляют пропускание более одного, более 2, более 3, более 4, более 5, более 6, более 7, более 8, более 9, более 10, более 11, более 12, более 13, более 14, более 15, более 16, более 17 экзонов, более 18, более 19, более 20, более 21, более 22, более 23, более 24, более 25, более 26, более 27, более 28, более 29, более 30, более 31, более 32, более 33, более 34, более 35, более 36, более 37, более 38, более 39, более 40, более 41, более 42, более 43, более 44, более 45, более 46, более 47, более 48, более 49, более 50 экзонов с использованием одного единственного олигонуклеотида, и, таким образом, это пропускание более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 экзонов проводят, не используя смесь или коктейль двух или более различных олигонуклеотидов, или не используя два или более различных олигонуклеотидов, которые могут быть связаны с помощью одного или нескольких линкера(ов), или не используя генную конструкцию, транскрибирующую два или более различных олигонуклеотидов. В одном варианте осуществления, таким образом, предусматривается, что изобретение охватывает один единственный олигонуклеотид и не содержит двух или более различных олигонуклеотидов, причем указанный единственный олигонуклеотид способен связываться с указанным первым и указанным вторым экзонами и способен индуцировать пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов в одной пре-мРНК, как проиллюстрировано в настоящем описании. В этом контексте квалифицированному специалисту будет понятно, что слово "единственный" не относится к количеству молекул, требуемому для индукции пропускания экзонов. «Единственный» относится к последовательности олигонуклеотида: изобретение охватывает одну единственную олигонуклеотидную последовательность и ее применение, и не включает две или более различных олигонуклеотидных последовательностей, причем указанная единственная олигонуклеотидная последовательность способна связываться с указанным первым и указанным вторым экзонами и способна индуцировать пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов в одной пре-мРНК, как объяснено в настоящем описании. Это изобретение представляет собой первое изобретение, позволяющее пропускание более чем одного экзона с помощью только одного единственного олигонуклеотида для лечения заболевания, вызываемого (редкой) мутацией в гене, при условии, что различные экзоны в указанном гене включают области, которые обладают по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей.

Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно используют в качестве части терапии на основе активности модулирования РНК, как определено в настоящем описании ниже. В зависимости от типа транскрипта, где присутствуют первый и второй экзоны, можно сконструировать олигонуклеотид для предупреждения, лечения или замедления данного заболевания.

Было показано, что нацеливание на два экзона в одной пре-мРНК с помощью одного олигонуклеотида, способного связываться с обоими экзонами, приводит к мРНК, лишенной экзонов-мишеней, и, кроме того, всего участка экзонов между ними. Преимуществом такого единственного олигонуклеотида, как определено в настоящем описании, является то, что можно лечить дефекты, вызванные различными мутациями в этом мультиэкзонном участке. Если выбрать два или более различных олигонуклеотидов для индукции пропускания двух или более экзонов, следует, например, учитывать, что каждый олигонуклеотид может обладать его собственным профилем PK, и что, таким образом, необходимо будет найти условия, где каждый из них будет сходным образом присутствовать в одной и той же клетке. Таким образом, другим преимуществом использования только одного единственного олигонуклеотида, способного связываться с двумя различными экзонами, как определено выше, является то, что значительно упрощается изготовление, исследование токсичности, поиск дозы и клиническое испытание, поскольку это может быть сведено к простому изготовлению и исследованию одного единственного соединения.

Ниже определены дополнительные признаки олигонуклеотида по изобретению.

В контексте изобретения, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с, является обратно комплементарным и/или способен ингибировать функцию по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в по меньшей мере указанном первом экзоне и/или указанном втором экзоне и/или влияет на структуру по меньшей мере указанного первого экзона и/или указанного второго экзона:

где указанный олигонуклеотид содержит последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной участку связывания серин-аргининового (SR) белка в указанном первом и/или втором экзоне,

и/или

где указанный олигонуклеотид способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным энхансеру сплайсинга экзонов (ESE), последовательности распознавания экзонов (ERS) и/или сайленсеру сплайсинга экзонов (ESS) в указанном первом и/или втором экзоне.

Более предпочтительно, указанный олигонуклеотид, который способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным области первого экзона пре-мРНК и/или области второго экзона пре-мРНК, способен специфически ингибировать по меньшей мере одну регулирующую сплайсинг последовательность и/или влиять на структуру по меньшей мере указанного первого и/или второго экзона в указанной пре-мРНК. Препятствование регулирующим сплайсинг последовательностям и/или структурам имеет преимущество, состоящее в том, что такие элементы располагаются в экзоне. Путем предоставления такого олигонуклеотида, как определено в настоящем описании, можно эффективно замаскировать по меньшей мере указанный первый и второй экзоны, и предпочтительно полный участок экзонов между ними, от аппарата сплайсинга. Отсутствие распознавание аппаратом сплайсинга этих экзонов, таким образом, приводит к пропусканию или исключению этих экзонов из конечной мРНК. Этот вариант осуществления сфокусирован только на кодирующих последовательностях. Полагают, что это позволяет способу быть более специфическим и, таким образом, надежным. Обратная комплементарность указанного олигонуклеотида с указанной областью указанного первого и/или второго экзона в пре-мРНК предпочтительно составляет по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

Таким образом, настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду для применения в качестве лекарственного средства для предупреждения, замедления, смягчения и/или лечения заболевания у индивидуума,

где указанный олигонуклеотид способен связываться с областью первого экзона и областью второго экзона, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона,

где указанный первый и указанный второй экзоны находятся в одной и той же пре-мРНК у указанного индивидуума,

где указанное связывание приводит к пропусканию указанного первого экзона и указанного второго экзона и предпочтительно к пропусканию мультиэкзонного участка, начинающегося с указанного первого экзона и охватывающего один или несколько экзонов, находящихся между указанным первым и указанным вторым экзонами, и в лучшем случае к пропусканию всего участка экзонов между указанным первым и указанным вторым экзонами, и

где получают транскрипт в рамке считывания, позволяющий продуцирование функционального или полуфункционального белка.

Предпочтительно, как проиллюстрировано в настоящем описании, указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание всего участка экзонов между указанным первым экзоном и указанным вторым экзоном.

Более предпочтительно, как объяснено в настоящем описании, указанное связывание указанного олигонуклеотида способно препятствовать по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в указанных областях указанных первого и второго экзонов, и/или вторичной структуре указанного первого и/или указанного второго экзонов, и/или вторичной структуре, охватывающей по меньшей мере указанный первый и/или указанный второй экзоны в указанной пре-мРНК. Предпочтительные регулирующие сплайсинг последовательности представлены в настоящем описании ниже.

Таким образом, один предпочтительный вариант осуществления относится к олигонуклеотиду по изобретению, который способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и/или с областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице 2), где указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание указанного первого и указанного второго экзонов в указанной пре-мРНК; что приводит к транскрипту, который находится в рамке считывания (например, для DMD, предпочтительно, как в таблице в таблице 1 или 6). Указанный олигонуклеотид обеспечивает у указанного индивидуума функциональный или полуфункциональный белок, и указанный олигонуклеотид дополнительно содержит:

- последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого и/или второго экзона пре-мРНК, которая гибридизуется с другой частью первого и/или второго экзона пре-мРНК (закрытая структура), и/или

- последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области указанного первого и/или второго экзона пре-мРНК, которая не гибридизуется с указанной пре-мРНК (открытая структура).

Для этого варианта осуществления приводится ссылка на патентную заявку WO 2004/083446. Молекулы РНК обладают прочными вторичными структурами, по большей части вследствие спаривания оснований обратно комплементарных или частично обратно комплементарных участков в одной и той же РНК. Уже давно полагают, что структуры в РНК играют роль в функции РНК. Без связи с теорией, полагают, что вторичная структура РНК экзона играет роль в структурировании процесса сплайсинга. В ее структуре экзон распознается в качестве части, которая должна быть включена в мРНК. В одном варианте осуществления олигонуклеотид способен препятствовать структуре по меньшей мере указанного первого экзона и, возможно, также указанного второго экзона и, возможно, также участка экзонов между ними, и, таким образом, способен препятствовать сплайсингу указанного первого, и, возможно, также указанного второго экзона, и, возможно, также участка экзонов между ними, путем маскирования указанных экзонов от аппарата сплайсинга и, тем самым, обеспечения пропускания указанных экзонов. Без связи с теорией, полагают, что перекрывание с открытой структурой повышает эффективность инвазии олигонуклеотида (т.е. повышает эффективность, с которой олигонуклеотид может проникать в структуру), в то время как перекрывание с закрытой структурой повышает эффективность препятствования вторичной структуре РНК экзона. Было обнаружено, что длина частичной обратной комплементарности как с закрытой, так и с открытой структурой в значительной степени не ограничена. Авторы настоящего изобретения наблюдали высокую эффективность в случае олигонуклеотида с различной длиной обратной комплементрности в любой структуре. Термин "обратная комплементарность" используют в настоящем описании для обозначения участка нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с другим участком нуклеиновых кислот в физиологических условиях. Условия гибридизации определены в настоящем описании ниже. Таким образом, не является абсолютным требованием, чтобы все основания в области обратной комплементарности были способны спариваться с основаниями на противоположной цепи. Например, при конструировании олигонуклеотида может быть желательным включение, например, одного или нескольких остатков, которые не образуют пары оснований с основаниями на обратной комплементарной цепи. Несоответствия оснований могут быть до некоторой степени допустимыми, если в условиях в клетке участок нуклеотидов все еще способен гибридизоваться с обратно комплементарной частью. В контексте настоящего изобретения присутствие несоответствия в олигонуклеотиде по изобретению является предпочтительным, поскольку в одном варианте осуществления указанный олигонуклеотид является по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% обратно комплементарным области первого экзона и/или области второго экзона. Присутствие несоответствия в указанном олигонуклеотиде является предпочтительной характеристикой изобретения, поскольку указанный олигонуклеотид способен связываться с областью указанного первого и с областью указанного второго экзона, как определено в настоящем описании выше.

Другие преимущества обеспечения присутствия несоответствия оснований в антисмысловом олигонуклеотиде по изобретению определены в настоящем описании, и они сходны с преимуществами, обеспечиваемыми присутствием инозина (гипоксантина), и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований: избегание присутствия CpG, избегание или снижение потенциальной мультимеризации или агрегации, избегание квадруплексных структур, возможность конструирования олигонуклеотида с улучшенной кинетикой связывания РНК и/или термодинамическими свойствами.

Предпочтительно, обратная комплементарность олигонуклеотида области идентичности между указанными первым и/или вторым экзонами составляет от 45% до 65%, от 50% до 75%, но более предпочтительно от 65% до 100% или от 70% до 90%, или от 75% до 85%, или от 80% до 95%. Как правило, это обеспечивает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 несоответствий в олигонуклеотиде из 20 нуклеотидов. Таким образом, в олигонуклеотиде из 40 нуклеотидов может быть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований. Предпочтительно, в олигонуклеотиде из 40 нуклеотидов присутствует менее 14 несоответствий оснований. Количество несоответствий оснований является таким, что олигонуклеотид по изобретению все еще способен связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на область указанного первого экзона и на область указанного второго экзона, тем самым, индуцируя пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов и индуцируя продукцию транскрипта в рамке считывания, как объяснено в настоящем описании. Предпочтительно, продукции транскрипта в рамке считывания достигают по меньшей мере с 5% эффективностью при использовании по меньшей мере 100 нМ указанного олигонуклеотида для трансфекции соответствующей клеточной культуры in vitro, как объяснено в настоящем описании выше.

Следует отметить, что изобретение охватывает олигонуклеотид, который не обладает никаким несоответствием оснований с областью первого экзона и который может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований с соответствующей областью второго экзона, как определено в настоящем описании. Однако изобретение также охватывает олигонуклеотид, который не имеет никакого несоответствия оснований с областью второго экзона и который может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований с соответствующей областью первого экзона, как определено в настоящем описании. Наконец, изобретение охватывает олигонуклеотид, который может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 или 22 несоответствия оснований с областью первого экзона и который может иметь 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 несоответствие оснований с соответствующей областью второго экзона, как определено в настоящем описании. Вновь, в рамках настоящего изобретения следует понимать, что количество несоответствий оснований в олигонуклеотиде по изобретению является таким, чтобы этот указанный олигонуклеотид все еще был способен связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на область указанного первого экзона и область указанного второго экзона, как пояснено в настоящем описании.

Олигонуклеотид по изобретению предпочтительно не пересекает пропуск в выравнивании области первого экзона и области второго экзона, как определено в настоящем описании. Выравнивание предпочтительно проводят с использованием сетевого инструмента EMBOSS Matcher, как пояснено в настоящем описании выше. Однако в конкретных случаях возможно, что олигонуклеотид по изобретению должен пересекать пропуск, как упомянуто в настоящем описании выше. Предпочтительно, указанный пропуск представляет собой только один пропуск. Указанный пропуск предпочтительно охватывает менее 3 нуклеотидов, наиболее предпочтительно только один нуклеотид. Количество и длина пропусков являются такими, что олигонуклеотид по изобретению все еще способен связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на область указанного первого экзона и область указанного второго экзона, тем самым, индуцируя пропускание по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзонов и индуцируя продукцию транскрипта в рамке считывания, как пояснено в настоящем описании.

Структуру (т.е. открытые и закрытые структуры) наилучшим образом анализируют в контексте пре-мРНК, где находится экзон. Такую структуру можно анализировать в истинной РНК. Однако в настоящее время возможно спрогнозировать вторичную структуру молекулы РНК (с наибольшими затратами энергии) достаточно тщательно с использованием моделирующих структуру программ. Неограничивающим примером подходящей программы является интернет-сервер Mfold (Zuker, M.).

Специалист в данной области способен спрогнозировать с приемлемой воспроизводимостью вероятную структуру экзона, учитывая нуклеотидную последовательность. Наилучшее прогнозирование осуществляют, когда программе предоставляют как последовательность указанного экзона, так и последовательности фланкирующих интронов. Как правило, не является необходимым моделирование структуры всей пре-мРНК.

Отжиг олигонуклеотида по изобретению может влиять на локальное сворачивание или 3D-структуру или конформацию РНК-мишени (т.е. область, охватывающую по меньшей мере первый и/или второй экзоны). Отличающаяся конформация может приводить к нарушению структуры, распознаваемой аппаратом сплайсинга. Однако, когда в первом и/или втором экзоне-мишени присутствуют потенциальные (скрытые) акцепторные и/или донорные последовательности сплайсинга, иногда образуется новая структура, определяющая отличающийся (нео-) экзон, т.е. с отличающимся 5'-концом, отличающимся 3'-концом или обоими из них. Этот тип активности находится в объеме настоящего изобретения, поскольку экзон-мишень исключается из мРНК. Присутствие нового экзона, содержащего часть указанного первого и/или второго экзона-мишени в мРНК, не изменяет тот факт, что экзон-мишень, как таковой, исключается. Включение нового экзона можно наблюдать в качестве побочного эффекта, который происходит только изредка. Существует две возможности, когда пропускание экзона используется для восстановления (части) открытой рамки считывания транскрипта, которая разрушается в результате мутации. Одной из них является то, что новый экзон является функциональным в отношении восстановления рамки считывания, в то время как в другом случае рамка считывания не восстанавливается. При выборе олигонуклеотида для восстановления открытой рамки считывания с помощью пропускания множества экзонов, безусловно, очевидно, что в этих условиях выбирают только те олигонуклеотиды, которые действительно приводят к пропусканию экзона, которое восстанавливает открытую рамку считывания данного транскрипта, с новым экзоном или без него.

Кроме того, в другом предпочтительном варианте осуществления предусматривается олигонуклеотид по изобретению, который способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и с областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона (предпочтительные области для экзонов дистрофина указаны в таблице 2 или таблице 6), где указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзонов указанной пре-мРНК; что приводит к транскрипту, который находится в рамке считывания (для DMD, предпочтительно, как в таблице 1 или таблице 6). Указанный олигонуклеотид обеспечивает у указанного индивидуума функциональный или полуфункциональный белок, и указанный олигонуклеотид дополнительно содержит: последовательность, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с, является обратно комплементарной для и/или способна ингибировать функцию одного или нескольких участков связывания серин-аргининового (SR) белка в РНК экзона из пре-мРНК.

В патентной заявке WO 2006/112705 авторы настоящего изобретения описали наличие корреляции между эффективностью внутреннего антисмыслового олигонуклеотида (AON) экзона в отношении индукции пропускания экзонов и присутствием предполагаемого участка связывания SR в заданном участке пре-мРНК указанного AON. Таким образом, в одном варианте осуществления получают указанный олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, включая определение одного или нескольких (предполагаемых) участков связывания для белка SR в РНК указанного первого и/или указанного второго экзона и получение соответствующего олигонуклеотида, который способен связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарным указанной РНК и который по меньшей мере частично перекрывает указанный (предполагаемый) участок связывания. Термин "по меньшей мере частично перекрывает" определяют в настоящем описании как включающий перекрывание только одного нуклеотида участка связывания SR, а также множества нуклеотидов одного или нескольких указанных участков связывания, а также полное перекрывание одного или нескольких указанных участков связывания. Этот вариант осуществления, предпочтительно, дополнительно включает определение во вторичной структуре первого и/или второго экзона области, которая гибридизуется с другой частью указанного первого и/или второго экзона (закрытая структура), и области, которая не гибридизуется в указанной структуре (открытая структура), а затем получение олигонуклеотида, который по меньшей мере частично перекрывает один или несколько указанных (предполагаемых) участков связывания, и который перекрывает по меньшей мере часть указанной закрытой структуры и перекрывает по меньшей мере часть указанной открытой структуры, и который связывается с, нацеливается на, гибридизуется с и/или является обратно комплементарным первому и второму экзонам. Таким образом, авторы настоящего изобретения увеличивают вероятность получения олигонуклеотида, который способен препятствовать включению указанного первого и второго экзонов, и, если это применимо, полного участка экзонов между ними, из пре-мРНК в мРНК. Без связи с какой-либо теорией, в настоящее время полагают, что применение олигонуклеотида, направленного на участок связывания белка SR, приводит (по меньшей мере частично) к нарушению связывания белка SR с указанным участком связывания, что приводит к нарушенному или ухудшенному сплайсингу.

Предпочтительно, область первого экзона и/или область второго экзона в одной и той же пре-мРНК, с которой способен связываться олигонуклеотид по изобретению, содержит открытую/закрытую структуру и/или участок связывания белка SR, более предпочтительно указанная открытая/закрытая структура и указанный участок связывания белка SR частично перекрываются, и еще более предпочтительно указанная открытая/закрытая структура полностью перекрывает участок связывания белка SR, или участок связывания белка SR полностью перекрывает открытую/закрытую структуру. Это обеспечивает дальнейшее нарушение включения экзона.

Помимо консенсусных последовательностей участков связывания, множество (или даже все) экзонов содержат регулирующие сплайсинг последовательности, такие как последовательности энхансера сплайсинга экзонов (ESE), чтобы облегчить распознавание истинных участков сплайсинга сплайсингосомой (Cartegni L, et al. 2002; и Cartegni L, et al., 2003). Подгруппа факторов связывания, называемых белками SR, может связываться с этими ESE и привлекать другие факторы сплайсинга, такие как U1 и U2AF, в (слабо определенные) участки сплайсинга. Участки сплайсинга четырех из наиболее распространенных белков SR (SF2/ASF, SC35, SRp40 и SRp55) проанализированы детально (Cartegni L, et al. 2002 и Cartegni L, et al., 2003). Существует корреляция между эффективностью олигонуклеотида и наличием/отсутствием участка связывания SF2/ASF, SC35, SRp40 и SRp55 в части первого экзона, с которой связывается, гибридизуется и/или на которую нацеливается указанный олигонуклеотид. В предпочтительном варианте осуществления изобретение, таким образом, относится к олигонуклеотиду, который связывается с, гибридизуется с, нацеливается на и/или обратно комплементарен участку связывания для белка SR. Предпочтительно, указанный SR белок представляет собой SF2/ASF или SC35, SRp40 или SRp55. В одном варианте осуществления олигонуклеотид связывается с, гибридизуется с, нацеливается на и/или является обратно комплементарным участку связывания белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 в первом экзоне и участку связывания другого белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 во втором экзоне. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид связывается с, гибридизуется с, нацеливается на и/или является обратно комплементарным участку связывания белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 в первом экзоне и участку связывания сходного белка SF2/ASF, SC35, SRp40 или SRp55 во втором экзоне.

В одном варианте осуществления у пациента обеспечивают функциональный или полуфункциональный белок с использованием олигонуклеотида, который способен связываться с, нацеливаться на регуляторную последовательность РНК, присутствующую в первом и/или втором экзоне, которая требуется для правильного сплайсинга указанного экзона(ов) в транскрипте. Для правильного сплайсинга экзонов в транскрипте требуется несколько цис-действующих последовательностей РНК. В частности, идентифицированы дополнительные элементы, такие как энхансеры сплайсинга экзонов (ESE), для регуляции специфического и эффективного сплайсинга конститутивных и альтернативных экзонов. С использованием соединения, содержащего олигонуклеотид, который связывается или способен связываться с одним из дополнительных элементов в указанном первом и/или втором экзоне(ах), их регуляторная функция нарушается так, что экзоны пропускаются. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению способен связываться с областью первого экзона в пре-мРНК и областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона, где указанный олигонуклеотид способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзона в указанной пре-мРНК; где указанная область указанного первого экзона и/или указанная область указанного второго экзона содержит энхансер сплайсинга экзонов (ESE), последовательность распознавания экзонов (ERS) и/или последовательность энхансера сплайсинга (SES), и/или где указанный олигонуклеотид способен связываться с, нацеливаться на, способен ингибировать и/или является обратно комплементарным указанному энхансеру сплайсинга экзонов (ESE), последовательности распознавания экзонов (ERS) и/или последовательности энхансера сплайсинга (SES).

Ниже описаны предпочтительные химические структуры олигонуклеотида по изобретению.

Олигонуклеотид широко известен как олигомер, который имеет базовые характеристики гибридизации, сходные с природными нуклеиновыми кислотами. Гибридизация определена в разделе, посвященном определениям, в конце описания изобретения. В настоящей заявке термины "олигонуклеотид" и "олигомер" используют взаимозаменяемо. Для получения указанного олигонуклеотида по изобретению можно использовать различные типы нуклеозидов. Олигонуклеотид может содержать по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь и/или по меньшей мере одну модификацию сахара и/или по меньшей мере одну модификацию основания по сравнению с встречающимся в природе олигонуклеотидом на основе рибонуклеотида или дезоксирибонуклеотида.

"Модифицированная межнуклеозидная связь" указывает на присутствие модифицированной версии фосфодиэфира относительно встречающейся в природе РНК и ДНК. Примерами модификаций межнуклеозидной связи, которые совместимы с настоящим изобретением, являются фосфоротиоат (PS), хирально чистый фосфоротиоат, фосфородитиоат (PS2), фосфоноацетат (PACE), фосфоноацетамид (PACA), тиофосфоноацетат, тиофосфоноацетамид, фосфоротиоатное пролекарство, H-фосфонат, метилфосфонат, метилфосфонотиоат, метилфосфат, метилфосфоротиоат, этилфосфат, этилфосфоротиоат, боранофосфат, боранофосфоротиоат, метилборанофосфат, метилборанофосфоротиоат, метилборанофосфонат, метилборанофосфонотиоат и их производные. Другая модификация включает фосфорамидит, фосфорамидат, фосфорамидат, фосфородиамидат, фосфортиоамидат, фосфорoтиодиамидат, сульфамат, диметиленсульфоксид, сульфонат, метиленимино (MMI), оксалил- и тиоацетамидонуклеиновую кислоту (TANA); и их производные. В зависимости от длины, олигонуклеотид по изобретению может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 модификаций основной цепи. Также изобретение охватывает внесение в указанный олигонуклеотид более одной отличающейся модификации основной цепи.

Также изобретение охватывает олигонуклеотид, который содержит межнуклеозидную связь, которая может отличаться с точки зрения атомов нуклеозидов, которые связаны друг с другом, по сравнению со встречающейся в природе межнуклеозидной связью. В этом отношении, олигонуклеотид по изобретению может содержать по меньшей мере одну межнуклеозидную связь, сконструированную как мономеры, связанные 3’-3’, 5’-5’, 2’-3’, 2’-5’, 2’-2’. Нумерация положений может отличаться для других химических структур, однако идея сохраняется в объеме изобретения.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную модификацию. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению является полностью модифицированным посредством фосфоротиоата.

"Модификация сахара" указывает на присутствие модифицированной версии рибозильной части относительно рибозильной части во встречающихся в природе РНК и ДНК (т.е. фуранозильная часть), такой как бициклические сахара, тетрагидропираны, структуры морфолино, 2'-модифицированные сахара, 3’-модифицированные сахара, 4'-модифицированные сахара, 5'-модифицированные сахара и 4'-замещенные сахара. Примеры подходящих модификаций сахаров включают, но не ограничиваются ими, 2’-O-модифицированные нуклеотидные остатки РНК, такие как 2’-O-алкил или 2’-O-(замещенный)алкил, например 2’-O-метил, 2’-O-(2-цианоэтил), 2’-O-(2-метокси)этил (2’-MOE), 2’-O-(2-тиометил)этил, 2’-O-бутирил, 2’-O-пропаргил, 2’-O-аллил, 2’-O-(2-амино)пропил, 2’-O-(2-(диметиламино)пропил), 2’-O-(3-амино)пропил, 2’-O-(3-(диметиламино)пропил), 2’-O-(2-амино)этил, 2’-O-(3-гуанидино)пропил (как описано в патентной заявке WO 2013/061295, University of the Witwatersrand, включенной в настоящее описание в качестве ссылки), 2’-O-(2-(диметиламино)этил); 2’-O-(галогеналкокси)метил (Arai K. et al.), например, 2’-O-(2-хлорэтокси)метил (MCEM), 2’-O-(2,2-дихлорэтокси)метил (DCEM); 2’-O-алкоксикарбонил, например, 2’-O-[2-(метоксикарбонил)этил] (MOCE), 2’-O-[2-(N-метилкарбамоил)этил] (MCE), 2’-O-[2-(N,N-диметилкарбамоил)этил] (DMCE); 2’-O-[метиламинокарбонил]метил; 2’-азидо; 2’-амино и 2’-замещенный амино; 2’-галоген, например, 2’-F, FANA (2’-F арабинозилнуклеиновая кислота); карбо- и аза- модификации сахаров; 3’-O-алкил, например, 3’-O-метил, 3’-O-бутирил, 3’-O-пропаргил; 2’,3’-дидезокси; и их производные.

Другая модификация сахара включает "мостиковые" или "бициклические" (BNA) модифицированные части сахаров нуклеиновой кислоты, такие, как встречаются, например, в закрытой нуклеиновой кислоте (LNA), ксило-LNA, α-L-LNA, β-D-LNA, cEt (2’-O,4’-C связанный этил) LNA, cMOEt (2’-O,4’-C связанный метоксиэтил) LNA, связанной этиленовым мостиком нуклеиновой кислоте (ENA), BNA^NC[N-Me] (как описано в Chem. Commun. 2007, 3765-3767 Kazuyuki Miyashita et al., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), CRN, как описано в патентной заявке WO 2013/036868 (Marina Biotech, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме); разомкнутой нуклеиновой кислоте (UNA) или других ациклических нуклеозидах, таких как описаны в патентной заявке США US 2013/0130378 (Alnylam Pharmaceuticals), включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме; 5’-метил-замещенных BNA (как описано в патентной заявке США 13/530218, которая включена в качестве ссылки в полном объеме); циклогексенилнуклеиновой кислоте (CeNA), алтриолнуклеиновой кислоте (ANA), гекситолнуклеиновой кислоте (HNA), фторированной HNA (F-HNA), пиранозил-РНК (p-РНК), 3’-дезоксипиранозил-ДНК (p-ДНК); или других модифицированных частях сахаров, таких как морфолино (PMO), катионный морфолино (PMOPlus), PMO-X; трициклоДНК; трицикло-PS-ДНК; и их производные. Производные BNA описаны, например, в WO 2011/097641, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Примеры PMO-X описаны в WO2011150408, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В зависимости от длины, олигонуклеотид по изобретению может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 модификаций сахаров. Также изобретение охватывает внесение более одной отличающейся модификации сахаров в указанный олигонуклеотид.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию сахара, выбранную из 2’-O-метила, 2’-O-(2-метокси)этила, 2’-F, морфолино, мостикового нуклеотида или BNA, или олигонуклеотид содержит как мостиковые нуклеотиды, так и 2’-дезоксинуклеотиды (смешанные BNA/ДНК-меры). Было показано, что олигонуклеотиды, содержащие 2’-фтор (2-‘F) нуклеотид, способны привлекать связывающий энхансер интерлейкина фактор 2 и 3 (ILF2/3) и, тем самым, способны индуцировать пропускание экзонов в пре-мРНК-мишени (Rigo F, et al., WO2011/097614).

В другом варианте осуществления олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, содержит или состоит из LNA или ее производного. Более предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению модифицирован по его всей длине модификацией сахара, выбранной из 2’-O-метила, 2’-O-(2-метокси)этила, морфолино, мостиковой нуклеиновой кислоты (BNA) или смешанного BNA/ДНК-мера. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению является полностью 2’-O-метил-модифицированным.

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию сахара и по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. Такие модификации включают пептидно-нуклеиновую кислоту (PNA), модифицированную борным кластером PNA, окси-пептидно-нуклеиновую кислоту на основе пирролидина (POPNA), нуклеиновую кислоту на основе гликоля или глицерина (GNA), нуклеиновую кислоту на основе треозы (TNA), ациклическую нуклеиновую кислоту на основе треонинола (aTNA), олигонуклеотиды на основе морфолино (PMO, PPMO, PMO-X), катионные олигомеры на основе морфолино (PMOPlus, PMO-X), олигонуклеотиды с объединенными основаниями и остовами (ONIB), пирролидин-амидные олигонуклеотиды (POM); и их производные. В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит остов пептидно-нуклеиновой кислоты и/или остов морфолинофосфородиамидата или их производное. В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению является 2’-O-метилфосфоротиоат-модифицированным, т.е. содержит по меньшей мере одну 2’-O-метилфосфоротиоатную модификацию, предпочтительно олигонуклеотид по изобретению является полностью 2’-O-метилфосфоротиоат-модифицированным. Предпочтительно, 2’-O-метилфосфоротиоат-модифицированный олигонуклеотид или полностью 2’-O-метилфосфоротиоат-модифицированный олигонуклеотид представляет собой РНК-олигонуклеотид.

Термин "модификация основания" или "модифицированное основание", как определено в настоящем описании, относится к модификации встречающегося в природе основания в РНК и/или ДНК (т.е. пиримидинового или пуринового основания) или к синтезированным de novo основаниям. Такое синтезированное de novo основание может рассматриваться как "модифицированное" по сравнению с существующим основанием.

В дополнение к модификациям, описанным выше, олигонуклеотид по изобретению может содержать дополнительные модификации, такие как различные типы нуклеотидных остатков нуклеиновой кислоты или нуклеотидов, как описано ниже. Для получения олигонуклеотида по изобретению можно использовать различные типы нуклеотидных остатков нуклеиновой кислоты. Указанный олигонуклеотид может иметь по меньшей мере одну модификацию основной цепи и/или сахара и/или по меньшей мере одну модификацию основания по сравнению с олигонуклеотидом на основе РНК или ДНК.

Олигонуклеотид может содержать природные основания пурины (аденин, гуанин) или пиримидины (цитозин, тимин, урацил) и/или модифицированные основания, как определено ниже. В контексте изобретения урацил может быть заменен тимином.

Модификация оснований включает модифицированную версию природных пуриновых и пиримидиновых оснований (например, аденин, урацил, гуанин, цитозин и тимин), таких как гипоксантин, оротовая кислота, агматидин, лизидин, псевдоурацил, псевдотимин, N1-метилпсевдоурацил, 2-тиопиримидин (например, 2-тиоурацил, 2-тиотимин), 2,6-диаминопурин, G-зажим и его производные, 5-замещенный пиримидин (например, 5-галогенурацил, 5-метилурацил, 5-метилцитозин, 5-пропинилурацил, 5-пропинилцитозин, 5-аминометилурацил, 5-гидроксиметилурацил, 5-аминометилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин, Super T), 5-октилпиримидин, 5-тиофенпиримидин, 5-октин-1-илпиримидин, 5-этинилпиримидин, 5-(пиридиламид), 5-изобутил, 5-фенил, как описано в патентной заявке US 2013/0131141 (RXi), включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме; 7-деазагуанин, 7-деазааденин, 7-аза-2,6-диаминопурин, 8-аза-7-деазагуанин, 8-аза-7-деазааденин, 8-аза-7-деаза-2,6-диаминопурин, Super G, Super A и N4-этилцитозин, или их производные; N2-циклопентилгуанин (cPent-G), N2-циклопентил-2-аминопурин (cPent-AP) и N2-пропил-2-аминопурин (Pr-AP), или их производные; и вырожденные или универсальные основания, такие как 2,6-дифтортолуол, или отсутствующие основания, такие как абазические участки (например, 1-дезоксирибоза, 1,2-дидезоксирибоза, 1-дезокси-2-O-метилрибоза; или производные пирролидина, в которых кислород кольца заменен азотом (азарибоза)). Примеры производных Super A, Super G и Super T могут быть найдены в патенте США 6683173 (Epoch Biosciences), который включен в настоящее описание в качестве ссылки. Было показано, что cPent-G, cPent-AP и Pr-AP снижает иммуностимулирующие эффекты при включении в миРНК (siRNA) (Peacock H. et al.), и сходные признаки были показаны для псевдоурацила и N1-метилпсевдоурацила (патентная заявка США 2013/0123481, modeRNA Therapeutics, включенная в настоящее описание качестве ссылки в полном объеме).

"Тимин" и "5-метилурацил" могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо. Аналогично, "2,6-диаминопурин" идентичен "2-аминоаденину", и эти термины могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо.

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один 5-метилцитозин и/или по меньшей мере один 5-метилурацил и/или по меньшей мере одно 2,6-диаминопуриновое основание, что следует понимать как то, что по меньшей мере одно из цитозиновых нуклеиновых оснований указанного олигонуклеотида модифицировано путем замены протона в положении 5 кольца пиримидина метильной группой (т.е. 5-метилцитозином), и/или что по меньшей мере одно из урацильных нуклеиновых оснований указанного олигонуклеотида модифицировано путем замены протона в положении 5 кольца пиримидина метильной группой (т.е. 5-метилурацил), и/или что по меньшей мере одно из адениновых нуклеиновых оснований указанного олигонуклеотида модифицировано путем замены протона в положении 2 аминогруппой (т.е. 2,6-диаминопурин), соответственно. В контексте изобретения выражение "замена протона метильной группой в положении 5 кольца пиримидина" может быть заменено выражением "замена пиримидина 5-метилпиримидином", причем пиримидин обозначает только урацил, только цитозин или оба из них. Аналогично, в контексте изобретения выражение "замена протона аминогруппой в положении 2 аденина" может быть заменено выражением "замена аденина 2,6-диаминопурином". Если указанный олигонуклеотид содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более остатков цитозина, урацила и/или аденина, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более остатков цитозина, урацила и/или аденина, соответственно, могут быть модифицированы таким путем. В предпочтительном варианте осуществления все остатки цитозина, все остатки урацила и/или все остатки аденина модифицированы таким путем или заменены 5-метилцитозином, 5-метилурацилом и/или 2,6-диаминопурином, соответственно.

Было обнаружено, что присутствие 5-метилцитозина, 5-метилурацила и/или 2,6-диаминопурина в олигонуклеотиде по изобретению имеет положительный эффект по меньшей мере на один из параметров или улучшение по меньшей мере одного из параметров указанного олигонуклеотида. В этом контексте параметры могут включать: аффинность и/или кинетику связывания, активность сайленсинга, биостабильность, (внутритканевое) распределение, клеточный захват и/или транспорт, и/или иммуногенность указанного олигонуклеотида, как объяснено ниже.

Поскольку известно, что несколько модификаций, упомянутых выше, увеличивает величину Tm и, таким образом, усиливает связывание определенного нуклеотида с его аналогом на его мРНК-мишени, эти модификации могут быть исследованы в отношении усиления связывания олигонуклеотида по изобретению как с областью первого экзона, так и с областью второго экзона, в контексте изобретения. Поскольку последовательности олигонуклеотида по изобретению могут не быть на 100% обратно комплементарными данной области первого экзона и/или второго экзона, увеличивающие Tm модификации, такие как мостиковый нуклеотид или BNA (такой как LNA) или модификация основания, выбранная из 5-метилпиримидинов и/или 2,6-диаминопурина, предпочтительно могут быть осуществлены в нуклеотидном положении, которое обратно комплементарно указанной первой и/или указанной второй области указанных экзонов.

Аффинность связывания и/или кинетика связывания или гибридизации зависят от термодинамических свойств AON. Они по меньшей мере частично определяются температурой плавления указанного олигонуклеотида (Tm; вычисляемая, например, с помощью калькулятора свойств олигонуклеотидов (http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html или http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) для одноцепочечной РНК с использованием базовой Tm и модели ближайшего соседа) и/или свободной энергией комплекса олигонуклеотида и экзона-мишени (с использованием RNA structure версии 4.5 или РНК mfold версии 3.5). Если Tm увеличивается, активность пропускания экзона, как правило, возрастает, однако ожидается, что, когда Tm является слишком высокой, AON станет менее специфичным к последовательности. Приемлемая Tm и свободная энергия зависят от последовательности олигонуклеотида. Таким образом, трудно привести предпочтительные диапазоны для каждого из этих параметров.

Активность олигонуклеотида по изобретению предпочтительно определяют следующим образом:

- смягчение одного или нескольких симптома(ов) заболевания, ассоциированного с мутацией, присутствующей в первом и/или во втором экзоне, и/или с мутацией, присутствующей в участке, начинающемся в указанном первом экзоне и оканчивающемся в указанном втором экзоне, предпочтительно смягчение одного или нескольких симптома(ов) DMD или BMD; и/или

- смягчение одной или нескольких характеристик клетки от пациента, предпочтительно мышечной клетки от пациента; и/или

- обеспечение у указанного индивидуума функционального или полуфункционального белка, предпочтительно функционального или полуфункционального белка дистрофина; и/или

- по меньшей мере частичное снижение продукции аберрантного белка у указанного индивидуума, предпочтительно по меньшей мере частичное снижение продукции аберрантного белка дистрофина у указанного индивидуума. Каждый из этих признаков и анализов для их оценки определен в настоящем описании ниже.

Ожидается, что предпочтительный олигонуклеотид по изобретению, содержащий 5-метилцитозин и/или 5-метилурацил и/или 2,6-диаминопуриновое основание, будет проявлять увеличенную активность по сравнению с соответствующей активностью олигонуклеотида без какого-либо 5-метилцитозина, без какого-либо 5-метилурацила и без какого-либо 2,6-диаминопуринового основания. Это различие в активности может составлять по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%. Биораспределение и биостабильность предпочтительно по меньшей мере частично определяются валидированным анализом лигирования при гибридизации, взятого из Yu et al., 2002. В одном варианте осуществления образцы плазмы или образцы гомогенизированной ткани инкубируют с конкретным улавливающим олигонуклеотидным зондом. После разделения, DIG-меченный олигонуклеотид лигируют с комплексом и проводят детекцию с использованием связанной с антителом против DIG пероксидазой. Некомпартментный анализ фармакокинетики проводят с использованием пакета программ WINNONLIN (модель 200, версия 5.2, Pharsight, Mountainview, CA). Проводят мониторинг уровней AON (мкг) на мл плазмы или мг ткани с течением времени для оценки площади под кривой (AUC), максимальной концентрации (Cmax), времени до достижения максимальной концентрации (Tmax), терминального времени полужизни и латентного периода всасывания (tlag). Такой предпочтительный анализ описан в экспериментальной части.

Олигонуклеотид может стимулировать врожденный иммунный ответ путем активации Toll-подобных рецепторов (TLR), включая TLR9 и TLR7 (Krieg A.M., et al., 1995). Активация TLR9, как правило, происходит вследствие присутствия неметилированных последовательностей CG, присутствующих в олигодезоксинуклеотидах (ODN), посредством имитации бактериальной ДНК, которая активирует врожденную иммунную систему посредством опосредуемого TLR9 высвобождения цитокинов. Однако 2’-O-метил-модификация может значительно снижать такой возможный эффект. Описано, что TLR7 распознает урациловые повторы в РНК (Diebold S.S., et al., 2006).

Активация TLR9 и TLR7 приводит к набору скоординированных иммунных ответов, которые включают врожденный иммунитет (макрофаги, дендритные клетки (DC) и NK-клетки) (Krieg A.M., et al., 1995; Krieg A.M., et al. 2000). В этот процесс вовлечено несколько хемокинов и цитокинов, таких как IP-10, TNFα, IL-6, MCP-1 и IFNα (Wagner H., et al., 1999; Popovic P.J., et al., 2006). Воспалительные цитокины привлекают дополнительные защитные клетки из крови, такие как T- и B-клетки. Уровни этих цитокинов можно исследовать с помощью исследования in vitro. В кратком изложении, цельную кровь человека инкубируют с возрастающими концентрациями олигонуклеотидов, после чего уровни цитокинов определяют с помощью стандартных коммерчески доступных наборов для ELISA. Снижение иммуногенности предпочтительно соответствует поддающемуся обнаружению снижению концентрации по меньшей мере одного из цитокинов, упомянутых выше, при сравнении с концентрацией соответствующего цитокина в анализе в клетке, обработанной олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере один 5-метилцитозин и/или 5-метилурацил и/или 2,6-диаминопурин, по сравнению с клеткой, обработанной соответствующим олигонуклеотидом, не имеющим 5-метилцитозинов, 5-метилурацилов или 2,6-диаминопуринов.

Таким образом, предпочтительный олигонуклеотид по изобретению имеет улучшенный параметр, такой как приемлемая или сниженная иммуногенность и/или лучшее биораспределение и/или приемлемая или улучшенная кинетика связывания РНК и/или термодинамические свойства по сравнению с соответствующим олигонуклеотидом без 5-метилцитозина, без 5-метилурацила и без 2,6-диаминопурина. Каждый из этих параметров можно оценивать с использованием анализов, известных специалисту в данной области.

Предпочтительный олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из молекулы РНК или модифицированной молекулы РНК. В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид является одноцепочечным. Однако квалифицированному специалисту будет понятно, что одноцепочечный олигонуклеотид может образовывать внутреннюю двухцепочечную структуру. Однако этот олигонуклеотид, тем не менее, называют одноцепочечным олигонуклеотидом в контексте настоящего изобретения. Одноцепочечный олигонуклеотид имеет несколько преимуществ по сравнению с двухцепочечным олигонуклеотидом миРНК: (i) ожидается, что его синтез будет более простым, чем синтез двух комплементарных цепей миРНК; (ii) существует более широкий диапазон химических модификаций, возможных для повышения захвата в клетки, более высокой (физиологической) стабильности и снижения потенциальных общих неблагоприятных эффектов; (iii) миРНК имеют более высокий потенциал для неспецифических эффектов (включая гены вне мишени) и улучшенную фармакологию (например, возможен меньший контроль эффективности и селективности схемы лечения или дозы); и (iv) миРНК с меньшей вероятностью будут действовать в ядре и не могут быть направлены против интронов.

В другом варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит абазический участок или абазический мономер. В контексте изобретения такой мономер может называться абазическим участком или абазическим мономером. Абазический мономер представляет собой нуклеотидный остаток или структурный элемент, который лишен нуклеинового основания, по сравнению с соответствующим нуклеотидным остатком, содержащим нуклеиновое основание. В рамках изобретения абазический мономер, таким образом, представляет собой часть структурного элемента олигонуклеотида, но лишенную нуклеинового основания. Такой абазический мономер может присутствовать, или может быть связан, или может быть присоединен, или может быть конъюгирован со свободным концом олигонуклеотида.

В более предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит 1-10 или более абазических мономеров. Таким образом, в олигонуклеотиде по изобретению может находиться 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более абазических мономеров.

Абазический мономер может представлять собой любой тип, известный и понятный квалифицированному специалисту, неограничивающие примеры которых представлены ниже:

В рамках настоящего изобретения, R₁ и R₂ независимо представляют собой H, олигонуклеотид или другой абазический участок(ки) при условии, что не оба из R₁ и R₂ представляют собой H и R₁ и R₂ не оба являются олигонуклеотидами. Абазический мономер(ы) может быть связан с любым или с обоими концами олигонуклеотида, как указано выше. Следует отметить, что олигонуклеотид, связанный с одним или двумя абазическим участком(ами) или абазическим мономером(ами), может содержать менее 10 нуклеотидов. В этом отношении олигонуклеотид по изобретению может содержать по меньшей мере 10 нуклеотидов, необязательно включающих один или несколько абазических участков или абазических мономеров на одном или обоих концах. Другие примеры абазических участков, которые охватываются изобретением, описаны в патентной заявке США 2013/013378 (Alnylam Pharmaceuticals), включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

В зависимости от длины олигонуклеотид по изобретению может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 модификаций оснований. Также изобретение охватывает внесение более одной определенной модификации оснований в указанный олигонуклеотид.

Таким образом, в одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит:

(a) по меньшей мере одну модификацию основания, выбранную из 2-тиоурацила, 2-тиотимина, 5-метилцитозина, 5-метилурацила, тимина, 2,6-диаминопурина; и/или

(b) по меньшей мере одну модификацию сахара, выбранную из 2’-O-метила, 2’-O-(2-метокси)этила, 2’-O-дезокси (ДНК), 2’-F, морфолино, мостикового нуклеотида или BNA, или олигонуклеотид содержит как мостиковые нуклеотиды, так и 2’-дезокси-модифицированные нуклеотиды (смешанные BNA/ДНК-меры); и/или

(c) по меньшей мере одну модификацию основной цепи, выбранную из фосфоротиоата или фосфородиамидата.

В другом варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит:

(a) по меньшей мере одну модификацию оснований, выбранную из 5-метилпиримидина и 2,6-диаминопурина; и/или

(b) по меньшей мере одну модификацию сахара, которая представляет собой 2’-O-метил; и/или

(c) по меньшей мере одну модификацию основной цепи, которая представляет собой фосфоротиоат.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере одну модификацию по сравнению со встречающимся в природе олигонуклеотидом на основе рибонуклеотида или дезоксирибонуклеотида, более предпочтительно

(a) по меньшей мере одну модификацию основания, предпочтительно выбранную из 2-тиоурацила, 2-тиотимина, 5-метилцитозина, 5-метилурацила, тимина, 2,6-диаминопурина, более предпочтительно, выбранную из 5-метилпиримидина и 2,6-диаминопурина; и/или

(b) по меньшей мере одну модификацию сахара, предпочтительно выбранную из 2’-O-метила, 2’-O-(2-метокси)этила, 2’-O-дезокси (ДНК), 2’-F, морфолино, мостикового нуклеотида или BNA, или олигонуклеотид содержит как мостиковые нуклеотиды, так и 2’-дезокси-модифицированные нуклеотиды (смешанные BNA/ДНК-меры), более предпочтительно модификация сахара представляет собой 2’-O-метил; и/или

(c) по меньшей мере одну модификацию основной цепи, предпочтительно выбранную из фосфоротиоата или фосфородиамидата, более предпочтительно модификация основной цепи представляет собой фосфоротиоат.

Таким образом, олигонуклеотид согласно этому варианту осуществления изобретения содержит модификацию основания (a) и отсутствие модификации сахара (b) и отсутствие модификации основной цепи (c). Другой предпочтительный олигонуклеотид согласно этому аспекту изобретения включает модификацию сахара (b) и отсутствие модификации основания (a) и отсутствие модификации основной цепи (c). Другой предпочтительный олигонуклеотид согласно этому аспекту изобретения содержит модификацию основной цепи (c) и отсутствие модификации основания (a) и отсутствие модификации сахара (b). Также предполагается, что настоящее изобретение охватывает олигонуклеотиды, не имеющие ни одной из упомянутых выше модификаций, а также олигонуклеотиды, содержащие две, т.е. (a) и (b), (a) и (c) и/или (b) и (c), или все три из модификаций (a), (b) и (c), как определено выше.

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению модифицирован по всей его длине одной или несколькими одинаковыми модификациями, выбранными из (a) одной из модификаций оснований; и/или (b) одной из модификаций сахара; и/или (c) одной из модификаций основной цепи.

С появлением технологии имитации нуклеиновых кислот стало возможным получать молекулы, которые обладают сходными, предпочтительно одинаковыми по типу характеристиками гибридизации, но не обязательно сходными количественными характеристиками, с самой нуклеиновой кислотой. Такие функциональные эквиваленты, безусловно, также являются пригодными для применения в рамках изобретения.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид содержит инозин, гипоксантин, универсальное основание, вырожденное основание и/или нуклеозид или нуклеотид, содержащие основание, способное образовывать качающуюся пару оснований или ее функциональный эквивалент. Применение инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, является высокоперспективным, как пояснено ниже. Инозин, например, является известным модифицированным основанием, которое может образовывать пару с тремя основаниями: урацил, аденин и цитозин. Инозин представляет собой нуклеозид, который образуется, когда гипоксантин связан с кольцом рибозы (также известным как рибофураноза) через β [бета]-N9-гликозидную связь. Инозин (I) обычно встречается в тРНК, и он необходим для надлежащей трансляции генетического кода в качающихся парах оснований. Качающаяся пара оснований может существовать между G и U, или между I с одной стороны и U, A или C с другой стороны. Это является фундаментальным при образовании вторичной структуры РНК. Ее термодинамическая стабильность сравнима с термодинамической стабильностью пары оснований Уотсона-Крика. Генетический код исправляет несоответствия в количестве аминокислот (20) для триплетных кодонов (64), с использованием модифицированных пар оснований в первом основании антикодона.

Первое преимущество использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, позволяет конструировать олигонуклеотид, который способен связываться с областью первого экзона из пре-мРНК и способен связываться с областью второго экзона в той же пре-мРНК, где указанная область из указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Иными словами, присутствие инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, позволяет связывание указанного олигонуклеотида с областью первого экзона и с областью второго экзона указанной пре-мРНК.

Второе преимущество использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, позволяет конструировать олигонуклеотид, который охватывает однонуклеотидный полиморфизм (SNP), без опасения, что полиморфизм нарушит эффективность отжига олигонуклеотида. Таким образом, в рамках изобретения использование такого основания позволяет конструирование олигонуклеотида, который можно использовать для индивидуума, имеющего SNP в участке пре-мРНК, на который нацелен олигонуклеотид по изобретению.

Третье преимущество использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, представляет собой случай, когда указанный олигонуклеотид в норме содержит CpG, если он сконструирован как являющийся комплементарным части первого экзона пре-мРНК, как определено в настоящем описании. Присутствие CpG в олигонуклеотиде обычно ассоциировано с увеличенной иммуногенностью указанного олигонуклеотида (Dorn A. and Kippenberger S.). Эта увеличенная иммуногенность является нежелательной, поскольку она может индуцировать разрушение мышечных волокон. Ожидается, что замена гуанина инозином в одном, двух или более CpG в указанном олигонуклеотиде обеспечит олигонуклеотид со сниженным и/или приемлемым уровнем иммуногенности. Иммуногенность можно оценивать в модели на животных путем оценки присутствия клеток CD4⁺ и/или CD8⁺ и/или инфильтрации воспалительных мононуклеоцитов в биоптате мышц указанного животного. Иммуногенность также можно оценивать в крови животного или человека, подвергаемого лечению олигонуклеотидом по изобретению, путем обнаружения присутствия нейтрализующего антитела и/или антитела, распознающего указанный олигонуклеотид, с использованием стандартного иммуноанализа, известного квалифицированному специалисту. Увеличение иммуногенности предпочтительно соответствует поддающемуся обнаружению увеличению по меньшей мере одного из этих типов клеток по сравнению с количеством каждого типа клеток в соответствующем биоптате мышц животного до обработки или лечения соответствующим олигонуклеотидом, имеющим по меньшей мере один инозин (гипоксантин) и/или универсальное основание и/или вырожденное основание и/или нуклеотид, содержащий основание, способное образовывать качающуюся пару оснований. Альтернативно, увеличение иммуногенности можно оценивать путем обнаружения присутствия или увеличения количества нейтрализующего антитела или антитела, распознающего указанный олигонуклеотид, с использованием стандартного иммуноанализа. Снижение иммуногенности предпочтительно соответствует поддающемуся обнаружению снижению по меньшей мере одного из этих типов клеток по сравнению с количеством соответствующего типа клеток в соответствующем биоптате мышц животного до лечения или после лечения соответствующим олигонуклеотидом, не имеющим инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований. Альтернативно, снижение иммуногенности можно оценивать по отсутствию или снижению количества указанного соединения и/или нейтрализующих антител с использованием стандартного иммуноанализа.

Четвертым преимуществом использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, является избегание или снижение потенциальной мультимеризации или агрегации олигонуклеотидов. Например, известно, что олигонуклеотид, содержащий мотив G-квартет, имеет тенденцию к образованию квадруплекса, мультимера или агрегата, образованного хугстиновским спариванием оснований четырех одноцепочечных олигонуклеотидов (Cheng A.J. и Van Dyke M.W.), что, безусловно, нежелательно: ожидается, что в результате этого эффективность олигонуклеотида снизится. Мультимеризацию или агрегацию предпочтительно оценивают стандартными способами полиакриламидного неденатурирующего гель-электрофореза, известными квалифицированному специалисту. В предпочтительном варианте осуществления менее 20% или 15%, 10%, 7%, 5% или менее от общего количества олигонуклеотида по изобретению обладает способностью к мультимеризации или агрегации, оцениваемой с использованием анализа, упомянутого выше.

Пятым преимуществом использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, таким образом, также является избегание квадруплексных структур, которая ассоциирована с антитромботической активностью (Macaya R.F., et al.), а также со связыванием с и ингибированием фагоцитарного рецептора макрофагов (Suzuki K., et al.).

Шестым преимуществом использования инозина (гипоксантина) и/или универсального основания и/или вырожденного основания и/или нуклеотида, содержащего основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, в олигонуклеотиде по изобретению, является возможность конструирования олигонуклеотида с улучшенной кинетикой связывания РНК и/или термодинамическими свойствами. Кинетика связывания РНК и/или термодинамические свойства по меньшей мере частично определяются температурой плавления олигонуклеотида (Tm; вычисляемая с помощью калькулятора свойств олигонуклеотидов (http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html) для одноцепочечной РНК с использованием базовой Tm и модели ближайшего соседа) и/или свободной энергией комплекса AON и экзона-мишени (с использованием RNA structure версии 4.5). Если Tm является чрезмерно высокой, ожидается, что олигонуклеотид будет менее специфичным. Приемлемая Tm и свободная энергия зависят от последовательности олигонуклеотида. Таким образом, трудно привести предпочтительные диапазоны для каждого из этих параметров. Приемлемая Tm может находиться в диапазоне от 35 до 85°C, и приемлемая свободная энергия может находиться в диапазоне от 15 до 45 ккал/моль.

В зависимости от длины, олигонуклеотид по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 остатков инозина (гипоксантина) и/или универсальных оснований и/или вырожденных оснований и/или нуклеотидов, содержащих основание, способное образовывать качающуюся пару оснований, или их функциональные эквиваленты.

Предпочтительно, указанный олигонуклеотид по изобретению содержит РНК, поскольку дуплексы РНК/РНК являются высокостабильными. Является предпочтительным, чтобы РНК-олигонуклеотид содержал модификацию, обеспечивающую РНК с дополнительным свойством, например, устойчивостью к эндонуклеазам, экзонуклеазам и РНК-азе H, дополнительной прочностью гибридизации, увеличенной стабильностью (например, в жидкостях организма), увеличенной или сниженной пластичностью, сниженной токсичностью, увеличенным внутриклеточным транспортом, тканевой специфичностью и т.д. Предпочтительные модификации описаны выше.

Таким образом, один вариант осуществления относится к олигонуклеотиду, который содержит по меньшей мере одну модификацию. Предпочтительный модифицированный олигонуклеотид является полностью 2'-O-метил-модифицированным. В одном варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит или состоит из гибридного олигонуклеотида, содержащего модификацию 2'-O-метил-фосфоротиоатным олигорибонуклеотидом и модификацию мостиковой нуклеиновой кислотой (BNA, как проиллюстрировано выше). В другом варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит или состоит из гибридного олигонуклеотида, содержащего модификацию 2’-O-метоксиэтилфосфоротиоатом и мостиковую нуклеиновую кислоту (BNA, как проиллюстрировано выше). В другом варианте осуществления изобретения олигонуклеотид содержит или состоит из гибридного олигонуклеотида, содержащего модификацию мостиковой нуклеиновой кислотой (BNA, как проиллюстрировано выше) и модификацию олигодезоксирибонуклеотидом. Эта конкретная комбинация обладает лучшей специфичностью последовательности по сравнению с эквивалентом, состоящим только из мостиковой нуклеиновой кислоты, и обладает увеличенной эффективностью по сравнению с олигонуклеотидом, состоящим из модификации 2'-O-метилфосфоротиоатным олиго(дезокси)рибонуклеотидом.

Соединение, как описано в рамках изобретения, предпочтительно может обладать ионогенными группами. Ионогенные группы могут представлять собой основания или кислоты, и они могут быть заряженными или нейтральными. Ионогенные группы могут присутствовать в качестве пары ионов с соответствующим противоионом, который имеет противоположный заряд(ы). Примерами катионных противоионов являются натрий, калий, цезий, Tris, литий, кальций, магний, триалкиламмоний, триэтиламмоний и тетраалкиламмоний. Примерами анионных противоионов являются хлорид, бромид, йодид, лактат, мезилат, ацетат, трифторацетат, дихлорацетат и цитрат. Примеры противоионов описаны [например, Kumar L, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме]. Примеры применения двух- или трехвалентных противоионов, особенно Ca²⁺, описаны в качестве дополнительных положительных характеристик к определенным олигонуклеотидам в патентной заявке США 2012046348 (Replicor), которая включена в качестве ссылки в полном объеме. Предпочтительные двухвалентные или трехвалентные противоионы выбирают из следующего перечня или группы: кальций, магний, кобальт, железо, марганец, барий, никель, медь и цинк. Предпочтительным двухвалентным противоионом является кальций. Таким образом, настоящее изобретение охватывает приготовление, получение и применение композиции, содержащей олигонуклеотид по изобретению и любой другой противоион, определенный выше, предпочтительно кальций.

Такой способ получения указанной композиции, содержащей указанный олигонуклеотид и указанный противоион, предпочтительно кальций, может быть следующим: олигонуклеотид по изобретению можно растворять в фармацевтически приемлемом водном эксципиенте, и постепенно к растворенному олигонуклеотиду можно добавлять раствор, содержащий указанный противоион, чтобы хелатный комплекс олигонуклеотида оставался растворимым.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению приводят в контакт с композицией, содержащей такой противоион, предпочтительно Ca²⁺, для формирования хелатного комплекса олигонуклеотида, содержащего два или более идентичных олигонуклеотидов, связанных таким противоионом, как определено в настоящем описании. Композиция, содержащая хелатный комплекс олигонуклеотида, содержащий два или более идентичных олигонуклеотида, связанных противоионом, предпочтительно кальцием, таким образом, охватывается настоящим изобретением.

Способ конструирования олигонуклеотида

Таким образом, в следующем аспекте изобретения предусматривается способ конструирования олигонуклеотида, где указанный способ приводит к олигонуклеотиду, как определено выше.

Этот способ включает следующие стадии:

(a) идентификация комбинации в рамке считывания первого и второго экзона в одной и той же пре-мРНК, где область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с областью указанного первого экзона;

(b) конструирование олигонуклеотида, который способен связываться с указанной областью указанного первого экзона и указанной областью указанного второго экзона; и

(c) где указанное связывание приводит к пропусканию указанного первого экзона и указанного второго экзона, предпочтительно к пропусканию мультиэкзонного участка, начинающегося указанным первым экзоном и охватывающего один или несколько экзонов, присутствующих между указанным первым и указанным вторым экзонами, и, в лучшем случае, к пропусканию всего участка экзонов между указанным первым и указанным вторым экзонами.

На стадии b) такого способа указанный олигонуклеотид предпочтительно конструируют так, чтобы его связывание препятствовало по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в указанных областях указанного первого и/или второго экзонов в указанной пре-мРНК.

Альтернативно или в комбинации с препятствованием регулирующей сплайсинг последовательности, связывание указанного олигонуклеотида предпочтительно препятствует вторичной структуре, охватывающей по меньшей мере указанный первый и/или указанный второй экзоны в указанной пре-мРНК.

Олигонуклеотид, получаемый этим способом, способен индуцировать пропускание указанных первого и второго экзонов в указанной пре-мРНК. Предпочтительно индуцируется пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно располагается между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный мРНК-транскрипт находится в рамке считывания. Олигонуклеотид предпочтительно способен индуцировать пропускание всего участка экзонов между указанным первым экзоном и указанным вторым экзоном. В одном варианте осуществления указанные области указанного первого экзона и указанного второго экзона содержат регулирующий сплайсинг элемент, так что связывание указанного олигонуклеотида способно препятствовать по меньшей мере одной регулирующей сплайсинг последовательности в указанных областях указанных первого и второго экзонов. Также предусматривается, что связывание указанного олигонуклеотида препятствует вторичной структуре, охватывающей по меньшей мере указанный первый и/или указанный второй экзоны в указанной пре-мРНК. Предпочтительная регулирующая сплайсинг последовательность содержит участок связывания серин-аргининового (SR) белка, энхансер сплайсинга экзонов (ESE), последовательность распознавания экзонов (ERS) и/или сайленсер сплайсинга экзонов (ESS).

Каждый признак этого способа уже определен в настоящем описании или известен квалифицированному специалисту.

Предпочтительные олигонуклеотиды

Предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению предназначен для применения в качестве лекарственного средства, более предпочтительно, указанное соединение предназначено для применения в модулирующих РНК терапевтических средствах. Более предпочтительно, указанное модулирование РНК приводит к коррекции нарушенной транскрипционной рамки считывания и/или к восстановлению экспрессии желаемого или ожидаемого белка. Таким образом, способ по изобретению и олигонуклеотид по изобретению можно в принципе применять к любому заболеванию, связанному с присутствием нарушающей рамку считывания мутации, что приводит к аберрантному транскрипту и/или к отсутствию кодируемого белка и/или к присутствию аберрантного белка. В предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению и олигонуклеотид по изобретению применяют к ассоциированным с заболеванием генам, содержащим повторяющиеся последовательности и, таким образом, области с относительно высокой идентичностью последовательности (т.е. по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80% идентичностью последовательности между областью второго экзона и областью первого экзона, как определено в настоящем описании). Неограничивающими примерами являются гены со спектрин-подобными повторами (поскольку ген DMD вовлечен в мышечную дистрофию Дюшенна, как описано в настоящем описании), Kelch-подобными повторами (как например, ген KLHL3, вовлеченный в семейную гиперкалиемическую гипертензию (Louis-Dit-Picard H et al.), ген KLHL6, вовлеченный в хронический лимфоцитарный лейкоз (Puente XS et al.), ген KLHL7, вовлеченный в пигментный ретинит (Friedman JS et al.), гены KLHL7/12, вовлеченные в синдром Шегрена (Uchida K et al.), ген KLHL9, вовлеченный в дистальную миопатию (Cirak S et al.), ген KLHL16 или GAN, вовлеченный в гигантскую аксональную невропатию (Bomont P et al.) , гены KLHL19 или KEAP1, вовлеченные в несколько злокачественных опухолей (Dhanoa BS et al.), ген KLHL20, вовлеченный в промиелоцитарный лейкоз (Dhanoa BS et al.) , или гены KLHL37 или ENC1, вовлеченные в опухоли головного мозга (Dhanoa BS et al.), FGF-подобными повторами, EGF-подобными повторами (как, например, ген NOTCH3, вовлеченный в CADASIL (Chabriat H et al.), гены SCUBE, вовлеченные в злокачественную опухоль или метаболическое заболевание костей, ген нейрексина-1 (NRXN1), вовлеченный в нейропсихиатрические нарушения и идиопатическую генерализованную эпилепсию (Moller RS et al.), ген Del-1, ген тенасцин-C (TNC), вовлеченный в атеросклероз и болезнь коронарных артерий (Mollie A et al.), ген THBS3 или ген фибриллина (FBN1), вовлеченный в синдром Марфана (Rantamaki T et al.), анкирин-подобными повторами (как, например, ген ANKRD1, вовлеченный в кардиомиопатию с дилятацией (Dubosq-Bidot L et al.), ген ANKRD2, ген ANKRD11, вовлеченные в синдром KBG (Sirmaci A et al.), ген ANKRD26, вовлеченный в тромбоцитопению (Noris P et al.) или диабет (Raciti GA et al.), ген ANKRD55, вовлеченный в рассеянный склероз (Alloza I et al.), или ген TRPV4, вовлеченный в дистальную спинальную мышечную атрофию (Fiorillo C et al.), HEAT-подобными повторами (как, например, ген, вовлеченный в болезнь Хантингтона), аннексин-подобными повторами, лейцин-богатыми повторами (как, например, гены NLRP2 и NLRP7, вовлеченные в идиопатическое привычное невынашивание беременности (Huang JY et al.)), ген LRRK2, вовлеченный в болезнь Паркинсона (Abeliovich A et al.), ген NLRP3, вовлеченный в болезнь Альцгеймера или менингит (Heneka MT et al.), ген NALP3, вовлеченный в почечную недостаточность (Knauf F et al.), или ген LRIG2, вовлеченный в урофациальный синдром (Stuart HM et al.), или доменами ингибитора сериновой протеазы (как, например, ген SPINK5, вовлеченный в синдром Незертона (Hovnanian A et al.), как описано в Andrade M.A. et al.

В контексте изобретения предпочтительной пре-мРНК или транскриптом является пре-мРНК или транскрипт дистрофина. Эта предпочтительная пре-мРНК или транскрипт предпочтительно являются человеческими. Заболевание, связанное с присутствием мутации, присутствующей в пре-мРНК дистрофина, представляет собой DMD или BMD, в зависимости от мутации. Предпочтительные комбинации и области первого и второго экзонов из пре-мРНК дистрофина, подлежащие применению в контексте изобретения, представлены в таблице 2.

В предпочтительном варианте осуществления соединение по изобретению используют для индукции пропускания экзона в клетке, в органе, в ткани и/или у пациента, предпочтительно у пациента с BMD или DMD или в клетке, органе, ткани, происходящих из указанного пациента. Пропускание экзона приводит к зрелой мРНК, которая не содержит пропущенного экзона, и, таким образом, когда указанный экзон кодирует аминокислоты, оно может приводить к экспрессии измененного, внутренне укороченного, но от частично до в большой степени функционального продукта дистрофина. Технология пропускания экзонов в настоящее время направлена на применение AON или транскрибирующих AON генных конструкций. Способы пропускания экзонов в настоящее время используют для борьбы с генетическими мышечными дистрофиями. Недавно авторами настоящего изобретения и другими исследователями были сообщены перспективные результаты в отношении терапии на основе индуцируемого AON пропускания экзонов, нацеленной на восстановление рамки считывания пре-мРНК дистрофина из мыши mdx и от пациентов с DMD (Heemskerk H., et al., Cirak S., et al., Goemans et al.). Путем направленного пропускания конкретного экзона тяжелый фенотип DMD (отсутствие функционального дистрофина) преобразуется в более мягкий фенотип BMD (экспрессия функционального или полуфункционального дистрофина). Пропускание экзона предпочтительно индуцируется связыванием AON, нацеленных на внутреннюю последовательность экзона.

Ниже изобретение иллюстрируется при помощи мутантной пре-мРНК дистрофина, где присутствуют первый и второй экзоны. Как определено в настоящем описании, пре-мРНК дистрофина предпочтительно означает пре-мРНК гена DMD, кодирующего белок дистрофина. Мутантная пре-мРНК дистрофина соответствует пре-мРНК пациента с BMD или DMD с мутацией по сравнению с пре-мРНК DMD дикого типа у здорового индивидуума, что приводит к (сниженным уровням) аберрантному белку (BMD), или к отсутствию функционального дистрофина (DMD). Пре-мРНК дистрофина также называют пре-мРНК DMD. Ген дистрофина также может быть называться геном DMD. Дистрофин и DMD могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо.

Пациент предпочтительно означает пациента, имеющего DMD или BMD, как определено в настоящем описании ниже, или пациента, предрасположенного к развитию DMD или BMD вследствие его (или ее) генетического фона. В случае пациента с DMD, используемое соединение предпочтительно корректирует мутацию, присутствующую в гене DMD указанного пациента и, таким образом, предпочтительно образует белок дистрофина, сходный с белком дистрофина пациента с BMD: указанный белок предпочтительно представляет собой функциональный или полуфункциональный дистрофин, как определено в настоящем описании ниже. В случае пациента с BMD, антисмысловой олигонуклеотид по изобретению предпочтительно модифицирует мутацию, присутствующую в гене BMD указанного пациента и предпочтительно образует дистрофин, который является более функциональным, чем дистрофин, который исходно присутствует у указанного пациента с BMD.

Как определено в настоящем описании, функциональный дистрофин предпочтительно представляет собой дистрофин дикого типа, соответствующий белку, имеющему аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO: 1. Функциональный дистрофин предпочтительно представляет собой дистрофин, который имеет действующий связывающий домен в его N-концевой части (первые 240 аминокислот на N-конце), цистеин-богатый домен (аминокислоты с 3361 по 3685) и C-концевой домен (последние 325 аминокислот на C-конца), причем каждый из этих доменов присутствует в дистрофине дикого типа, как известно квалифицированному специалисту. Аминокислоты, указанные в настоящем описании, соответствуют аминокислотам дистрофина дикого типа, указанным в SEQ ID NO: 1. Иными словами, функциональный или полуфункциональный дистрофин представляет собой дистрофин, который проявляет по меньшей мере в некоторой степени активность дистрофина дикого типа. "По меньшей мере в некоторой степени" предпочтительно означает по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% соответствующей активности функционального дистрофина дикого типа. В этом контексте активность функционального дистрофина предпочтительно представляет собой связывание с актином и взаимодействие с ассоциированным с дистрофином гликопротеиновым комплексом (DGC) или (DAGC) (Ehmsen J et al,). Связывание дистрофина с актином и с комплексом DGC можно визуализировать либо посредством ко-иммунопреципитации с использованием экстрактов тотального белка, либо посредством иммунофлуоресцентного анализа поперечных срезов из биоптата мышцы, предположительно являющейся дистрофичной, как известно квалифицированному специалисту.

Индивидуумы, страдающие DMD, как правило, имеют мутацию в гене, кодирующем дистрофин, которая препятствует синтезу полного белка, например, преждевременный стоп-кодон препятствует синтезу C-конца. При BMD ген дистрофина также содержит мутацию, однако эта мутация не нарушает открытую рамку считывания и синтезируется C-конец. В результате образуется (полу)функциональный или функциональный белок дистрофин, который обладает сходным типом активности с белком дикого типа, хотя и не обязательно сходным уровнем активности. Геном индивидуума с BMD, как правило, кодирует белок дистрофин, содержащий N-концевую часть (первые 240 аминокислот на N-конце), цистеин-богатый домен (аминокислоты с 3361 по 3685) и C-концевой домен (последние 325 аминокислот на C-конце), однако, в большинстве случаев его центральный домен в форме стержня может быть короче, чем у дистрофина дикого типа (Monaco A.P., et al.).

Пропускание экзонов для лечения DMD, как правило, относится к обходу преждевременного стоп-кодона в пре-мРНК путем пропускания экзона, фланкирующего или содержащего мутацию. Это позволяет коррекцию открытой рамки считывания и синтез внутренне укороченного белка дистрофина, но включающего C-конец. В предпочтительном варианте осуществления у индивидуума, имеющего DMD и подвергаемого лечению олигонуклеотидом по изобретению, синтезируется дистрофин, который проявляет, по меньшей мере в некоторой степени, сходную активность с дистрофином дикого типа. Более предпочтительно, если указанный индивидуум является пациентом с DMD или предположительно является пациентом с DMD, (полу)функциональный дистрофин представляет собой дистрофин индивидуума, имеющего BMD: как правило, указанный дистрофин способен взаимодействовать как с актином, так и с DGC или DAGC (Ehmsen J., et al., Monaco A.P., et al.).

Центральный стержневой домен дистрофина дикого типа содержит 24 спектрин-подобных повтора (Ehmsen J., et al.). Во многих случаях центральный стержневой домен в BMD-подобных белках является более коротким, чем в дистрофине дикого типа (Monaco A.P., et al.). Например, центральный стержневой домен дистрофина, как предусматривается в настоящем описании, может содержать от 5 до 23, от 10 до 22 или от 12 до 18 спектрин-подобных повторов при условии, что он может связываться с актином и с DGC.

Смягчение одного или нескольких симптомов DMD или BMD у индивидуума с использованием соединения по изобретению можно оценивать с помощью любого из следующих анализов: продление времени до прекращения хождения, увеличение мышечной силы, повышение способности поднимать тяжести, улучшение времени вставания с пола, улучшение времени ходьбы на девять метров, улучшение времени подъема на четыре ступеньки, улучшение степени функции ног, улучшение легочной функции, улучшение сердечной функции, улучшение качества жизни. Каждый из этих анализов известен квалифицированному специалисту. В качестве примера, в публикации Manzur et al. (Manzur A.Y. et al.) приводится обширное пояснение каждого из этих анализов. Для каждого из этих анализов, когда выявляют поддающееся обнаружению улучшение или продление параметра, измеряемого в анализе, это предпочтительно означает, что один или несколько симптомов DMD или BMD смягчились у индивидуума с использованием соединения по изобретению. Поддающееся обнаружению улучшение или продление предпочтительно представляет собой статистически значимое улучшение или продление, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.). Альтернативно, смягчение одного или нескольких симптомов DMD или BMD можно оценивать посредством измерения улучшения функции, целостности и/или выживаемости мышечных волокон. В предпочтительном способе один или несколько симптомов пациента с DMD или BMD смягчается и/или одна или несколько характеристик одной или нескольких мышечных клеток от пациента с DMD или BMD улучшается. Такие симптомы или характеристики можно оценивать на клеточном, тканевом уровне или у самого пациента.

Смягчение одной или нескольких характеристик мышечной клетки от пациента с DMD или BMD можно оценивать с помощью любого из следующих анализов на миогенной клетке или мышечной клетке от этого пациента: сниженный захват кальция мышечными клетками, сниженный синтез коллагена, измененная морфология, измененный биосинтез липидов, сниженный окислительный стресс и/или улучшенная функция, целостность и/или выживаемость мышечных волокон. Эти параметры обычно оценивают с использованием иммунофлуоресцентных и/или гистохимических анализов поперечных срезов биоптатов мышц.

Улучшение функции, целостности и/или выживаемости мышечных волокон можно оценивать с использованием по меньшей мере одного из следующих анализов: поддающееся обнаружению снижение уровня креатинкиназы в крови, поддающееся обнаружению снижение некроза мышечных волокон в поперечном срезе биоптата мышцы, предположительно являющейся дистрофической, и/или поддающееся обнаружению повышение гомогенности диаметра мышечных волокон в поперечном срезе биоптата мышцы, предположительно являющейся дистрофической. Каждый из этих анализов известен квалифицированному специалисту.

Креатинкиназу можно выявлять в крови, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.). Поддающееся обнаружению снижение креатинкиназы может означать снижение на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с концентрацией креатинкиназы у того же пациента с DMD или BMD до лечения.

Поддающееся обнаружению снижение некроза мышечных волокон предпочтительно оценивают в биоптате мышц, более предпочтительно, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.), с использованием поперечных срезов биоптатов. Поддающееся обнаружению снижение некроза может представлять собой снижение, составляющее 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более от площади, где идентифицирован некроз с использованием поперечных срезов биоптатов. Снижение измеряют путем сравнения с некрозом, как оценивают у того же пациента с DMD или BMD до лечения.

Поддающееся обнаружению повышение гомогенности диаметра мышечных волокон предпочтительно оценивают в поперечном срезе биоптата, более предпочтительно, как описано в Hodgetts et al. (Hodgetts S., et al.). Увеличение измеряют путем сравнения с гомогенностью диаметра мышечного волокна у того же пациента с DMD или BMD до лечения.

Предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению обеспечивает у указанного индивидуума (более высокие уровни) функциональный и/или (полу)функциональный белок дистрофин (как для DMD, так и для BMD) и/или способен, по меньшей мере частично, снижать продукцию аберрантного белка дистрофина у указанного индивидуума. В этом контексте, функциональный и/или полуфункциональный дистрофин может означать, что может образовываться несколько форм функционального и/или полуфункционального дистрофина. Этого можно ожидать, когда область с по меньшей мере 50% идентичностью между первым и вторым экзонами перекрывается с одной или несколькими другими областями с по меньшей мере 50% идентичностью между другими первым и вторым экзонами, и где указанный олигонуклеотид способен связываться с указанной перекрывающейся частью, так что несколько различных участков экзонов пропускается и продуцируется несколько различных транскриптов в рамке считывания. Эта ситуация иллюстрируется в примере 4, где один единственный олигонуклеотид по изобретению (PS816; SEQ ID NO: 1679) способен индуцировать продукцию нескольких транскриптов в рамке считывания, все из которых имеют общий экзон 10 в качестве первого экзона, и где второй экзон может представлять собой экзон 13, 14, 15, 18, 20, 27, 30, 31, 32, 35, 42, 44, 47, 48 или 55.

Более высокие уровни относятся к увеличению уровня функционального и/или (полу)функционального белка дистрофина по сравнению с соответствующим уровнем функционального и/или (полу)функционального белка дистрофина у пациента до начала лечения олигонуклеотидом по изобретению. Уровень указанного функционального и/или (полу)функционального белка дистрофина предпочтительно оценивают с использованием иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга (белок).

Снижение продукции аберрантной мРНК дистрофина или аберрантного белка дистрофина предпочтительно означает, что 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или менее от первоначального количества аберрантной мРНК дистрофина или аберрантного белка дистрофина все еще поддается обнаружению с помощью ОТ-ПЦР (мРНК) или иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга (белок). Аберрантную мРНК или белок дистрофина также обозначают в настоящем описании как менее функциональную (по сравнению с функциональным белком дистрофина дикого типа, как определено в настоящем описании ранее) или нефункциональную мРНК или белок дистрофина. Нефункциональный белок дистрофина предпочтительно представляет собой белок дистрофина, который не способен связывать актин и/или представителей белкового комплекса DGC. Нефункциональный белок дистрофина или мРНК дистрофина, как правило, не обладает или не кодирует белок дистрофина с интактным C-концом белка. В предпочтительном варианте осуществления используют способ пропускания экзонов (также называемый модулированием РНК или переключением сплайсинга).

Увеличение продукции функциональной и/или полуфункциональной мРНК и/или белка дистрофина предпочтительно означает, что такая функциональная и/или полуфункциональная мРНК и/или белок дистрофина поддаются обнаружению или увеличены по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с выявляемым количеством указанной мРНК и/или белка в начале лечения. Указанное выявление можно осуществлять с использованием ОТ-ПЦР (мРНК) или иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга (белок).

В другом варианте осуществления соединение по изобретению обеспечивает у указанного индивидуума функциональный или полуфункциональный белок дистрофина. Этот функциональный или полуфункциональный белок или мРНК дистрофина можно выявлять в качестве аберрантного белка или мРНК дистрофина, как пояснено в настоящем описании выше.

Посредством направленного совместного пропускания указанных двух экзонов (указанный первый и указанный второй экзоны) можно индуцировать пропускание дополнительного экзона(ов), где указанный дополнительный экзон(ы) предпочтительно расположен между указанным первым и указанным вторым экзонами, и где полученный транскрипт дистрофина находится в рамке считывания (предпочтительно, как в таблице 1 или 6), фенотип DMD или тяжелой BMD преобразуется в более мягкий фенотип BMD или даже бессимптомный фенотип. Совместное пропускание указанных двух экзонов предпочтительно индуцируется связыванием олигонуклеотида с областью первого экзона в пре-мРНК дистрофина и связыванием олигонуклеотида с областью второго экзона в пре-мРНК дистрофина, где указанная область указанного второго экзона обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Предпочтительно, указанный первый и указанный второй экзоны дистрофина и области идентичности в них представлены в таблице 2 или 6. Указанный олигонуклеотид предпочтительно не обладает перекрыванием с последовательностями не экзонов. Указанный олигонуклеотид предпочтительно не перекрывается с участками сплайсинга, по меньшей мере не в той степени, в какой они присутствуют в интроне. Указанный олигонуклеотид, направленный на внутреннюю последовательность экзона, предпочтительно не содержит последовательность, обратно комплементарную соседнему интрону. Способ пропускания экзонов предпочтительно используют так, что отсутствие указанных двух экзонов, предпочтительно дополнительного экзона(ов), более предпочтительно расположенного между указанным первым и указанным вторым экзонами, из мРНК, продуцированной с пре-мРНК DMD, образует кодирующую область для (более высокой) экспрессии более (полу)функционального - хотя и более короткого - белка дистрофина. В этом контексте (как правило, у пациента с BMD), ингибирование включения указанных двух экзонов, предпочтительно дополнительного экзона(ов), расположенных между указанным первым и указанным вторым экзонами, предпочтительно означает, что:

- уровень исходной аберрантной (менее функциональной) мРНК дистрофина снижен по меньшей мере на 5% при оценке способом ОТ-ПЦР, или уровень соответствующего аберрантного белка дистрофина снижается по меньшей мере на 2% при оценке с помощью иммунофлуоресцентного анализа или анализа с использованием вестерн-блоттинга с использованием антител против дистрофина; и/или

- транскрипт в рамке считывания, кодирующий полуфункциональный или функциональный белок дистрофин, поддается обнаружению или его уровень возрастает по меньшей мере на 5% при оценке способом ОТ-ПЦР (уровень мРНК) или по меньшей мере на 2% при оценке с помощью иммунофлуоресцентного анализа или вестерн-блоттинга с использованием антител против дистрофина (белковый уровень).

Снижение аберрантного менее функционального или нефункционального белка дистрофина предпочтительно составляет по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, и предпочтительно оно происходит одновременно или параллельно выявлению или увеличенной продукции более функционального или полуфункционального транскрипта или белка дистрофина. В этом контексте (как правило, у пациента с DMD), ингибирование включения указанных двух экзонов, предпочтительно дополнительного экзона(ов), расположенного между указанным первым и указанным вторым экзонами, предпочтительно означает, что у указанного индивидуума обеспечивается (более высокий уровень) более функциональный или (полу)функциональный белок или мРНК дистрофина.

После того, как у пациента с DMD обеспечивают (более высокие уровни) (более) функциональный или полуфункциональный белок дистрофина, причина DMD, по меньшей мере частично, смягчается. Таким образом, можно ожидать, что симптомы DMD в достаточной степени снижаются. Кроме того, настоящее изобретение относится к пониманию того, что пропускание всего участка из по меньшей мере двух экзонов дистрофина в пре-мРНК, содержащей указанные экзоны, индуцируется или усиливается при использовании единственного олигонуклеотида, направленного на (или способного связываться с, или гибридизоваться с, или являющегося обратно комплементарным или способного нацеливаться на) оба из внешних экзона указанного участка. В настоящей заявке, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению, таким образом, по меньшей мере на 80% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 45% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона, как определено в настоящем описании, где указанные первый и второй экзоны соответствуют наружным экзонам участка экзонов, подлежащего пропусканию. Более предпочтительно, указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 85%, 90% 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного первого экзона и по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% обратно комплементарен указанной области указанного второго экзона. Увеличенная частота пропускания также увеличивает уровень более (полу)функционального белка дистрофина, продуцированного в мышечной клетки индивидуума с DMD или BMD.

Олигонуклеотид в соответствии с настоящим изобретением, который предпочтительно используют, предпочтительно является обратно комплементарным или способен связываться, или гибридизоваться, или нацеливаться на область первого экзона дистрофина, причем указанная область имеет по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, предпочтительно является обратно комплементарной или способна связываться, или гибридизоваться, или нацеливаться на область второго экзона дистрофина, причем указанная область имеет по меньшей мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов, где указанная область указанного второго экзона в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона.

В контексте изобретения олигонуклеотид может содержать или состоять из функционального эквивалента олигонуклеотида. Функциональный эквивалент олигонуклеотида предпочтительно означает олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, где один или несколько нуклеотидов заменены, и где активность указанного функционального эквивалента сохраняется по меньшей мере в некоторой степени. Предпочтительно, активность указанного соединения, содержащего функциональный эквивалент олигонуклеотида, представляет собой обеспечение функционального или полуфункционального белка дистрофина. Указанную активность указанного соединения, содержащего функциональный эквивалент олигонуклеотида, таким образом, предпочтительно оценивают путем количественного определения функционального или полуфункционального белка дистрофина. Функциональный или полуфункциональный дистрофин предпочтительно определяют в рамках настоящего изобретения как представляющий собой дистрофин, способный связываться с актином и представителями комплекса белков DGC и поддерживать структуру и гибкость мембран мышечных волокон. Оценка указанной активности соединения, содержащего функциональный олигонуклеотид или эквивалент, предпочтительно включает ОТ-ПЦР (для обнаружения пропускания экзона на уровне РНК) и/или иммунофлуоресценцию или анализ с использованием вестерн-блоттинга (для обнаружения экспрессии и локализации белка). Указанная активность предпочтительно сохраняется, по меньшей мере в некоторой степени, когда она соответствует по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% или более соответствующей активности указанного соединения, содержащего олигонуклеотид, из которого происходит функциональный эквивалент. На протяжении настоящей заявки, когда используют слово "олигонуклеотид", оно может быть заменено его функциональным эквивалентом, как определено в настоящем описании.

Таким образом, применение олигонуклеотида или его функционального эквивалента, содержащего или состоящего из последовательности:

которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого экзона дистрофина,

которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области второго экзона дистрофина,

и

где указанная область второго экзона в пре-мРНК дистрофина обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона, проявляет терапевтические результаты в отношении DMD посредством:

- смягчения одного или нескольких симптомов DMD или BMD; и/или

- смягчения одной или нескольких характеристик мышечной клетки от пациента; и/или

- обеспечения у указанного индивидуума функционального или полуфункционального белка дистрофина; и/или

- по меньшей мере частичного снижения продукции аберрантного белка дистрофина у указанного индивидуума.

Каждый из этих признаков уже определен в настоящем описании.

Предпочтительно, олигонуклеотид содержит или состоит из последовательности, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого экзона DMD или дистрофина, где область второго экзона DMD или дистрофина в той же пре-мРНК обладает по меньшей мере 50% идентичностью с указанной областью указанного первого экзона. Указанные первый и второй экзоны предпочтительно выбирают из группы экзонов, включающей экзоны с 8 по 60, где участок экзонов, начинающийся с первого экзона и содержащий второй экзон в качестве последнего экзона, участок экзонов, начинающийся первым экзоном и содержащий второй экзон в качестве последнего экзона, когда он пропускается, обеспечивает транскрипт в рамке считывания. Предпочтительные комбинации экзонов в рамке считывания в мРНК дистрофина приведены в таблице 1, 2 или 6.

Без связи с какой-либо теорией, идентичность первого и второго экзонов дистрофина можно определять с помощью одного или нескольких из следующих аспектов. В одном варианте осуществления один или несколько интронов, присутствующих между первым экзоном и вторым экзоном, не являются чрезмерно большими. В этом контексте, чрезмерно большой интрон в гене дистрофина может составлять 70, 80, 90, 100, 200 т.п.н. или более; например, интрон 1 (~83 т.п.н.), интрон 2 (~170 т.п.н.), интрон 7 (~110 т.п.н.), интрон 43 (~70 т.п.н.), интрон 44 (~248 т.п.н.), интрон 55 (~119 т.п.н.) или интрон 60 (~96 т.п.н.). Кроме того, в следующем варианте осуществления может предусматриваться пример уже пациента с BMD, у которого экспрессируется укороченный белок дистрофин, где этот первый, этот второй экзон и участок экзонов от указанного первого экзона до указанного второго экзона удалены. Другим критерием может быть относительно большая применимость пропущенных экзонов для объединенных субпопуляций пациентов с DMD (и/или BMD) с конкретными соответствующими мутациями.

В предпочтительном варианте осуществления пропускается участок экзонов DMD в рамке считывания (более предпочтительно, полностью пропускается в одном транскрипте), где наружные экзоны определяются первым и вторым экзонами следующим образом:

- первый экзон представляет собой экзон 8, и второй экзон представляет собой экзон 19 (применимо для ~7% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 9, и второй экзон представляет собой экзон 22 (применимо для ~11% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 9, и второй экзон представляет собой экзон 30 (применимо для ~14% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 18 (применимо для ~5% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10 и второй экзон представляет собой экзон 30 (применимо для ~13% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 42 (применимо для ~16% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 47 (применимо для ~29% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 57 (применимо для ~72% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 10, и второй экзон представляет собой экзон 60 (применимо для ~72% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 11, и второй экзон представляет собой экзон 23 (применимо для ~8% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 13 и второй экзон представляет собой экзон 30 (применимо для ~10% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 23, и второй экзон представляет собой экзон 42 (применимо для ~7% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 34 и второй экзон представляет собой экзон 53 (применимо для ~42% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 40, и второй экзон представляет собой экзон 53 (применимо для ~38% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 44, и второй экзон представляет собой экзон 56 (применимо для ~40% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 45, и второй экзон представляет собой экзон 51 (применимо для ~17% пациентов с DMD)

- первый экзон представляет собой экзон 45 и второй экзон представляет собой экзон 53 (применимо для ~28% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 45, и второй экзон представляет собой экзон 55 (применимо для ~33% пациентов с DMD),

- первый экзон представляет собой экзон 45, и второй экзон представляет собой экзон 60 (применимо для ~37% пациентов с DMD), или

- первый экзон представляет собой экзон 56, и второй экзон представляет собой экзон 60 (применимо для ~2% пациентов с DMD).

Таким образом, в одном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению индуцирует пропускание следующих экзонов дистрофина: экзоны с 8 по 19, экзоны с 9 по 22, экзоны с 9 по 30, экзоны с 10 по 18, экзоны с 10 по 30, экзоны с 10 по 42, экзоны с 10 по 47, экзоны с 10 по 57, экзоны с 10 по 60, экзоны с 11 по 23, экзоны с 13 по 30, экзоны с 23 по 42, экзоны с 34 по 53, экзоны с 40 по 53, экзоны с 44 по 56, экзоны с 45 по 51, экзоны с 45 по 53, экзоны с 45 по 55, экзоны с 45 по 60 или экзоны с 56 по 60.

Предпочтительно, олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из последовательности, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и/или является обратно комплементарной области первого экзона пре-мРНК дистрофина, так что обратно комплементарная часть составляет по меньшей мере 30% длины указанного олигонуклеотида по изобретению, более предпочтительно по меньшей мере 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% или еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, или еще более предпочтительно 98% и наиболее предпочтительно вплоть до 100%. В этом контексте первый экзон предпочтительно представляет собой экзон 8, 9, 10, 11, 13, 23, 34, 40, 44, 45 или 56 пре-мРНК дистрофина, как определено в настоящем описании. Указанный олигонуклеотид может содержать дополнительные фланкирующие последовательности. В более предпочтительном варианте осуществления длина указанной обратно комплементарной части указанного олигонуклеотида составляет по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Можно использовать несколько типов фланкирующих последовательностей. Предпочтительно, фланкирующие последовательности используют для модификации связывания белка с указанным олигонуклеотидом или для модификации термодинамического свойства указанного олигонуклеотида, более предпочтительно для модификации аффинности связывания РНК-мишени. В другом предпочтительном варианте осуществления дополнительные фланкирующие последовательности являются обратно комплементарными последовательностям пре-мРНК дистрофина, которые не присутствуют в указанном экзоне.

В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид содержит или состоит из последовательности, которая способна связываться с, нацеливаться на, гибридизоваться с и является обратно комплементарной по меньшей мере области первого и области второго экзона дистрофина, присутствующей в пре-мРНК дистрофина, где указанные первый и второй экзоны выбраны из группы экзонов 8 (SEQ ID NO: 2), 9 (SEQ ID NO: 3), 10 (SEQ ID NO: 4), 11 (SEQ ID NO: 1761), 13 (SEQ ID NO: 1762),18 (SEQ ID NO: 5), 19 (SEQ ID NO: 6), 22 (SEQ ID NO: 7), 23 (SEQ ID NO: 8), 30 (SEQ ID NO: 9), 34 (SEQ ID NO: 1763), 40 (SEQ ID NO: 1764), 42 (SEQ ID NO: 11), 44 (SEQ ID NO: 1765), 45 (SEQ ID NO: 12), 47 (SEQ ID NO: 10), 51 (SEQ ID NO: 1760), 53 (SEQ ID NO: 13), 55 (SEQ ID NO: 14), 56 (SEQ ID NO: 15), 57 (SEQ ID NO: 1744) или 60 (SEQ ID NO: 16) и указанные области имеют по меньшей мере 10 нуклеотидов. Однако указанные области также могут иметь по меньшей мере 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 или более нуклеотидов. Для предпочтительных экзонов, указанных выше, квалифицированный специалист способен идентифицировать область первого экзона и область второго экзона с использованием способов, известных в данной области. Более предпочтительно используют сетевой инструмент EMBOSS Matcher, как пояснено выше. Еще более предпочтительно, предпочтительные области идентичности первого и второго экзонов дистрофина, с которыми олигонуклеотид по изобретению предпочтительно связывается и/или для которых он является, по меньшей мере частично, обратно комплементарным, представлены в таблице 2. Обратная комплементарность в этом контексте предпочтительно составляет по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%. Предпочтительная олигонуклеотидная последовательность, подлежащая применению в рамках изобретения, способна связываться с, гибридизоваться с, нацеливаться на и/или является обратно комплементарной области идентичности между указанными первым и вторым экзонами, предпочтительно из таблицы 2, и имеет длину по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов, более предпочтительно менее 40 нуклеотидов или более предпочтительно менее 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно менее 25 нуклеотидов и наиболее предпочтительно от 20 до 25 нуклеотидов. Обратная комплементарность в этом контексте предпочтительно составляет по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

В одном варианте осуществления предпочтительный олигонуклеотид является таким, что первый и второй экзоны дистрофина являются такими, как указано в таблице 1, 2 или 6, и указанный олигонуклеотид способен связываться с соответствующими областями первого и второго экзонов, как указано в таблице 2 или 6 и как определяется SEQ ID NO: 17-1670, 1742, 1743 или 1766-1777.

Предпочтительные олигонуклеотиды описаны в таблице 3 и содержат или состоят из SEQ ID NO: 1671-1741. Другие предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1778-1891, как описано в таблице 6. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат SEQ ID NO: 1671-1741 или 1778-1891 и имеют на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов больше или на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов меньше, чем их точный SEQ ID NO, как указано в таблице 3 или 6. Эти дополнительные нуклеотиды могут присутствовать на 5’- или 3’-стороне данного SEQ ID NO. Эти отсутствующие нуклеотиды могут представлять собой нуклеотиды, присутствующие на 5’- или 3’-стороне данного SEQ ID NO. Каждый из этих олигонуклеотидов может иметь любую химическую структуру, как определено в настоящем описании ранее или их комбинации. В каждом из олигонуклеотидов, указанных в настоящем описании с помощью SEQ ID NO, U может быть заменен на T.

Более предпочтительные олигонуклеотиды приведены ниже.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 8 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 19, предпочтительная область экзона 8 содержит или состоит из SEQ ID NO: 17, и предпочтительная область экзона 19 содержит или состоит из SEQ ID NO: 18. Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1722 или 1723 или содержит SEQ ID NO: 1722 или 1723, и имеет длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 13, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 101, и предпочтительная область экзона 13 содержит или состоит из SEQ ID NO: 102.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 14, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 103, и предпочтительная область экзона 14 содержит или состоит из SEQ ID NO: 104.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 15, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 105, и предпочтительная область экзона 15 содержит или состоит из SEQ ID NO: 106.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 18, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 109, и предпочтительная область экзона 18 содержит или состоит из SEQ ID NO: 110. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681, 1778, 1812, 1813, 1884-1886, 1890 или 1891 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1814 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1815-1819 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1820, 1824 и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1826, 1782, 1832 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1821, 1825, 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1822 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1823, 1781, 1829, 1830, 1831 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов,

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1887 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1888 или 1889 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1827 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1828 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 18, другая предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1766, и другая предпочтительная область экзона 18 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1767. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1783, 1833, 1834, 1835 и имеющую длину 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 18, другая предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1768, и другая предпочтительная область экзона 18 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1769. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1673 или 1674 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 20, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 111, и предпочтительная область экзона 20 содержит или состоит из SEQ ID NO: 112.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 27, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 121, и предпочтительная область экзона 27 содержит или состоит из SEQ ID NO: 122.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 30, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 127, и предпочтительная область экзона 30 содержит или состоит из SEQ ID NO: 128. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681, 1812, 1813, 1884-1886, 1890 или 1891 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1814 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1675 или 1676 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1677 или 1678 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1784, 1836 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1786, 1838 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1785, 1837 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 30, другая предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1772, и другая предпочтительная область экзона 30 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1773. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1688, 1689, 1839, 1840, 1841, 1842, 1843 или 1844 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1845, 1846, 1847, 1848 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1849, 1850 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1787, 1851 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 31, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 129, и предпочтительная область экзона 31 содержит или состоит из SEQ ID NO: 130.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 32, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 131, и предпочтительная область экзона 32 содержит или состоит из SEQ ID NO: 132.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 35, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 137, и предпочтительная область экзона 35 содержит или состоит из SEQ ID NO: 138.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 42, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 151, и предпочтительная область экзона 42 содержит или состоит из SEQ ID NO: 152.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 44, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 153, и предпочтительная область экзона 44 содержит или состоит из SEQ ID NO: 154.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 47, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 157, и предпочтительная область экзона 47 содержит или состоит из SEQ ID NO: 158.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 48, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 159, и предпочтительная область экзона 48 содержит или состоит из SEQ ID NO: 160.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 55, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 167, и предпочтительная область экзона 55 содержит или состоит из SEQ ID NO: 168.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 57, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 169, и предпочтительная область экзона 57 содержит или состоит из SEQ ID NO: 170.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 60, предпочтительная область экзона 10 содержит или состоит из SEQ ID NO: 173, и предпочтительная область экзона 60 содержит или состоит из SEQ ID NO: 174.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1673 или содержит SEQ ID NO: 1673 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1675 или содержит SEQ ID NO: 1675 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1677 или содержит SEQ ID NO: 1677 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1679 или содержит SEQ ID NO: 1679 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид содержит последовательность оснований SEQ ID NO: 1679 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Необязательно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 из U в SEQ ID NO: 1679 заменены на T. В предпочтительном варианте осуществления все U в SEQ ID NO: 1679 заменен/заменены на T. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1679, содержит любую из химических структур, определенных в настоящем описании выше: модификацию основания и/или модификацию сахара и/или модификацию основной цепи.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1681 или содержит SEQ ID NO: 1681 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1684 или содержит SEQ ID NO: 1684 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1685 или содержит SEQ ID NO: 1685 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1686 или содержит SEQ ID NO: 1686 и имеет длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1688 или содержит SEQ ID NO: 1688 и имеет длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид содержит последовательность оснований SEQ ID NO: 1688 и имеет длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Необязательно, 1, 2, 3, 4, 5, 6 из U в SEQ ID NO: 1688 заменен/заменены на T. В предпочтительном варианте осуществления все U в SEQ ID NO: 1688 заменены на T. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1688, содержит любую из химических структур, определенных в настоящем описании выше: модификацию основания и/или модификацию сахара и/или модификацию основной цепи.

Для каждого из олигонуклеотидов, соответствующих SEQ ID NO: 1673, 1675, 1677, 1679, 1681, 1684, 1685, 1686 и 1688, первый экзон дистрофина представляет собой экзон 10. Однако второй экзон дистрофина представляет собой экзон 13, 14, 15, 18, 20, 27, 30, 31, 32, 35, 42, 44, 47, 48, 55, 57 или 60. Это означает, что при использовании любого из этих олигонуклеотидов может произойти образование нескольких транскриптов в рамке считывания, каждый из которых приводит к продукции укороченного, но (полу)функционального белка дистрофина.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 11 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 23, предпочтительная область экзона 23 содержит или состоит из SEQ ID NO: 191, и предпочтительная область экзона 23 содержит или состоит из SEQ ID NO: 192. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1794, 1861, 1795, 1862 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1796, 1863, 1797, 1864 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1798, 1865, 1799, 1866 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 13 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 30, предпочтительная область экзона 13 содержит или состоит из SEQ ID NO: 285, и предпочтительная область экзона 30 содержит или состоит из SEQ ID NO: 286. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1808, 1867, 1809, 1868, 1810, 1869, 1858, 1873 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов,

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1811, 1870, 1859, 1874 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1856, 1871, 1860, 1875 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1857, 1872 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 23 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 42, предпочтительная область экзона 23 содержит или состоит из SEQ ID NO: 776, и предпочтительная область экзона 42 содержит или состоит из SEQ ID NO: 777. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1698-1703.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 34 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 53, предпочтительная область экзона 34 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1294, и предпочтительная область экзона 53 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1295. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1800, 1876, 1801, 1877 и имеющую длину 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1802, 1878, 1803, 1879 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 40 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 53, предпочтительная область экзона 40 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1477, и предпочтительная область экзона 53 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1478. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1804, 1880 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

- последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1805, 1881 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 44 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 56, предпочтительная область экзона 44 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1577, и предпочтительная область экзона 56 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1558. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1806, 1882, 1807, 1883 и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 51, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1567, и предпочтительная область экзона 51 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1568. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1730-1731.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 53, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1569, и предпочтительная область экзона 53 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1570. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1732-1737.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 55, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1571, и предпочтительная область экзона 55 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1572. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1704-1719, 1788, 1852, 1789, 1853.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1706 или содержит SEQ ID NO: 1706 и имеет длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1706 и имеющий длину 25 нуклеотидов, состоит из SEQ ID NO: 1706.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1707 или содержит SEQ ID NO: 1707 и имеет длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1707 и имеющий длину 25 нуклеотидов, состоит из SEQ ID NO: 1706.

Предпочтительный олигонуклеотид состоит из SEQ ID NO: 1713 или содержит SEQ ID NO: 1713 и имеет длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов. Предпочтительный олигонуклеотид, содержащий SEQ ID NO: 1713 и имеющий длину 25 нуклеотидов, состоит из SEQ ID NO: 1710.

Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1788, 1852, 1789, 1853 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 55, другая предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1774, и другая предпочтительная область экзона 55 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1775. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1790, 1854, 1792, 1855 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 45 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 60, предпочтительная область экзона 45 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1577, и предпочтительная область экзона 60 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1578. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1738-1741.

Если первый экзон дистрофина представляет собой экзон 56 и второй экзон дистрофина представляет собой экзон 60, предпочтительная область экзона 56 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1742, и предпочтительная область экзона 60 содержит или состоит из SEQ ID NO: 1743. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат или состоят из SEQ ID NO: 1720-1721.

Более предпочтительный олигонуклеотид содержит:

(a) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1673 или 1674 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(b) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1675 или 1676 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(c) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1677 или 1678 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(d) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(e) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1684-1686 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(f) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1688 или 1689 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(g) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1704-1706 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов,

(h) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1707-1709 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов; или

(i) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1710, 1713-1717 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Еще более предпочтительные олигонуклеотиды содержат:

(a) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1679-1681, 1778, 1812, 1813, 1884-1886, 1890 или 1891 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или SEQ ID NO: 1814 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(b) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1688, 1689 или 1839-1844 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(c) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1673 или 1674 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(d) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1675 или 1676 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(e) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1677 или 1678 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(f) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1684-1686 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(g) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1704-1706 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(h) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1707-1709 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(i) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1710, 1713-1717 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(j) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1815-1819 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(k) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1820, 1824, и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(l) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1826, 1782, 1832 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(m) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1821, 1825, 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(n) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1822 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(o) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1823, 1781, 1829, 1830, 1831 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(p) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1783, 1833, 1834, 1835 и имеющую длину 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(q) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1887 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(r) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1888 или 1889 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(s) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1827 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(t) последовательность оснований, определяемую SEQ ID NO: 1828 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(u) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1784, 1836 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(v) или последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1786, 1838 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(w) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1780 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(x) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1785, 1837 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(y) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1845, 1846, 1847, 1848 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(z) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1849, 1850 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(a1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1787, 1851 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(b1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1788, 1852, 1789, 1853 и имеющую длину 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(c1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1790, 1854, 1792, 1855 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(d1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1794, 1861, 1795, 1862 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(e1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1796, 1863, 1797, 1864 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(f1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1798, 1865, 1799, 1866 и имеющую длину 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(g1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1808, 1867, 1809, 1868, 1810, 1869, 1858, 1873 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(h1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1811, 1870, 1859, 1874 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(i1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1856, 1871, 1860, 1875 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(j1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1857, 1872 и имеющую длину 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(k1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1800, 1876, 1801, 1877 и имеющую длину 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(l1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1802, 1878, 1803, 1879 и имеющую длину 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(m1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1804, 1880 и имеющую длину 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(n1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1805, 1881 и имеющую длину 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или

(o1) последовательность оснований, определяемую любой из SEQ ID NO: 1806, 1882, 1807, 1883 и имеющую длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.

Олигонуклеотид по изобретению, который содержит или состоит из последовательности, определяемой номером SEQ ID, также охватывает олигонуклеотид, содержащий последовательность оснований, определяемую этим SEQ ID. Олигонуклеотиды, имеющие модифицированную основную цепь (т.е. модифицированные части сахаров и/или модифицированные межнуклеозидные связи), относительно олигонуклеотидов, определяемых SEQ ID, также охватываются изобретением. Каждое основание U в SEQ ID NO олигонуклеотида, как определено в настоящем описании, может быть модифицировано или заменено на T.

Композиция

В следующем аспекте предусматривается композиция, содержащая олигонуклеотид, как описано в предыдущем разделе под названием "Олигонуклеотид". Эта композиция предпочтительно содержит или состоит из олигонуклеотида, как описано выше. Предпочтительная композиция содержит один единственный олигонуклеотид, как определено выше. Таким образом, понятно, что пропускания по меньшей мере указанного первого и указанного второго экзона достигают с использованием одного единственного олигонуклеотида, а не с использованием коктейля различных олигонуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления указанная композиция предназначена для применения в качестве лекарственного средства. Таким образом, указанная композиция представляет собой фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция обычно содержит фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент. В предпочтительном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению содержит соединение, как определено в настоящем описании, и необязательно дополнительно содержит фармацевтически приемлемый состав, наполнитель, консервант, солюбилизатор, носитель, разбавитель, эксципиент, соль, адъювант и/или растворитель. Такой фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель, консервант, солюбилизатор, разбавитель, соль, адъювант, растворитель и/или эксципиент может быть найден, например, в Remington. Соединение, как описано в рамках изобретения, обладает по меньшей мере одной ионогенной группой. Ионогенная группа может представлять собой основание или кислоту, и она может быть заряженной или нейтральной. Ионогенная группа может присутствовать в качестве пары ионов с соответствующим противоионом, который имеет противоположный заряд(ы). Примерами катионных противоионов являются натрий, калий, цезий, Tris, литий, кальций, магний, триалкиламмоний, триэтиламмоний и тетраалкиламмоний. Примерами анионных противоионов являются хлорид, бромид, йодид, лактат, мезилат, ацетат, трифторацетат, дихлорацетат и цитрат. Примеры противоионов описаны (Kumar L., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид по изобретению приводят в контакт с композицией, содержащей такие ионогенные группы, предпочтительно Ca²⁺, с получением хелатного комплекса олигонуклеотида, содержащего два или более идентичных олигонуклеотидов, связанных таким мультивалентным катионом, как уже определено в настоящем описании.

Фармацевтическую композицию, кроме того, можно составлять, чтобы дополнительно способствовать повышению стабильности, растворимости, всасывания, биодоступности, фармакокинетики и клеточного захвата указанного соединения, в частности, составов, содержащих эксципиенты или конъюгаты, способные образовывать комплексы, наночастицы, микрочастицы, нанотрубки, наногели, гидрогели, полоксамеры или плюроники, полимерсомы, коллоиды, микропузырьки, везикулы, мицеллы, липоплексы и/или липосомы. Примеры наночастиц включают полимерные наночастицы, золотые наночастицы, магнитные наночастицы, частицы на основе диоксида кремния, липидные наночастицы, наночастицы на основе сахаров, белковые наночастицы и пептидные наночастицы.

Предпочтительная композиция содержит по меньшей мере один эксципиент, который может далее способствовать усилению нацеливания и/или доставки указанной композиции и/или указанного олигонуклеотида к и/или в мышцу и/или клетку. Клетка может представлять собой мышечную клетку.

Другая предпочтительная композиция может содержать по меньшей мере один эксципиент, классифицируемый как второй тип эксципиента. Второй тип эксципиента может включать или содержать конъюгатную группу, как описано в настоящем описании, для усиления нацеливания и/или доставки композиции и/или олигонуклеотида по изобретению к ткани и/или клетке и/или в ткань и/или клетку, например, такую как мышечная ткань или клетка. Оба типа эксципиентов можно комбинировать в одну единственную композицию, как определено в настоящем описании. Предпочтительные конъюгатные группы описаны в части, посвященной определениям.

Квалифицированный специалист может выбирать, комбинировать и/или адаптировать один или несколько из описанных выше или других альтернативных эксципиентов и систем для доставки для составления и доставки соединения для применения в рамках настоящего изобретения.

Такую фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить в эффективной концентрации в установленные моменты времени животному, предпочтительно млекопитающему. Более предпочтительным млекопитающим является человек. Соединение или композиция, как определено в настоящем описании, могут быть пригодны для прямого введения в клетку, ткань и/или орган in vivo у индивидуумов, предпочтительно указанные индивидуумы страдают или имеют риск развития BMD или DMD, и их можно вводить прямо in vivo, ex vivo или in vitro. Введение можно осуществлять системным и/или парентеральным путями, например, внутривенным, подкожным, внутрижелудочковым, интратекальным, внутримышечным, интраназальным, энтеральным, интравитреальным, внутрицеребральным, эпидуральным или пероральным путем.

Предпочтительно, такая фармацевтическая композиция по изобретению может быть инкапсулирована в форме эмульсии, суспензии, пилюли, таблетки, капсулы или мягкой желатиновой капсулы для пероральной доставки, или она может быть в форме аэрозоля или сухого порошка для доставки в дыхательные пути и легкие.

В одном варианте осуществления соединение по изобретению можно использовать вместе с другим соединением, уже известным тем, что его используют для лечения указанного заболевания. Такие другие соединения можно использовать для замедления прогрессирования заболевания, для снижения аномального поведения или движений, для снижения воспаления мышечной ткани, для улучшения функции, целостности и/или выживаемости мышечных волокон и/или для улучшения, увеличения или восстановления сердечной функции. Примерами являются, но не ограничиваясь ими, стероид, предпочтительно (глюко)кортикостероид, ингибитор ACE (предпочтительно периндоприл), блокатор рецептора ангиотензина II типа 1 (предпочтительно лозартан), ингибитор фактора некроза опухоли-альфа (TNFα), ингибитор TGFβ (предпочтительно декорин), рекомбинантный бигликан человека, источник mIGF-1, ингибитор миостатина, манноза-6-фосфат, антиоксидант, ингибитор ионных каналов, ингибитор протеаз, ингибитор фосфодиэстеразы (предпочтительно ингибитор PDE5, такой как силденафил или тадалафил), L-аргинин, блокаторы дофамина, амантадин, тетрабеназин и/или кофермент Q10. Это комбинированное применение может представлять собой последовательное применение: каждый компонент вводят в отдельной композиции. Альтернативно, каждое соединение можно использовать вместе в одной композиции.

Применение

В следующем аспекте предусматривается применение композиции или соединения, как описано в настоящем описании, в качестве лекарственного средства или части терапии, или применения, в которых соединение проявляет его активность внутриклеточно.

В предпочтительном варианте осуществления соединение или композиция по изобретению предназначены для применения в качестве лекарственного средства, где лекарственное средство предназначено для профилактики, замедления, смягчения и/или лечения заболевания, как определено в настоящем описании, предпочтительно DMD или BMD.

Способ профилактики, замедления, смягчения и/или лечения заболевания

В следующем аспекте предусматривается способ профилактики, замедления, смягчения и/или лечения заболевания, как определено в настоящем описании, предпочтительно DMD или BMD. Указанное заболевание можно предупреждать, лечить, замедлять или смягчать у индивидуума, в клетке, ткани или органе указанного индивидуума. Способ включает введение олигонуклеотида или композиции по изобретению указанному индивидууму или субъекту, нуждающемуся в этом.

Способ по изобретению, где олигонуклеотид или композиция, как определено в настоящем описании, могут быть пригодными для введения в клетку, ткань и/или орган in vivo индивидуумам, предпочтительно индивидуумам, страдающим BMD или DMD или имеющим риск развития такого заболевания, можно проводить in vivo, ex vivo или in vitro. Индивидуум или субъект, нуждающиеся в этом, предпочтительно представляют собой млекопитающее, более предпочтительно человека.

В одном варианте осуществления в способе по изобретению концентрация олигонуклеотида или композиции находится в диапазоне от 0,01 нМ до 1 мкМ. Более предпочтительно, используемая концентрация составляет от 0,02 до 400 нМ, или от 0,05 до 400 нМ, или от 0,1 до 400 нМ, еще более предпочтительно от 0,1 до 200 нМ.

Диапазоны доз олигонуклеотида или композиции по изобретению предпочтительно выбирают, исходя из исследований с возрастающей дозой в клинических испытаниях (применение in vivo), для которых существуют строгие требования протокола. Олигонуклеотид, как определено в настоящем описании, можно использовать в дозе, которая находится в диапазоне от 0,01 до 200 мг/кг, или от 0,05 до 100 мг/кг, или от 0,1 до 50 мг/кг, или от 0,1 до 20 мг/кг, предпочтительно от 0,5 до 10 мг/кг.

Диапазоны концентрации или дозы олигонуклеотида или композиции, приведенные выше, являются предпочтительными концентрациями или дозами для применений in vitro или ex vivo. Квалифицированному специалисту будет понятно, что в зависимости от типа используемого олигонуклеотида, клетки-мишени, подлежащей лечению, гена-мишени и его уровней экспрессии, используемой среды и условий трансфекции и инкубации, концентрация или доза указанного используемого олигонуклеотида может далее варьировать и может требовать дальнейшей оптимизации.

Определения

"Идентичность последовательностей", как известно в данной области, представляет собой взаимосвязь между двумя или более последовательностями нуклеиновой кислоты (полинуклеотид или нуклеотид), как определяют путем сравнения последовательностей. В данной области процент "идентичности" или "сходства" указывает на степень родственности последовательностей нуклеиновой кислоты при определении по соответствию цепей таких последовательностей. "Идентичность" может быть заменена в настоящем описании "сходством". Предпочтительно, процент идентичности определяют путем сравнения всей SEQ ID NO, как определено в настоящем описании. Однако также можно использовать часть последовательности. Часть последовательности в этом контексте может означать по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% данной последовательности или SEQ ID NO.

"Идентичность" и "сходство" можно без труда вычислить известными способами, включая, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; и Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

Предпочтительные способы определения идентичности разработаны так, чтобы обеспечить наибольшее соответствие между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности и сходства закодированы в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные программы для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают, например, пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984)), BestFit и FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Семейство программ BLAST 2.0, которое можно использовать для поиска сходства в базах данных, включает, например, BLASTN для нуклеотидных последовательностей запроса против нуклеотидных последовательностей из баз данных. Семейство программ BLAST 2.0 является общедоступным от NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Также для определения идентичности можно использовать хорошо известный алгоритм Смита-Ватермана.

Предпочтительные параметры для сравнения нуклеиновых кислот включают следующие параметры: алгоритм: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); матрица сравнений: совпадение=+10, несовпадение=0; штраф за пропуск: 50; штраф за продолжение пропуска: 3. Доступен в качестве программы Gap от Genetics Computer Group, расположенной в Madison, Wis. Выше приведены параметры по умолчанию для сравнений нуклеиновых кислот.

Другим предпочтительным способом определения сходства и идентичности последовательностей является способ с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453, Kruskal, J. B. (1983), обзор сравнения последовательностей: D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley).

Другим предпочтительным способом определения сходства и идентичности последовательностей является способ с использованием EMBOSS Matcher и алгоритма Waterman-Eggert (локальное выравнивание двух последовательностей; [Schoniger и Waterman, Bulletin of Mathematical Biology 1992, Vol. 54 (4), pp. 521-536; Vingron and Waterman, J. Mol. Biol. 1994; 235(1), p1-12]). Можно использовать следующие web-сайты: http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html или http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/matcher. Определения параметров, используемых в этом алгоритме, находится на следующем web-сайте: http://emboss.sourceforge.net/docs/themes/AlignFormats.html#id. Предпочтительно используют параметры по умолчанию (матрица: EDNAFULL, штраф за пропуск: 16, штраф за продолжение пропуска: 4). Emboss Matcher обеспечивает наилучшее локальное выравнивание между двумя последовательностями, однако также предоставляются альтернативные выравнивания. В таблице 2 представлено наилучшее локальное выравнивание между двумя различными экзонами, предпочтительно экзонами дистрофина, которые предпочтительно используют для конструирования олигонуклеотидов. Однако также можно идентифицировать альтернативные выравнивания и, таким образом, альтернативные области идентичности между двумя экзонами, и их можно использовать для конструирования олигонуклеотидов, что также является частью настоящего изобретения.

На протяжении заявки слова "связывается", "нацеливается", "гибридизуется" могут использоваться взаимозаменяемо, когда их используют в контексте олигонуклеотида, который обратно комплементарен области пре-мРНК, как определено в настоящем описании. Аналогично, выражения "способен связываться", "способен нацеливаться" и "способен гибридизоваться" могут использоваться взаимозаменяемо для указания на то, что олигонуклеотид имеет определенную последовательность, которая позволяет связывание, нацеливание или гибридизацию с последовательностью-мишенью. Когда последовательность-мишень определена в настоящем описании или известна в данной области, квалифицированный специалист способен сконструировать все возможные структуры указанного олигонуклеотида с использованием принципа обратной комплементарности. В этом отношении будет понятно, что допустимо ограниченное количество несоответствий или пропусков в последовательности между олигонуклеотидом по изобретению и последовательностями-мишенями в первом и/или втором экзонах при условии, что связывание не изменяется, как рассмотрено выше. Таким образом, олигонуклеотид, который способен связываться с определенной последовательностью-мишенью, может считаться олигонуклеотидом, который обратно комплементарен последовательности-мишени. В контексте изобретения "гибридизуется" или "способен гибридизоваться" используют для физиологических условий в клетке, предпочтительно в клетке человека, если нет иных указаний.

Как используют в рамках изобретения, "гибридизация" относится к спариванию комплементарных олигомерных соединений (например, антисмысловое соединение и его нуклеиновая кислота-мишень). Не ограничиваясь конкретным механизмом, наиболее распространенный механизм образования пар вовлекает образование водородных связей, которое может представлять собой образование водородных связей по типу Уотсона-Крика, Хугстина или обратному хугстиновскому типу между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями (нуклеиновые основания). Например, природное основание аденин представляет собой нуклеиновое основание, комплементарное природному нуклеиновому основанию тимину, 5-метилурацилу и урацилу, которые образуют пару путем образования водородных связей. Природное основание гуанин представляет собой нуклеиновое основание, комплементарное природным основаниям цитозину и 5-метилцитозину. Гибридизация может происходить в различных условиях.

Аналогично, "обратную комплементарность" используют для указания на две нуклеотидных последовательности, которые способны гибридизоваться друг с другом, в то время как одна из последовательностей ориентирована от 3’ к 5’, а другая ориентирована в обратном направлении, т.е. от 5’ к 3’. Таким образом, нуклеозид A на первой нуклеотидной последовательности способен образовывать пару с нуклеозидом A* на второй нуклеотидной последовательности через их соответствующие нуклеиновые основания, и нуклеозид B, расположенный в 5’-положении от упомянутого выше нуклеозида A в первой нуклеотидной последовательности, способен образовывать пару с нуклеозидом B*, который расположен в 3’-положении от упомянутого выше нуклеозида A* во второй нуклеотидной последовательности. В контексте настоящего изобретения первая нуклеотидная последовательность, как правило, представляет собой олигонуклеотид по изобретению, и вторая нуклеотидная последовательность представляет собой часть экзона из пре-мРНК, предпочтительно пре-мРНК дистрофина. Олигонуклеотид предпочтительно называют обратно комплементарным области экзона (первого и/или второго экзона), когда указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% обратно комплементарен указанной области указанного первого и/или второго экзона. Предпочтительно, обратная комплементарность составляет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

В контексте изобретения эксципиенты включают полимеры (например, полиэтиленимин (PEI), полипропиленимин (PPI), производные декстрана, бутилцианоакрилат (PBCA), гексилцианоакрилат (PHCA), сополимер молочной и гликолевой кислоты (PLGA), полиамины (например, спермин, спермидин, путресцин, кадаверин), хитозан, поли(амидоамины) (PAMAM), поли(сложный эфир-амин), поливиниловый эфир, поливинилпирролидон (PVP), полиэтиленгликоль (PEG) циклодекстрины, гиалуроновую кислоту, коломиновую кислоту и их производные), дендримеры (например, поли(амидоамин)), липиды {например, 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний пропан (DODAP), диолеоилдиметиламмоний хлорид (DODAC), производные фосфатидилхолина [например, 1,2- дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC)], производные лизо-фосфатидилхолина [например, 1-стеароил-2-лизо-sn-глицеро-3-фосфохолин (S-LysoPC)], сфингомиелин, 2-{3-[бис-(3-аминопропил)амино]пропиламино}-N-дитетрацедилкарбамоилметилацетамид (RPR209120), производные фосфоглицерина [например, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерин, натриевая соль (DPPG-Na), производные фосфатицидной кислоты [1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатицидная кислота, натриевая соль (DSPA), производные фосфатидилэтаноламина [например, диолеоил-фосфатидилэтаноламин (DOPE), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DSPE), 2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPhyPE)], N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний (DOTAP), N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний (DOTMA), 1,3-диолеоилокси-2-(6-карбоксиспермил)пропиламид (DOSPER), (1,2-димиристоилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмоний (DMRIE), (N1-холестерилоксикарбонил-3,7-диазанонан-1,9-диамин (CDAN), диметилдиоктадециламмоний бромид (DDAB), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицерол-3-фосфохолин (POPC), (b-L-аргинил-2,3-L-диаминопропионовая кислота-N-пальмитил-N-олеиламид тригидрохлорид (AtuFECT01), производные N,N-диметил-3-аминопропана [например, 1,2-дистеароилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DSDMA), 1,2-диолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DoDMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-3-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA), производные фосфатидилсерина [1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин, натриевая соль (DOPS)], холестерин}, белки (например, альбумин, желатины, ателлоколлаген) и пептиды (например, протамин, PepFects, NickFects, полиаргинин, полилизин, CADY, MPG).

В контексте изобретения конъюгатные группы выбирают из группы, состоящей из нацеливающих частей, повышающих стабильность частей, усиливающих захват частей, усиливающих растворимость частей, улучшающих фармакокинетику частей, улучшающих фармакодинамику частей, повышающих активность частей, репортерных молекул и лекарственных средств, где эти части могут представлять собой пептиды, белки, углеводы, полимеры, производные этиленгликоля, витамины, липиды, полифторалкильные части, стероиды, холестерин, флуоресцентные части и радиоактивно меченые части. Конъюгатные группы необязательно могут быть защищенными и они могут быть связаны с олигонуклеотидом по изобретению прямо или через двухвалентный или поливалентных линкер.

Конъюгатные группы включают части, которые усиливают нацеливание, захват, растворимость, активность, фармакодинамику, фармакокинетику или которые снижают токсичность. Примеры таких групп включают пептиды (например, глутатион, полиаргинин, пептиды RXR (см., например, Antimicrob. Agents Chemother. 2009, 53, 525), полиорнитин, TAT, TP10, pAntp, полилизин, NLS, пенетратин, MSP, ASSLNIA, MPG, CADY, Pep-1, Pip, SAP, SAP(E), транспортан, буфорин II, полимиксин B, гистатин, CPP5, NickFects, PepFects), vivo-porter, белки (например, антитела, авидин, Ig, трансферрин, альбумин), углеводы (например, глюкоза, галактоза, манноза, мальтоза, мальтотриоза, рибоза, трегалоза, глюкозамин, N-ацетилглюкозамин, лактоза, сахароза, фукоза, арабиноза, талоза, сиаловая кислота, гиалуроновая кислота, нейрамидиновая кислота, рамноза, квиновоза, галактозамин, N-ацетилгалактозамин, ксилоза, ликсоза, фруктоза, манноза-6-фосфат, 2-дезоксирибоза, глюкал, целлулобиоза, хитобиоза, хитотриоза), полимеры (например, полиэтиленгликоль, полиэтиленимин, полимолочная кислота, поли(амидоамин)), производные этиленгликоля (например, триэтиленгликоль, тетраэтиленгликоль), водорастворимые витамины (например, витамин B, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C), жирорастворимые витамины (например, витамин A, D, D2, D3, E, K1, K2, K3), липиды (например, пальмитил, миристил, олеил, стеарил, батил, глицерофосфолипид, глицеролипид, сфинголипид, церамид, цереброзид, сфингозин, стерин, пренол, эруцил, арахидонил, линолеил, линоленил, арахидил, бутирил, сапеинил, элаидил, лаурил, бегенил, нонил, децил, ундецил, октил, гептил, гексил, пентил, DOPE, DOTAP, терпенил, дитерпеноид, тритерпеноид), полифторалкильные части (например, перфтор[1H,1H,2H,2H]-алкил), одобренные лекарственные средства с ММ<1500 Да, которые обладают аффинностью к конкретным белкам (например, NSAID, такие как ибупрофен (больше описано в патенте США 6656730, включенном в настоящее описание в качестве ссылки), антидепрессанты, противовирусные средства, антибиотики, алкилирующие средства, амебицидные средства, аналгетики, андрогены, ингибиторы ACE, снижающие аппатит средства, антациды, противогельминтные средства, антиангиогенные средства, антиадренергетики, антиангинальные средства, антихолинергетики, антикоагулянты, противосудорожные препараты, противодиабетические средства, противодиарейные средства, антидиуретики, антидоты, противогрибковые средства, противорвотные средства, средства против головокружения, противоподагрические средства, антигонадотропные средства, антигистамины, антигиперлипидемические средства, антигипертензивные средства, противомалярийные средства, средства против мигрени, средства против злокачественной опухоли, антипсихотические средства, противоревматические средства, антитиреоидные средства, антитоксины, противокашлевые средства, анксиолитические средства, контрацептивы, стимуляторы ЦНС, хелаторы, сердечно-сосудистые средства, противозастойные средства, дерматологические средства, диуретики, отхаркивающие средства, диагностические средства, желудочно-кишечные средства, анестетики, глюкокортикоиды, антиаритмические средства, иммуностимулирующие средства, иммунодепрессивные средства, слабительные средства, лепростатические средства, метаболические средства, средства, действующие на органы дыхательной системы, муколитики, мышечные релаксанты, нутрицевтические средства, сосудорасширяющие средства, тромболитические средства, утеротонические средства, сосудосуживающие средства), природные соединения с ММ<2000 Да (например, антибиотики, эйкозаноиды, алкалоиды, флавоноиды, терпеноиды, кофакторы ферментов, поликетиды), стероиды (например, преднизон, преднизолон, дексаметазон, ланостерин, холевая кислота, эстран, андростан, прегнан, холан, холестан, эргостерин, холестерин, кортизол, кортизон, дефлазакорт), пентациклические тритерпеноиды (например, 18β-глицирретиновая кислота, урсоловая кислота, амирин, карбеноксолон, эноксолон, ацетоксолон, бетулиновая кислота, азиатиковая кислота, эритродиол, олеанолевая кислота), полиамины (например, спермин, спермидин, путресцин, кадаверин), флуоресцентные части (например, FAM, карбоксифлуоресцеин, FITC, TAMRA, JOE, HEX, TET, родамин, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, CW800, BODIPY, AlexaFluors, Dabcyl, DNP), репортерные молекулы (например, акридины, биотины, дигоксигенин, (радио)изотопно меченые части (например, с ²H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁸F, ³²P, ³⁵S, ⁵⁷Co, ^99mTc, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁵³Gd)) и их комбинации. Такие конъюгатные группы могут быть присоединены прямо к соединениям по изобретению или через линкер. Этот линкер может быть двухвалентным (обеспечивающим конъюгат 1:1) или поливалентным, обеспечивающим олигомер с более чем одной конъюгатной группой. Методики связывания такой конъюгатной группы, либо прямо, либо через линкер, с олигомером по изобретению известны в данной области. Также в контексте изобретения находится применение наночастиц, с которыми ковалентно связаны олигонуклеотиды по изобретению, таким образом, такие конструкции называют сферическими нуклеиновыми кислотами (SNA), например, как описано в J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 12192 (Hurst et al., включенная в настоящее описание в качестве ссылки).

В настоящем документе и в его формуле изобретения глагол "содержать" и его спряжения используют в неограничивающем значении для обозначения того, что объекты после этого слова включены, однако объекты, конкретно не упомянутые, не исключены. Кроме того, глагол "состоять из" может быть заменен на "по существу состоять из", что означает, что олигонуклеотид или композиция, как определено в настоящем описании, могут содержать дополнительный компонент(ы) помимо компонентов, конкретно указанных, причем указанный дополнительный компонент(ы) не изменяет уникальной характеристики изобретения. Кроме того, указание на элемент в единственном числе не исключает возможности того, что присутствует более одного элемента, если контекст явно не требует, чтобы существовал один и только один из элементов. Таким образом, форма единственного числа обычно означает "по меньшей мере один".

Слова "приблизительно" или "примерно", когда их используют применительно к числовой величине (приблизительно 10), предпочтительно означают, что величина может представлять собой данную величину, равную 10, или отличается менее чем на 1% от этой величины.

Каждый вариант осуществления, как указано в настоящем описании, может быть комбинирован с другим, если нет иных указаний. Все патентные и литературные ссылки в настоящем описании включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Следующие примеры представлены только для иллюстративных целей, и они не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения никоим образом.

Примеры

Таблицы 1-3

Таблица 1
Перечень возможных комбинаций экзонов в транскрипте гена DMD, для которых экзон U (вышележащий) имеет непрерывную открытую рамку считывания с экзоном D (нижележащий), если экзоны с U+1 (первый экзон) по D-1 (второй экзон), и любые экзоны между ними, удалены из транскрипта Первый экзон ("U") Второй экзон ("D") 1 8,20,22,51,53,59,62,64,65,67,76,79 2 5,6,9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,
42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 3 6,9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,
30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,
50,52,54,56,58,60,61,68,70 4 9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,
30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,
43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 5 9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,
43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 6 12,18,44,46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 7 20,22,51,53,59,62,64,65,67,76,79 8 11,13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,
32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,
47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 9 13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,
33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,
49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 10 13,14,15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,
33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,
49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 11 18,44,46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 12 15,16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,
35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,
52,54,56,58,60,61,68,70 13 16,17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,
54,56,58,60,61,68,70 14 17,19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,
56,58,60,61,68,70 15 19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,
38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,
58,60,61,68,70 16 19,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,
38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,
58,60,61,68,70 17 44,46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 18 21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,
39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,
60,61,68,70 19 22,51,53,59,62,64,65,67,76,79 20 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,
40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,
61,68,70 21 51,53,59,62,64,65,67,76,79 22 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,
42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,
70 23 26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,
43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 24 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,
45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 25 28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,
47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 26 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,
49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 27 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,
50,52,54,56,58,60,61,68,70 28 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,
52,54,56,58,60,61,68,70 29 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,
54,56,58,60,61,68,70 30 33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,
56,58,60,61,68,70 31 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,
58,60,61,68,70 32 35,36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,
60,61,68,70 33 36,37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,
61,68,70 34 37,38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,
68,70 35 38,39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 36 39,40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 37 40,41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 38 41,42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 39 42,43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 40 43,45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 41 45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 42 45,47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 43 46,55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 44 47,49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 45 55,57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 46 49,50,52,54,56,58,60,61,68,70 47 50,52,54,56,58,60,61,68,70 48 52,54,56,58,60,61,68,70 49 52,54,56,58,60,61,68,70 50 53,59,62,64,65,67,76 51 54,56,58,60,61,68,70 52 59,62,64,65,67,76 53 56,58,60,61,68,70 54 57,63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 55 58,60,61,68,70 56 63,66,69,71,72,73,74,75,77,78 57 60,61,68,70 58 62,64,65,67,76,79 59 68,70 60 68,70 61 64,65,67,76,79 62 66,69,71,72,73,74,75,77,78 63 67,76,79 64 67,76,79 65 69,71,72,73,74,75,77,78 66 76,79 67 70 68 71,72,73,74,75,77,78 70 73,74,75,77,78 71 74,75,77,78 72 75,77,78 73 77,78 74 77,78

Таблица 3
Перечень предпочтительных последовательностей оснований олигонуклеотидов по изобретению. Олигонуклеотиды, содержащие эти последовательности оснований, способны связываться с высоко сходными областями (участки последовательности с >50% идентичностью) в двух различных экзонах DMD (как проиллюстрировано в таблице 2), и они способны индуцировать пропускание этих двух экзонов и любых экзонов между ними с образованием транскрипта DMD в рамке считывания Соединение Последовательность* SEQ ID NO Первый экзон 8 - Второй экзон 19 PS830 GUGAUGUACAUUAAGAUGGACUUC 1671 GYGZYGYZXZYYZZGZYGGZXYYX 1672 YGGZXYYXYYZYXYGGZY 1722 YXYGZZXYYXYXZGXYY 1723 Первый экзон 9 - Второй экзон 22 YXZGZGGYGGYGZXZYZZG 1724 YXZYZGYXGGYGZXZXYZZG 1725 Первый экзон 9 - Второй экзон 30 YXYXZYZYXXXYGYGXYZGZXYG 1726 GZZYXGZGGXYYZGGYGZZGZZG 1727 YYXZGYXYXXYGGGXZGZXYG 1728 GZXYXXYGGZYYZZGYGYZZGG 1729 Первый экзон 10 - Второй экзон 13, 14, 15, 18, 20, 27, 30, 31, 32, 35, 42, 44, 47, 48, 55, 57 или 60 PS811 CUUCCUUCCGAAAGAUUGCAAAUUC 1673 XYYXXYYXXGZZZGZYYGXZZZYYX 1674 PS814 GACUUGUCUUCAGGAGCUUCC 1675 GZXYYGYXYYXZGGZGXYYXX 1676 PS815 CAAAUGACUUGUCUUCAGGAGCUUC 1677 XZZZYGZXYYGYXYYXZGGZGXYYX 1678 PS816 CUGCCAAAUGACUUGUCUUCAGGAG 1679 XYGXXZZZYGZXYYGYXYYXZGGZG 1680 PS1168 CUGCCDDDUGDCUUGUCUUCDGGDG 1681 PS1050 CCAAAUGACUUGUCU 1682 CCAAAYGACYYGYCY 1683 PS1059 CAAAUGACUUGUCUUCAGGAG 1684 PS1138 CAAAUGACUUGUCUUCAGGAG 1685 PS1170 CDDDUGDCUUGUCUUCDGGDG 1686 ZYGZXYYGYXYYXZGGZGGZG 1687 PS1016 CAGUCUCCUGGGCAGACUGGAUGCUC 1688 XZGYXYXXYGGGXZGZXYGGZYGXYX 1689 ZYGZZXYGXXZZZYGZXYYGYX 1690 ZYZZGXYGXXZZXYGXYYGYX 1691 GYXXZGGYYYZXYYXZXY 1692 GYXXZXXYYGYXYGXZZY 1693 XYYXYZZZGXYGYYYGZ 1694 XYYXXYGZGGXZYYYGZ 1695 YYYGZYZZXGGYXXZGGYYYZXYYXZ 1696 ZGGXZYYYGZGXYGXGYXXZ 1697 Первый экзон 23 - Второй экзон 42 YXYYXGZXZYXYXYYYXZXZGY 1698 GXGXYYYXYYXGZXZYXYX 1699 ZZYYYXZGZGGGXGXYYYXYYX 1700 YXYYXZGYXZYXZXXZYXZYXGY 1701 GGXZYGYXYYXZGYXZYXZX 1702 ZZYYYXXZZZGGXZYGYXYYX 1703 Первый экзон 45 - Второй экзон 51 YGGXZYXYGYGYYYGZGGZYYGXYG 1730 YGGXZYYYXYZGYYYGGZGZYGGXZG 1731 Первый экзон 45 - Второй экзон 53 YYXXZXZGYYGXZYYXZZYGYYXYGZ 1732 YYXZZXYGYYGXXYXXZGYYXYGZ 1733 YYXXYGYZGZZYZXYGGXZYXYGY 1734 YYXZZXYGYYGXXYXXGGYYXYGZ 1735 XYYYZZXZYYYXZYYXZZXYGYYGX 1736 YYXYYXXYYZGXYYXXZGXXZYYGYGYY 1737 Первый экзон 45 - Второй экзон 55 UCCUGUAGAAUACUGGCAUCUGUUU 1704 YXXYGYZGZZYZXYGGXZYXYGYYY 1705 PS1185 UCCUGUDGDDUDCUGGCDUCUGUUU 1706 PS1186 UCCUGUDGDDUDCUGGCDUCUGU 1707 UCCUGUAGAAUACUGGCAUCUGU 1708 YXXYGYZGZZYZXYGGXZYXYGY 1709 PS1187 UCCUGUDGGDUDUUGGCDGUUGUUU 1710 UCCUGUAGGAUAUUGGCAGUUGUUU 1711 YXXYGYZGGZYZYYGGXZGYYGYYY 1712 PS1188 UCCUGUDGGDUDUUGGCDGUUGU 1713 UCCUGUAGGAUAUUGGCAGUUGU 1714 YXXYGYZGGZYZYYGGXZGYYGY 1715 UCCUGUAGGACAUUGGCAGUUGU 1716 YXXYGYZGGZXZYYGGXZGYYGY 1717 UCCUGUAGGACAUUGGCAGUUGUUU 1718 YXXYGYZGGZXZYYGGXZGYYGYYY 1719 Первый экзон 45 - Второй экзон 60 ZZYZXYGGXZYXYGYYGYYGZGG 1738 XYGYZGZZYZXYGGXZYXYGYY 1739 GXYYXXZYXYGGYGYYXZGG 1740 XYGXZGZZGXYYXXZYXYGGY 1741 Первый экзон 56 - Второй экзон 60 YXYGYGYGZGXYYXZZYYYXZXXYYGGZG 1720 YCYYYXZGZGGXGXZZYYYXYXXYXGZZG 1721 *D=2,6-диаминопурин; C=5-метилцитозин; X=C или 5-метилцитозин, Y=U или 5-метилурацил; Z=A или 2,6-диаминопурин.

Таблица 6
Перечень наиболее предпочтительных и/или дополнительных комбинаций экзонов, наиболее предпочтительных и/или дополнительных областей идентичности экзонов, и наиболее предпочтительных и/или дополнительных олигонуклеотидов с их последовательностями оснований, химическими модификациями и идентификационными номерами последовательностей, где *= LNA, C=5-метилцитозин, U=5-метилурацил, D=2,6-диаминопурин, X=C или 5-метилцитозин, Y=U или 5-метилурацил, Z=A или 2,6-диаминопурин, и < > все 2’-фторнуклеотиды (как в SEQ ID NO: 1844)

Примеры 1-5

Материалы и способы

Конструирование олигонуклеотидов в первую очередь было основано на обратной комплементарности с конкретными высоко сходными участками последовательности в двух различных экзонах DMD, как идентифицировано в EMBOSS Matcher и как описано в таблице 2. Следующими учитываемыми параметрами последовательности были присутствие частично открытых/закрытых структур РНК в указанных участках последовательности (как предсказано с помощью RNA structure версии 4.5 или РНК mfold версии 3.5 (Zuker, M.) и/или присутствие предполагаемых участков связывания SR-белка в указанных участках последовательности (как предсказано с помощью программного обеспечения ESE-finder (Cartegni L, et al. 2002 и Cartegni L, et al., 2003). Все AON были синтезированы в Prosensa Therapeutics B.V. (Leiden, Netherlands) или были получены из коммерческого источника (ChemGenes, США), и они содержат 2’-O-метил-РНК и полноразмерные фосфоротиоатные (PS) основные цепи. Все олигонуклеотиды представляли собой 2’-O-метилфосфоротиоатную РНК, и их синтезировали в масштабе 10 мкмоль с использованием устройства для синтеза OP-10 (GE/ÄKTA Oligopilot), с помощью стандартных протоколов для фосфорамидитов. Олигонуклеотиды расщепляли и из них удаляли защитные группы двухстадийным способом (обработка DIEA, а затем концентрированным NH₄OH), очищали с помощь ВЭЖХ и растворяли в воде, и добавляли избыток NaCl для обмена ионами. После упаривания соединения перерастворяли в воде, обессоливали с помощью FPLC и лиофилизировали. Масс-спектрометрия подтвердила идентичность всех соединений, и чистота (определенная с помощью UPLC) была найдена приемлемой для всех соединений (>80%). Для экспериментов in vitro, описанных в настоящем описании, приготавливали 50 мкМ рабочие растворы AON в фосфатном буфере (pH 7,0).

Культивирование тканей, трансфекция и анализ способом ОТ-ПЦР

Дифференцированные здоровые контрольные мышечные клетки человека (мышечные трубочки) трансфицировали в 6-луночных планшетах при стандартной концентрации AON 400 нМ в соответствии со стандартными рабочими методиками, не относящимися к GLP. Для трансфекции использовали полиэтиленимин (ExGen500; Fermentas Netherlands) (2 мкл на мкг AON, в 0,15 M NaCl). Упомянутые выше методики трансфекции были адаптированы из ранее описанных материалов и способов (Aartsma-Rus A., et al., 2003). Через 24 часа после трансфекции РНК выделяли и анализировали способом ОТ-ПЦР. В кратком изложении, для получения кДНК использовали случайную смесь гексамеров (1,6 мкг/мкл; Roche Netherlands) в реакции с обратной транскриптазой (RT) на 500-1000 нг исходной РНК. Затем проводили анализ ПЦР на 3 мкл кДНК для каждого образца, и он включал первую и гнездовую ПЦР с использованием праймеров, специфичных к гену DMD (см. таблицы 4 и 5). Выделение РНК и анализ ОТ-ПЦР проводили в соответствии со стандартными рабочими методиками, не относящимися к GLP, адаптированными из ранее описанных материалов и способов (Aartsma-Rus A., et al., 2002; и Aartsma-Rus A., et al., 2003). Продукты ОТ-ПЦР анализировали гель-электрофорезом (2% агарозные гели). Полученные фрагменты ОТ-ПЦР количественно определяли с помощью анализа DNA Lab-on-a-Chip analysis (Agilent Technologies USA; DNA 7500 LabChips). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения "Agilent 2100 Bioanalyzer" и Excel 2007. Оценивали соотношение меньших продуктов транскрипции (содержащих ожидаемое пропускание множества экзонов) и общего количества продуктов транскрипции (что соответствует эффективности пропускания в процентах), и прямо сравнивали с количеством продуктов транскрипции в нетрансфицированных клетках. Фрагменты ПЦР также выделяли из агарозных гелей (набор для экстракции из геля QIAquick gel extraction kit, Qiagen Netherlands) для подтверждения последовательности (секвенирование по методу Сенгера, BaseClear, Нидерланды).

Таблица 4
Наборы праймеров для ПЦР, использованные для обнаружения пропускания экзонов-мишеней Экзоны-мишени 1-ая ПЦР 2-ая ПЦР прямой обратный прямой обратный 10-18 h7f h20r h8f h19r 10-30 h7f h32r h8f h31r 10-47 h8f h50r h9f h49r 10-57 h8f h64r h9f h63r2 45-55 h43f2 h57r h44f h56r

Таблица 5
Последовательности праймеров ID праймера Последовательность (5'→3') h7f agtcagccacacaacgactg h8f caaggccacctaaagtgactaaa h9f gagctatgcctacacacagg h43f2 cctgtggaaagggtgaagc h44f gcgatttgacagatctgttg h19r gcatcttgcagttttctgaac h20r actggcagaattcgatccac h31r tgtgcaacatcaatctgagac h32r tagacgctgctcaaaattgg h49r cactggctgagtggctgg h50r tcagtccaggagctaggtc h56r cgtctttgtaacaggactgc h57r tctgaactgctggaaagtcg h63r2 gagctctgtcattttgggatg h64r gggccttctgcagtcttcgga (SEQ ID NO: 1745-1759)

Результаты

Пример 1. Нацеливание на участок последовательности с высоким сходством в экзонах 10 и 18 посредством AON в различных положениях

Исходя из высоко сходного участка последовательностей (63%) в экзонах 10 (SEQ ID NO: 109) и 18 (SEQ ID NO: 110) конструировали серию AON, распределенных по указанному участку последовательности, на 100% обратно комплементарные либо экзону 10 (PS814; SEQ ID NO: 1675, PS815; SEQ ID NO: 1677, PS816; SEQ ID NO: 1679) или либо экзону 18 (PS811; SEQ ID NO: 1673). После трансфекции в контрольных культурах мышечных трубочек здорового человека анализ ОТ-ПЦР продемонстрировал, что все четыре AON были способны индуцировать пропускание экзонов с 10 по 18 (что подтверждено с помощью анализа последовательности) (фиг.1). PS811 и PS816 обладают наиболее высокими процентами обратной комплементарности с обоими экзонами (фиг. 1B), и они были наиболее эффективными с эффективностью пропускания экзонов с 10 по 18, составляющей 70% и 66%, соответственно (фиг.1C). PS814 был наименее эффективным, что может быть связано с его расположением и/или более короткой длиной (21 против 25 нуклеотидов) и, таким образом, более низкой аффинностью или стабильностью. В необработанных клетках не наблюдали пропускания экзонов с 10 по 18 (NT). Эти результаты были высоко воспроизводимыми (пропускание экзонов с 10 по 18 посредством PS816 при 20/20 различных трансфекциях) и демонстрируют, что пропускание мультиэкзонного участка с 10 по 18 экзоны является осуществимым с использованием одного AON, который способен связываться как с экзоном 10, так и с экзоном 18, в области с высоким сходством последовательности (63%), и который способен индуцировать пропускание этих экзонов и всех экзонов между ними. Хотя в этой области транскрипта могут быть получены дополнительные фрагменты с пропусканием множества экзонов, полученный транскрипт, в котором экзон 9 был прямо сплайсирован с экзоном 19 (транскрипт в рамке считывания), был наиболее распространенным во всех экспериментах.

Пример 2. Нацеливание на участок последовательности с высоким сходством в экзоне 10 и 18 посредством AON различной длины

Учитывая высоко сходные участки последовательности в экзонах 10 (SEQ ID NO: 109) и 18 (SEQ ID NO: 110), авторы настоящего изобретения оценивали эффект AON различной длины для идентификации наиболее эффективной минимальный длины. После трансфекции PS816 (25-мер; SEQ ID NO: 1679), PS1059 (21-мер; SEQ ID NO: 1684) или PS1050 (15-мер; SEQ ID NO: 1682) в контрольных мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированных мышечных трубочках), анализ ОТ-ПЦР продемонстрировал, что все три AON были способны индуцировать пропускание экзонов с 10 по 18 (что подтверждено с помощью анализа последовательности) (фиг.2A, B). PS816 и PS1059 были наиболее эффективными (68% и 79%, соответственно). Наиболее короткий PS1050 был менее эффективным (25%). В необработанных клетках (NT) не наблюдали пропускания экзонов с 10 по 18. Эти результаты указывают на то, что пропускание мультиэкзонного участка с 10 по 18 экзоны является осуществимым с использованием AON из 15, 21 и 25 нуклеотидов. Также ожидается, что будут действовать более длинные AON. 21-мерный PS1059 был наиболее эффективным наиболее коротким кандидатом. 15-мер PS1050 был наименее эффективным, что может быть связано с его уменьшенной обратной комплементарностью экзону 18 (47%; фиг.2B) и/или уменьшенной аффинностью связывания с РНК-мишенью или стабильностью. Для повышения Tm и, таким образом, аффинности связывания и стабильности дуплекса, 15-меров в целях повышения их биоактивности могут требоваться модификации оснований. Наиболее многочисленным полученным продуктом-транскриптом в этом эксперименте вновь был продукт, в котором экзон 9 был прямо сплайсирован с экзоном 19 (транскрипт в рамке считывания).

Пример 3. Нацеливание на участок последовательности с высоким сходством в экзоне 10 и 18 посредством AON с модифицированной химической структурой оснований

Конкретные характеристики выбранной химической структуры AON, по меньшей мере частично, влияет на доставку AON к транскрипту-мишени: путь введения, биостабильность, биораспределение, внутритканевое распределение и клеточный захват и транспорт. Кроме того, считается, что дальнейшая оптимизация химической структуры олигонуклеотида повысит аффинность связывания и стабильность, повысит активность, улучшит безопасность и/или снизит затраты вследствие уменьшения длины или усовершенствования методик синтеза и/или очистки. В высоко сходном участке последовательностей в экзонах 10 (SEQ ID NO: 109) и 18 (SEQ ID NO: 110) авторы настоящего изобретения оценивали эффект AON на основе 2’-O-метил-РНК с различными модифицированными основаниями (такими как 5-замещенные пиримидины и 2,6-диаминопурины). После трансфекции PS816 (AON с регулярной 2’-O-метил РНК; SEQ ID NO: 1679), PS1168 (PS816, но в котором все As заменены на 2,6-диаминопурин; SEQ ID NO: 1681), PS1059 (AON с регулярной 2’-O-метилфосфоротиоатной РНК; SEQ ID NO: 1684), PS1138 (PS1059, но в котором все Cs заменены на 5-метилцитозин; SEQ ID NO: 1685), или PS1170 (PS1059, но в котором все As заменены на 2,6-диаминопурин; SEQ ID NO: 1686) (фиг.3B) в контрольных мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированные мышечные трубочки). Анализ ОТ-ПЦР продемонстрировал, что все пять AON были способны индуцировать пропускание экзонов с 10 по 18 (что подтверждено с помощью анализа последовательности) (фиг.3). PS816 был наиболее эффективным (88%). Хотя модификации оснований в этих конкретных последовательностях не повышали биоактивность еще более, они могли иметь более положительный эффект на биораспределение, стабильность и/или безопасность, так что менее эффективные соединения все еще являются предпочтительными для клинической разработки. Эти результаты указывают на то, что пропускание мультиэкзонного участка с 10 по 18 экзоны является осуществимым с использованием AON с модифицированными основаниями. Наиболее многочисленным полученным транскриптом-продуктом в этом эксперименте вновь был транскрипт, в котором экзон 9 был прямо сплайсирован с экзоном 19 (транскрипт в рамке считывания).

Пример 4. PS816 индуцирует пропускание других мультиэкзонных участков в рамке считывания

Высоко сходный участок последовательности в экзонах 10 (SEQ ID NO: 109) и 18 (SEQ ID NO: 110) также (частично) присутствует в экзонах 30 (SEQ ID NO: 128), 31 (SEQ ID NO: 130), 32 (SEQ ID NO: 132), 42 (SEQ ID NO: 152), 47 (SEQ ID NO: 158), 48 (SEQ ID NO: 160), 57(SEQ ID NO: 170) и 60 (SEQ ID NO: 174) (фиг.4A, B, таблица 2). Таким образом, авторы настоящего изобретения сфокусировались на выявлении пропускания мультиэкзонных участков после трансфекции 400 нМ PS816 (SEQ ID NO: 1679). Авторы настоящего изобретения использовали различные наборы праймеров (таблица 4 и 5) для этой цели. Действительно, с помощью анализа ОТ-ПЦР авторы настоящего изобретения выявили пропускание в рамке считывания экзонов с 10 по 30, экзонов с 10 по 42, экзонов с 10 по 47, экзонов с 10 по 57 и/или экзонов с 10 по 60 в множественных экспериментах (подтверждено с помощью анализа последовательности), которое не наблюдалось в необработанных клетках. В качестве примера, на фиг.4C представлено индуцированное PS816 пропускание экзонов с 10 по 18, экзонов с 10 по 30 и экзонов с 10 по 47. Несмотря на дополнительные случаи пропускания множества экзонов (как в рамке считывания, так и не в рамке считывания), полученный транскрипт, в котором экзон 9 был прямо сплайсирован с экзоном 19 (транскрипт в рамке считывания), был наиболее воспроизводимым и оказался наиболее многочисленным во всех экспериментах. Эти результаты подтверждают, что в гене DMD может быть индуцировано пропускание множества экзонов с использованием одного AON, который способен связываться с участком последовательности, который высоко сходен между двумя различными экзонами и способен индуцировать пропускание этих экзонов и всех экзонов между ними с образованием транскрипта DMD в рамке считывания.

Пример 5. Нацеливание на участок последовательности с высоким сходством в экзоне 45 и 55 с помощью AON с модифицированной химической структурой оснований

Исходя из высоко сходного (80%) участка последовательности в экзонах 45 (SEQ ID NO: 1571) и 55 (SEQ ID NO: 1572) была сконструирована серия AON, распределенных по всему указанному участку последовательности, либо на 100% обратно комплементарных экзону 45 (PS1185; SEQ ID NO: 1706, PS1186; SEQ ID NO: 1707), либо на 96% обратно комплементарных экзону 55 (с одним несоответствием оснований) (PS1188; SEQ ID NO: 1713) (фиг.5A). Во всех трех AON As были заменены на 2,6-диаминопурин. После трансфекции в контрольных культурах мышечных трубочек здорового человека анализ ОТ-ПЦР продемонстрировал, что PS1185, PS1186 и PS1188 были способны индуцировать пропускание экзонов с 45 по 55 (что подтверждено с помощью анализа последовательности) (фиг.5B). В необработанных клетках (NT) не наблюдали пропускания экзонов с 45 по 55. Эти результаты демонстрируют, что пропускание другого мультиэкзонного участка с 45 по 55 экзоны является осуществимым с использованием одного AON, который способен связываться как с экзоном 45, так и с экзоном 55 в области с высоким сходством последовательности (80%), и который способен индуцировать пропускание этих экзонов и всех экзонов между ними. Полученный транскрипт, в котором экзон 44 был прямо сплайсирован с экзоном 56, находится в рамке считывания, и он был выявлен во множестве экспериментов. Что касается экспериментов с пропусканием экзонов с 10 по 18 (пример 3), авторы настоящего изобретения вновь продемонстрировали, что можно эффективно использовать AON с модифицированными основаниями. Более того, результаты, полученные с помощью PS1188, указывают на то, что AON не должен быть на 100% обратно комплементарным одному из экзонов-мишеней, но также может быть сконструирован в качестве гибридных структур, в которых отсутствует 100% обратная комплементарность с каким-либо экзоном-мишенью.

Описание чертежей

Фиг.1. A) Локализация PS811 (SEQ ID NO: 1673), PS814 (SEQ ID NO: 1675), PS815 (SEQ ID NO: 1677) и PS816 (SEQ ID NO: 1679) в участке последовательности, который является высоко сходным (63%) в экзоне 10 и экзоне 18. B) Характеристики и эффективность AON. Указан процент обратной комплементарности (обр. компл.) каждого AON в отношении либо экзона 10, либо экзона 18. C) Анализ способом ОТ-ПЦР. В мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированных мышечных трубочках) все четыре AON были эффективными в отношении индукции пропускания мультиэкзонного участка с 10 экзона по 18 экзон. PS811 и PS816 были наиболее эффективными. В рамках слева на фигуре представлено содержание амплфицированных способом ПЦР продуктов транскриптов. (M: маркер размера ДНК; NT: не обработанные клетки).

Фиг.2. A) Анализ ОТ-ПЦР. В мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированных мышечных трубочках) исследовали AON с различной длиной, однако с одинаковой центральной последовательностью-мишенью в участке последовательности, который является высоко сходным (63%) в экзоне 10 и экзоне 18. PS816 (SEQ ID NO: 1679), 25-мер, и PS1059 (SEQ ID NO: 1684), 21-мер, были наиболее эффективными (пропускание экзонов 10 и 18 составляет 68% и 79%, соответственно). 15-мер PS1050 (SEQ ID NO: 1682) был менее эффективным. В рамках слева на фигуре представлено содержание амплифицированных способом ПЦР продуктов-транскриптов. (M: маркер размера ДНК; NT: необработанные клетки). B) Характеристики и эффективность AON. Указан процент обратной комплементарности (обр. компл.) каждого AON в отношении либо экзона 10, либо экзона 18.

Фигура 3. A) Анализ ОТ-ПЦР. В мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированные мышечные трубочки) исследовали AON с различной химической структурой оснований: PS816 (AON с регулярной 2’-O-метилфосфоротиоатной РНК; SEQ ID NO: 1679), PS1168 (PS816, но в котором все As заменены на 2,6-диаминопурин; SEQ ID NO: 1681), PS1059 (AON с регулярной 2’-O-метилфосфоротиоатной РНК; SEQ ID NO: 1684), PS1138 (PS1059, но в котором все Cs заменены на 5-метилцитозины; SEQ ID NO: 1685) или PS1170 (PS1059, но в котором все As заменены на 2,6-диаминопурины; SEQ ID NO: 1686). Пропускание экзонов с 10 по 18 наблюдали для всех исследованных AON. PS816 был наиболее эффективным (88%). В этих конкретных последовательностях модификации оснований не повышали далее биоактивность. В рамках слева на фигуре указаны амплифицированные способом ПЦР продукты-транскрипты. (M: маркер размера ДНК; NT: не обработанные клетки). B) Характеристики и эффективность AON.

Фиг.4. A) Высоко сходные участки последовательности в экзонах 10, 18, 30 и 47 в качестве множественных мишеней для PS816. SEQ ID NO относятся к полноразмерному выравниванию экзонов EMBOSS (как в таблице 2). Серым цветом выделена часть последовательности, которая не была включена в выравнивание EMBOSS, но которая является соседней с частью с высокой обратной комплементарностью с PS816. B) Обзор выравнивания экзонов и процентов обратной комплементарности (обр. компл.) с PS816. C) Анализ ОТ-ПЦР. С помощью PS816 может быть индуцировано пропускание мультиэкзонного участка, обозначаемое в настоящем описание как пропускание экзонов с 10 по 18, экзонов с 10 по 30 и экзонов с 10 по 47. Полученные транскрипты находятся в рамке считывания. Они не были выявлены в необработанных клетках (NT). В рамках слева и справа на фигуре представлено содержание амплифицированных способом ПЦР продуктов транскриптов. (M: маркер размера ДНК).

Фиг.5. A) Локализация PS1185 (SEQ ID NO: 1706), PS1186 (SEQ ID NO: 1707) и PS1188 (SEQ ID NO: 1713) в участке последовательности, который является высоко сходным (80%) в экзоне 45 и экзоне 55. В таблице обобщенно представлены характеристики AON. Указан процент обратной комплементарности (обр. компл.) каждого AON в отношении либо экзона 45, либо экзона 55. B) Анализ ОТ-ПЦР. В мышечных клетках здорового человека (т.е. дифференцированные мышечные трубочки) все три AON были эффективными в отношении индукции пропускания мультиэкзонного участка с 45 по 55 экзоны. В рамках слева на фигуре представлено содержание амплифицированных способом ПЦР продуктов транскриптов. (M: маркер размера ДНК; NT: необработанные клетки).

Список ссылок

Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, Janson AA, den Dunnen JT, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy. See 1 article found using an alternative search: Neuromuscul Disord. 2002; 12:S71-7.

Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, Bremmer-Bout M, den Dunnen JT, Baas F, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Therapeutic antisense-induced exon skipping in cultured muscle cells from six different DMD patients. Hum Mol Genet. 2003; 12(8):907-14.

Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, Bremmer-Bout M, van Ommen GJ, den Dunnen JT, van Deutekom JC. Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense. Am. J. Hum. Genet. 2004; Jan 74(1):83-92.

Alloza I et al., Genes Immun 2012; 13(3):253-257.

Abeliovich A et al., J Neurochem 2006; 99:1062-1072.

van Ommen GJ, van Deutekom J, Aartsma-Rus A. The therapeutic potential of antisense-mediated exon skipping. Curr Opin Mol Ther. 2008; 10(2):140-9.

Andrade MA, Perez-Iratxeta C, Ponting CP. Protein repeats: structures, functions, and evolution. J Struct Biol. 2001; 134(2-3):117-31.

Arai K, Uchiyama N, Wada T. Synthesis and properties of novel 2'-O-alkoxymethyl-modified nucleic acids. Bioorg Med Chem Lett. 2011; 21(21):6285-7.

Béroud C, Tuffery-Giraud S, Matsuo M, Hamroun D, Humbertclaude V, Monnier N, Moizard MP, Voelckel MA, Calemard LM, Boisseau P, Blayau M, Philippe C, Cossée M, Pagès M, Rivier F, Danos O, Garcia L, Claustres M. Multiexon skipping leading to an artificial DMD protein lacking amino acids from exons 45 through 55 could rescue up to 63% of patients with Duchenne muscular dystrophy. Hum Mutat. 2007; Feb;28(2):196-202.

Bomont P et al., Nat Genet 2000; 26(3):370-374.

Cartegni L, Chew SL, Krainer AR. Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet 2002; 3(4):285-98.

Cartegni L, Wang J, Zhu Z, Zhang MQ, Krainer AR. ESEfinder: A web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res 2003; 31(13):3568-71.

Chabriat H et al., Lancet Neurol 2009; 8(7):643-653.

Cheng AJ and Van Dyke MW. Oligodeoxyribonucleotide length and sequence effects on intramolecular and intermolecular G-quartet formation. Gene. 1997; 197(l-2):253-60.

Cirak S, Arechavala-Gomeza V, Guglieri M, Feng L, Torelli S, Anthony K, Abbs S, Garralda ME, Bourke J, Wells DJ, Dickson G, Wood MJ, Wilton SD, Straub V, Kole R, Shrewsbury SB, Sewry C, Morgan JE, Bushby K, Muntoni F. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 2011; 378(9791):595-605.

Cirak S et al., Brain 2010; 133(Pt 7):2123-2135.

Diebold SS, Massacrier C, Akira S, Paturel C, Morel Y, Reis e Sousa C. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. Eur J Immunol; 2006; 36(12):3256-67.

Dhanoa BS et al., Hum Genomics 2013; 7(1):13.

Dorn A, Kippenberger S. Clinical application of CpG-, non-CpG-, and antisense oligodeoxynucleotides as immunomodulators. Curr Opin Mol Ther. 2008; 10(1):10-20.

Dubosq-Bidot L et al., Eur Heart J 2009; 30(17):2128-2136.

Ehmsen J. et al, J. Cell Sci. 2002, 115 (Pt14):2801-2803.

Fiorillo C et al., Neurogenetics 2012; 13(3):195-203.

Friedman JS et al., Am J Hum genet 2009; 84(6):792-800.

Goemans NM, Tulinius M, van den Akker JT, Burm BE, Ekhart PF, Heuvelmans N, Holling T, Janson AA, Platenburg GJ, Sipkens JA, Sitsen JM, Aartsma-Rus A, van Ommen GJ, Buyse G, Darin N, Verschuuren JJ, Campion GV, de Kimpe SJ, van Deutekom JC. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 2011; 364(16):1513-22.

Goyenvalle A, Wright J, Babbs A, Wilkins V, Garcia L, Davies KE. Engineering Multiple U7snRNA Constructs to Induce Single and Multiexon-skipping for Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. 2012 Jun; 20(6):1212-21.

Heemskerk H, de Winter C, van Kuik P, Heuvelmans N, Sabatelli P, Rimessi P, Braghetta P, van Ommen GJ, de Kimpe S, Ferlini A, Aartsma-Rus A, van Deutekom JC. Preclinical PK and PD studies on 2'-O-methyl-phosphorothioate RNA antisense oligonucleotides in the mdx mouse model. Mol Ther. 2010; 18(6):1210-7.

Heneka MT et al., Nature2013; 493(7434):674-678.

Hodgetts S, Radley H, Davies M, Grounds MD. Reduced necrosis of dystrophic muscle by depletion of host neutrophils, or blocking TNFalpha function with Etanercept in mdx mice. Neuromuscul Disord. 2006; 16(9-10):591-602.

Hovnanian A, Cell Tissue Res 2013; 351(2):289-300.

Huang JY et al., Hum Reprod 2013; 28(4):1127-1134.

Knauf F et al., Kidney Int 2013; doi:10.1038/ki.2013.207.

Krieg AM, Yi AK, Matson S, Waldschmidt TJ, Bishop GA, Teasdale R, Koretzky GA, Klinman DM. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature. 1995; 374(6522):546-9.

Krieg, AM. The role of CpG motifs in innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 2000; 12:35-43.

Kumar L, Pharm. Technol. 2008, 3, 128.

Louis-Dit-Picard H et al., Nat Genet 2012; 44(4):456-460.

Macaya RF, Waldron JA, Beutel BA, Gao H, Joesten ME, Yang M, Patel R, Bertelsen AH, Cook AF. Structural and functional characterization of potent antithrombotic oligonucleotides possessing both quadruplex and duplex motifs. Biochemistry. 1995; 34(13):4478-92.

Manzur AY, Kuntzer T, Pike M, Swan A. Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy. Cochrane Database Syst Rev. 2008; (1):CD003725.

Monaco A.P., et al., Genomics 1988; 2:90-95.

Peacock H, Fucini RV, Jayalath P, Ibarra-Soza JM, Haringsma HJ, Flanagan WM, Willingham A, Beal PA. Nucleobase and ribose modifications control immunostimulation by a microRNA-122-mimetic RNA. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133(24):9200-3.

Mollie A et al., Hum Genet 2011; 129(6):641-654.

Moller RS et al., Epilepsia 2013; 54(2):256-264.

Noris P et al., Blood 2011; 117(24):6673-6680.

Popovic PJ, DeMarco R, Lotze MT, Winikoff SE, Bartlett DL, Krieg AM, Guo ZS, Brown CK, Tracey KJ, Zeh HJ 3rd. High mobility group B1 protein suppresses the human plasmacytoid dendritic cell response to TLR9 agonists. J of Immunol 2006; 177:8701-8707.

Puente XS et al., Nature 2011; 475(7354):101-105.

Raciti GA et al., Diabetologia 2011; 54(11):2911-2922.

Rantamaki T et al., Am J Hum Genet 1999; 64(4):993-1001.

Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000.

Sirmaci A et al., Am J Hum Genet 2011; 89(2):289-294.

Stuart HM et al., Am J Hum Genet 2013; 92(2):259-264.

Suzuki K, Doi T, Imanishi T, Kodama T, Tanaka T. Oligonucleotide aggregates bind to the macrophage scavenger receptor. Eur J Biochem. 1999; 260(3):855-60.

Uchida K et al., Immunology 2005; 116(1):53-63.

van Deutekom JC, Janson AA, Ginjaar IB, Frankhuizen WS, Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, den Dunnen JT, Koop K, van der Kooi AJ, Goemans NM, de Kimpe SJ, Ekhart PF, Venneker EH, Platenburg GJ, Verschuuren JJ, van Ommen GJ. Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med. 2007; 357(26):2677-86.

van Vliet L, de Winter CL, van Deutekom JC, van Ommen GJ, Aartsma-Rus A. Assessment of the feasibility of exon 45-55 multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy. BMC Med Genet. 2008, Dec 1; 9:105.

Wagner, H., Bacterial CpG DNA activates immune cells to signal infectious danger Adv. Immunol. 1999; 73: 329-368.

Yokota T, Duddy W, Partridge T. Optimizing exon skipping therapies for DMD. Acta Myol. 2007; 26(3):179-84.

Yokota T, Hoffman E, Takeda S. Antisense oligo-mediated multiple exon skipping in a dog model of duchenne muscular dystrophy. Methods Mol Biol. 2011; 709:299-312.

Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 2003; 31(13), 3406-3415.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Prosensa Technologies B.V.

<120> Олигонуклеотид для лечения пациентов с мышечной дистрофией

<130> P6035506PCTф

<150> EP 12174781.0

<151> 2012-07-03

<150> US 61/667,517

<151> 2012-07-03

<160> 1891

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3685

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val

1 5 10 15

Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe

20 25 30

Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg

35 40 45

Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys

50 55 60

Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala

65 70 75 80

Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser

85 90 95

Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp

100 105 110

Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met

115 120 125

Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val

130 135 140

Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr

145 150 155 160

Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His

165 170 175

Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala

180 185 190

Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly

195 200 205

Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp

210 215 220

Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro

225 230 235 240

Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg

245 250 255

Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met

260 265 270

His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg

275 280 285

Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala

290 295 300

Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln

305 310 315 320

His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu

325 330 335

Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu

340 345 350

Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile

355 360 365

Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly

370 375 380

Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu

385 390 395 400

Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu

405 410 415

Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu

420 425 430

Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val

435 440 445

Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu

450 455 460

Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly

465 470 475 480

Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu

485 490 495

Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His

500 505 510

Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala

515 520 525

Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys

530 535 540

Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys

545 550 555 560

Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser

565 570 575

Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp

580 585 590

Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala

595 600 605

Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys

610 615 620

Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr

625 630 635 640

Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln

645 650 655

Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr

660 665 670

Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr Thr Val Met Glu Thr Val Thr Thr Val

675 680 685

Thr Thr Arg Glu Gln Ile Leu Val Lys His Ala Gln Glu Glu Leu Pro

690 695 700

Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Arg Gln Ile Thr Val Asp Ser Glu Ile

705 710 715 720

Arg Lys Arg Leu Asp Val Asp Ile Thr Glu Leu His Ser Trp Ile Thr

725 730 735

Arg Ser Glu Ala Val Leu Gln Ser Pro Glu Phe Ala Ile Phe Arg Lys

740 745 750

Glu Gly Asn Phe Ser Asp Leu Lys Glu Lys Val Asn Ala Ile Glu Arg

755 760 765

Glu Lys Ala Glu Lys Phe Arg Lys Leu Gln Asp Ala Ser Arg Ser Ala

770 775 780

Gln Ala Leu Val Glu Gln Met Val Asn Glu Gly Val Asn Ala Asp Ser

785 790 795 800

Ile Lys Gln Ala Ser Glu Gln Leu Asn Ser Arg Trp Ile Glu Phe Cys

805 810 815

Gln Leu Leu Ser Glu Arg Leu Asn Trp Leu Glu Tyr Gln Asn Asn Ile

820 825 830

Ile Ala Phe Tyr Asn Gln Leu Gln Gln Leu Glu Gln Met Thr Thr Thr

835 840 845

Ala Glu Asn Trp Leu Lys Ile Gln Pro Thr Thr Pro Ser Glu Pro Thr

850 855 860

Ala Ile Lys Ser Gln Leu Lys Ile Cys Lys Asp Glu Val Asn Arg Leu

865 870 875 880

Ser Gly Leu Gln Pro Gln Ile Glu Arg Leu Lys Ile Gln Ser Ile Ala

885 890 895

Leu Lys Glu Lys Gly Gln Gly Pro Met Phe Leu Asp Ala Asp Phe Val

900 905 910

Ala Phe Thr Asn His Phe Lys Gln Val Phe Ser Asp Val Gln Ala Arg

915 920 925

Glu Lys Glu Leu Gln Thr Ile Phe Asp Thr Leu Pro Pro Met Arg Tyr

930 935 940

Gln Glu Thr Met Ser Ala Ile Arg Thr Trp Val Gln Gln Ser Glu Thr

945 950 955 960

Lys Leu Ser Ile Pro Gln Leu Ser Val Thr Asp Tyr Glu Ile Met Glu

965 970 975

Gln Arg Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Gln Ser Ser Leu Gln Glu Gln

980 985 990

Gln Ser Gly Leu Tyr Tyr Leu Ser Thr Thr Val Lys Glu Met Ser Lys

995 1000 1005

Lys Ala Pro Ser Glu Ile Ser Arg Lys Tyr Gln Ser Glu Phe Glu

1010 1015 1020

Glu Ile Glu Gly Arg Trp Lys Lys Leu Ser Ser Gln Leu Val Glu

1025 1030 1035

His Cys Gln Lys Leu Glu Glu Gln Met Asn Lys Leu Arg Lys Ile

1040 1045 1050

Gln Asn His Ile Gln Thr Leu Lys Lys Trp Met Ala Glu Val Asp

1055 1060 1065

Val Phe Leu Lys Glu Glu Trp Pro Ala Leu Gly Asp Ser Glu Ile

1070 1075 1080

Leu Lys Lys Gln Leu Lys Gln Cys Arg Leu Leu Val Ser Asp Ile

1085 1090 1095

Gln Thr Ile Gln Pro Ser Leu Asn Ser Val Asn Glu Gly Gly Gln

1100 1105 1110

Lys Ile Lys Asn Glu Ala Glu Pro Glu Phe Ala Ser Arg Leu Glu

1115 1120 1125

Thr Glu Leu Lys Glu Leu Asn Thr Gln Trp Asp His Met Cys Gln

1130 1135 1140

Gln Val Tyr Ala Arg Lys Glu Ala Leu Lys Gly Gly Leu Glu Lys

1145 1150 1155

Thr Val Ser Leu Gln Lys Asp Leu Ser Glu Met His Glu Trp Met

1160 1165 1170

Thr Gln Ala Glu Glu Glu Tyr Leu Glu Arg Asp Phe Glu Tyr Lys

1175 1180 1185

Thr Pro Asp Glu Leu Gln Lys Ala Val Glu Glu Met Lys Arg Ala

1190 1195 1200

Lys Glu Glu Ala Gln Gln Lys Glu Ala Lys Val Lys Leu Leu Thr

1205 1210 1215

Glu Ser Val Asn Ser Val Ile Ala Gln Ala Pro Pro Val Ala Gln

1220 1225 1230

Glu Ala Leu Lys Lys Glu Leu Glu Thr Leu Thr Thr Asn Tyr Gln

1235 1240 1245

Trp Leu Cys Thr Arg Leu Asn Gly Lys Cys Lys Thr Leu Glu Glu

1250 1255 1260

Val Trp Ala Cys Trp His Glu Leu Leu Ser Tyr Leu Glu Lys Ala

1265 1270 1275

Asn Lys Trp Leu Asn Glu Val Glu Phe Lys Leu Lys Thr Thr Glu

1280 1285 1290

Asn Ile Pro Gly Gly Ala Glu Glu Ile Ser Glu Val Leu Asp Ser

1295 1300 1305

Leu Glu Asn Leu Met Arg His Ser Glu Asp Asn Pro Asn Gln Ile

1310 1315 1320

Arg Ile Leu Ala Gln Thr Leu Thr Asp Gly Gly Val Met Asp Glu

1325 1330 1335

Leu Ile Asn Glu Glu Leu Glu Thr Phe Asn Ser Arg Trp Arg Glu

1340 1345 1350

Leu His Glu Glu Ala Val Arg Arg Gln Lys Leu Leu Glu Gln Ser

1355 1360 1365

Ile Gln Ser Ala Gln Glu Thr Glu Lys Ser Leu His Leu Ile Gln

1370 1375 1380

Glu Ser Leu Thr Phe Ile Asp Lys Gln Leu Ala Ala Tyr Ile Ala

1385 1390 1395

Asp Lys Val Asp Ala Ala Gln Met Pro Gln Glu Ala Gln Lys Ile

1400 1405 1410

Gln Ser Asp Leu Thr Ser His Glu Ile Ser Leu Glu Glu Met Lys

1415 1420 1425

Lys His Asn Gln Gly Lys Glu Ala Ala Gln Arg Val Leu Ser Gln

1430 1435 1440

Ile Asp Val Ala Gln Lys Lys Leu Gln Asp Val Ser Met Lys Phe

1445 1450 1455

Arg Leu Phe Gln Lys Pro Ala Asn Phe Glu Gln Arg Leu Gln Glu

1460 1465 1470

Ser Lys Met Ile Leu Asp Glu Val Lys Met His Leu Pro Ala Leu

1475 1480 1485

Glu Thr Lys Ser Val Glu Gln Glu Val Val Gln Ser Gln Leu Asn

1490 1495 1500

His Cys Val Asn Leu Tyr Lys Ser Leu Ser Glu Val Lys Ser Glu

1505 1510 1515

Val Glu Met Val Ile Lys Thr Gly Arg Gln Ile Val Gln Lys Lys

1520 1525 1530

Gln Thr Glu Asn Pro Lys Glu Leu Asp Glu Arg Val Thr Ala Leu

1535 1540 1545

Lys Leu His Tyr Asn Glu Leu Gly Ala Lys Val Thr Glu Arg Lys

1550 1555 1560

Gln Gln Leu Glu Lys Cys Leu Lys Leu Ser Arg Lys Met Arg Lys

1565 1570 1575

Glu Met Asn Val Leu Thr Glu Trp Leu Ala Ala Thr Asp Met Glu

1580 1585 1590

Leu Thr Lys Arg Ser Ala Val Glu Gly Met Pro Ser Asn Leu Asp

1595 1600 1605

Ser Glu Val Ala Trp Gly Lys Ala Thr Gln Lys Glu Ile Glu Lys

1610 1615 1620

Gln Lys Val His Leu Lys Ser Ile Thr Glu Val Gly Glu Ala Leu

1625 1630 1635

Lys Thr Val Leu Gly Lys Lys Glu Thr Leu Val Glu Asp Lys Leu

1640 1645 1650

Ser Leu Leu Asn Ser Asn Trp Ile Ala Val Thr Ser Arg Ala Glu

1655 1660 1665

Glu Trp Leu Asn Leu Leu Leu Glu Tyr Gln Lys His Met Glu Thr

1670 1675 1680

Phe Asp Gln Asn Val Asp His Ile Thr Lys Trp Ile Ile Gln Ala

1685 1690 1695

Asp Thr Leu Leu Asp Glu Ser Glu Lys Lys Lys Pro Gln Gln Lys

1700 1705 1710

Glu Asp Val Leu Lys Arg Leu Lys Ala Glu Leu Asn Asp Ile Arg

1715 1720 1725

Pro Lys Val Asp Ser Thr Arg Asp Gln Ala Ala Asn Leu Met Ala

1730 1735 1740

Asn Arg Gly Asp His Cys Arg Lys Leu Val Glu Pro Gln Ile Ser

1745 1750 1755

Glu Leu Asn His Arg Phe Ala Ala Ile Ser His Arg Ile Lys Thr

1760 1765 1770

Gly Lys Ala Ser Ile Pro Leu Lys Glu Leu Glu Gln Phe Asn Ser

1775 1780 1785

Asp Ile Gln Lys Leu Leu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ile Gln Gln

1790 1795 1800

Gly Val Asn Leu Lys Glu Glu Asp Phe Asn Lys Asp Met Asn Glu

1805 1810 1815

Asp Asn Glu Gly Thr Val Lys Glu Leu Leu Gln Arg Gly Asp Asn

1820 1825 1830

Leu Gln Gln Arg Ile Thr Asp Glu Arg Lys Arg Glu Glu Ile Lys

1835 1840 1845

Ile Lys Gln Gln Leu Leu Gln Thr Lys His Asn Ala Leu Lys Asp

1850 1855 1860

Leu Arg Ser Gln Arg Arg Lys Lys Ala Leu Glu Ile Ser His Gln

1865 1870 1875

Trp Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Ala Asp Asp Leu Leu Lys Cys Leu

1880 1885 1890

Asp Asp Ile Glu Lys Lys Leu Ala Ser Leu Pro Glu Pro Arg Asp

1895 1900 1905

Glu Arg Lys Ile Lys Glu Ile Asp Arg Glu Leu Gln Lys Lys Lys

1910 1915 1920

Glu Glu Leu Asn Ala Val Arg Arg Gln Ala Glu Gly Leu Ser Glu

1925 1930 1935

Asp Gly Ala Ala Met Ala Val Glu Pro Thr Gln Ile Gln Leu Ser

1940 1945 1950

Lys Arg Trp Arg Glu Ile Glu Ser Lys Phe Ala Gln Phe Arg Arg

1955 1960 1965

Leu Asn Phe Ala Gln Ile His Thr Val Arg Glu Glu Thr Met Met

1970 1975 1980

Val Met Thr Glu Asp Met Pro Leu Glu Ile Ser Tyr Val Pro Ser

1985 1990 1995

Thr Tyr Leu Thr Glu Ile Thr His Val Ser Gln Ala Leu Leu Glu

2000 2005 2010

Val Glu Gln Leu Leu Asn Ala Pro Asp Leu Cys Ala Lys Asp Phe

2015 2020 2025

Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Asp

2030 2035 2040

Ser Leu Gln Gln Ser Ser Gly Arg Ile Asp Ile Ile His Ser Lys

2045 2050 2055

Lys Thr Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr Pro Val Glu Arg Val Lys

2060 2065 2070

Leu Gln Glu Ala Leu Ser Gln Leu Asp Phe Gln Trp Glu Lys Val

2075 2080 2085

Asn Lys Met Tyr Lys Asp Arg Gln Gly Arg Phe Asp Arg Ser Val

2090 2095 2100

Glu Lys Trp Arg Arg Phe His Tyr Asp Ile Lys Ile Phe Asn Gln

2105 2110 2115

Trp Leu Thr Glu Ala Glu Gln Phe Leu Arg Lys Thr Gln Ile Pro

2120 2125 2130

Glu Asn Trp Glu His Ala Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Leu

2135 2140 2145

Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln Thr Val Val Arg Thr Leu Asn

2150 2155 2160

Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln Ser Ser Lys Thr Asp Ala

2165 2170 2175

Ser Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Ser Leu Asn Leu Arg Trp Gln

2180 2185 2190

Glu Val Cys Lys Gln Leu Ser Asp Arg Lys Lys Arg Leu Glu Glu

2195 2200 2205

Gln Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Gln Arg Asp Leu Asn Glu Phe

2210 2215 2220

Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala Asp Asn Ile Ala Ser Ile Pro Leu

2225 2230 2235

Glu Pro Gly Lys Glu Gln Gln Leu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Val

2240 2245 2250

Lys Leu Leu Val Glu Glu Leu Pro Leu Arg Gln Gly Ile Leu Lys

2255 2260 2265

Gln Leu Asn Glu Thr Gly Gly Pro Val Leu Val Ser Ala Pro Ile

2270 2275 2280

Ser Pro Glu Glu Gln Asp Lys Leu Glu Asn Lys Leu Lys Gln Thr

2285 2290 2295

Asn Leu Gln Trp Ile Lys Val Ser Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln

2300 2305 2310

Gly Glu Ile Glu Ala Gln Ile Lys Asp Leu Gly Gln Leu Glu Lys

2315 2320 2325

Lys Leu Glu Asp Leu Glu Glu Gln Leu Asn His Leu Leu Leu Trp

2330 2335 2340

Leu Ser Pro Ile Arg Asn Gln Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Asn

2345 2350 2355

Gln Glu Gly Pro Phe Asp Val Gln Glu Thr Glu Ile Ala Val Gln

2360 2365 2370

Ala Lys Gln Pro Asp Val Glu Glu Ile Leu Ser Lys Gly Gln His

2375 2380 2385

Leu Tyr Lys Glu Lys Pro Ala Thr Gln Pro Val Lys Arg Lys Leu

2390 2395 2400

Glu Asp Leu Ser Ser Glu Trp Lys Ala Val Asn Arg Leu Leu Gln

2405 2410 2415

Glu Leu Arg Ala Lys Gln Pro Asp Leu Ala Pro Gly Leu Thr Thr

2420 2425 2430

Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr Leu Val Thr Gln Pro

2435 2440 2445

Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser

2450 2455 2460

Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Ala Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala

2465 2470 2475

Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp Leu Ser Leu Leu Asp Gln Val Ile

2480 2485 2490

Lys Ser Gln Arg Val Met Val Gly Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu

2495 2500 2505

Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala Thr Met Gln Asp Leu Glu Gln Arg

2510 2515 2520

Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys

2525 2530 2535

Asn Lys Thr Ser Asn Gln Glu Ala Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg

2540 2545 2550

Ile Glu Arg Ile Gln Asn Gln Trp Asp Glu Val Gln Glu His Leu

2555 2560 2565

Gln Asn Arg Arg Gln Gln Leu Asn Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr

2570 2575 2580

Gln Trp Leu Glu Ala Lys Glu Glu Ala Glu Gln Val Leu Gly Gln

2585 2590 2595

Ala Arg Ala Lys Leu Glu Ser Trp Lys Glu Gly Pro Tyr Thr Val

2600 2605 2610

Asp Ala Ile Gln Lys Lys Ile Thr Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys

2615 2620 2625

Asp Leu Arg Gln Trp Gln Thr Asn Val Asp Val Ala Asn Asp Leu

2630 2635 2640

Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp Tyr Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys

2645 2650 2655

Val His Met Ile Thr Glu Asn Ile Asn Ala Ser Trp Arg Ser Ile

2660 2665 2670

His Lys Arg Val Ser Glu Arg Glu Ala Ala Leu Glu Glu Thr His

2675 2680 2685

Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala

2690 2695 2700

Trp Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala

2705 2710 2715

Thr Arg Lys Glu Arg Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly Val Lys Glu

2720 2725 2730

Leu Met Lys Gln Trp Gln Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu Ala His

2735 2740 2745

Thr Asp Val Tyr His Asn Leu Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu

2750 2755 2760

Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg

2765 2770 2775

Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser

2780 2785 2790

Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys

2795 2800 2805

Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu

2810 2815 2820

Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe

2825 2830 2835

Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe Lys Arg

2840 2845 2850

Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr

2855 2860 2865

Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys

2870 2875 2880

Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln

2885 2890 2895

Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr

2900 2905 2910

Glu Trp Glu Lys Leu Asn Leu His Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys

2915 2920 2925

Ile Asp Glu Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr

2930 2935 2940

Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly

2945 2950 2955

Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp

2960 2965 2970

His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu

2975 2980 2985

Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr

2990 2995 3000

Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu

3005 3010 3015

Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp

3020 3025 3030

Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala

3035 3040 3045

Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg

3050 3055 3060

Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr

3065 3070 3075

Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln

3080 3085 3090

Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr

3095 3100 3105

Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu

3110 3115 3120

Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu

3125 3130 3135

Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys

3140 3145 3150

Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu Glu Gln Glu His Asn Asn Leu

3155 3160 3165

Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu

3170 3175 3180

Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg Ile Arg Val Leu Ser

3185 3190 3195

Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala His Leu Glu Asp

3200 3205 3210

Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe

3215 3220 3225

Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ser Ile Gln

3230 3235 3240

Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn

3245 3250 3255

Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys

3260 3265 3270

Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu

3275 3280 3285

Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala

3290 3295 3300

Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu

3305 3310 3315

Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn

3320 3325 3330

Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys

3335 3340 3345

Gly His Lys Met His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr

3350 3355 3360

Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn

3365 3370 3375

Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg Met Gly

3380 3385 3390

Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr

3395 3400 3405

Pro Val Thr Leu Ile Asn Phe Trp Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala

3410 3415 3420

Ser Ser Pro Gln Leu Ser His Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu

3425 3430 3435

His Tyr Ala Ser Arg Leu Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser

3440 3445 3450

Tyr Leu Asn Asp Ser Ile Ser Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu

3455 3460 3465

His Leu Leu Ile Gln His Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser

3470 3475 3480

Pro Leu Ser Gln Pro Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu

3485 3490 3495

Glu Ser Glu Glu Arg Gly Glu Leu Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu

3500 3505 3510

Glu Glu Glu Asn Arg Asn Leu Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys

3515 3520 3525

Gln Gln His Glu His Lys Gly Leu Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro

3530 3535 3540

Glu Met Met Pro Thr Ser Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu

3545 3550 3555

Ile Ala Glu Ala Lys Leu Leu Arg Gln His Lys Gly Arg Leu Glu

3560 3565 3570

Ala Arg Met Gln Ile Leu Glu Asp His Asn Lys Gln Leu Glu Ser

3575 3580 3585

Gln Leu His Arg Leu Arg Gln Leu Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu

3590 3595 3600

Ala Lys Val Asn Gly Thr Thr Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu

3605 3610 3615

Gln Arg Ser Asp Ser Ser Gln Pro Met Leu Leu Arg Val Val Gly

3620 3625 3630

Ser Gln Thr Ser Asp Ser Met Gly Glu Glu Asp Leu Leu Ser Pro

3635 3640 3645

Pro Gln Asp Thr Ser Thr Gly Leu Glu Glu Val Met Glu Gln Leu

3650 3655 3660

Asn Asn Ser Phe Pro Ser Ser Arg Gly Arg Asn Thr Pro Gly Lys

3665 3670 3675

Pro Met Arg Glu Asp Thr Met

3680 3685

<210> 2

<211> 182

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 8 транскрипта дистрофина человека

<400> 2

auguugauac caccuaucca gauaagaagu ccaucuuaau guacaucaca ucacucuucc 60

aaguuuugcc ucaacaagug agcauugaag ccauccagga aguggaaaug uugccaaggc 120

caccuaaagu gacuaaagaa gaacauuuuc aguuacauca ucaaaugcac uauucucaac 180

ag 182

<210> 3

<211> 129

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 3

aucacgguca gucuagcaca gggauaugag agaacuucuu ccccuaagcc ucgauucaag 60

agcuaugccu acacacaggc ugcuuauguc accaccucug acccuacacg gagcccauuu 120

ccuucacag 129

<210> 4

<211> 189

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 4

cauuuggaag cuccugaaga caagucauuu ggcaguucau ugauggagag ugaaguaaac 60

cuggaccguu aucaaacagc uuuagaagaa guauuaucgu ggcuucuuuc ugcugaggac 120

acauugcaag cacaaggaga gauuucuaau gauguggaag uggugaaaga ccaguuucau 180

acucaugag 189

<210> 5

<211> 124

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 5

guuggauguu gauauaacug aacuucacag cuggauuacu cgcucagaag cuguguugca 60

gaguccugaa uuugcaaucu uucggaagga aggcaacuuc ucagacuuaa aagaaaaagu 120

caau 124

<210> 6

<211> 88

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 6

gccauagagc gagaaaaagc ugagaaguuc agaaaacugc aagaugccag cagaucagcu 60

caggcccugg uggaacagau ggugaaug 88

<210> 7

<211> 146

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 22 транскрипта дистрофина человека

<400> 7

uuuuugacac uuugccacca augcgcuauc aggagaccau gagugccauc aggacauggg 60

uccagcaguc agaaaccaaa cucuccauac cucaacuuag ugucaccgac uaugaaauca 120

uggagcagag acucggggaa uugcag 146

<210> 8

<211> 213

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 8

gcuuuacaaa guucucugca agagcaacaa aguggccuau acuaucucag caccacugug 60

aaagagaugu cgaagaaagc gcccucugaa auuagccgga aauaucaauc agaauuugaa 120

gaaauugagg gacgcuggaa gaagcucucc ucccagcugg uugagcauug ucaaaagcua 180

gaggagcaaa ugaauaaacu ccgaaaaauu cag 213

<210> 9

<211> 162

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 30 транскрипта дистрофина человека

<400> 9

gcuguaagga ggcaaaaguu gcuugaacag agcauccagu cugcccagga gacugaaaaa 60

uccuuacacu uaauccagga gucccucaca uucauugaca agcaguuggc agcuuauauu 120

gcagacaagg uggacgcagc ucaaaugccu caggaagccc ag 162

<210> 10

<211> 150

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 47 транскрипта дистрофина человека

<400> 10

uuacuggugg aagaguugcc ccugcgccag ggaauucuca aacaauuaaa ugaaacugga 60

ggacccgugc uuguaagugc ucccauaagc ccagaagagc aagauaaacu ugaaaauaag 120

cucaagcaga caaaucucca guggauaaag 150

<210> 11

<211> 195

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 11

cacacugucc gugaagaaac gaugauggug augacugaag acaugccuuu ggaaauuucu 60

uaugugccuu cuacuuauuu gacugaaauc acucaugucu cacaagcccu auuagaagug 120

gaacaacuuc ucaaugcucc ugaccucugu gcuaaggacu uugaagaucu cuuuaagcaa 180

gaggagucuc ugaag 195

<210> 12

<211> 176

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 45 транскрипта дистрофина человека

<400> 12

gaacuccagg auggcauugg gcagcggcaa acuguuguca gaacauugaa ugcaacuggg 60

gaagaaauaa uucagcaauc cucaaaaaca gaugccagua uucuacagga aaaauuggga 120

agccugaauc ugcgguggca ggaggucugc aaacagcugu cagacagaaa aaagag 176

<210> 13

<211> 212

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 53 транскрипта дистрофина человека

<400> 13

uugaaagaau ucagaaucag ugggaugaag uacaagaaca ccuucagaac cggaggcaac 60

aguugaauga aauguuaaag gauucaacac aauggcugga agcuaaggaa gaagcugagc 120

aggucuuagg acaggccaga gccaagcuug agucauggaa ggaggguccc uauacaguag 180

augcaaucca aaagaaaauc acagaaacca ag 212

<210> 14

<211> 190

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 55 транскрипта дистрофина человека

<400> 14

ggugagugag cgagaggcug cuuuggaaga aacucauaga uuacugcaac aguucccccu 60

ggaccuggaa aaguuucuug ccuggcuuac agaagcugaa acaacugcca auguccuaca 120

ggaugcuacc cguaaggaaa ggcuccuaga agacuccaag ggaguaaaag agcugaugaa 180

acaauggcaa 190

<210> 15

<211> 173

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 56 транскрипта дистрофина человека

<400> 15

gaccuccaag gugaaauuga agcucacaca gauguuuauc acaaccugga ugaaaacagc 60

caaaaaaucc ugagaucccu ggaagguucc gaugaugcag uccuguuaca aagacguuug 120

gauaacauga acuucaagug gagugaacuu cggaaaaagu cucucaacau uag 173

<210> 16

<211> 147

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Экзон 60 транскрипта дистрофина человека

<400> 16

gcacuucgag gagaaauugc gccucugaaa gagaacguga gccacgucaa ugaccuugcu 60

cgccagcuua ccacuuuggg cauucagcuc ucaccguaua accucagcac ucuggaagac 120

cugaacacca gauggaagcu ucugcag 147

<210> 17

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 8 транскрипта дистрофина человека

<400> 17

agauaagaag ucca 14

<210> 18

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 18

agcugagaag uuca 14

<210> 19

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 8 транскрипта дистрофина человека

<400> 19

accuauccag auaagaaguc caucuuaaug uaca 34

<210> 20

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 20

acaaaucauu uuaagcaagu cuuuucugau gugca 35

<210> 21

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 8 транскрипта дистрофина человека

<400> 21

uuugccucaa caagugagca uugaagcc 28

<210> 22

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 50 транскрипта дистрофина человека

<400> 22

uuuacuucaa gagcugaggg caaagcagcc 30

<210> 23

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 8 транскрипта дистрофина человека

<400> 23

gaagccaucc aggaagugga a 21

<210> 24

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 52 транскрипта дистрофина человека

<400> 24

gcaacaaugc aggauuugga a 21

<210> 25

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 8 транскрипта дистрофина человека

<400> 25

caagugagca uugaa 15

<210> 26

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 58 транскрипта дистрофина человека

<400> 26

caagagggaa uugaa 15

<210> 27

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 27

cuagcacagg gaua 14

<210> 28

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 28

caagcacaag gaga 14

<210> 29

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 29

gucagucuag cacagggaua ugagagaac 29

<210> 30

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 12 транскрипта дистрофина человека

<400> 30

gacuggcuaa caaaaacaga agaaagaac 29

<210> 31

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 31

ucuagcacag ggauaugaga g 21

<210> 32

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 32

ucuagaacaa gaacaaguca g 21

<210> 33

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 33

acacaggcug cuuaugucac caccucugac 30

<210> 34

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 34

agacauccuu cucaaauggc aacgucuuac 30

<210> 35

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 35

ucuagcacag ggauaugaga gaa 23

<210> 36

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 36

uuuagugcau ggcuuucaga aaa 23

<210> 37

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 37

uaugccuaca cacaggcugc uuaugucacc ac 32

<210> 38

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 38

uauucacuca aacaagaucu ucuuucaaca c 31

<210> 39

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 39

gauaugagag aacuuc 16

<210> 40

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 40

gauauaacug aacuuc 16

<210> 41

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 41

caccaccucu gacccuaca 19

<210> 42

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 42

caccccauca gagccaaca 19

<210> 43

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 43

cuuaugucac caccucuga 19

<210> 44

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 22 транскрипта дистрофина человека

<400> 44

cuuaguguca ccgacuaug 19

<210> 45

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 45

uaugucacca ccucug 16

<210> 46

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 46

uaucucagca ccacug 16

<210> 47

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 47

cagggauaug agagaacuuc uuccc 25

<210> 48

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 25 транскрипта дистрофина человека

<400> 48

cagugauauu cagacaauuc agccc 25

<210> 49

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 49

uaagccucga uucaagagcu au 22

<210> 50

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 26 транскрипта дистрофина человека

<400> 50

uaagccucca gaaagaucua u 21

<210> 51

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 51

accaccucug acccuacac 19

<210> 52

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 27 транскрипта дистрофина человека

<400> 52

acuaccagug gcucugcac 19

<210> 53

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 53

ggauaugaga gaacuucu 18

<210> 54

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 28 транскрипта дистрофина человека

<400> 54

ggagcugagg aaaucucu 18

<210> 55

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 55

agggauauga gagaacuucu uccccu 26

<210> 56

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 29 транскрипта дистрофина человека

<400> 56

aggaacuuga gacauuuaau ucucgu 26

<210> 57

<211> 49

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 57

cagucuagca cagggauaug agagaacuuc uuccccuaag ccucgauuc 49

<210> 58

<211> 47

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 30 транскрипта дистрофина человека

<400> 58

cagucugccc aggagacuga aaaauccuua cacuuaaucc aggaguc 47

<210> 59

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 59

ggucagucua gcacagggau augagagaac uucuuc 36

<210> 60

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 31 транскрипта дистрофина человека

<400> 60

gaucaguuua gaagaaauga agaaacauaa uc 32

<210> 61

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 61

uucuuccccu aagccucgau ucaagagcua ugccuaca 38

<210> 62

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 32 транскрипта дистрофина человека

<400> 62

uuauuccaga aaccagccaa uuuugagcag cgucuaca 38

<210> 63

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 63

cccuaagccu cgauucaaga g 21

<210> 64

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 33 транскрипта дистрофина человека

<400> 64

cccaaagaac uugaugaaag ag 22

<210> 65

<211> 62

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 65

gggauaugag agaacuucuu ccccuaagcc ucgauucaag agcuaugccu acacacaggc 60

ug 62

<210> 66

<211> 63

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 34 транскрипта дистрофина человека

<400> 66

gagaaaugcu ugaaauuguc ccguaagaug cgaaaggaaa ugaaugucuu gacagaaugg 60

cug 63

<210> 67

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 67

agucuagcac agggauauga gagaacuu 28

<210> 68

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 35 транскрипта дистрофина человека

<400> 68

agaguaucac agagguagga gaggccuu 28

<210> 69

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 69

ucagucuagc acagggauau gagagaa 27

<210> 70

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 36 транскрипта дистрофина человека

<400> 70

ucaggcugac acacuuuugg augaaucaga gaa 33

<210> 71

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 71

cagucuagca cagggauaug agagaacuuc uu 32

<210> 72

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 38 транскрипта дистрофина человека

<400> 72

caguuuaacu cagauauaca aaaauugcuu 30

<210> 73

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 73

caggcugcuu auguc 15

<210> 74

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 40 транскрипта дистрофина человека

<400> 74

caggcugaug aucuc 15

<210> 75

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 75

ccaccucuga ccc 13

<210> 76

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 41 транскрипта дистрофина человека

<400> 76

ccaacucaga ucc 13

<210> 77

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 77

gauaugagag aacuucu 17

<210> 78

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 78

gaaguggaac aacuucu 17

<210> 79

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 79

gggauaugag agaacu 16

<210> 80

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 44 транскрипта дистрофина человека

<400> 80

gcgauuugac agaucu 16

<210> 81

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 81

gucagucuag cacagggaua ugagagaacu ucuu 34

<210> 82

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 46 транскрипта дистрофина человека

<400> 82

gucagaauuu caaagagauu uaaaugaauu uguu 34

<210> 83

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 83

uccccuaagc cucga 15

<210> 84

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 47 транскрипта дистрофина человека

<400> 84

ucccauaagc ccaga 15

<210> 85

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 85

gauucaagag cuaugccuac acacagg 27

<210> 86

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 48 транскрипта дистрофина человека

<400> 86

guuuccagag cuuuaccuga gaaacaag 28

<210> 87

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 87

ggucagucua gcacagggau augagagaac uucu 34

<210> 88

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 49 транскрипта дистрофина человека

<400> 88

guucaagcua aacaaccgga uguggaagag auuuu 35

<210> 89

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 89

cacggucagu cuagcacagg gauaugagag aacuu 35

<210> 90

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 51 транскрипта дистрофина человека

<400> 90

cucuggcaga uuucaaccgg gcuuggacag aacuu 35

<210> 91

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 91

cuacacacag gcug 14

<210> 92

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 53 транскрипта дистрофина человека

<400> 92

caacacaaug gcug 14

<210> 93

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 93

gucuagcaca gggauaugag agaacuucu 29

<210> 94

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 57 транскрипта дистрофина человека

<400> 94

gucugcaccu uucucugcag gaacuucu 28

<210> 95

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 95

caggcugcuu augucaccac 20

<210> 96

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 59 транскрипта дистрофина человека

<400> 96

caggcugagg aggucaauac 20

<210> 97

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 9 транскрипта дистрофина человека

<400> 97

caccucugac ccuaca 16

<210> 98

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 60 транскрипта дистрофина человека

<400> 98

cagcucucac cguaua 16

<210> 99

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 99

ugauguggaa guggugaaag accaguuuca uacucaugag 40

<210> 100

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 12 транскрипта дистрофина человека

<400> 100

ugaucuugaa gaccuaaaac gccaaguaca acaacauaag 40

<210> 101

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 101

ucaaacagcu uuagaagaag ua 22

<210> 102

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 102

ucaagaagau cuagaacaag aa 22

<210> 103

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 103

caaacagcuu uagaagaagu auuaucgugg cuucuuu 37

<210> 104

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 104

caaacaucug uagauggaca gaagaccgcu ggguucuuu 39

<210> 105

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 105

acagcuuuag aagaaguauu aucguggcuu c 31

<210> 106

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 106

aaagaucaaa augaaauguu aucaagucuu c 31

<210> 107

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 107

aguaaaccug gaccguuauc aaacagcuuu agaagaagu 39

<210> 108

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 108

acucaaacaa gaucuucuuu caacacugaa gaauaagu 38

<210> 109

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 109

auuuggaagc uccugaagac aagucauuug gcag 34

<210> 110

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 110

auuugcaauc uuucggaagg aaggcaacuu cucag 35

<210> 111

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 111

aucaaacagc uuuagaagaa gu 22

<210> 112

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 112

aucaaacaag ccucagaaca acu 23

<210> 113

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 113

gacacauugc aagca 15

<210> 114

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 22 транскрипта дистрофина человека

<400> 114

gacacuuugc cacca 15

<210> 115

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 115

ugaaguaaac cuggaccguu aucaaacagc uuuagaagaa gu 42

<210> 116

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 116

ugaaauuagc cggaaauauc aaucagaauu ugaagaaau 39

<210> 117

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 117

aaaccuggac cguuaucaaa cagcuuuaga agaaguauua uc 42

<210> 118

<211> 43

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 25 транскрипта дистрофина человека

<400> 118

agacuugaga cagaacucaa agaacuuaac acucaguggg auc 43

<210> 119

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 119

cugcugagga cacauugcaa gcacaaggag agau 34

<210> 120

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 26 транскрипта дистрофина человека

<400> 120

cuccagauga auuacagaaa gcaguugaag agau 34

<210> 121

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 121

acagcuuuag aagaag 16

<210> 122

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 27 транскрипта дистрофина человека

<400> 122

agagcuaaag aagagg 16

<210> 123

<211> 75

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 123

aaaccuggac cguuaucaaa cagcuuuaga agaaguauua ucguggcuuc uuucugcuga 60

ggacacauug caagc 75

<210> 124

<211> 73

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 28 транскрипта дистрофина человека

<400> 124

auacuuggag aaagcaaaca aguggcuaaa ugaaguagaa uuuaaacuua aaaccacuga 60

aaacauuccu ggc 73

<210> 125

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 125

cuaaugaugu ggaaguggug aaa 23

<210> 126

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 29 транскрипта дистрофина человека

<400> 126

cuaaucaaug aggaacuuga gaca 24

<210> 127

<211> 70

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 127

gacaagucau uuggcaguuc auugauggag agugaaguaa accuggaccg uuaucaaaca 60

gcuuuagaag 70

<210> 128

<211> 61

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 30 транскрипта дистрофина человека

<400> 128

gacaagcagu uggcagcuua uauugcagac aagguggacg cagcucaaau gccucaggaa 60

g 61

<210> 129

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 129

gacaagucau uuggcaguuc auugauggag agugaaguaa 40

<210> 130

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 31 транскрипта дистрофина человека

<400> 130

gacaagucau gagaucaguu uagaagaaau gaagaaa 37

<210> 131

<211> 81

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 131

acaagucauu uggcaguuca uugauggaga gugaaguaaa ccuggaccgu uaucaaacag 60

cuuuagaaga aguauuaucg u 81

<210> 132

<211> 86

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 32 транскрипта дистрофина человека

<400> 132

acaagaaagu aagaugauuu uagaugaagu gaagaugcac uugccugcau uggaaacaaa 60

gaguguggaa caggaaguag uacagu 86

<210> 133

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 133

ugauguggaa guggugaaag ac 22

<210> 134

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 33 транскрипта дистрофина человека

<400> 134

ugaaguggaa auggugauaa agac 24

<210> 135

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 135

cuaaugaugu ggaaguggug aaagaccag 29

<210> 136

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 34 транскрипта дистрофина человека

<400> 136

cuacagauau ggaauugaca aagagaucag 30

<210> 137

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 137

aaacagcuuu agaagaagua 20

<210> 138

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 35 транскрипта дистрофина человека

<400> 138

aaacaguuuu gggcaagaag ga 22

<210> 139

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 139

aagcacaagg agagauuucu aaugaugugg a 31

<210> 140

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 36 транскрипта дистрофина человека

<400> 140

aaacacaugg aaacuuuuga ccagaaugug ga 32

<210> 141

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 141

gaaguaaacc ugga 14

<210> 142

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 37 транскрипта дистрофина человека

<400> 142

gaauuaagac ugga 14

<210> 143

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 143

ugaaguaaac cuggaccguu aucaaacagc uuuagaagaa gu 42

<210> 144

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 38 транскрипта дистрофина человека

<400> 144

ugaaggaauu ggagcaguuu aacucagaua uacaaaaauu 40

<210> 145

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 145

auugauggag agugaaguaa accu 24

<210> 146

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 39 транскрипта дистрофина человека

<400> 146

auuguugcaa agaggagaca acuu 24

<210> 147

<211> 57

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 147

ugaggacaca uugcaagcac aaggagagau uucuaaugau guggaagugg ugaaaga 57

<210> 148

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 40 транскрипта дистрофина человека

<400> 148

ugaggucuca aagaagaaaa aaggcucuag aaauuucuca ucagugguau caguacaaga 60

<210> 149

<211> 46

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 149

gcugaggaca cauugcaagc acaaggagag auuucuaaug augugg 46

<210> 150

<211> 47

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 41 транскрипта дистрофина человека

<400> 150

gcugaaugca gugcguaggc aagcugaggg cuugucugag gaugggg 47

<210> 151

<211> 134

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 151

cugaagacaa gucauuuggc aguucauuga uggagaguga aguaaaccug gaccguuauc 60

aaacagcuuu agaagaagua uuaucguggc uucuuucugc ugaggacaca uugcaagcac 120

aaggagagau uucu 134

<210> 152

<211> 138

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 152

cugaagacau gccuuuggaa auuucuuaug ugccuucuac uuauuugacu gaaaucacuc 60

augucucaca agcccuauua gaaguggaac aacuucucaa ugcuccugac cucugugcua 120

aggacuuuga agaucucu 138

<210> 153

<211> 109

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 153

cguuaucaaa cagcuuuaga agaaguauua ucguggcuuc uuucugcuga ggacacauug 60

caagcacaag gagagauuuc uaaugaugug gaagugguga aagaccagu 109

<210> 154

<211> 106

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 44 транскрипта дистрофина человека

<400> 154

cguuuucauu augauauaaa gauauuuaau caguggcuaa cagaagcuga acaguuucuc 60

agaaagacac aaauuccuga gaauugggaa caugcuaaau acaaau 106

<210> 155

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 155

aaguaaaccu ggaccguuau caaacagcuu uagaagaagu auuaucgugg 50

<210> 156

<211> 54

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 46 транскрипта дистрофина человека

<400> 156

aagaauaucu ugucagaauu ucaaagagau uuaaaugaau uuguuuuaug guug 54

<210> 157

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 157

aagcuccuga agacaaguc 19

<210> 158

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 47 транскрипта дистрофина человека

<400> 158

aagcucaagc agacaaauc 19

<210> 159

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 159

uggaagcucc ugaagacaag ucauuuggca guu 33

<210> 160

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 48 транскрипта дистрофина человека

<400> 160

uugaagcuca aauaaaagac cuugggcagc u 31

<210> 161

<211> 53

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 161

gagagugaag uaaaccugga ccguuaucaa acagcuuuag aagaaguauu auc 53

<210> 162

<211> 53

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 49 транскрипта дистрофина человека

<400> 162

gaaacugaaa uagcaguuca agcuaaacaa ccggaugugg aagagauuuu guc 53

<210> 163

<211> 108

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 163

uucauugaug gagagugaag uaaaccugga ccguuaucaa acagcuuuag aagaaguauu 60

aucguggcuu cuuucugcug aggacacauu gcaagcacaa ggagagau 108

<210> 164

<211> 108

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 51 транскрипта дистрофина человека

<400> 164

uuccuugaug uuggagguac cugcucuggc agauuucaac cgggcuugga cagaacuuac 60

cgacuggcuu ucucugcuug aucaaguuau aaaaucacag agggugau 108

<210> 165

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 165

gagagauuuc uaaugaugug gaagugguga aagaccaguu ucaua 45

<210> 166

<211> 46

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 53 транскрипта дистрофина человека

<400> 166

gaaagaauuc agaaucagug ggaugaagua caagaacacc uucaga 46

<210> 167

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 167

cagcuuuaga agaa 14

<210> 168

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 55 транскрипта дистрофина человека

<400> 168

cugcuuugga agaa 14

<210> 169

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 169

cauuuggaag cuccugaaga caagu 25

<210> 170

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 57 транскрипта дистрофина человека

<400> 170

cauuuggaag ccaguucuga ccagu 25

<210> 171

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 171

cuuucugcug aggacaca 18

<210> 172

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 59 транскрипта дистрофина человека

<400> 172

cugccuccug aggagaga 18

<210> 173

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 10 транскрипта дистрофина человека

<400> 173

cauuuggaag cuccugaag 19

<210> 174

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 60 транскрипта дистрофина человека

<400> 174

cagauggaag cuucugcag 19

<210> 175

<211> 92

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 175

aucagaagau gaagaaacug aaguacaaga gcagaugaau cuccuaaauu caagauggga 60

augccucagg guagcuagca uggaaaaaca aa 92

<210> 176

<211> 99

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 12 транскрипта дистрофина человека

<400> 176

aucagaaacu gaaagaguug aaugacuggc uaacaaaaac agaagaaaga acaaggaaaa 60

uggaggaaga gccucuugga ccugaucuug aagaccuaa 99

<210> 177

<211> 55

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 177

agaagaugaa gaaacugaag uacaagagca gaugaaucuc cuaaauucaa gaugg 55

<210> 178

<211> 53

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 178

agaagaucua gaacaagaac aagucagggu caauucucuc acucacaugg ugg 53

<210> 179

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 179

gaugaagaaa cugaaguaca agagcagaug a 31

<210> 180

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 180

gaugggcaaa caucuguaga uggacagaag a 31

<210> 181

<211> 90

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 181

uaucagaaga ugaagaaacu gaaguacaag agcagaugaa ucuccuaaau ucaagauggg 60

aaugccucag gguagcuagc auggaaaaac 90

<210> 182

<211> 84

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 182

uuucagaaaa agaagaugca gugaacaaga uucacacaac uggcuuuaaa gaucaaaaug 60

aaauguuauc aagucuucaa aaac 84

<210> 183

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 183

aagaaacuga aguacaagag cagaugaauc uccuaaauuc aagau 45

<210> 184

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 184

aagaaaaagc aauccauggg caaacuguau ucacucaaac aagau 45

<210> 185

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 185

aggaaaauua ucagaagaug aagaaa 26

<210> 186

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 186

aggcaacuuc ucagacuuaa aagaaa 26

<210> 187

<211> 62

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 187

cggguuggua auauucuaca auugggaagu aagcugauug gaacaggaaa auuaucagaa 60

ga 62

<210> 188

<211> 62

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 188

ccgguggauc gaauucugcc aguugcuaag ugagagacuu aacuggcugg aguaucagaa 60

ca 62

<210> 189

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 189

ccaucagggc cggguu 16

<210> 190

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 22 транскрипта дистрофина человека

<400> 190

ccaucaggac augggu 16

<210> 191

<211> 65

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 191

cugauuggaa caggaaaauu aucagaagau gaagaaacug aaguacaaga gcagaugaau 60

cuccu 65

<210> 192

<211> 66

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 192

cugaaauuag ccggaaauau caaucagaau uugaagaaau ugagggacgc uggaagaagc 60

ucuccu 66

<210> 193

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 193

gaugaagaaa cugaaguaca agagcagaug aauc 34

<210> 194

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 24 транскрипта дистрофина человека

<400> 194

gauucagaaa uucuaaaaaa gcagcugaaa c 31

<210> 195

<211> 77

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 195

guugguaaua uucuacaauu gggaaguaag cugauuggaa caggaaaauu aucagaagau 60

gaagaaacug aaguaca 77

<210> 196

<211> 77

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 25 транскрипта дистрофина человека

<400> 196

gucagugaua uucagacaau ucagcccagu cuaaacagug ucaaugaagg ugggcagaag 60

auaaagaaug aagcaga 77

<210> 197

<211> 49

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 197

caggaaaauu aucagaagau gaagaaacug aaguacaaga gcagaugaa 49

<210> 198

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 26 транскрипта дистрофина человека

<400> 198

cagaaagauc uaucagagau gcacgaaugg augacacaag cugaagaa 48

<210> 199

<211> 44

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 199

aagaugaaga aacugaagua caagagcaga ugaaucuccu aaau 44

<210> 200

<211> 44

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 27 транскрипта дистрофина человека

<400> 200

aagaagaggc ccaacaaaaa gaagcgaaag ugaaacuccu uacu 44

<210> 201

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 201

gaagaugaag aaacugaagu acaaga 26

<210> 202

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 28 транскрипта дистрофина человека

<400> 202

ggagcugagg aaaucucuga ggugcuaga 29

<210> 203

<211> 74

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 203

gcugauugga acaggaaaau uaucagaaga ugaagaaacu gaaguacaag agcagaugaa 60

ucuccuaaau ucaa 74

<210> 204

<211> 73

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 29 транскрипта дистрофина человека

<400> 204

gcauauuggc acagacccua acagauggcg gagucaugga ugagcuaauc aaugaggaac 60

uugagacauu uaa 73

<210> 205

<211> 62

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 205

aagcugauug gaacaggaaa auuaucagaa gaugaagaaa cugaaguaca agagcagaug 60

aa 62

<210> 206

<211> 61

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 31 транскрипта дистрофина человека

<400> 206

aaucugauuu gacaagucau gagaucaguu uagaagaaau gaagaaacau aaucagggga 60

a 61

<210> 207

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 207

auugggaagu aagcugauug gaacaggaa 29

<210> 208

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 32 транскрипта дистрофина человека

<400> 208

auuggaaaca aagagugugg aacaggaa 28

<210> 209

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 209

aaaauuauca gaagaugaag aaacugaagu acaagagcag augaa 45

<210> 210

<211> 44

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 33 транскрипта дистрофина человека

<400> 210

aaaagucuga gugaagugaa gucugaagug gaaaugguga uaaa 44

<210> 211

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 211

uggaacagga aaauuaucag aagaugaaga aa 32

<210> 212

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 34 транскрипта дистрофина человека

<400> 212

uggaauugac aaagagauca gcaguugaag gaa 33

<210> 213

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 213

agaugaagaa acugaag 17

<210> 214

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 35 транскрипта дистрофина человека

<400> 214

agauugagaa acagaag 17

<210> 215

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 215

aucagaagau gaagaaacug aaguacaaga gcagaug 37

<210> 216

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 36 транскрипта дистрофина человека

<400> 216

aucagagaaa aagaaacccc agcaaaaaga agacg 35

<210> 217

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 217

auggauuuga cagcc 15

<210> 218

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 37 транскрипта дистрофина человека

<400> 218

aucgauuugc agcc 14

<210> 219

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 219

aaaauuauca gaagaugaag aaacugaagu acaagagcag augaaucu 48

<210> 220

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 38 транскрипта дистрофина человека

<400> 220

aaaauugcuu gaaccacugg aggcugaaau ucagcagggg gugaaucu 48

<210> 221

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 221

agaagaugaa gaaacugaag uacaagagca gaug 34

<210> 222

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 39 транскрипта дистрофина человека

<400> 222

agaaagcgag aggaaauaaa gauaaaacag cagcug 36

<210> 223

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 223

aguacaagag cagaugaauc uccuaaauu 29

<210> 224

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 40 транскрипта дистрофина человека

<400> 224

aguacaagag gcaggcugau gaucuccuga aau 33

<210> 225

<211> 47

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 225

gaaaauuauc agaagaugaa gaaacugaag uacaagagca gaugaau 47

<210> 226

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 41 транскрипта дистрофина человека

<400> 226

gaaauugauc gggaauugca gaagaagaaa gaggagcuga au 42

<210> 227

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 227

uaucagaaga ugaagaa 17

<210> 228

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 228

uauuagaagu ggaacaa 17

<210> 229

<211> 68

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 229

acaagagcag augaaucucc uaaauucaag augggaaugc cucaggguag cuagcaugga 60

aaaacaaa 68

<210> 230

<211> 66

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 44 транскрипта дистрофина человека

<400> 230

acagaagcug aacaguuucu cagaaagaca caaauuccug agaauuggga acaugcuaaa 60

uacaaa 66

<210> 231

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 231

gaaguacaag agcagaugaa ucuccuaaau ucaa 34

<210> 232

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 46 транскрипта дистрофина человека

<400> 232

gaagaacaaa agaauaucuu gucagaauuu caa 33

<210> 233

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 233

cagaagauga agaaacugaa guacaagagc agaugaaucu cc 42

<210> 234

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 47 транскрипта дистрофина человека

<400> 234

cagaagagca agauaaacuu gaaaauaagc ucaagcagac aaaucucc 48

<210> 235

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 235

aacugaagua caagagcaga ugaaucuccu aaauucaaga 40

<210> 236

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 48 транскрипта дистрофина человека

<400> 236

accugagaaa caaggagaaa uugaagcuca aauaaaaga 39

<210> 237

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 237

ggaacaggaa aauuaucaga agaugaagaa acugaaguac aagag 45

<210> 238

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 49 транскрипта дистрофина человека

<400> 238

gaaacugaaa uagcaguuca agcuaaacaa ccggaugugg aagag 45

<210> 239

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 239

augaaucucc uaaauucaag augggaaugc c 31

<210> 240

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 51 транскрипта дистрофина человека

<400> 240

aggaaacugc caucuccaaa cuagaaaugc c 31

<210> 241

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 241

gaaaauuauc agaagaugaa gaaacugaag uacaagagca 40

<210> 242

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 53 транскрипта дистрофина человека

<400> 242

gaaagaauuc agaaucagug ggaugaagua caagaaca 38

<210> 243

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 243

agaugaagaa acugaaguac aagagcagau gaauc 35

<210> 244

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 55 транскрипта дистрофина человека

<400> 244

agaagacucc aagggaguaa aagagcugau gaaac 35

<210> 245

<211> 56

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 245

ggaaguaagc ugauuggaac aggaaaauua ucagaagaug aagaaacuga aguaca 56

<210> 246

<211> 55

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 57 транскрипта дистрофина человека

<400> 246

ggcaggcacc uauuggaggc gacuuuccag caguucagaa gcagaacgau guaca 55

<210> 247

<211> 138

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 247

ucagggccgg guugguaaua uucuacaauu gggaaguaag cugauuggaa caggaaaauu 60

aucagaagau gaagaaacug aaguacaaga gcagaugaau cuccuaaauu caagauggga 120

augccucagg guagcuag 138

<210> 248

<211> 140

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 59 транскрипта дистрофина человека

<400> 248

ucaauacuga gugggaaaaa uugaaccugc acuccgcuga cuggcagaga aaaauagaug 60

agacccuuga aagacuccag gaacuucaag aggccacgga ugagcuggac cucaagcugc 120

gccaagcuga ggugaucaag 140

<210> 249

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 11 транскрипта дистрофина человека

<400> 249

ccuaaauuca agauggga 18

<210> 250

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 60 транскрипта дистрофина человека

<400> 250

ccugaacacc agauggaa 18

<210> 251

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 12 транскрипта дистрофина человека

<400> 251

acauagaguu uuaaugga 18

<210> 252

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 252

acagacaacu guaaugga 18

<210> 253

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 12 транскрипта дистрофина человека

<400> 253

gcuaacaaaa acagaagaaa gaacaagg 28

<210> 254

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 43 транскрипта дистрофина человека

<400> 254

guuaacaaaa uguacaagga ccgacaagg 29

<210> 255

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 12 транскрипта дистрофина человека

<400> 255

caaaaacaga agaaagaaca aggaaaaugg aggaag 36

<210> 256

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 45 транскрипта дистрофина человека

<400> 256

caaaaacaga ugccaguauu cuacaggaaa aauugggaag 40

<210> 257

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 12 транскрипта дистрофина человека

<400> 257

uuacauagag uuuuaaugga ucuccagaau ca 32

<210> 258

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 54 транскрипта дистрофина человека

<400> 258

uaacagagaa uaucaaugcc ucuuggagaa gca 33

<210> 259

<211> 62

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 12 транскрипта дистрофина человека

<400> 259

gaucuccaga aucagaaacu gaaagaguug aaugacuggc uaacaaaaac agaagaaaga 60

ac 62

<210> 260

<211> 69

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 56 транскрипта дистрофина человека

<400> 260

gaccuccaag gugaaauuga agcucacaca gauguuuauc acaaccugga ugaaaacagc 60

caaaaaauc 69

<210> 261

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 261

ucacgcaacu gcugcuuugg aagaacaa 28

<210> 262

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 262

ucacacaacu ggcuuuaaag aucaa 25

<210> 263

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 263

aagaagaucu agaacaagaa caag 24

<210> 264

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 264

aagcggaucu agaaaagaaa aag 23

<210> 265

<211> 46

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 265

aaucuagugg agaucacgca acugcugcuu uggaagaaca acuuaa 46

<210> 266

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 266

aaucuuucgg aaggaaggca acuucucaga cuuaaaagaa aaagucaa 48

<210> 267

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 267

aucuagugga gaucacgcaa cugcugcu 28

<210> 268

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 268

aacaauugga gcagaugaca acuacugcu 29

<210> 269

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 269

agucaggguc aauucucuc 19

<210> 270

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 22 транскрипта дистрофина человека

<400> 270

agucagaaac caaacucuc 19

<210> 271

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 271

gcuucaagaa gaucuagaac aagaacaagu cagggucaau ucucucac 48

<210> 272

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 272

gcuuuacaaa guucucugca agagcaacaa aguggccuau acuaucuc 48

<210> 273

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 273

acaugguggu gguaguugau g 21

<210> 274

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 24 транскрипта дистрофина человека

<400> 274

aaauggaugg cugaaguuga ug 22

<210> 275

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 275

agaagaucua gaacaagaac aagucagggu 30

<210> 276

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 25 транскрипта дистрофина человека

<400> 276

agaagauaaa gaaugaagca gagccagagu 30

<210> 277

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 277

cuucaagaag aucua 15

<210> 278

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 26 транскрипта дистрофина человека

<400> 278

cuccagaaag aucua 15

<210> 279

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 279

ucaagaagau cuagaacaag aacaagucag ggucaauucu cucacuca 48

<210> 280

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 27 транскрипта дистрофина человека

<400> 280

uaaagaagag gcccaacaaa aagaagcgaa agugaaacuc cuuacuga 48

<210> 281

<211> 66

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 281

caugguggug guaguugaug aaucuagugg agaucacgca acugcugcuu uggaagaaca 60

acuuaa 66

<210> 282

<211> 67

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 28 транскрипта дистрофина человека

<400> 282

cauguuggca ugaguuauug ucauacuugg agaaagcaaa caaguggcua aaugaaguag 60

aauuuaa 67

<210> 283

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 283

caugguggug guaguugaug a 21

<210> 284

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 29 транскрипта дистрофина человека

<400> 284

cauggaugag cuaaucaaug a 21

<210> 285

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 285

ucacucacau ggugguggua guugaugaau cuaguggaga ucacgcaacu 50

<210> 286

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 30 транскрипта дистрофина человека

<400> 286

ucauugacaa gcaguuggca gcuuauauug cagacaaggu ggacgcagcu 50

<210> 287

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 287

agaagaucua gaacaagaac aagucaggg 29

<210> 288

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 31 транскрипта дистрофина человека

<400> 288

agaagaaaug aagaaacaua aucaggg 27

<210> 289

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 289

gaugaaucua guggagauca cgcaacugcu gcuuuggaa 39

<210> 290

<211> 43

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 32 транскрипта дистрофина человека

<400> 290

gaugauuuua gaugaaguga agaugcacuu gccugcauug gaa 43

<210> 291

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 291

gcaacugcug cuuuggaa 18

<210> 292

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 34 транскрипта дистрофина человека

<400> 292

gcagcuacag auauggaa 18

<210> 293

<211> 113

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 293

ucaagaagau cuagaacaag aacaagucag ggucaauucu cucacucaca uggugguggu 60

aguugaugaa ucuaguggag aucacgcaac ugcugcuuug gaagaacaac uua 113

<210> 294

<211> 110

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 35 транскрипта дистрофина человека

<400> 294

ucaaaaagag auugagaaac agaaggugca ccugaagagu aucacagagg uaggagaggc 60

cuugaaaaca guuuugggca agaaggagac guugguggaa gauaaacuca 110

<210> 295

<211> 53

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 295

uugaugaauc uaguggagau cacgcaacug cugcuuugga agaacaacuu aag 53

<210> 296

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 36 транскрипта дистрофина человека

<400> 296

uggaugaauc agagaaaaag aaaccccagc aaaaagaaga cgugcuuaag 50

<210> 297

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 297

gaaucuagug gagaucacgc aac 23

<210> 298

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 37 транскрипта дистрофина человека

<400> 298

gacucuacac gugaccaagc agc 23

<210> 299

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 299

aucuagaaca agaacaaguc a 21

<210> 300

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 38 транскрипта дистрофина человека

<400> 300

aucugaaaga ggaagacuuc a 21

<210> 301

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 301

gaugaaucua guggagauca cgcaacugcu gcuuuggaag aacaacuuaa 50

<210> 302

<211> 54

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 39 транскрипта дистрофина человека

<400> 302

gagaaagcga gaggaaauaa agauaaaaca gcagcuguua cagacaaaac auaa 54

<210> 303

<211> 88

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 303

agaucuagaa caagaacaag ucagggucaa uucucucacu cacauggugg ugguaguuga 60

ugaaucuagu ggagaucacg caacugcu 88

<210> 304

<211> 85

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 40 транскрипта дистрофина человека

<400> 304

aggucucaaa gaagaaaaaa ggcucuagaa auuucucauc agugguauca guacaagagg 60

caggcugaug aucuccugaa augcu 85

<210> 305

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 305

aguggagauc acgcaacugc ugcuuuggaa g 31

<210> 306

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 41 транскрипта дистрофина человека

<400> 306

aguggagcca acucagaucc agcucagcaa g 31

<210> 307

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 307

ugaugaaucu aguggagauc acgcaacugc ugcuuuggaa 40

<210> 308

<211> 43

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 308

ugaagaaacg augaugguga ugacugaaga caugccuuug gaa 43

<210> 309

<211> 52

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 309

aguugaugaa ucuaguggag aucacgcaac ugcugcuuug gaagaacaac uu 52

<210> 310

<211> 56

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 44 транскрипта дистрофина человека

<400> 310

agauauuuaa ucaguggcua acagaagcug aacaguuucu cagaaagaca caaauu 56

<210> 311

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 311

cuucaagaag aucuagaaca ag 22

<210> 312

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 46 транскрипта дистрофина человека

<400> 312

cuaaaagaaa agcuugagca ag 22

<210> 313

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 313

gugcuucaag aagaucuaga acaagaacaa gu 32

<210> 314

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 47 транскрипта дистрофина человека

<400> 314

gugcucccau aagcccagaa gagcaagaua aacu 34

<210> 315

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 315

aguggagauc acgcaacugc ugcuuugg 28

<210> 316

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 48 транскрипта дистрофина человека

<400> 316

agagcaguua aaucaucugc ugcugugg 28

<210> 317

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 317

uagaacaaga acaagucag 19

<210> 318

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 49 транскрипта дистрофина человека

<400> 318

uuguacaagg aaaaaccag 19

<210> 319

<211> 76

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 319

ggucaauucu cucacucaca uggugguggu aguugaugaa ucuaguggag aucacgcaac 60

ugcugcuuug gaagaa 76

<210> 320

<211> 74

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 51 транскрипта дистрофина человека

<400> 320

gaucaaguua uaaaaucaca gagggugaug gugggugacc uugaggauau caacgagaug 60

aucaucaagc agaa 74

<210> 321

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 321

gaucuagaac aagaaca 17

<210> 322

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 53 транскрипта дистрофина человека

<400> 322

gaugaaguac aagaaca 17

<210> 323

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 или 55 транскрипта дистрофина человека

<400> 323

gcugcuuugg aagaa 15

<210> 324

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 324

uucaagaaga ucuagaacaa gaacaa 26

<210> 325

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 57 транскрипта дистрофина человека

<400> 325

uuccagcagu ucagaagcag aacga 25

<210> 326

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 326

ggagaucacg caacugcugc uuuggaagaa caacuuaag 39

<210> 327

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 59 транскрипта дистрофина человека

<400> 327

ggcgaucucc ucauugacuc ucuccaagau caccucgag 39

<210> 328

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 13 транскрипта дистрофина человека

<400> 328

gcaacugcug cuuuggaaga acaacuuaag 30

<210> 329

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 60 транскрипта дистрофина человека

<400> 329

gaaauugcgc cucugaaaga gaacgugag 29

<210> 330

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 330

acgucuuacu gaagaaca 18

<210> 331

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 331

auggcuuuca gaaaaaga 18

<210> 332

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 332

aucgaugggc aaac 14

<210> 333

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 333

auccaugggc aaac 14

<210> 334

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 334

uucucaaaug gcaacgucuu acugaagaa 29

<210> 335

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 335

uccugaauuu gcaaucuuuc ggaagga 27

<210> 336

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 336

caaauggcaa cgucuuacug aaga 24

<210> 337

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 337

cagaugacaa cuacugcuga aaa 23

<210> 338

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 338

uauugggaga ucgaugggca aacaucugua gaugg 35

<210> 339

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 22 транскрипта дистрофина человека

<400> 339

uaucaggaga ccaugagugc caucaggaca ugg 33

<210> 340

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 340

uuuacaagac auccuucuca aauggcaac 29

<210> 341

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 341

uuuacaaagu ucucugcaag agcaac 26

<210> 342

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 342

aagacauccu ucucaaaugg caacgucuua cugaagaa 38

<210> 343

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 24 транскрипта дистрофина человека

<400> 343

aagaaaugga uggcugaagu ugauguuuuu cugaagga 38

<210> 344

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 344

uguagaugga cagaaga 17

<210> 345

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 25 транскрипта дистрофина человека

<400> 345

ugaagguggg cagaaga 17

<210> 346

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 346

aaauggcaac gucuuacuga 20

<210> 347

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 27 транскрипта дистрофина человека

<400> 347

aaagugaaac uccuuacuga 20

<210> 348

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 348

gcaaacaucu guagaugga 19

<210> 349

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 28 транскрипта дистрофина человека

<400> 349

gcaaacaagu ggcuaaauga a 21

<210> 350

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 350

aucgaugggc aaa 13

<210> 351

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 29 транскрипта дистрофина человека

<400> 351

auggaugagc uaa 13

<210> 352

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 352

cagaagaccg cuggguucuu uuacaag 27

<210> 353

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 30 транскрипта дистрофина человека

<400> 353

caggaguccc ucacauucau ugacaag 27

<210> 354

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 354

uuuuacaaga cau 13

<210> 355

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 31 транскрипта дистрофина человека

<400> 355

uuugacaagu cau 13

<210> 356

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 356

uguagaugga cagaaga 17

<210> 357

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 32 транскрипта дистрофина человека

<400> 357

uuuagaugaa gugaaga 17

<210> 358

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 358

aacgucuuac ugaag 15

<210> 359

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 33 транскрипта дистрофина человека

<400> 359

aaagucugag ugaag 15

<210> 360

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 360

aaauggcaac gucuuacuga a 21

<210> 361

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 34 транскрипта дистрофина человека

<400> 361

aaaugaaugu cuugacagaa 20

<210> 362

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 362

cagaagaccg cuggguucuu uu 22

<210> 363

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 35 транскрипта дистрофина человека

<400> 363

cagaagagug guuaaaucuu uu 22

<210> 364

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 364

caaauggcaa cgucuuac 18

<210> 365

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 36 транскрипта дистрофина человека

<400> 365

cacauggaaa cuuuugac 18

<210> 366

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 366

aucgaugggc aaacaucugu agauggacag aagaccg 37

<210> 367

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 37 транскрипта дистрофина человека

<400> 367

aucgauuugc agccauuuca cacagaauua agacug 36

<210> 368

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 368

ucucaaaugg caacgucuua cugaaga 27

<210> 369

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 38 транскрипта дистрофина человека

<400> 369

ucugaaagag gaagacuuca auaaaga 27

<210> 370

<211> 53

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 370

gaagaccgcu ggguucuuuu acaagacauc cuucucaaau ggcaacgucu uac 53

<210> 371

<211> 52

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 39 транскрипта дистрофина человека

<400> 371

gaagacaaug aggguacugu aaaagaauug uugcaaagag gagacaacuu ac 52

<210> 372

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 372

acgucuuacu gaagaaca 18

<210> 373

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 40 транскрипта дистрофина человека

<400> 373

aggucucaaa gaagaaaa 18

<210> 374

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 374

gggagaucga ugggcaaa 18

<210> 375

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 41 транскрипта дистрофина человека

<400> 375

gggaaauuga gagcaaa 17

<210> 376

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 376

aagacauccu ucucaaau 18

<210> 377

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 377

aagacaugcc uuuggaaau 19

<210> 378

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 378

aaauggcaac gucuuacuga aga 23

<210> 379

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 44 транскрипта дистрофина человека

<400> 379

aaauggcggc guuuucauua uga 23

<210> 380

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 380

uagauggaca gaaga 15

<210> 381

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 46 транскрипта дистрофина человека

<400> 381

uagaagaaca aaaga 15

<210> 382

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 382

uucucaaaug gcaacgucuu acugaagaac 30

<210> 383

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 47 транскрипта дистрофина человека

<400> 383

uucucaaaca auuaaaugaa acuggaggac 30

<210> 384

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 384

auugggagau cgaugggcaa acaucuguag auggac 36

<210> 385

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 48 транскрипта дистрофина человека

<400> 385

aguuggaaau uuauaaccaa ccaaaccaag aaggac 36

<210> 386

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 386

augggcaaac aucuguagau ggacaga 27

<210> 387

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 49 транскрипта дистрофина человека

<400> 387

aagggcagca uuuguacaag gaaaaa 26

<210> 388

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 388

uggacagaag accgcugggu ucuuuuacaa gacauccuuc ucaaauggca 50

<210> 389

<211> 53

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 51 транскрипта дистрофина человека

<400> 389

uggacagaac uuaccgacug gcuuucucug cuugaucaag uuauaaaauc aca 53

<210> 390

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 390

uggguucuuu uacaagacau ccuucucaaa uggcaacguc uuacugaa 48

<210> 391

<211> 51

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 53 транскрипта дистрофина человека

<400> 391

ugggaugaag uacaagaaca ccuucagaac cggaggcaac aguugaauga a 51

<210> 392

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 392

caaauggcaa cgucuuacug aa 22

<210> 393

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 55 транскрипта дистрофина человека

<400> 393

caacugccaa uguccuacag ga 22

<210> 394

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 394

cuuuuacaag acauccuucu caaauggcaa cgucu 35

<210> 395

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 57 транскрипта дистрофина человека

<400> 395

cauuuggaag ccaguucuga ccaguggaag cgucu 35

<210> 396

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 396

gaugggcaaa caucuguaga ug 22

<210> 397

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 59 транскрипта дистрофина человека

<400> 397

gacuggcaga gaaaaauaga ug 22

<210> 398

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 14 транскрипта дистрофина человека

<400> 398

cuguagaugg acagaagacc gcuggguucu uuuaca 36

<210> 399

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 60 транскрипта дистрофина человека

<400> 399

cucuggaaga ccugaacacc agauggaagc uucugca 37

<210> 400

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 400

agaaaaagaa gaugcaguga acaagauuca cacaa 35

<210> 401

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 401

agaaaaagca auccaugggc aaacuguauu cacucaa 37

<210> 402

<211> 46

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 402

cacaacuggc uuuaaagauc aaaaugaaau guuaucaagu cuucaa 46

<210> 403

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 403

cacagcugga uuacucgcuc agaagcugug uugcagaguc cugaa 45

<210> 404

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 404

aaagaagaug cagugaacaa gauucacaca acug 34

<210> 405

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 405

aaugcagaua gcaucaaaca agccucagaa caacug 36

<210> 406

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 406

aacuggcuuu aaagaucaaa augaaau 27

<210> 407

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 407

aauuagccgg aaauaucaau cagaauu 27

<210> 408

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 408

uucagaaaaa gaagaugcag ugaaca 26

<210> 409

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 24 транскрипта дистрофина человека

<400> 409

uucuaaaaaa gcagcugaaa cagugcaga 29

<210> 410

<211> 76

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 410

uuuuagugca uggcuuucag aaaaagaaga ugcagugaac aagauucaca caacuggcuu 60

uaaagaucaa aaugaa 76

<210> 411

<211> 77

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 25 транскрипта дистрофина человека

<400> 411

uuuuagucag ugauauucag acaauucagc ccagucuaaa cagugucaau gaaggugggc 60

agaagauaaa gaaugaa 77

<210> 412

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 412

auggcuuuca gaaaaagaag augcagugaa caag 34

<210> 413

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 26 транскрипта дистрофина человека

<400> 413

augaauuaca gaaagcaguu gaagagauga ag 32

<210> 414

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 414

agaaaaagaa gaugcaguga a 21

<210> 415

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 27 транскрипта дистрофина человека

<400> 415

acaaaaagaa gcgaaaguga a 21

<210> 416

<211> 53

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 416

cacacaacug gcuuuaaaga ucaaaaugaa auguuaucaa gucuucaaaa acu 53

<210> 417

<211> 53

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 28 транскрипта дистрофина человека

<400> 417

caaacaagug gcuaaaugaa guagaauuua aacuuaaaac cacugaaaac auu 53

<210> 418

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 418

agaagaugca gugaacaaga uucacaca 28

<210> 419

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 29 транскрипта дистрофина человека

<400> 419

agaggauaac ccaaaucaga uucgcaua 28

<210> 420

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 420

uuucagaaaa agaagaugca gugaacaaga uuca 34

<210> 421

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 30 транскрипта дистрофина человека

<400> 421

uugcagacaa gguggacgca gcucaaaugc cuca 34

<210> 422

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 422

aaaaugaaau guuaucaagu cuucaaa 27

<210> 423

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 31 транскрипта дистрофина человека

<400> 423

aaaauccaau cugauuugac aagucaugag a 31

<210> 424

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 424

gccuuuuuag ugcauggcuu ucagaaaaag aagaug 36

<210> 425

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 32 транскрипта дистрофина человека

<400> 425

gccaauuuug agcagcgucu acaagaaagu aagaug 36

<210> 426

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 426

uucagaaaaa gaagaugca 19

<210> 427

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 33 транскрипта дистрофина человека

<400> 427

uacagaaaaa gcagacgga 19

<210> 428

<211> 85

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 428

cagaaaaaga agaugcagug aacaagauuc acacaacugg cuuuaaagau caaaaugaaa 60

uguuaucaag ucuucaaaaa cuggc 85

<210> 429

<211> 81

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 34 транскрипта дистрофина человека

<400> 429

cagaaagaaa gcaacaguug gagaaaugcu ugaaauuguc ccguaagaug cgaaaggaaa 60

ugaaugucuu gacagaaugg c 81

<210> 430

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 430

uucagaaaaa gaagaugcag ugaacaagau ucacaca 37

<210> 431

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 35 транскрипта дистрофина человека

<400> 431

uugagaaaca gaaggugcac cugaagagua ucacaga 37

<210> 432

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 432

ugcauggcuu ucagaaaaag aagaugcagu gaacaaga 38

<210> 433

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 36 транскрипта дистрофина человека

<400> 433

uggaugaauc agagaaaaag aaaccccagc aaaaaga 37

<210> 434

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 434

uuuaaagauc aaaaugaa 18

<210> 435

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 37 транскрипта дистрофина человека

<400> 435

uuuaaaggca gaacugaa 18

<210> 436

<211> 57

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 436

ugcauggcuu ucagaaaaag aagaugcagu gaacaagauu cacacaacug gcuuuaa 57

<210> 437

<211> 57

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 38 транскрипта дистрофина человека

<400> 437

uccauuccuu ugaaggaauu ggagcaguuu aacucagaua uacaaaaauu gcuugaa 57

<210> 438

<211> 71

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 438

ucagaaaaag aagaugcagu gaacaagauu cacacaacug gcuuuaaaga ucaaaaugaa 60

auguuaucaa g 71

<210> 439

<211> 67

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 39 транскрипта дистрофина человека

<400> 439

ugagagaaag cgagaggaaa uaaagauaaa acagcagcug uuacagacaa aacauaaugc 60

ucucaag 67

<210> 440

<211> 79

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 440

aaagaagaug cagugaacaa gauucacaca acuggcuuua aagaucaaaa ugaaauguua 60

ucaagucuuc aaaaacugg 79

<210> 441

<211> 80

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 40 транскрипта дистрофина человека

<400> 441

aaagaagaaa aaaggcucua gaaauuucuc aucaguggua ucaguacaag aggcaggcug 60

augaucuccu gaaaugcuug 80

<210> 442

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 442

uuucagaaaa agaagaugca gugaa 25

<210> 443

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 41 транскрипта дистрофина человека

<400> 443

uugcagaaga agaaagagga gcugaa 26

<210> 444

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 444

ggcuuuaaag auc 13

<210> 445

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 445

gacuuugaag auc 13

<210> 446

<211> 85

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 446

uuuuuagugc auggcuuuca gaaaaagaag augcagugaa caagauucac acaacuggcu 60

uuaaagauca aaaugaaaug uuauc 85

<210> 447

<211> 90

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 44 транскрипта дистрофина человека

<400> 447

uauuuaauca guggcuaaca gaagcugaac aguuucucag aaagacacaa auuccugaga 60

auugggaaca ugcuaaauac aaaugguauc 90

<210> 448

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 448

aagaucaaaa ugaaauguua ucaagucuuc aaaaa 35

<210> 449

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 46 транскрипта дистрофина человека

<400> 449

aagaacaaaa gaauaucuug ucagaauuuc aaaga 35

<210> 450

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 450

aagaucaaaa ugaaauguua ucaagucuuc aaa 33

<210> 451

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 47 транскрипта дистрофина человека

<400> 451

aagauaaacu ugaaaauaag cucaagcaga caaa 34

<210> 452

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 452

gcuuucagaa aaagaagaug cagugaa 27

<210> 453

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 48 транскрипта дистрофина человека

<400> 453

gcuugaagac cuugaagagc aguuaa 26

<210> 454

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 454

gaaaaagaag augcagugaa caagauucac acaacuggcu uu 42

<210> 455

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 49 транскрипта дистрофина человека

<400> 455

gaaacugaaa uagcaguuca agcuaaacaa ccggaugu 38

<210> 456

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 456

uggcuuuaaa gaucaaaaug aaauguuauc aag 33

<210> 457

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 51 транскрипта дистрофина человека

<400> 457

ugaccuugag gauaucaacg agaugaucau caag 34

<210> 458

<211> 87

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 458

uucagaaaaa gaagaugcag ugaacaagau ucacacaacu ggcuuuaaag aucaaaauga 60

aauguuauca agucuucaaa aacuggc 87

<210> 459

<211> 87

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 53 транскрипта дистрофина человека

<400> 459

uucagaauca gugggaugaa guacaagaac accuucagaa ccggaggcaa caguugaaug 60

aaauguuaaa ggauucaaca caauggc 87

<210> 460

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 460

uuuagugcau ggcuuucaga aaaagaa 27

<210> 461

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 55 транскрипта дистрофина человека

<400> 461

uuucuugccu ggcuuacaga agcugaa 27

<210> 462

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 462

uucagaaaaa gaagaugca 19

<210> 463

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 57 транскрипта дистрофина человека

<400> 463

uucagaagca gaacgaugua 20

<210> 464

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 464

uggcuuucag aaaaagaaga ug 22

<210> 465

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 59 транскрипта дистрофина человека

<400> 465

ugacuggcag agaaaaauag aug 23

<210> 466

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 15 транскрипта дистрофина человека

<400> 466

ucagaaaaag aagaug 16

<210> 467

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 60 транскрипта дистрофина человека

<400> 467

ucugaaagag aacgug 16

<210> 468

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 468

aaaagaaaaa gcaau 15

<210> 469

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 469

aaaagaaaaa gucaau 16

<210> 470

<211> 90

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 470

uaagucagug acccagaaga cggaagcaug gcuggauaac uuugcccggu guugggauaa 60

uuuaguccaa aaacuugaaa agaguacagc 90

<210> 471

<211> 85

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 471

uaagugagag acuuaacugg cuggaguauc agaacaacau caucgcuuuc uauaaucagc 60

uacaacaauu ggagcagaug acaac 85

<210> 472

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 472

aagucaguga cccagaagac ggaagcaugg 30

<210> 473

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 22 транскрипта дистрофина человека

<400> 473

aacuuagugu caccgacuau gaaaucaugg 30

<210> 474

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 474

aaaagcaauc caugggcaaa cuguauucac ucaaacaaga uc 42

<210> 475

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 475

aaaagcuaga ggagcaaaug aauaaacucc gaaaaauuc 39

<210> 476

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 476

acccagaaga cggaagcaug gcugga 26

<210> 477

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 24 транскрипта дистрофина человека

<400> 477

acccugaaga aauggauggc ugaa 24

<210> 478

<211> 64

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 478

aagacggaag cauggcugga uaacuuugcc cgguguuggg auaauuuagu ccaaaaacuu 60

gaaa 64

<210> 479

<211> 61

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 25 транскрипта дистрофина человека

<400> 479

aagaaugaag cagagccaga guuugcuucg agacuugaga cagaacucaa agaacuuaac 60

a 61

<210> 480

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 480

gggcaaacug uauucacuca aacaagaucu 30

<210> 481

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 26 транскрипта дистрофина человека

<400> 481

gagaaaacug uaagccucca gaaagaucu 29

<210> 482

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 482

uuaaaagcgg aucuagaaa 19

<210> 483

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 27 транскрипта дистрофина человека

<400> 483

uuaaaaaagg aacuugaaa 19

<210> 484

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 484

gaaaaagcaa uccaugggca aacuguauu 29

<210> 485

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 28 транскрипта дистрофина человека

<400> 485

gagaaagcaa acaaguggcu aaaugaagu 29

<210> 486

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 486

cagaagacgg aagcauggcu g 21

<210> 487

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 29 транскрипта дистрофина человека

<400> 487

cagauggcgg agucauggau g 21

<210> 488

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 488

cccagaagac ggaagcau 18

<210> 489

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 30 транскрипта дистрофина человека

<400> 489

cccaggagac ugaaaaau 18

<210> 490

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 490

agaaaagaaa aagcaaucca ugggca 26

<210> 491

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 31 транскрипта дистрофина человека

<400> 491

agaaaugaag aaacauaauc aggggaa 27

<210> 492

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 492

uuaguccaaa aac 13

<210> 493

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 32 транскрипта дистрофина человека

<400> 493

uuauuccaga aac 13

<210> 494

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 494

ccaaaaacuu gaaaagagua cagc 24

<210> 495

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 33 транскрипта дистрофина человека

<400> 495

ccaaagaacu ugaugaaaga guaacagc 28

<210> 496

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 496

cggaucuaga aaagaaaaag caauc 25

<210> 497

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 34 транскрипта дистрофина человека

<400> 497

cagauaugga auugacaaag agauc 25

<210> 498

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 498

ggaucuagaa aagaaaaagc aaucc 25

<210> 499

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 36 транскрипта дистрофина человека

<400> 499

ggaugaauca gagaaaaaga aaccc 25

<210> 500

<211> 43

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 500

aaaagcggau cuagaaaaga aaaagcaauc caugggcaaa cug 43

<210> 501

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 37 транскрипта дистрофина человека

<400> 501

aaagguggac ucuacacgug accaagcagc aaacuugaug gcaaaccg 48

<210> 502

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 502

auucacucaa acaagaucuu cuuucaacac ugaagaauaa gucag 45

<210> 503

<211> 47

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 38 транскрипта дистрофина человека

<400> 503

acucagauau acaaaaauug cuugaaccac uggaggcuga aauucag 47

<210> 504

<211> 54

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 504

aacuguauuc acucaaacaa gaucuucuuu caacacugaa gaauaaguca guga 54

<210> 505

<211> 55

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 39 транскрипта дистрофина человека

<400> 505

aaaagaauug uugcaaagag gagacaacuu acaacaaaga aucacagaug agaga 55

<210> 506

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 506

aaaagcggau cuagaaa 17

<210> 507

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 40 транскрипта дистрофина человека

<400> 507

aaaaaaggcu cuagaaa 17

<210> 508

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 508

cagaagacgg aagcauggcu ggau 24

<210> 509

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 41 транскрипта дистрофина человека

<400> 509

cagaagaaga aagaggagcu gaau 24

<210> 510

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 510

acuguauuca cuca 14

<210> 511

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 511

acugaaauca cuca 14

<210> 512

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 512

acugaagaau aagucaguga cccagaagac ggaa 34

<210> 513

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 44 транскрипта дистрофина человека

<400> 513

acagaagcug aacaguuucu cagaaagaca caa 33

<210> 514

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 514

aaaagcggau cuagaaaaga aaaagc 26

<210> 515

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 46 транскрипта дистрофина человека

<400> 515

aaaagagcag caacuaaaag aaaagc 26

<210> 516

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 516

aaaaacuuga aaaga 15

<210> 517

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 47 транскрипта дистрофина человека

<400> 517

auaaacuuga aaaua 15

<210> 518

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 518

agcaauccau gggcaaacug uauucacuca aacaaga 37

<210> 519

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 48 транскрипта дистрофина человека

<400> 519

aggaaucagu uggaaauuua uaaccaacca aaccaaga 38

<210> 520

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 520

uuucaacacu gaagaauaag ucagugaccc ag 32

<210> 521

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 49 транскрипта дистрофина человека

<400> 521

uuuguacaag gaaaaaccag ccacucagcc ag 32

<210> 522

<211> 44

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 522

gcaaacugua uucacucaaa caagaucuuc uuucaacacu gaag 44

<210> 523

<211> 43

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 51 транскрипта дистрофина человека

<400> 523

ggaaacugcc aucuccaaac uagaaaugcc aucuuccuug aug 43

<210> 524

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 524

aaagaaaaag caauccaugg gcaaa 25

<210> 525

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 53 транскрипта дистрофина человека

<400> 525

acaguagaug caauccaaaa gaaaa 25

<210> 526

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 526

gaagaauaag ucagugaccc agaagacgga agcauggc 38

<210> 527

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 55 транскрипта дистрофина человека

<400> 527

gaagacucca agggaguaaa agagcugaug aaacaauggc 40

<210> 528

<211> 57

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 528

uucacucaaa caagaucuuc uuucaacacu gaagaauaag ucagugaccc agaagac 57

<210> 529

<211> 60

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 57 транскрипта дистрофина человека

<400> 529

uucucugcag gaacuucugg uguggcuaca gcugaaagau gaugaauuaa gccggcaggc 60

<210> 530

<211> 55

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 530

gcaauccaug ggcaaacugu auucacucaa acaagaucuu cuuucaacac ugaag 55

<210> 531

<211> 58

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 59 транскрипта дистрофина человека

<400> 531

gcagcccgug ggcgaucucc ucauugacuc ucuccaagau caccucgaga aagucaag 58

<210> 532

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 16 транскрипта дистрофина человека

<400> 532

cagaagacgg aagcau 16

<210> 533

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 60 транскрипта дистрофина человека

<400> 533

caccagaugg aagcuu 16

<210> 534

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 534

aucacuaaca cagacaacug uaauggaaa 29

<210> 535

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 535

auuacucgcu cagaagcugu guugcaga 28

<210> 536

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 536

gaacuuccac caccaccucc ccaaaaga 28

<210> 537

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 537

gaaaauccaa cccaccaccc caucaga 27

<210> 538

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 538

ccaccacuca gccauca 17

<210> 539

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 22 транскрипта дистрофина человека

<400> 539

ccaccaaugc gcuauca 17

<210> 540

<211> 49

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 540

caccaccucc ccaaaagaag aggcagauua cuguggauuc ugaaauuag 49

<210> 541

<211> 48

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 541

cagcaccacu gugaaagaga ugucgaagaa agcgcccucu gaaauuag 48

<210> 542

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 542

uguggauucu gaaauuagga aaa 23

<210> 543

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 24 транскрипта дистрофина человека

<400> 543

uggggauuca gaaauucuaa aaa 23

<210> 544

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 544

aaacaguaac uacggugacc acaagggaa 29

<210> 545

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 25 транскрипта дистрофина человека

<400> 545

aaacaguguc aaugaaggug ggcagaagau aa 32

<210> 546

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 546

aagaggaacu uccaccacca ccuccccaaa agaagaggc 39

<210> 547

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 27 транскрипта дистрофина человека

<400> 547

aaaaggaacu ugaaacucua accaccaacu accaguggc 39

<210> 548

<211> 65

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 548

aacacagaca acuguaaugg aaacaguaac uacggugacc acaagggaac agauccuggu 60

aaagc 65

<210> 549

<211> 68

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 28 транскрипта дистрофина человека

<400> 549

aaagcaaaca aguggcuaaa ugaaguagaa uuuaaacuua aaaccacuga aaacauuccu 60

ggcggagc 68

<210> 550

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 550

uccugguaaa gcaugcucaa gaggaacuu 29

<210> 551

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 29 транскрипта дистрофина человека

<400> 551

ucauggauga gcuaaucaau gaggaacuu 29

<210> 552

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 552

aaaagaagag gcagauuacu guggauucug aaa 33

<210> 553

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 30 транскрипта дистрофина человека

<400> 553

aacagagcau ccagucugcc caggagacug aaa 33

<210> 554

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 554

agggaacaga uccugguaaa gcaugcu 27

<210> 555

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 31 транскрипта дистрофина человека

<400> 555

aagaaacaua aucaggggaa ggaggcu 27

<210> 556

<211> 56

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 556

cuguaaugga aacaguaacu acggugacca caagggaaca gauccuggua aagcau 56

<210> 557

<211> 56

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 32 транскрипта дистрофина человека

<400> 557

cugcauugga aacaaagagu guggaacagg aaguaguaca gucacagcua aaucau 56

<210> 558

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 558

agaagaggca gauuacugug gauucugaaa uuaggaaaag 40

<210> 559

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 33 транскрипта дистрофина человека

<400> 559

auaaaagucu gagugaagug aagucugaag uggaaaug 38

<210> 560

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 560

aggcagauua cuguggauuc ugaaauu 27

<210> 561

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 34 транскрипта дистрофина человека

<400> 561

augccuagua auuuggauuc ugaaguu 27

<210> 562

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 562

caccucccca aaagaagag 19

<210> 563

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 35 транскрипта дистрофина человека

<400> 563

caccucccga gcagaagag 19

<210> 564

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 564

ccaaaagaag agg 13

<210> 565

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 36 транскрипта дистрофина человека

<400> 565

caaaaagaag acg 13

<210> 566

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 566

cagacaacug uaauggaaac aguaacuacg gugaccac 38

<210> 567

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 37 транскрипта дистрофина человека

<400> 567

cagcaaacuu gauggcaaac cgcggugacc ac 32

<210> 568

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 568

uggauucuga aauu 14

<210> 569

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 38 транскрипта дистрофина человека

<400> 569

uggaggcuga aauu 14

<210> 570

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 570

aaagaagagg cagauuacug uggauucuga aauuaggaaa ag 42

<210> 571

<211> 44

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 39 транскрипта дистрофина человека

<400> 571

aaagaggaga caacuuacaa caaagaauca cagaugagag aaag 44

<210> 572

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 572

caaaagaaga ggcagauuac uguggauucu gaaau 35

<210> 573

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 40 транскрипта дистрофина человека

<400> 573

caguacaaga ggcaggcuga ugaucuccug aaau 34

<210> 574

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 574

cagauccugg uaaagcaugc ucaagaggaa 30

<210> 575

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 41 транскрипта дистрофина человека

<400> 575

cagauccagc ucagcaagcg cuggcggga 29

<210> 576

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 576

aaaagaagag gcagauuacu gugga 25

<210> 577

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 577

aaacgaugau ggugaugacu gaaga 25

<210> 578

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 578

aagaggcaga uuacugugga uucugaa 27

<210> 579

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 44 транскрипта дистрофина человека

<400> 579

aagacacaaa uuccugagaa uugggaa 27

<210> 580

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 580

gaagaggcag auuacugug 19

<210> 581

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 46 транскрипта дистрофина человека

<400> 581

gaggaagcag auaacauug 19

<210> 582

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 582

gaccacaagg gaacagaucc ugguaaagca ugcucaagag ga 42

<210> 583

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 47 транскрипта дистрофина человека

<400> 583

gcccagaaga gcaagauaaa cuugaaaaua agcucaagca ga 42

<210> 584

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 584

uacuguggau ucugaaauua ggaa 24

<210> 585

<211> 25

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 48 транскрипта дистрофина человека

<400> 585

ugcugugguu aucuccuauu aggaa 25

<210> 586

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 586

accaccacuc agcca 15

<210> 587

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 49 транскрипта дистрофина человека

<400> 587

accagccacu cagcca 16

<210> 588

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 588

aaacaguaac uacggugacc acaa 24

<210> 589

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 51 транскрипта дистрофина человека

<400> 589

agacuguuac ucuggugaca caa 23

<210> 590

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 590

ccaucacuaa cacagacaac uguaauggaa 30

<210> 591

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 53 транскрипта дистрофина человека

<400> 591

ccuucagaac cggaggcaac aguugaauga aa 32

<210> 592

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 592

cuccccaaaa gaagaggc 18

<210> 593

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 55 транскрипта дистрофина человека

<400> 593

cuacccguaa ggaaaggc 18

<210> 594

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 594

agcaugcuca agaggaacuu c 21

<210> 595

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 57 транскрипта дистрофина человека

<400> 595

accuuucucu gcaggaacuu c 21

<210> 596

<211> 43

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 596

gugaccacaa gggaacagau ccugguaaag caugcucaag agg 43

<210> 597

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 59 транскрипта дистрофина человека

<400> 597

gagcccagaa ugucacucgg cuucuacgaa agcaggcuga ggagg 45

<210> 598

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 17 транскрипта дистрофина человека

<400> 598

uuucacaggc ugucaccacc acucagccau cacuaacac 39

<210> 599

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 60 транскрипта дистрофина человека

<400> 599

ucucaccgua uaaccucagc acucuggaag accugaacac 40

<210> 600

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 600

gaagcugugu ugcagagucc ugaauuugca au 32

<210> 601

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 43 транскрипта дистрофина человека

<400> 601

gaagcucucu cccagcuuga uuuccaau 28

<210> 602

<211> 56

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 602

gaguccugaa uuugcaaucu uucggaagga aggcaacuuc ucagacuuaa aagaaa 56

<210> 603

<211> 57

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 45 транскрипта дистрофина человека

<400> 603

gaagccugaa ucugcggugg caggaggucu gcaaacagcu gucagacaga aaaaaga 57

<210> 604

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 604

uaaaagaaaa agucaau 17

<210> 605

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 54 транскрипта дистрофина человека

<400> 605

uaacagagaa uaucaau 17

<210> 606

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 18 транскрипта дистрофина человека

<400> 606

gauguugaua uaacugaacu uca 23

<210> 607

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 56 транскрипта дистрофина человека

<400> 607

gacguuugga uaacaugaac uuca 24

<210> 608

<211> 59

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 608

aguucagaaa acugcaagau gccagcagau cagcucaggc ccugguggaa cagauggug 59

<210> 609

<211> 59

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 609

aaugcagaua gcaucaaaca agccucagaa caacugaaca gccgguggau cgaauucug 59

<210> 610

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 610

ucagaaaacu gcaagaugcc agcagauca 29

<210> 611

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 22 транскрипта дистрофина человека

<400> 611

ucaggagacc augagugcca ucaggaca 28

<210> 612

<211> 70

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 612

agcgagaaaa agcugagaag uucagaaaac ugcaagaugc cagcagauca gcucaggccc 60

ugguggaaca 70

<210> 613

<211> 74

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 613

agccggaaau aucaaucaga auuugaagaa auugagggac gcuggaagaa gcucuccucc 60

cagcugguug agca 74

<210> 614

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 614

aucagcucag gcccuggugg aacagauggu gaa 33

<210> 615

<211> 35

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 24 транскрипта дистрофина человека

<400> 615

aucacauaca aacccugaag aaauggaugg cugaa 35

<210> 616

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 616

agagcgagaa aaagcugaga aguucagaaa acugcaaga 39

<210> 617

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 25 транскрипта дистрофина человека

<400> 617

agagccagag uuugcuucga gacuugagac agaacucaaa ga 42

<210> 618

<211> 86

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 618

gccauagagc gagaaaaagc ugagaaguuc agaaaacugc aagaugccag cagaucagcu 60

caggcccugg uggaacagau ggugaa 86

<210> 619

<211> 93

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 26 транскрипта дистрофина человека

<400> 619

gccagaaagg aggccuugaa gggagguuug gagaaaacug uaagccucca gaaagaucua 60

ucagagaugc acgaauggau gacacaagcu gaa 93

<210> 620

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 620

agcugagaag uucagaaaac ugcaagau 28

<210> 621

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 28 транскрипта дистрофина человека

<400> 621

agcugaggaa aucucugagg ugcuagau 28

<210> 622

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 622

agaugccagc agaucagcuc aggcccuggu ggaacagaug gugaa 45

<210> 623

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 29 транскрипта дистрофина человека

<400> 623

agauucgcau auuggcacag acccuaacag auggcgga 38

<210> 624

<211> 55

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 624

cauagagcga gaaaaagcug agaaguucag aaaacugcaa gaugccagca gauca 55

<210> 625

<211> 55

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 30 транскрипта дистрофина человека

<400> 625

cauucauuga caagcaguug gcagcuuaua uugcagacaa gguggacgca gcuca 55

<210> 626

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 626

agaugccagc agaucagcuc ag 22

<210> 627

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 31 транскрипта дистрофина человека

<400> 627

acaagucaug agaucaguuu ag 22

<210> 628

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 628

agaaaacugc aagaugccag ca 22

<210> 629

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 32 транскрипта дистрофина человека

<400> 629

aaaaaauuac aagaugucuc ca 22

<210> 630

<211> 49

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 630

agaaaaagcu gagaaguuca gaaaacugca agaugccagc agaucagcu 49

<210> 631

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 33 транскрипта дистрофина человека

<400> 631

agaaaaagca gacggaaaau cccaaagaac uugaugaaag aguaacagcu 50

<210> 632

<211> 37

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 632

cauagagcga gaaaaagcug agaaguucag aaaacug 37

<210> 633

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 34 транскрипта дистрофина человека

<400> 633

cagaaagaaa gcaacaguug gagaaaugcu ugaaauug 38

<210> 634

<211> 71

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 634

agcugagaag uucagaaaac ugcaagaugc cagcagauca gcucaggccc ugguggaaca 60

gauggugaau g 71

<210> 635

<211> 72

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 35 транскрипта дистрофина человека

<400> 635

accugaagag uaucacagag guaggagagg ccuugaaaac aguuuugggc aagaaggaga 60

cguuggugga ag 72

<210> 636

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 636

gcugagaagu ucagaaaacu gcaagaugcc agcagaucag 40

<210> 637

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 37 транскрипта дистрофина человека

<400> 637

ggugaccacu gcaggaaauu aguagagccc caaaucucag 40

<210> 638

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 638

agcagaucag cucag 15

<210> 639

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 38 транскрипта дистрофина человека

<400> 639

agcaguuuaa cucag 15

<210> 640

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 640

cauagagcga gaaaaagcug agaaguucag aaaacugca 39

<210> 641

<211> 42

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 39 транскрипта дистрофина человека

<400> 641

cacagaugag agaaagcgag aggaaauaaa gauaaaacag ca 42

<210> 642

<211> 77

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 642

cgagaaaaag cugagaaguu cagaaaacug caagaugcca gcagaucagc ucaggcccug 60

guggaacaga uggugaa 77

<210> 643

<211> 77

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 40 транскрипта дистрофина человека

<400> 643

cuagaaauuu cucaucagug guaucaguac aagaggcagg cugaugaucu ccugaaaugc 60

uuggaugaca uugaaaa 77

<210> 644

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 644

cagaucagcu caggcccugg uggaaca 27

<210> 645

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 41 транскрипта дистрофина человека

<400> 645

cagauccagc ucagcaagcg cuggcgggaa a 31

<210> 646

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 646

guggaacaga uggugaaug 19

<210> 647

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 647

guggaacaac uucucaaug 19

<210> 648

<211> 47

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 648

cauagagcga gaaaaagcug agaaguucag aaaacugcaa gaugcca 47

<210> 649

<211> 45

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 44 транскрипта дистрофина человека

<400> 649

cagaaagaca caaauuccug agaauuggga acaugcuaaa uacaa 45

<210> 650

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 650

agaaaaagcu gagaaguuca 20

<210> 651

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 46 транскрипта дистрофина человека

<400> 651

agaaaagcuu gagcaaguca 20

<210> 652

<211> 43

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 652

agaaguucag aaaacugcaa gaugccagca gaucagcuca ggc 43

<210> 653

<211> 43

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 47 транскрипта дистрофина человека

<400> 653

auaagcccag aagagcaaga uaaacuugaa aauaagcuca agc 43

<210> 654

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 654

agcagaucag cucaggcccu gguggaacag auggug 36

<210> 655

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 49 транскрипта дистрофина человека

<400> 655

agcaguucaa gcuaaacaac cggaugugga agagauuuug 40

<210> 656

<211> 39

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 656

gaaaaagcug agaaguucag aaaacugcaa gaugccagc 39

<210> 657

<211> 40

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 53 транскрипта дистрофина человека

<400> 657

gaagaagcug agcaggucuu aggacaggcc agagccaagc 40

<210> 658

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 658

agaaguucag aaaacugcaa gaugccagca g 31

<210> 659

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 55 транскрипта дистрофина человека

<400> 659

agaagcugaa acaacugcca auguccuaca g 31

<210> 660

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 660

gcaagaugcc agcagaucag 20

<210> 661

<211> 20

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 57 транскрипта дистрофина человека

<400> 661

gcgacuuucc agcaguucag 20

<210> 662

<211> 34

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 662

aacugcaaga ugccagcaga ucagcucagg cccu 34

<210> 663

<211> 31

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 59 транскрипта дистрофина человека

<400> 663

aacuucaaga ggccacggau gagcuggacc u 31

<210> 664

<211> 38

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 19 транскрипта дистрофина человека

<400> 664

agaaguucag aaaacugcaa gaugccagca gaucagcu 38

<210> 665

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 60 транскрипта дистрофина человека

<400> 665

auaaccucag cacucuggaa gaccugaaca ccagau 36

<210> 666

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 666

aacccaccac cccaucagag ccaacagcaa uuaaaaguca guuaaaaauu 50

<210> 667

<211> 50

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 667

aagucaaccg gcuaucaggu cuucaaccuc aaauugaacg auuaaaaauu 50

<210> 668

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 668

acaacaauug gagc 14

<210> 669

<211> 14

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 50 транскрипта дистрофина человека

<400> 669

accacuauug gagc 14

<210> 670

<211> 79

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 670

caauuggagc agaugacaac uacugcugaa aacugguuga aaauccaacc caccacccca 60

ucagagccaa cagcaauua 79

<210> 671

<211> 73

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 52 транскрипта дистрофина человека

<400> 671

caguuggaag aacucauuac cgcugcccaa aauuugaaaa acaagaccag caaucaagag 60

gcuagaacaa uca 73

<210> 672

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 20 транскрипта дистрофина человека

<400> 672

acugaacagc cgguggaucg aau 23

<210> 673

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 58 транскрипта дистрофина человека

<400> 673

acagagcagc cuuuggaagg acu 23

<210> 674

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 674

caaccggcua ucagg 15

<210> 675

<211> 15

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 22 транскрипта дистрофина человека

<400> 675

caaugcgcua ucagg 15

<210> 676

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 676

ucaaagcaua gcccugaaag aga 23

<210> 677

<211> 23

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 23 транскрипта дистрофина человека

<400> 677

ucucagcacc acugugaaag aga 23

<210> 678

<211> 32

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 678

gauuaaaaau ucaaagcaua gcccugaaag ag 32

<210> 679

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 24 транскрипта дистрофина человека

<400> 679

gauucagaaa uucuaaaaaa gcagcugaaa cag 33

<210> 680

<211> 54

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 680

cauuuuaagc aagucuuuuc ugaugugcag gccagagaga aagagcuaca gaca 54

<210> 681

<211> 55

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 25 транскрипта дистрофина человека

<400> 681

cagucuaaac agugucaaug aaggugggca gaagauaaag aaugaagcag agcca 55

<210> 682

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 682

agaaagagcu acagaca 17

<210> 683

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 26 транскрипта дистрофина человека

<400> 683

agaaagaucu aucagaga 18

<210> 684

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 684

cugaaagaga aaggacaag 19

<210> 685

<211> 18

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 27 транскрипта дистрофина человека

<400> 685

cugaauggga aaugcaag 18

<210> 686

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 686

auuaaaaauu caaagca 17

<210> 687

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 28 транскрипта дистрофина человека

<400> 687

auuuaaacuu aaaacca 17

<210> 688

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 688

gauuaaaaau ucaaagcaua gccc 24

<210> 689

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 29 транскрипта дистрофина человека

<400> 689

gaugcgacau ucagaggaua accc 24

<210> 690

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 690

ccucaaauug aacgauuaaa aauucaaagc aua 33

<210> 691

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 30 транскрипта дистрофина человека

<400> 691

ccucacauuc auugacaagc aguuggcagc uua 33

<210> 692

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 692

aagucuuuuc ugaugugcag gccagaga 28

<210> 693

<211> 30

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 31 транскрипта дистрофина человека

<400> 693

aaauccaauc ugauuugaca agucaugaga 30

<210> 694

<211> 72

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 694

ugaagucaac cggcuaucag gucuucaacc ucaaauugaa cgauuaaaaa uucaaagcau 60

agcccugaaa ga 72

<210> 695

<211> 69

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 32 транскрипта дистрофина человека

<400> 695

ugaaguggaa auggugauaa agacuggacg ucagauugua cagaaaaagc agacggaaaa 60

ucccaaaga 69

<210> 696

<211> 79

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 696

aaaaauucaa agcauagccc ugaaagagaa aggacaagga cccauguucc uggaugcaga 60

cuuuguggcc uuuacaaau 79

<210> 697

<211> 74

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 33 транскрипта дистрофина человека

<400> 697

agaaaugcuu gaaauugucc cguaagaugc gaaaggaaau gaaugucuug acagaauggc 60

uggcagcuac agau 74

<210> 698

<211> 28

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 698

guggccuuua caaaucauuu uaagcaag 28

<210> 699

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 34 транскрипта дистрофина человека

<400> 699

gaggccuuga aaacaguuuu gggcaag 27

<210> 700

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 700

uuuguggccu uuacaaauca uuuuaag 27

<210> 701

<211> 27

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 35 транскрипта дистрофина человека

<400> 701

uuugcagcca uuucacacag aauuaag 27

<210> 702

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 702

cugaaagaga aag 13

<210> 703

<211> 13

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 36 транскрипта дистрофина человека

<400> 703

cugaaagagg aag 13

<210> 704

<211> 36

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 704

aaaaauucaa agcauagccc ugaaagagaa aggaca 36

<210> 705

<211> 33

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 39 транскрипта дистрофина человека

<400> 705

aaagaaucac agaugagaga aagcgagagg aaa 33

<210> 706

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 706

agcccugaaa gagaaaggac aa 22

<210> 707

<211> 21

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 40 транскрипта дистрофина человека

<400> 707

agcccagaga ugaaaggaaa a 21

<210> 708

<211> 56

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 708

aagcauagcc cugaaagaga aaggacaagg acccauguuc cuggaugcag acuuug 56

<210> 709

<211> 55

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 41 транскрипта дистрофина человека

<400> 709

aagcgcuggc gggaaauuga gagcaaauuu gcucaguuuc gaagacucaa cuuug 55

<210> 710

<211> 77

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 710

agcccugaaa gagaaaggac aaggacccau guuccuggau gcagacuuug uggccuuuac 60

aaaucauuuu aagcaag 77

<210> 711

<211> 77

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 42 транскрипта дистрофина человека

<400> 711

agcccuauua gaaguggaac aacuucucaa ugcuccugac cucugugcua aggacuuuga 60

agaucucuuu aagcaag 77

<210> 712

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 712

acaaggaccc auguuccug 19

<210> 713

<211> 19

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 44 транскрипта дистрофина человека

<400> 713

agaaagacac aaauuccug 19

<210> 714

<211> 56

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 714

uuacaaauca uuuuaagcaa gucuuuucug augugcaggc cagagagaaa gagcua 56

<210> 715

<211> 58

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 46 транскрипта дистрофина человека

<400> 715

uuucaaagag auuuaaauga auuuguuuua ugguuggagg aagcagauaa cauugcua 58

<210> 716

<211> 17

<212> РНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Часть экзона 21 транскрипта дистрофина человека

<400> 716

agcccugaaa gagaaag 17