ПРИМЕНЕНИЕ КОМПОЗИЦИИ ФИЛЛИРИНА/ФИЛЛИГЕНИНА ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ МЕДИКАМЕНТА ИЛИ ПРОДУКТА МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ И/ИЛИ НАЗНАЧЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, И МЕДИКАМЕНТ ИЛИ ПРОДУКТ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2018 года по МПК A61K31/7048 A61K31/34 A61P31/16 A61K31/22 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области фармацевтической химии, и в частности, к композиции или смеси филлирина/филлигенина, и к её применению при приготовлении лекарств или продуктов медицинского назначения для облегчения и/или лечения вирусных заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Грипп является одним из острых вирусных респираторных инфекционных заболеваний, приносящих тяжелый вред здоровью человека. В 21 веке распространение SARS, вируса H5N1 и вируса гриппа типа A H1N1 приносит большой ущерб людям. В настоящее время не имеется натуральных лекарственных средств, способных к эффективному лечению гриппа и вирусной пневмонии в мире.

Плоды форзиции являются сухими плодами Форзиции пониклой (сем. Маслиновые) (Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl (Oleaceae)), которая растет главным образом в провинциях Хенань, Шаньси, Шаньдун и других районах Китая, а также провинциях Хубэй, Хэбей, Сычуань и Ганьсу. Форзицию обычно применяют для лечения простуды, фурункулов и язв, туберкулезного лимфаденита, инфекции мочевых путей, и т.д. Главные ингредиенты Forsythia suspense включают филлирин и филлирин агликон (также известный как филлигенин); и структура двух компонентов представлена следующими формулами.

филлирин филлигенин ((+)-филлигенин)

Филлирин, в качестве главного компонента Forsythia suspense, обладает противовирусным, антибактериальным, антиоксидантным эффектом, способностью к удалению свободных радикалов, и другими фармакологическими эффектами. Филлигенин, также известный как главный активный компонент Forsythia suspense, обладает антиоксидантным, бактериостатическим, противоопухолевым и противовоспалительным эффектом; способствует снижению уровня липидов в крови, удаляет свободные радикалы. Опубликованные литературные данные направлены главным образом на исследование антивирусных фармакологических эффектов экстрактов Forsythia suspense, содержащих неизвестные компоненты и некоторые известные компоненты, и единственный компонент филлирин. Однако антивирусные фармакологические эффекты композиции филлигенина/филлирина и единственного компонента филлигенина все еще не изучены.

Изложение сущности изобретения

Для решения существующих технических проблем лечения, профилактики или облегчения вирусных заболеваний, задачей настоящего изобретения является обеспечение применения композиции филлирина/филлигенина для приготовления лекарств или продуктов медицинского назначения для облегчения и/или лечения вирусных заболеваний. Композиция филлирина/филлигенина из настоящего изобретения обладает хорошей активностью и эффективностью для облегчения и/или лечения вирусных заболеваний, и обеспечивает новый подход к разработке новых лекарственных средств для облегчения и/или лечения вирусных заболеваний; т.е. обеспечивает новый подход к лекарствам или медицинскому питанию для облегчения, контроля и лечения вирусных заболеваний.

Для решения вышеуказанной задачи, с одной стороны, настоящее изобретение обеспечивает применение композиции филлирина/филлигенина при приготовлении лекарств или средств медицинского назначения для облегчения и/или лечения вирусных заболеваний.

При этом вирусными заболеваниями являются заболевания, вызванные вирусом гриппа, вирусом парагриппа, вирусом Коксаки CoxA16, респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), вирусом простого герпеса HSV- I, вирусом простого герпеса HSV- II, вирусом простого герпеса CVB3, аденовирусом ADV или энтеровирусом EV71; предпочтительно, вирусом гриппа; пневмония и респираторные инфекционные заболевания, вызванные вирусами гриппа, вирусами парагриппа, вирусом Коксаки CoxA16 и респираторно-синцитиальным вирусом (RSV).

В процессе скрининга натуральных активных компонентов, эффективных для облегчения и/или лечения гриппа, вирусной пневмонии и респираторных инфекционных заболеваний, автор настоящего изобретения установил, что композиция филлирина/филлигенина обладает мощным эффектом ингибирования гриппа и вирусной пневмонии, со значительно более выраженной эффективностью, чем у филлирина или филлигенина, используемых по отдельности.

При этом массовое отношение филлирина к филлигенину в композиции филлирина/филлигенина составляет 80-98:2-20, предпочтительно 90-98:2-10, более предпочтительно 98:2.

В частности, композиция филлирина/филлигенина дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.

Такой фармацевтически приемлемый носитель, как правило, считается специалистами в области здравоохранения пригодным для этой цели, и служит в качестве неактивного компонента лекарственных средств. Информацию о фармацевтически приемлемых носителях можно найти в справочниках, таких как «Handbook of Pharmaceutical excipients, 2nd Edition» («Справочник по фармакологическим вспомогательным веществам»), редакция A. Wade and P. J. Weller, опубликованном Американской фармацевтической ассоциацией, Вашингтон, и Pharmaceutical Press, Лондон, 1994. В частности, носитель включает вспомогательное вещество, такое как крахмал и вода; любрикант, такой как магния стеарат; дезинтегрант, такой как микрокристаллическая целлюлоза; наполнитель, такой как лактоза; связующий агент, такой как прежелатинизированный крахмал и декстрин; подсластитель; антиоксидант; антисептик; ароматизатор; эссенцию, и т.д.

В частности, лекарственное средство из настоящего изобретения присутствует в форме таблеток, капсул, пилюль, порошков, гранул, сиропов, эмульсий, инъекций, спреев, аэрозолей, гелей, кремов, припарок, липких пластырей или повязок.

При этом массовое отношение филлирина и филлигенина в композиции филлирина/филлигенина к фармацевтически приемлемому носителю составляет от 1:1 до 1:100, предпочтительно 1:100, более предпочтительно 1:5, еще более предпочтительно 1:2, и еще более предпочтительно 1:1.

В частности, содержание композиции филлирина/филлигенина составляет 80% или больше (т.е. ≥80%), предпочтительно ≥85%, более предпочтительно ≥88%, еще более предпочтительно ≥90%, и еще более предпочтительно ≥99%.

В частности, массовое отношение филлирина и филлигенина в композиции филлирина/филлигенина составляет 2-98:98-2, предпочтительно 80:20 или 20:80, более предпочтительно 90:10 или 10:90, и еще более предпочтительно 98:2 или 2:98.

При этом композиция филлирина/филлигенина образована филлирином и филлигенином в форме мономеров, или композиция экстрактов филлигенина-филлирина приготовлена путем тепловой экстракции с применением растворителя, или является композицией филлигенина-филлирина-циклодекстрина, образованной путем комбинации филлигенина и филлирина с циклодекстрином или производным циклодекстрина.

В частности, композиция филлигенина-филлирина-циклодекстрина является смесью, образованной путем смешивания филлигенина и филлирина с α-циклодекстрином, β-циклодекстрином или γ-циклодекстрином или их производным, или композицией, образованной филлигенином, филлирином и α-циклодекстрином, β-циклодекстрином или γ-циклодекстрином или их производным, посредством физической или химической обработки.

При этом отношение общей массы филлирина и филлигенина в композиции филлигенина-филлирина-циклодекстрина к массе циклодекстрина или производного циклодекстрина составляет 1:1-50.

В частности, циклодекстрин является α-циклодекстрином, β-циклодекстрином или γ-циклодекстрином; производное циклодекстрина является гидроксиэтил β-циклодекстрином, 2,6-диметил β-циклодекстрином, 2,3,6-триметил β-циклодекстрином, 2,6-диэтил β-циклодекстрином, 2,3,6-диэтил β-циклодекстрином, мальтозил β-циклодекстрином или сульфонилэфир β-циклодекстрином, п-толуолсульфонил-хлорид (п- TсCl) замещенным β-циклодекстрином, замещенным в 6 положении β-CD п-толуолсульфонатом (β-циклодекстрин-6-OTs), 2-окси-гидроксипропил- β-циклодекстрином, однозамещенным во 2 положении п-толуолсульфонатом (β-циклодекстрин-2-OTс), β-циклодекстрин п-толуолсульфонатом (Tosyl-β-CD), и звездообразной макромолекулой β-циклодекстрина PCL-(Tos)7-β-CD.

При этом композицию экстракта филлирина-филлигенина готовят в соответствии со следующим способом:

1) экстракцией с обратным холодильником листьев или плодов форзиции пониклой с применением растворителя при нагревании 2-3 раза, по 2-4 часа каждый раз;

2) концентрированием экстрагированной жидкости, с последующим отстаиванием для осаждения, с получением неочищенной смеси филлигенина и филлирина;

3) растворением неочищенной смеси филлигенина и филлирина в растворителе, с отстаиванием для кристаллизации, до получения смеси филлигенина и филлирина;

4) обработкой смеси филлигенина и филлирина рекристаллизацией с применением растворителя, до получения экстракта филлигенина-филлирина.

В частности, растворителем на этапе (1), (3) и (4) является метанол, этанол, ацетон, раствор метанола, включающий воду, или раствор этанола, включающий воду.

В частности, концентрация метанола в массовых процентах в растворе составляет 70-95%, концентрация этанола в массовых процентах в растворе составляет 70-95%.

При этом на этапе (2) отстаивание для осаждения проводят при комнатной температуре, предпочтительно 10-35°С, более предпочтительно 20-25°С; время отстаивания составляет 1-48 часов; на этапе (2) отношение объема концентрированной жидкости от экстракции к объему исходной жидкости при экстракции составляет 0,1-0,5:1.

В частности, на этапе (4) рекристаллизацию проводят при комнатной температуре, предпочтительно 10-35°С, более предпочтительно 20-25°С.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает лекарственное средство или продукт медицинского назначения для облегчения и/или лечения вирусных заболеваний, содержащие филлирин и филлигенин.

При этом массовое отношение филлирина к филлигенину составляет 80-98:2-20, предпочтительно 90-98:2-10, более предпочтительно 98:2.

В частности, лекарственное средство или продукт медицинского назначения состоит из композиции филлирина/филлигенина и фармацевтически приемлемого носителя.

При этом отношение общей массы филлирина и филлигенина в композиции филлирина/филлигенина к массе фармацевтически приемлемого носителя составляет 1:1 - 1:100, предпочтительно 1:100, более предпочтительно 1:5, еще более предпочтительно 1:2, и еще более предпочтительно 1:1.

В частности, отношение массы композиции филлигенина/филлирина к общей массе лекарственного средства или продукта медицинского назначения составляет 0,01-10:100, предпочтительно 0,1-10:100, более предпочтительно 1-10:100.

В частности, лекарственное средство находится в форме таблеток, капсул, пилюль, порошков, гранул, сиропов, растворов, эмульсий, инъекций, спреев, аэрозолей, гелей, кремов, припарок, липких пластырей или повязок.

В частности, лекарственное средство или продукт медицинского назначения дополнительно включает одно или более из экстракта травы одуванчика, экстракта корня вайды, экстракта цветов жимолости, экстракта корневища анемаррены, экстракта корня норичника, экстракта соплодий черноголовки, экстракта корневища тростника, экстракта травы лофатерума, экстракта плодов гардении, экстракта луковиц рябчика усатого, экстракта листьев падуба рогатого, и экстракта травы хауттюйнии.

Лекарственное средство может быть приготовлено в виде различных фармацевтических препаратов, таких как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы сиропы, растворы, эмульсии, инъекции, спреи, аэрозоли, гели, кремы, припарки, липкие пластыри или повязки, с применением способа, общеизвестного в данной области техники.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения заболеваний гриппа и вирусной пневмонии, включающий применение терапевтического количества фармацевтической композиции филлигенина и филлирина у пациента, где терапевтически эффективная доза составляет 0,1-50 мг/кг/сутки, предпочтительно 0,3-30 мг/кг/сутки, более предпочтительно 0,5-10 мг/кг/сутки.

Если не указано иное, термин «терапевтически эффективная доза», применяемый в настоящей заявке, означает дозу лекарственного средства, необходимую для обеспечения эффективности; «терапевтически эффективную дозу» можно регулировать и менять; наконец, она может быть определена медицинским персоналом, в зависимости от учитываемых факторов, включая способ применения, свойство препарата, массу тела реципиента, возраст и другие общие условия, и природу и тяжесть заболеваний, подлежащих лечению.

По сравнению с предшествующим уровнем техники, настоящее изобретение имеет следующие явные преимущества.

Способ приготовления композиции филлирина/филлигенина из настоящего изобретения является простым и пригодным для промышленного применения; композиция обладает выраженной эффективностью в отношении резистентности к различным вирусным заболеваниям, таким как грипп и пневмония, а антивирусная эффективность выше, чем у филлирина и филлигенина, используемых по отдельности, а также лучше, чем у осельтамивира фосфата (Тамифлю), который является новейшим противовирусным средством в клинической практике. Далее, также установлено, что композиция филлирина/филлигенина обладает эффективностью в отношении резистентности к другим вирусам, проявляет существенное ингибирующее влияние на вирус Коксаки CoxA16, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус простого герпеса HSV-I, вирус простого герпеса HSV-II, вирус простого герпеса CVB3, аденовирус ADV и энтеровирус EV71; и может применяться для лечения заболеваний, вызванных вышеупомянутыми вирусами, таким как грипп и пневмония, опоясывающий лишай, миокардит, энтеровирусный везикулярный стоматит, инфекции верхней части дыхательных путей, капиллярный бронхит, кожная сыпь и менингит. Таким образом, настоящее изобретение может обеспечивать высокоэффективные натуральные лекарственные средства или продукты медицинского назначения для облегчения и/или лечения таких заболеваний, как грипп и вирусная пневмония, опоясывающий лишай, миокардит, энтеровирусный везикулярный стоматит, инфекции верхних отделов дыхательных путей, капиллярный бронхит, кожная сыпь, менингит и другие заболевания; таким образом, открывая новые перспективы применения медицинского материала форзиции пониклой.

1. Композиция филлирина/филлигенина из настоящего изобретения обладает эффективностью в отношении резистентности к вирусам гриппа и вирусам пневмонии, и эта эффективность существенно выше, чем у филлирина и филлигенина, используемых по отдельности; филлирин и филлигенин применяют в комбинации в специфическом отношении для получения синергетического эффекта.

2. Композиция филлирина/филлигенина из настоящего изобретения обладает ингибирующим влиянием в отношении вируса Коксаки CoxA16, респираторно-синцитиального вируса (RSV), вируса простого герпеса HSV-I, вируса простого герпеса HSV-II, вируса простого герпеса CVB3, аденовируса ADV, энтеровируса EV71 и других вирусов; композицию филлирина/филлигенина можно применять для лечения заболеваний, вызванных вышеупомянутыми вирусами, таких как грипп и пневмония, опоясывающий лишай, миокардит, энтеровирусный везикулярный стоматит, инфекции верхних отделов дыхательных путей, капиллярный бронхит, кожная сыпь, и менингит.

3. Композиция филлирина/филлигенина из настоящего изобретения обладает выраженными эффектами в отношении ингибирования воспаления, вызванного вирусами, и усиления иммунитета пациента; композиция филлирина/филлигенина оказывает выраженный фармакологический эффект на ингибирование гриппа и вирусной пневмонии, является очень эффективной в облегчении, контроле и лечении гриппа и вирусной пневмонии, обладает быстрым действием, является менее токсичной или проявляет меньше побочных эффектов, и высоко безопасна, пригодна для длительного применения, и имеет хорошие медицинские перспективы.

4. Сырьевой материал продукта из настоящего изобретения широко распространен, имеет низкую стоимость, и безопасен для клинического применения; процесс приготовления является простым, а продукт имеет разные формы и малую дозу, и его легко применять, и таким образом, легко продвигать.

5. Композиция филлирина/филлигенина из настоящего изобретения может быть приготовленной из мономерных компонентов в количественной комбинации, может также быть приготовлена путем экстракции плодов форзиции; или быть комплексом композиции филлирина/филлигенина и α-циклодекстрина или β-циклодекстрина или γ-циклодекстрина, или производного циклодекстрина, и может также быть комплексом композиции филлирина/филлигенина и других активных компонентов (таких как одно или более из экстракта травы одуванчика, экстракта корня вайды, экстракта цветов жимолости, экстракта корневища анемаррены, экстракта корня норичника, экстракта соплодий черноголовки, экстракта корневища тростника, экстракта травы лофатерума, экстракта плодов гардении, экстракта луковицы рябчика усатого, экстракта листьев падуба рогатого, и экстракта травы хауттюйнии), таким образом, обеспечивая комплексный медикамент для лечения гриппа, вирусной пневмонии и других вирусных заболеваний.

Подробное описание изобретения

Преимущества составов из настоящего изобретения подробно описаны ниже посредством специфических вариантов осуществления. Эти примеры являются просто иллюстративными, и не предназначены для ограничения объема изобретения. Специалисту в данной области техники необходимо понять, что модификации или изменения деталей и форм технического решения настоящего изобретения могут быть выполнены без отделения от концепции и объема применения составов из настоящего изобретения; однако, все эти модификации и изменения входят в пределы объема настоящего изобретения.

Пример 1-4. Приготовление композиции филлирина/филлигенина

Готовили отдельные навески порошков двух мономерных компонентов, т.е. филлирина и филлигенина, для смеси в соответствии с массовым отношением, указанным в таблице 1, для приготовления композиции филлирина/филлигенина; мономер филлирин был произведен Dalian Fusheng Natural Drug Development Co., Ltd.; его чистота составила 99,5% при определении с помощью ВЭЖХ системы, оснащенной УФ детектором и испарительным светорассеивающим детектором (ELSD) с применением метода нормализации площадей пиков; и его содержание калибровали и признали равным 99,5% с эталоном филлирина, полученным от China Pharmaceutical and Biological Products для определения содержания; филлигенин был произведен Dalian Fusheng Natural Drug Development Co., Ltd.; его чистота составила 99,1% при определении с помощью ВЭЖХ системы, оснащенной УФ детектором и испарительным светорассеивающим детектором (ELSD) с применением метода нормализации площадей пиков.

Таблица 1. Таблица отношения сырьевых материалов для композиций филлирина/филлигенина из примеров 1-4

Пример № Массовое отношение Филлирин Филлигенин Пример 1 98 2 Пример 2 80 20 Пример 3 90 10 Пример 4 95 5

Примеры 5-24. Приготовление композиции филлирина/филлигенина

Из композиции филлирина/филлигенина, приготовленной в примере 1-4, готовили композицию, включающую циклодекстрин, в соответствии с массовым отношением, показанным в таблице 2, с применением следующего способа: (1) прямое добавление в раствор циклодекстрина, или (2) прямое добавление в раствор циклодекстрина и тщательное перемешивание в течение 1-24 часов, (3) прямое добавление в раствор циклодекстрина и нагревание в течение 10-120 минут, (4) прямое добавление в раствор циклодекстрина и обработка ультразвуком в течение 120 минут, (5) прямое измельчение вместе с порошком циклодекстрина в течение 10-120 минут, (6) тщательное смешивание композиции филлирина/филлигенина с порошком циклодекстрина и просеивание смеси, (7) прямое добавление в раствор производного циклодекстрина, или (8) прямое добавление в раствор производного циклодекстрина и тщательное перемешивание в течение 1-24 часов, (9) прямое добавление в раствор производного циклодекстрина и нагревание в течение 10-120 минут, (10) прямое добавление в раствор производного циклодекстрина и обработка ультразвуком в течение 10-120 минут, (11) прямое измельчение вместе с порошком производного циклодекстрина в течение 10-120 минут, (12) тщательное смешивание с порошком производного циклодекстрина и просеивание смеси.

Таблица 2. Отношение сырьевых материалов и способ приготовления из примеров 5-24

№ примера Композиция филлирина/ филлигенина (г) Циклодекстрин или производное циклодекстрина (г) Способ приготовления Пример 5 100 (98:2) 100 (1) Прямое добавление в
раствор циклодекстрина Пример 6 100 (80:20) 10000 (2) Перемешивание в
течение 1 часа Пример 7 100 (90:10) 500 (5) Нагревание в течение 10 минут Пример 8 100 (95:5) 1000 (4) Обработка ультразвуком в течение 10 минут Пример 9 100 (98:2) 2000 (5) Измельчение с порошком циклодекстрина в течение 10 минут Пример 10 100 (98:2) 3000 (6) Тщательное смешивание с порошком циклодекстрина и просеивание в течение 10 минут Пример 11 100 (98:2) 4000 (1) Прямое добавление в
раствор циклодекстрина Пример 12 100 (98:2) 3500 (2) Перемешивание в
течение 12 часов Пример 13 100 (98:2) 4500 (3) Нагревание в течение 120 минут Пример 14 100 (98:2) 1500 (4) Обработка ультразвуком в течение 120 минут Пример 15 100 (98:2) 100 (7) Прямое добавление в
раствор производного
циклодекстрина Пример 16 100 (80:20) 10000 (8) Перемешивание в
течение 1 часа Пример 17 100 (90:10) 500 (9) Нагревание в течение 10 минут Пример 18 100 (95:5) 1000 (10) Обработка
ультразвуком в течение 10 минут Пример 19 100 (98:2) 2000 (11) Измельчение с
производным циклодекстрина в течение 10 минут Пример 20 100 (98:2) 3000 (12) Тщательное
перемешивание с
производным циклодекстрина и
просеивание в течение 10 минут Пример 21 100 (98:2) 4000 (1) Прямое добавление Пример 22 100 (98:2) 3500 (2) Перемешивание в
течение 12 часов Пример 23 100 (98:2) 4500 (5) Нагревание в течение 120 минут Пример 24 100 (98:2) 1500 (6) Обработка ультразвуком в течение 120 минут

Вспомогательные вещества, использованные в примерах 5-24, были иллюстрированы с применением β-циклодекстрина в качестве примера; другие циклодекстрина и производные циклодекстрина также можно применять в настоящем изобретении, такие как: 1) β-гидроксиэтил циклодекстрин, 2) гидроэтил β-циклодекстрин, 3) 2,6-диметил β-циклодекстрин, 4) 2,3,6-триметил β-циклодекстрин, 5) 2,6-диэтил β-циклодекстрин, 6) 2,3,6-триэтил β-циклодекстрин, 7) мальтозил β-циклодекстрин, 8) сульфобутил-эфир β-циклодекстрин, 9) п-толуолсульфонилхлорид (п-TсCl) замещенный β-циклодекстрин, 10) замещенный в 6 положении β-ЦД п-толуолсульфонат (β-циклодекстрин-6-OTс), 11) 2-окси-гидроксипропил-β-циклодекстрин, 12) однозамещенный во 2 положении п-толуолсульфонат (β-циклодекстрин-2-OTс), 13) β-циклодекстрин п-толуолсульфонат (Tosyl-β-CD), и 15) звездообразная макромолекула β-циклодекстрина PCL-(Tos)7-β-CD.

Пример 25. Приготовление композиции филлирина и филлигенина

10 кг 95 масс.% этанола добавляли к 1 кг сухих листьев форзиции пониклой, смесь экстрагировали с обратным холодильником при нагревании дважды, каждый раз по 2 часа, экстрагированную жидкость фильтровали, фильтрат концентрировали под вакуумом до половины от исходного объема, и отстаивали для осаждения при 25°С в течение 1 часа для отделения осадка; осадок растворяли метанолом для рекристаллизации, и осажденные вещества отделяли; вышеуказанный процесс повторяли для рекристаллизации метанолом для получения аморфного порошка композиции филлирина/филлигенина с содержанием филлирина и филлигенина 98% и 2%, соответственно, по результатам ВЭЖХ.

Пример 26. Приготовление композиции филлирина и филлигенина

10 кг метанола добавляли к 1 кг сухих плодов форзиции пониклой, смесь экстрагировали с обратным холодильником при нагревании трижды, каждый раз по 4 часа, экстрагированную жидкость фильтровали, фильтрат концентрировали под вакуумом до 1/10 от исходного объема, и отстаивали для осаждения при 20°С в течение 48 часов для отделения осадка; осадок растворяли этанолом для рекристаллизации, и осажденные вещества отделяли; вышеуказанный процесс повторяли для рекристаллизации этанолом для получения аморфного порошка композиции филлирина/филлигенина с содержанием филлирина и филлигенина 95% и 4%, соответственно.

Пример 27. Приготовление композиции филлирина и филлигенина

10 кг 70 масс.% метанола добавляли к 1 кг сухих листьев форзиции пониклой, смесь экстрагировали с обратным холодильником при нагревании трижды, каждый раз по 3 часа, экстрагированную жидкость фильтровали, фильтрат концентрировали под вакуумом до 1/3 от исходного объема, и отстаивали для осаждения при комнатной температуре в течение 2 часов для отделения осадка; осадок растворяли 90% метанолом для рекристаллизации, и осажденные вещества отделяли; вышеуказанный процесс повторяли для рекристаллизации метанолом для получения аморфного порошка композиции филлирина/филлигенина с содержанием филлирина и филлигенина 88% и 2%, соответственно.

Пример 28. Приготовление композиции филлирина и филлигенина

10 кг безводного этанола добавляли к 1 кг сухих плодов форзиции пониклой, смесь экстрагировали с обратным холодильником при нагревании дважды, каждый раз по 4 часа, экстрагированную жидкость фильтровали, фильтрат концентрировали под вакуумом до ¼ от исходного объема, и отстаивали для осаждения при комнатной температуре в течение 24 часов для отделения осадка; осадок растворяли ацетоном для рекристаллизации, и осажденные вещества отделяли; вышеуказанный процесс повторяли для рекристаллизации ацетоном для получения аморфного порошка композиции филлирина/филлигенина с содержанием филлирина и филлигенина 90% и 6%, соответственно.

Пример 29. Приготовление композиции филлирина и филлигенина

10 кг ацетона добавляли к 1 кг сухих листьев форзиции пониклой, смесь экстрагировали с обратным холодильником при нагревании трижды, каждый раз по 3 часа, экстрагированную жидкость фильтровали, фильтрат концентрировали под вакуумом до 1/5 от исходного объема, и отстаивали для осаждения при комнатной температуре в течение 10 часов для отделения осадка; осадок растворяли 70% этанолом для рекристаллизации, и осажденные вещества отделяли; вышеуказанный процесс повторяли для рекристаллизации 70% этанолом для получения аморфного порошка композиции филлирина/филлигенина с содержанием филлирина и филлигенина 80% и 5%, соответственно.

Пример 30. Приготовление таблеток из композиции филлирина и филлигенина

Таблетки композиции филлирина/филлигенина готовили в соответствии со следующим массовым отношением:

Композиция филлирина/филлигенина (массовое отношение 98:2) 500 г Крахмал 480 г Порошок талька 1% (10 г) Магния стеарат 1% (10 г)

В соответствии с вышеуказанным отношением композицию филлирина/филлигенина, приготовленную в примере 1, тщательно перемешивали с крахмалом, а затем из смеси готовили гранулы; добавляли тальк и магния стеарат, и тщательно перемешивали, и смесь прессовали с получением 10000 таблеток.

Пример 31. Приготовление гранул из композиции филлирина и филлигенина

Гранулы композиции филлирина/филлигенина готовили в соответствии со следующим массовым отношением:

Композиция филлирина/филлигенина (массовое отношение 98:2) 100 г Микрокристаллическая целлюлоза 10000 г

В соответствии с вышеуказанным отношением, композицию филлирина/филлигенина, приготовленную в примере 1, тщательно смешивали с микрокристаллической целлюлозой, а затем из смеси готовили гранулы; гранулы помещали в пакеты с получением 10 000 пакетов.

Пример 32. Приготовление капсул из композиции филлирина и филлигенина

Капсулы композиции филлирина/филлигенина готовили в соответствии со следующим массовым отношением:

Композиция филлирина/филлигенина (массовое отношение 98:2) 250 г Крахмал 2500 г

В соответствии с вышеуказанным отношением, композицию филлирина/филлигенина, приготовленную в примере 1, тщательно смешивали с крахмалом, а затем из смеси готовили капсулы, с получением 10000 капсул.

Пример 33-36. Приготовление капсул композиции филлирина/филлигенина

В примерах 33-36 композиции филлирина/филлигенина тщательно смешивали с крахмалом в соответствии с массовым отношением, показанным в таблице 3, а затем из смеси готовили капсулы, с получением 10000 капсул для каждого примера.

Таблица 3

№ примера Сырьевой материал (композиция из филлигенина и филлирина, г) Фармацевтический адъювант (крахмал, г) Массовое отношение сырьевого материала к фармацевтическому адъюванту Пример 33 500 (98:2) 500 1:1 Пример 34 50 (80:20) 5000 1:100 Пример 35 250 (90:10) 2500 1:10 Пример 36 250 (95:5) 5000 1:20

Материалы в таблице можно заменить композицией из филлигенина и филлирина, приготовленной в примерах 5-29.

Примеры 37-40. Приготовление гранул из композиции филлирина/филлигенина

В примерах 37-40 композиции филлирина/филлигенина тщательно смешивали с микрокристаллической целлюлозой в соответствии с массовым отношением, показанным в таблице 4, а затем из смеси готовили гранулы, затем гранулы фасовали в пакеты с получением 10000 пакетов.

Таблица 4

№ примера Сырьевой материал (композиция из
филлигенина и
филлирина, г) Фармацевтический адъювант (микрокристаллическая целлюлоза, г) Массовое отношение сырьевого материала к фармацевтическому адъюванту Пример 37 1000 (98:2) 1000 1:1 Пример 38 250 (80:20) 25000 1:100 Пример 39 2500 (90:10) 25000 1:10 Пример 30 2500 (95:5) 50000 1:20

Материалы в таблице можно заменить композицией из филлигенина и филлирина, приготовленной в примерах 5-29

Пример 41. Приготовление таблеток из композиции филлирина/филлигенина.

Таблетки композиции филлирина/филлигенина готовили в соответствии со следующим массовым отношением:

Композиция филлирина/филлигенина (массовое отношение 98:2) 500 г Крахмал 380 г Экстракт травы одуванчика 100 г Порошок талька 1% (10 г) Магния стеарат 1% (10 г)

В соответствии с вышеуказанным отношением, композицию филлирина/филлигенина тщательно смешивали с порошком вышеуказанного экстракта, а затем тщательно смешивали с крахмалом, из смеси готовили гранулы, добавляли порошок талька и магния стеарата, и тщательно перемешивали, а затем из смеси прессовали 10000 таблеток. При этом композицию филлирина/филлигенина в данном примере можно заменить композицией филлигенина и филлирина, приготовленной в примерах 5-29.

Пример 42. Приготовление гранул из композиции филлирина/филлигенина

Гранулы композиции филлирина/филлигенина готовили в соответствии со следующим массовым отношением:

Композиция филлирина/филлигенина

(массовое отношение 98:2) 250 г

Экстракт корня вайды 250 г Экстракт цветов жимолости 250 г Микрокристаллическая целлюлоза 24500 г

В соответствии с вышеуказанным отношением, композицию филлирина/филлигенина тщательно смешивали с порошком вышеуказанного экстракта, а затем тщательно смешивали с микрокристаллической целлюлозой, из смеси готовили гранулы; гранулы фасовали в пакеты с получением 10000 пакетов. При этом композицию филлирина/филлигенина в данном примере можно заменить композицией филлигенина и филлирина, приготовленной в примерах 5-29.

Пример 43. Приготовление капсул из композиции филлирина/филлигенина

Капсулы из композиции филлирина/филлигенина готовили в соответствии со следующим массовым отношением:

Композиция филлирина/филлигенина (массовое отношение 98:2) 250 г Экстракт плодов гардении 250 г Экстракт луковиц рябчика усатого 250 г Экстракт листьев падуба рогатого 250 г Крахмал 1000 г

В соответствии с вышеуказанным отношением, композицию филлирина/филлигенина тщательно смешивали с порошком вышеуказанного экстракта, а затем тщательно смешивали с крахмалом, из смеси готовили капсулы с получением 10000 капсул. При этом композицию филлирина/филлигенина в данном примере можно заменить композицией филлигенина и филлирина, приготовленной в примерах 5-29.

Пример 52. Приготовление таблеток из композиции филлирина/филлигенина

Таблетки композиции филлирина/филлигенина готовили в соответствии со следующим массовым отношением:

Композиция филлирина/филлигенина (массовое отношение 80:20) 500 г Крахмал 480 г Экстракт корневища анемаррены 500 г Порошок талька 1% (10 г) Магния стеарат 1% (10 г)

В соответствии с вышеуказанным отношением, композицию филлирина/филлигенина тщательно смешивали с порошком вышеуказанного экстракта, а затем тщательно смешивали с крахмалом, из смеси готовили гранулы; добавляли тальк и магния стеарат и тщательно перемешивали; смесь прессовали с получением 10000 таблеток. При этом композицию филлирина/филлигенина в данном примере можно заменить композицией филлигенина и филлирина, приготовленной в примерах 5-29.

Пример 53. Приготовление гранул из композиции филлирина/филлигенина

Гранулы композиции филлирина/филлигенина готовили в соответствии со следующим массовым отношением:

Композиция филлирина/филлигенина (массовое отношение 90:10) 1000 г Экстракт корня норичника 500 г Экстракт травы лофатерума 500 г Микрокристаллическая целлюлоза 10000 г

В соответствии с вышеуказанным отношением, композицию филлирина/филлигенина тщательно смешивали с порошком вышеуказанного экстракта, а затем тщательно смешивали с микрокристаллической целлюлозой, из смеси готовили гранулы; гранулы фасовали в пакеты с получением 10000 пакетов. При этом композицию филлирина/филлигенина в данном примере можно заменить композицией филлигенина и филлирина, приготовленной в примерах 5-29.

Пример 54. Приготовление капсул из композиции филлирина/филлигенина

Капсулы из композиции филлирина/филлигенина готовили в соответствии со следующим массовым отношением:

Композиция филлирина/филлигенина (массовое отношение 94:6) 2000 г Экстракт соплодий черноголовки 250 г Экстракт травы хауттюйнии 500 г Экстракт корневища тростника 250 г Крахмал 1000 г

В соответствии с вышеуказанным отношением, композицию филлирина/филлигенина тщательно смешивали с порошком вышеуказанного экстракта, а затем тщательно смешивали с крахмалом, из смеси готовили капсулы с получением 10000 капсул. При этом композицию филлирина/филлигенина в данном примере можно заменить композицией филлигенина и филлирина, приготовленной в примерах 5-29.

Опытный пример 1. Анализ противовирусной активности композиции филлирина/филлигенина

1. Анализ противовирусной активности in vitro

1,1. Материалы для анализа

(1) Лекарственные средства

1) Филлирин, белый порошок, произведенный Dalian Fusheng Natural Drug Development Co. Ltd., чистота составила 99,5% при определении посредством ВЭЖХ системы, оснащенной УФ детектором и испарительным детектором светорассеяния (ELSD), с применением способа нормирования площадей пиков; содержание было калибровано и подтверждено как 99,5% с эталоном филлирина, поставляемым China Pharmaceutical and Biological Products для определения содержания.

2) Филлигенин, белый порошок, произведенный Dalian Fusheng Natural Drug Development Co. Ltd., чистота составила 99,1% при определении посредством ВЭЖХ системы, оснащенной УФ детектором и испарительным детектором светорассеяния (ELSD), с применением способа нормирования площадей пиков; содержание было калибровано и подтверждено как 99,1% с эталоном филлирина, поставляемым China Pharmaceutical and Biological Products для определения содержания.

3) Композиция филлирина/филлигенина А, которая является белым порошком, производится Dalian Fusheng Natural Drug Development Co. Ltd., образована двумя мономерами филлирина и филлигенина; при калибровке с применением 99,5% филлирина и 99,1% филлигенина в качестве мономера содержание каждого из мономеров в композиции филлирина/филлигенина составило 98%; при этом массовое отношение филлирина к филлигенину в композиции филлирина/филлигенина А составило 98:2; композиция филлирина/филлигенина В, которая является белым порошком, производится Dalian Fusheng Natural Drug Development Co. Ltd., образована двумя мономерами филлирина и филлигенина; при этом массовое отношение филлирина к филлигенину в композиции филлирина/филлигенина В составило 80:20.

4) Рибавирин для инъекций: бесцветная прозрачная жидкость, произведенная Henan Runhong Pharmaceutical Co., Ltd., серия №1206261; регистрационное удостоверение №H19993553; 100 мг/мл, использован в качестве лекарственного средства для положительного контроля в этом анализе;

5) Осельтамивир фосфат, поставляемый Национальным институтом контроля фармацевтических и биологических продуктов; серия №101096-200901; 100 мг/дозу, использован в качестве лекарственного средства для положительного контроля в этом анализе.

Вышеупомянутые лекарства растворяли в очищенной воде, фильтровали, стерилизовали, разливали и хранили при 4°С до применения; все лекарства подлежали анализу в настоящем тесте.

(2) Клеточный штамм.

Штамм клеток Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) предоставлен Колледжем основных медицинских наук Цзилиньского университета.

(3) Вирусные штаммы

1) Вирус гриппа, вирус парагриппа и респираторно-синцитиальный вирус (RSV) получены из Института вирусологии Китайской академии профилактической медицины;

2) Вирус Коксаки В3 (CVB3) получен из США и хранился в нашем научно-исследовательском отделе;

3) Вирус Коксаки А16 (СохА16) и энтеровирус ЕV71 получены из Сендайского национального госпиталя из Японии и хранился в научно-исследовательском отделе автора настоящей заявки;

4) Аденовирус (AdV) был предоставлен Педиатрическим исследовательским отделом Первого госпиталя Медицинского университета Нормана Бетьюна;

5) Вирус простого герпеса I типа (HSV-1) был получен из Национального института контроля фармацевтических и биологических продуктов Министерства здравоохранения.

(4) Основные приборы и реагенты

Кабинет биологической безопасности BHC-1300 II A/B3, AIRTECH

CO₂ инкубатор MCO-18AIC, SANYO

Инвертированный микроскоп CKX41, OLYMPUS

Электронные аналитические весы AR1140/C, DHAUS

Среда для культивирования DMEM, HyClone

Эмбриональная телячья сыворотка HyClone

Трипсин Gibco

МТТ Sigma

ДМСО был получен от Tianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd.

1,2. Методы анализа

(1) Приготовление клеток

Клетки Vero культивировали в субкультуре в течение 1-2 суток до формирования слоя и проявления выраженных границ и явной трехмерной ориентации и диоптрии, затем клетки расщепляли панкреатическим ферментом; после появления игольчатых отверстий на клеточной поверхности расщепляющую среду полностью удаляли, затем клетки диспергировали в нескольких миллилитрах культуральной среды, подсчитывали, затем разбавляли примерно до 5×10⁷ клеток/литр с культуральной средой (DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки), и переносили на 96-луночный планшет для культивирования до образования монослоя.

(2) Анализ токсичности лекарства

Анализ цитотоксичности: лекарства разбавляли в соответствии концентрациями, указанными в таблице 1-1 для анализа цитотоксичности.

Таблица 1-1. Справочная таблица по разведениям лекарств (единица: г/л)

Лекарство Градиент концентрации Градиент 1 Градиент 2 Градиент 3 Градиент 4 Градиент 5 Градиент 6 Градиент 7 Градиент 8 Филлирин 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0,015625 0,078125 Филлигенин 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0,015625 0,078125 Композиция А филлирина/ филлигенина 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0,015625 0,078125 Композиция В филлирина/ филлигенина 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0,015625 0,078125 Рибавирин 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 0,15625 0,078125 0,039063 Осельтамивир фосфат 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0,015625

Вышеуказанные лекарства, разбавленные поддерживающей средой (DMEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки) до различных концентраций, добавляли по каплям к монослою клеток Vero с 0,2 мл на лунку, и для каждой концентрации лекарства добавляли в шести повторностях в 6 лунок, соответственно. Кроме того, 6 лунок использовали для нормального контроля (без лекарств), а другие 6 лунок использовали в качестве пустого контроля (только среда). Клетки выращивали при 37°С в инкубаторе при 5% CO₂. ЦПЭ визуализировали под инвертированным микроскопом и регистрировали ежедневно. Спустя 72 часа добавляли 20 мкл МТТ раствора (5 мг/мл) в каждую лунку, и инкубировали в течение 4 часов. Культуральную среду в каждой лунке удаляли аспирацией, добавляли 100 мкл ДМСО в каждую лунку. Культуру встряхивали в течение 5 минут, и измеряли значение ОП при 492 нм для подсчета доли выживших клеток. Долю выживших клеток анализировали с применением пробит-регрессионной модели с применением статистического программного обеспечения SPSS 18,0, и определяли максимальную нетоксичную концентрацию (TC₀) и медианную токсичную концентрацию (TC₅₀) лекарств против клеток Vero.

(3) Определение TCID50 для различных вирусов

Проводили 10-кратные серийные разведения для каждого вируса для получения разведений 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5 и 10^-6, и инокулировали в 96-луночный планшет для культивирования с монослоем клеток Vero, по 6 лунок на каждое разведение, при этом используя группу нормального контроля клеток. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°C в 5% CO₂, затем удаляли раствор вируса, и добавляли 100 мкл среды для культивирования клеток в каждую лунку для последующей инкубации при 37°C в 5% CO₂. Цитопатический эффект оценивали под микроскопом от 3 суток, и результаты определяли и регистрировали на 7-8-е сутки, определяя максимальное разведение, в котором отмечался цитопатический эффект в 50% лунок с клетками; титр вирусов подсчитывали методом Карбера.

Уравнение: LogTCID₅₀=XM+d-d

TCID₅₀: доза 50% инфицирования гистиоцитов

ХМ: логарифм наибольшей концентрации разбавления вируса

d: логарифм коэффициента разведения (кратное число)

Σpi: сумма процента цитотоксического эффекта для каждого разведения

(4) Влияние лекарств на вирус-индуцированную цитотоксичность

Культуральную среду в планшетах, покрывающую монослой клеток, удаляли аспирацией, клетки инокулировали агрессивными вирусами в дозе 100TCID₅₀ с последующей инкубацией при 37°C в инкубаторе при 5% CO₂ в течение 2 часов, а затем добавляли определенную концентрацию (максимальную нетоксичную концентрацию или около того), и использовали 6 лунок для культуры каждой концентрации, по 200 мкл на лунку. Рибавирин для инъекций и осельтамивир фосфат служили в качестве групп положительного контроля, в то время как нормальную контрольную группу (без вируса и без лекарства) и группу контроля вирусов (с добавлением вируса, но без лекарства) использовали для оценки эффекта лекарств в отношении вирус-индуцированного цитопатического эффекта (ЦПЭ). Спустя 72 часа определяли значение ОП при длине волны 492 нм с применением МТТ-колориметрического метода, и рассчитывали уровень антивирусного эффекта (ER%) лекарства. Использовали дисперсионный анализ (ANOVA) со статистическим программным обеспечением SPSS 18,0 для определения достоверной разницы антивирусной эффективности лекарств из различных групп.

ER%=(среднее значение ОП в группе с применением лекарств - среднее значение ОП в контрольной группе с вирусом)/(среднее значение ОП в группе контроля клеток - среднее значение ОП в контрольной группе с вирусом)×100%

1,3. Результаты анализа

(1) TCID₅₀ для каждого вируса

Вирус парагриппа: LogTCID₅₀=-2+0,5-

Вирус гриппа: LogTCID₅₀=-2+0,5-

CVB₃: LogTCID₅₀=-2+0,5-

HSV-1: LogTCID₅₀=-2+0,5-

AdV: LogTCID₅₀=-2+0,5-

RSV: LogTCID₅₀=-2+0,5-

CoxA16: LogTCID₅₀=-2+0,5-

EV71: LogTCID₅₀=-2+0,5-

(2) Определение токсичности лекарств

1) Определение цитотоксичности лекарств

Максимальная не-цитотоксичная концентрация (TC₀), медианная токсичная концентрация (TC₅₀) каждого лекарства против клеток Vero, и концентрации лекарств, используемых в антивирусном анализе, показаны в таблице 1-2.

Таблица 1-2. Результаты анализа цитотоксичности лекарств (единица: г/л)

Вирус Лекарства Филлирин Филлигенин Композиция А филлирина/ филлигенина Композиция В филлирина/ филлигенина Рибавирин Осельтамивира фосфат Максимальная нетоксичная концентрация 0,0066 0,011 0,010 0,0066 0,065 0,28 Медианная токсическая концентрация 0,55 0,297 0,60 0,55 1,392 0,832 0,30 0,01 0,02 0,01 0,01 0,70 0,30

2) Результаты анализа защитного влияния лекарств на вирус-индуцированную цитотоксичность

Результаты анализа антивирусной эффективности лекарств и одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) показаны в таблице 1-3.

Таблица 1-3. Статистические данные антивирусной эффективности лекарств (ЕR%)

Вирус Лекарства Филлирин Филлигенин Композиция А филлирина/ филлигенина Композиция В филлирина/ филлигенина Рибавирин Осельтамивира фосфат Вирус гриппа 75,38 ** 75,35** 100,00 ***^{##▲▲ΔΔ ●} 97,60 ***^{##▲▲ Δ Δ ●} 57,49 ** 81,76** Вирус парагриппа 84,96 ** 80,72** 100,00 ***^#▲ 99,51 ***^#▲ 91,56 ** 94,52** CoxA16 75,08 ** 50,04 98,20 ***^{##▲▲ΔΔ
Δ ●●●} 97,63 ***^{##▲▲ΔΔΔ ●●●} 0,70 2,95 RSV 80,40** 80,88** 96,22
***^{#▲ΔΔ ●●●} 95,88
***^{#▲ΔΔ ●●●} 50,08* 37,60 HSV-I 85,00** 84,30** 100,00 ***^{#▲ ΔΔ ●●} 99,24,00 ***^{#▲ ΔΔ ●●} 62,92 ** 66,56 ** ADV 75,14** 50,61 100,00 ***^{##▲▲ΔΔ Δ●●●} 96,10 ***^{##▲▲ΔΔΔ ●●●} 0,43 10,31 EV71 84,85** 75,86** 100,00 ***^{#▲▲ΔΔΔ ●●●} 98,01 ***^{#▲▲ΔΔΔ ●●●} 4,25 51,86 CVB₃ 75,27** 50,89 92,67 **^{##▲▲ΔΔΔ ●●●} 90,49
**^{##▲▲ΔΔΔ ●●●} 13,44 1,64

Примечание: по сравнению с группой вирусного контроля: ^*P<0,05, ^**P<0,01; сравнение композиции филлирина/филлигенина с филлирином: ^#P<0,05, ^##P<0,01; сравнение композиции филлирина/филлигенина с филлигенином: ^▲P<0,05, ^▲▲P<0,01; сравнение композиции филлирина/филлигенина с рибавирином: ^ΔP<0,05, ^ΔΔP<0,01, ^ΔΔΔP<0,001; сравнение композиции филлирина/филлигенина с осельтамивира фосфатом: ^●P<0,05, ^●●P<0,01, ^●●●P<0,001.

Как видно из результатов в таблице 1-3, композиция филлирина/филлигенина оказывала достоверное ингибирующее влияние (P<0,01 или P<0,001) на все 8 вирусов, с уровнем эффективности 100% в отношении вируса гриппа, вируса парагриппа, вируса простого герпеса I типа (HSV-I), энтеровируса EV71 и аденовируса (ADV), и обладала существенно лучшим терапевтическим эффектом, чем филлирин и филлигенин. Это показывает, что композиция филлирина/филлигенина обладает синергетическим эффектом. Далее, композиция филлирина/филлигенина обладала значительно лучшим терапевтическим эффектом в отношении ингибирования вируса гриппа, вируса Коксаки А16 (CoxA16), респираторно-синцитиального вируса (RSV), вируса простого герпеса I типа (HSV-I), аденовируса (ADV), энтеровируса EV71 и вируса Коксаки B₃ (CVB₃), чем лекарство положительного контроля рибавирин (P< 0,01 или P< 0,001), и обладала значительно лучшим терапевтическим эффектом в отношении ингибирования вируса гриппа, вируса Коксаки А16 (CoxA16), респираторно-синцитиального вируса (RSV), вируса простого герпеса I типа (HSV-I), аденовируса (ADV), энтеровируса EV71 и вируса Коксаки B₃ (CVB₃), чем осельтамивира фосфат (P<0,05, или P<0,01, P<0,001).

2. Анализ противовирусной активности in vivo

2.1. Материалы для анализа

(1) Экспериментальные животные

Куньминские мыши, лабораторные животные №10-5219 были получены из Центра лабораторных животных Исследовательского центра здравоохранения Нормана Бетьюна Цзилиньского университета.

(2) Приборы для детекции и реагенты

Наименование прибора Модель Производитель Прибор для количественной ПЦР 7300 ABI Прибор для ПЦР ES-60J Shenyang Longteng Co., Ltd. Электронные аналитические весы FA1004 Shenyang Longteng Co., Ltd. CO₂ инкубатор HG303-5 Нанкинский завод экспериментальных приборов Ламинарно-потоковый бокс SW-CJ-IF Suzhou Antai Technology Co., Ltd. Инвертированный микроскоп CKX41 Olympus Instrument Ультра-низкотемпературный морозильник -80°С TECON-5082 Австралия Водяная баня с осциллятором HZS-H Harbin Donglian Co., Ltd. Ридер микропланшетов TECAN A-5082 Австралия Спектрофотометр Модель 7550 Япония

2.2. Экспериментальные методы

(1) Определение медианной летальной дозы у мышей при инфицировании вирусом гриппа и вирусом парагриппа

Вирус гриппа и вирус парагриппа (клеточный лизат) разбавляли с 10-кратным снижением с получением вирусных жидкостей с концентрациями 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 и 10^-5. Брали 120 куньминских мышей, 60 из них распределили в группу с вирусом гриппа, остальных 60 - в группу вируса парагриппа, 60 мышей произвольно распределяли на 6 групп; мышей подвергали легкой анестезии эфиром, и инфицировали назально вирусными жидкостями, содержащими различные разведения, по 0,03 мл на мышь. При этом устанавливали холостую пробу, и вирусную жидкость заменяли солевым раствором. В качестве индексов наблюдения использовали гибель и выживание, и наблюдение проводили каждый день до 14 дня после инфицирования. Мышей, погибших в пределах 24 часов после инфицирования, считали погибшими от неспецифических причин, и не учитывали, а значение LD50 для вирусной жидкости рассчитывали с применением метода Карбера. Формула расчета: LogLD₅₀=XM+d-d [где: LD₅₀ - медианная летальная доза; XM - логарифм наивысшей концентрации разведения вируса; d - логарифм коэффициента разведения (множитель); Σpi -сумма процента цитопатического эффекта для каждого разведения].

(2) Исследование противовирусной активности композиции филлирина/филлигенина при пневмонии, индуцированной вирусом гриппа и вирусом парагриппа

1) Лабораторные животные и разделение на группы

540 куньминских мышей в возрасте 4 недели было взято для выполнения двух анализов. Получали 270 мышей и произвольно распределяли на 27 групп (по 10 в каждой группе) для определения легочного индекса у мышей, инфицированных вирусом гриппа и парагриппа, и уровня ингибирования легочного индекса после применения композиции филлирина/филлигенина; эксперимент повторяли 3 раза, по 90 мышей каждый раз. Кроме того, 270 мышей получали и произвольно распределяли на 27 группу (по 10 в каждой группе) для определения титра гемагглютинации вируса в легочной суспензии при применении композиции филлирина и филлигенина; тест повторяли 3 раза, по 90 мышей каждый раз.

2) Способ инфицирования

Кусок адсорбирующей ваты помещали в 200-300 мл стакан, и наливали на него подходящее количество диэтилового эфира (до увлажнения адсорбирующей ваты); стакан с адсорбирующей ватой переворачивали вверх дном, и помещали в него мышь для анестезии. После проявления у мышей крайнего возбуждения и явной слабости, их помещали на спину и инфицировали назально с 15 LD50 вируса гриппа и вируса парагриппа по 0,03 мл на ноздрю; а в группе нормального контроля суспензию вирусов заменяли физиологическим солевым раствором.

3) Способ применения и применяемые дозы

Группу композиции А филлирина/филлигенина, группу композиции В филлирина/филлигенина, группу филлигенина, группу филлирина, контрольную группу рибавирина и контрольную группу осельтамивира фосфата брали по отдельности для обычного внутрижелудочного применения за одни сутки до инфицирования; группы композиций А и В филлирина/филлигенина были группами с высокой, средней и низкой дозой, соответственно, а применяемые дозы составили 13,0; 6,5 и 3,25 мг/кг, соответственно; применяемая доза в группе филлирина составила 13 мг/кг, применяемая доза в группе филлигенина составила 13 мг/кг, применяемая доза в группе лекарства положительного контроля рибавирина составила 58,5 мг/кг, применяемая доза в группе лекарства положительного контроля осельтамивира фосфата составила 19,5 мг/кг; применение осуществляли один раз в сутки в течение 5 последовательных дней, а у мышей в группе нормального контроля и группе вирусного контроля применяли физиологический солевой раствор того же самого объема.

4) Индекс наблюдения

1) Определение легочного индекса

На пятые сутки после применения лекарств у мышей предотвращали доступ к питьевой воде, и спустя 8 часов мышей взвешивали, а затем умерщвляли путем обескровливания при энуклеации глаз. Затем извлекали легкие после вскрытия грудины, дважды промывали физиологическим солевым раствором, затем удаляли влагу с поверхности фильтровальной бумагой и взвешивали с применением электронных весов. Легочный индекс и уровень ингибирования легочного индекса рассчитывали с помощью следующих уравнений:

Легочный индекс = Масса легкого мыши/Масса тела мыши × 100%

Уровень ингибирования легочного индекса = (Средний легочный индекс в группе модельной инфекции - Средний в экспериментальной группе)/Средний легочный индекс в группе модельной инфекции × 100%.

(2) Определение титра гемагглютинации вируса в легочной суспензии

Легкие мышей различных групп извлекали на 5 сутки после лечения, и измельчали в гомогенизаторе при низкой температуре; гомогенат разбавляли до 10% суспензии легочной ткани физиологическим солевым раствором; проводили центрифугирование для получения надосадочной жидкости, которую разбавляли в два раза и вносили на планшет для титрования по 0,2 мл на лунку; добавляли 0,2 мл 1% суспензии куриных эритроцитов в каждую лунку; планшет для титрования оставляли при комнатной температуре на 30 минут для наблюдения и регистрации титров гемагглютинации. Конечной точкой была гемагглютинация эритроцитов (++), а титр выражали в кратности разведения суспензии.

2.3. Результаты экспериментов и анализ

(1) Результат определения медианной летальной дозы у мышей при инфицировании вирусом гриппа и вирусом парагриппа

Куньминских мышей в опытных группах инфицировали назально 30 мкл вирусов гриппа и вирусов парагриппа в различных концентрациях; на третьи сутки после инфицирования у всех мышей в первых трех группах (10^-1 группе, 10^-2 группе и 10^-3 группе, на основе концентраций вирусов) проявились различные симптомы разной степени: пиломоторный рефлекс, дрожь, снижение аппетита и тому подобное; на пятые сутки отмечалось нарушение движения; на шестые сутки мыши в группе с наивысшей концентрацией вируса начали умирать; гибель отмечалась в остальных группах на седьмые сутки после инфицирования. После завершения наблюдения на 14 сутки подсчитывали смертность мышей в каждой группе, и результаты показаны в таблице 1-4 и таблице 1-5 ниже. При подсчете LD₅₀ вируса гриппа составило разведение 10^-2,9, а LD₅₀ вируса парагриппа составило разведение 10^-2,5.

Таблица 1-4. Результаты анализа медианной летальной дозы вируса гриппа

Группа вируса гриппа Совокупная смертность Совокупное выживание Совокупный уровень смертности Группа 10^-1 9 1 90% Группа 10^-2 7 3 70% Группа 10^-3 4 6 40% Группа 10^-4 3 7 30% Группа 10^-5 1 9 10% Группа холостого контроля 0 10 0%

Значения LD₅₀ вирусов рассчитывали с помощью метода Карбера. Значение LogLD₅₀ вируса гриппа было следующим:

LogLD₅₀=XM+d-d=-1+0,5-(80%+60%+40%+20%+0%+0%)=-2,9

Таблица 1-5. Результаты анализа медианной летальной дозы вируса парагриппа

Группа вируса парагриппа Совокупная смертность Совокупное выживание Совокупный уровень смертности Группа 10^-1 8 2 80% Группа 10^-2 6 4 60% Группа 10^-3 4 6 40% Группа 10^-4 2 8 20% Группа 10^-5 0 10 0% Группа холостого контроля 0 10 0%

Значения LD₅₀ вирусов рассчитывали с помощью метода Карбера. Значение LogLD₅₀ вируса парагриппа было следующим:

LogLD₅₀=XM+d-d=-1+0,5-(90%+70%+40%+30%+10%+0%)=-2,5

(2) Результаты анализа влияния композиции филлирина/филлигенина на устойчивость к пневмонии, вызванной вирусом гриппа и вирусом парагриппа

1) Определение легочного индекса

После инфицирования мышей вирусом гриппа и вирусом парагриппа средний легочный индекс показал, что по сравнению с группой модели инфекции, легочные индексы в группе нормального контроля, группе филлирина (13,0 мг/кг/сутки), группе филлигенина (16,0 мг/кг/сутки), группах с тремя дозами композиций А и В филлирина/филлигенина (группе низкой дозы 3,25 мг/кг/кг, группе средней дозы 6,25 мг/кг/сутки, группе высокой дозы 13,0 мг/кг/сутки), группе рибавирина и группе осельтамивира фосфата существенно снижались (P< 0,05 или P< 0,01); где композиция филлирина/филлигенина оказывала достоверное защитное влияние в диапазоне концентраций 3,25-13,0 мг/кг/сутки, существенно снижала все легочные индексы, и оказывала существенно лучший терапевтический эффект в отношении уровня ингибирования индекса поражения легочной ткани, чем в группе филлирина и группе филлигенина (P< 0,01 или P< 0,05). См. результаты в таблицах 1-6 и 1-7.

Таблица 1-6. Уровень ингибирования композицией филлирина/филлигенина легочного индекса у мышей, инфицированных вирусом гриппа (n=3)

Группа Доза лекарства (мг/кг/ сутки) Легочный индекс
(±S) Уровень ингибиро-вания легочного индекса (%) Значение Р
Значение Р Группа нормального контроля 0 1,274±0,102 —— Группа вирусного контроля 0 1,488±0,084 —— Группа рибавирина 58,5 1,281±0,061 13,90 *<0,05 Группа осельтамивира фосфата 19,5 1,178±0,066 19,84 **<0,01 Группа филлирина 13,0 1,280±0,040 14,00 *<0,05 Группа филлигенина 13,0 1,302±0,046 12,51 *<0,05 Композиция филлирина/ филлигенина А Группа высокой дозы 13,0 1,049±0,056 29,52 **<0,01 ^{## ▲▲} <0,01 Группа средней дозы 6,5 1,129±0,041 24,15 **<0,01 ^{▲ #}<0,05 Группа низкой дозы 3,25 1,184±0,039 20,40 **<0,01 ^{▲ #}<0,05 Композиция филлирина/ филлигенина В Группа высокой дозы 13,0 1,070±0,056 28,10 **<0,01 ^{## ▲▲} <0,01 Группа средней дозы 6,5 1,131±0,041 24,00 **<0,01 ^{▲ #}<0,05 Группа низкой дозы 3,25 1,197±0,039 19,56 **<0,01 ^{▲ #}<0,05

Примечание: по сравнению с группой вирусного контроля: ^*P<0,05, ^**P<0,01; сравнение композиции филлирина/филлигенина с филлирином: ^#P<0,05, ^##P<0,01; сравнение композиции филлирина/филлигенина с филлигенином: ^▲P<0,05, ^▲▲P<0,01.

Таблица 1-7. Уровень ингибирования композицией филлирина/филлигенина легочного индекса у мышей, инфицированных вирусом парагриппа (n=3).

Группа Доза лекарства (мг/кг/ сутки) Легочный индекс
(±S) Уровень ингибиро-вания легочного индекса (%) Значение Р
Значение Р Группа нормального контроля 0 1,305±0,031 —— Группа вирусного контроля 0 1,591±0,062 —— Группа рибавирина 58,5 1,340±0,065 15,76 *<0,05 Группа осельтамивира фосфата 19,5 1,243±0,054 21,85 *<0,01 Группа филлирина 13,0 1,335±0,062 16,10 *<0,01 Группа филлигенина 13,0 1,357±0,050 14,69 *<0,01 Композиция филлирина/ филлигенина А Группа высокой дозы 13,0 1,068±0,058 32,87 *<0,01 ^##▲▲<0,01 Группа средней дозы 6,5 1,143±0,065 28,13 *<0,01 ^#▲▲<0,05 Группа низкой дозы 3,25 1,177±0,044 26,01 *<0,01 ^#▲<0,05 Композиция филлирина/ филлигенина В Группа высокой дозы 13,0 1,101±0,058 30,79 *<0,01 ^##▲▲<0,01 Группа средней дозы 6,5 1,158±0,065 27,22 *<0,01 ^#▲▲<0,05 Группа низкой дозы 3,25 1,188±0,044 25,30 *<0,01 ^#▲<0,05

Примечание: по сравнению с группой вирусного контроля: ^*P<0,05, ^**P<0,01; сравнение композиции филлирина/филлигенина с филлирином: ^#P<0,05, ^##P<0,01; сравнение композиции филлирина/филлигенина с филлигенином: ^▲P<0,05.

2) Определение титра вирусной гемагглютинации легочной суспензии

После инфицирования вирусом гриппа и вирусом парагриппа титры вирусной гемагглютинации (InX) легочной ткани в группе модели инфекции составили 32,40 и 33,11, соответственно; после лечения композициями А и В филлирина/филлигенина в различных концентрациях в течение 5 суток титры вирусной гемагглютинации легочной ткани снижались до некоторой степени, и по сравнению с группой модели инфекции, разница была достоверной (P< 0,01); а в группах с различными дозами композиций А и В филлирина/филлигенина отмечались значительно сниженные титры вирусов гриппа и парагриппа, по сравнению с группой филлирина и группой филлигенина (P<0,05 - P<0,001). Это показывает, что композиция филлирина/филлигенина обладает синергетическим эффектом, и имеет значительно более высокий уровень ингибирования размножения вируса, чем в группе филлирина и группе филлигенина (P<0,05 - P<0,001); при этом в группах с высокой, средней и низкой дозой композиций А и В филлирина/филлигенина отмечался значительно более высокий уровень ингибирования титра гемагглютинации в легочной суспензии мышей, инфицированных вирусом гриппа, чем в группе филлирина и группе филлигенина (P<0,01 - P<0,001). Подробности результатов вышеуказанного анализа показаны в таблицах 1-8 и 1-9.

Таблица 1-8. Влияние композиции филлирина/филлигенина на титры гемагглютинации в легочной суспензии мышей, инфицированных вирусом гриппа (n=3)

Группы Доза лекарства (мг/кг/сутки) Титр гемагглюти-нации
(InX) Уровень ингиби-рования (%) Значе-ние Р Значе-ние Р Группа нормального
контроля 0 0 Группа вирусного
контроля 0 32,40±1,105 Группа рибавирина 58,5 21,91±1,050 32,39 *<0,01 Группа осельтамивира
фосфата 19,5 20,50±1,123 36,73 *<0,01 Группа филлирина 13,0 22,06±1,120 31,90 *<0,01 Группа филлигенина 13,0 22,61±1,059 30,22 *<0,01 Композиция А филлирина/ филлигенина Группа высокой дозы 13,0 17,70±0,618 45,36 *<0,01 ^###▲▲▲ <0,001 Группа средней дозы 6,5 19,21±0,450 40,72 *<0,01 ^##▲▲ <0,01 Группа низкой дозы 3,25 20,71±1,439 36,08 *<0,01 ^#▲ <0,05 Композиция В филлирина/ филлигенина Группа высокой дозы 13,0 17,70±0,618 45,36 *<0,01 ^###▲▲▲ <0,001 Группа средней дозы 6,5 19,21±0,450 40,72 *<0,01 ^##▲▲ <0,01 Группа низкой дозы 3,25 20,71±1,439 36,08 *<0,01 ^#▲ <0,05

Таблица 1-9. Влияние композиции филлирина/филлигенина на титры гемагглютинации в легочной суспензии мышей, инфицированных вирусом парагриппа (n=3)

Группы Доза лекарства (мг/кг/сутки) Титр гемагглюти-нации
(InX) Уровень ингиби-рования (%) Значе-ние Р Значе-ние Р Группа нормального
Контроля 0 0 Группа вирусного
Контроля 0 33,11±1,210 Группа рибавирина 58,5 23,22±1,091 29,86 * <0,05 Группа осельтамивира
фосфата 19,5 22,05±1,055 33,40 * <0,01 ^# <0,05 Группа филлирина 13,0 23,17±1,059 30,01 * <0,01 ^# <0,05 Группа филлигенина 13,0 23,79±1,072 28,15 * <0,01 ^# >0,05 Композиция А филлирина/ филлигенина Группа высокой дозы 13,0 17,38±0,955 47,50 * <0,01 ^{### ▲▲▲} <0,001 Группа средней дозы 6,5 19,04±0,501 42,49 * <0,01 ^{## ▲▲▲} <0,01 Группа низкой дозы 3,25 20,36±0,824 38,52 * <0,01 ^{## ▲▲} <0,01 Композиция В филлирина/ филлигенина Группа высокой дозы 13,0 17,97±0,955 45,73 * <0,01 ^{### ▲▲▲} <0,001 Группа средней дозы 6,5 19,69±0,501 40,52 * <0,01 ^{## ▲▲▲} <0,01 Группа низкой дозы 3,25 20,81±0,824 37,15 * <0,01 ^{## ▲▲} <0,01

В таблицах 1-8 и 1-9, где каждую опытную группу сравнивали с группой вирусного контроля, ^*P<0,05, ^**P<0,01; где группу композиции филлирина/филлигенина сравнивали с филлирином, ^#P<0,05, ^##P<0,01, ^###P<0,001; где группу композиции филлирина/филлигенина сравнивали с филлигенином, ^▲P<0,05, ^▲▲P<0,01, ^▲▲▲P<0,001.

Опытный пример 2. Анализ жаропонижающего и противовоспалительного эффекта композиции филлирина и филлигенина

1.1. Материалы для анализа

(1) Экспериментальные животные

Крысы Вистар, масса тела 120-250 г, самцы и самки, сертификат лабораторных животных №10-5219; японские белые кролики, самцы, масса тела 1,5-2,0 кг, сертификат лабораторных животных №10-5115. И крысы, и кролики обеспечены Changchun Gaoxin центром лабораторных животных, корм для животных получен из Отдела лабораторных животных Цзилиньского университета.

(2) Тестируемые лекарственные средства

(1) Лекарственные средства

1) Филлирин, белый порошок, произведенный Dalian Fusheng Natural Drug Development Co. Ltd., чистота составила 99,5% при определении посредством ВЭЖХ системы, оснащенной УФ детектором и испарительным детектором светорассеяния (ELSD), с применением способа нормирования площадей пиков; содержание было калибровано и подтверждено как 99,5% с эталоном филлирина, поставляемым China Pharmaceutical and Biological Products для определения содержания.

2) Филлигенин, белый порошок, произведенный Dalian Fusheng Natural Drug Development Co. Ltd., чистота составила 99,1% при определении посредством ВЭЖХ системы, оснащенной УФ детектором и испарительным детектором светорассеяния (ELSD), с применением способа нормирования площадей пиков;

3) Композиция филлирина/филлигенина А, которая является белым порошком, производится Dalian Fusheng Natural Drug Development Co. Ltd., образована двумя мономерами филлирина и филлигенина; при калибровке с применением 99,5% филлирина и 99,1% филлигенина в качестве мономера содержание каждого из мономеров в композиции филлирина/филлигенина составило 98%; при этом массовое отношение филлирина к филлигенину в композиции филлирина/филлигенина А составило 98:2; композиция филлирина/филлигенина В, которая является белым порошком, производится Dalian Fusheng Natural Drug Development Co. Ltd., образована двумя мономерами филлирина и филлигенина; при этом массовое отношение филлирина к филлигенину в композиции филлирина/филлигенина В составило 80:20.

1.2. Основные приборы и реагенты

Прибор для измерения отека лап крысы YLS-7A; Отдел оборудования Шаньдунской академии медицинской службы;

Спектрофотометр 722: произведен Shanghai Spectrum Instruments Co., Ltd.;

Портативный цифровой термодетектор, модель WSC-411P, 3-й завод Pudong, Шанхай;

Пилокарпин: Тяньцзиньская фармацевтическая фабрика, серия №20130112;

Гистамин: Шанхайский институт биохимии и клеточной биологии, SIBS, CAS, серия №20130115;

5-гидрокситриптамин: Шанхайский институт биохимии и клеточной биологии, SIBS, CAS, серия №20130623;

Краситель синий Эванса: Шанхайское отделение заготовки и поставки химических реагентов, серия №20130217;

Хлорфенирамина малеата таблетки: Changchun Economic Development Zone Pharmaceutical Co., серия № 20130801;

Каррагенин: Цзилиньский институт исследования лекарств, серия №20130502;

Парацетамола таблетки: Liaoyuan Baikang Pharmaceutical Co., Ltd., серия №20130512;

Аспирина таблетки: Baicheng Wanda Pharmaceutical Co., Ltd., серия №20130305;

Saccharomyces cerevisiae: Beijing AOBOX Biotechnology Co., Ltd., серия №2013020;

Тифозная и паратифозная вакцина: Чанчуньский институт биологических продуктов, серия №20130216.

1.3. Статистический анализ

При статистическом анализе применяли анализ суммы рангов, X² тест и t-тест с двухсторонним критерием.

2.1. Анализ влияния композиции филлирина/филлигенина на секрецию пота лапой крысы (метод окрашивания)

(1) Материалы и методы

Этот тест разработан для наблюдения изменения секреции пота на основе того, что распределение потовых желез на подушечках лап крысы, количество секретируемого пота и его изменение можно наблюдать благодаря развитию розовой окраски при контакте йода и крахмала с потом.

Для этого анализа отбирали 500 крыс Вистар с равным количеством самцов и самок с массой тела 120-150 г. Этих крыс произвольно распределяли на 50 групп по массе и полу, в частности, 5 групп для контрольной группы (0,5% карбоксиметилцеллюлозы), 5 групп для группы филлирина, 5 групп для филлигенина, 5 групп для низкой, средней и высокой дозы (2,5; 5 и 10 мг/кг, соответственно) композиций А и В филлирина/филлигенина, соответственно, и 5 групп для лекарства положительного контроля пилокарпина (35 мг/кг). В каждой группе было 10 крыс, по 10 крыс на каждый анализ, каждый имел 5 периодов времени (1, 5, 10, 15 и 20 мин). Крыс помещали в самодельную клетку для фиксации, с двумя отверстиями для нижних конечностей. Грязь на правой лапе осторожно вытирали ватным тампоном, смоченным безводным этанолом. Применяли подкожную инъекцию для раствора пилокарпина, использовали внутрижелудочное введение для всех других групп. Спустя один час после применения (30 минут после применения в группе пилокарпина) исходный пот на подушечке правой лапы в каждой группе, и пот, выделившийся при борьбе, вначале вытирали сухим ватным тампоном, и наносили на лапу реагент Hetian-Gao Yuan's А (2 г йода, растворенного в 100 мл безводного спирта). После полного высушивания, наносили тонкий слой реагента Hetian-Gao Yuan's В (однородной смеси 50 г растворимого крахмала и 100 мл касторового масла). Спустя 1, 5, 10, 15 и 20 минут после нанесение реагента В, соответственно, использовали увеличительное стекло для тщательного анализа окраски и числа темно-розовых пятен (т.е. точек выделения пота). При завершении теста проводили статистический анализ в соответствии с двухсторонним анализом суммы рангов, для определения разницы между группами.

(2) Результаты

По сравнению с контрольной группой, в группах средней и высокой дозы (5, 10 мг/кг) композиции филлирина/филлигенина отмечалось явное стимулирующее влияние на секрецию пота лапой крысы спустя 10, 15 и 20 минут после нанесения реагента В (P<0,05), а в группе 2,5 мг/кг композиции филлирина/филлигенина отмечалось достоверное стимулирующее влияние на секрецию пота лапой крысы спустя 15 и 20 минут после нанесения раствора В (P<0,05). Их потогонные функции были примерно эквивалентными эффекту лекарства положительного контроля пилокарпина, и эти группы имеют характеристики медленной стимуляции секреции пота лапами крысы. В группе высокой дозы композиции филлирина/филлигенина отмечен значительно лучший стимулирующий эффект в отношении секреции пота лапами крысы спустя 10, 15 и 20 минут после нанесения раствора В, чем у филлирина и филлигенина (p<0,05). В группе средней дозы композиции филлирина/филлигенина отмечен значительно лучший стимулирующий эффект в отношении секреции пота лапами крысы спустя 10 и 15 минут после нанесения раствора В, чем у филлирина и филлигенина (p<0,05). В группе низкой дозы композиции филлирина/филлигенина отмечен значительно лучший стимулирующий эффект в отношении секреции пота лапами крысы спустя 15 минут после нанесения раствора В, чем у филлирина и филлигенина (p<0,05). Вышеуказанные результаты демонстрируют, что композиция филлирина/филлигенина оказывает достоверно лучшее влияние на стимуляцию секреции пота лапами крыс, чем филлирин и филлигенин. См. подробности в таблицах 2-1, 2-2, 2-3, 2-4 и 2-5.

Таблица 2-1. Влияние композиции филлирина/филлигенина на секрецию пота лапой крыс в норме (метод окрашивания)

Группы Число животных Число животных с пятнами пота каждого уровня спустя 1 минуту после нанесения раствора В (крысы) Значение Р - + ++ +++ ++++ Контрольная группа 10 2 2 3 2 1 Филлирин 10 0 2 2 2 4 >0,05 Филлигенин 10 0 1 3 3 3 >0,05 Пилокарпин
35,0 мг/кг 10 0 1 3 1 5 >0,05 Композиция А филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 0 2 2 1 5 >0,05 5,0 мг/кг 10 0 2 2 1 5 >0,05 10,0 мг/кг 10 0 2 2 1 5 >0,05 Композиция В филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 0 3 2 0 5 >0,05 5,0 мг/кг 10 0 3 1 1 5 >0,05 10,0 мг/кг 10 0 3 1 1 5 >0,05

Таблица 2-2. Влияние композиции филлирина/филлигенина на секрецию пота лапой крыс в норме (метод окрашивания)

Группы Число животных Число животных с пятнами пота каждого уровня спустя 5 минут после нанесения раствора В (крысы) Значение Р - + ++ +++ ++++ Контрольная группа 10 0 4 1 4 1 Филлирин 10 0 1 2 2 5 >0,05 Филлигенин 10 0 1 3 2 4 >0,05 Пилокарпин
35,0 мг/кг 10 0 1 2 1 6 <0,05* Композиция А филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 0 0 1 4 5 >0,05 5,0 мг/кг 10 0 1 1 3 5 >0,05 10,0 мг/кг 10 0 1 3 2 5 >0,05 Композиция В филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 0 2 2 1 5 >0,05 5,0 мг/кг 10 0 1 2 2 5 >0,05 10,0 мг/кг 10 0 1 3 1 5 >0,05

Таблица 2-3. Влияние композиции филлирина/филлигенина на секрецию пота лапой крыс в норме (метод окрашивания)

Группы Число животных Число животных с пятнами пота каждого уровня спустя 10 минут после нанесения раствора В (крысы) Значение Р - + ++ +++ ++++ Контрольная группа 10 0 3 2 4 1 Филлирин 10 0 1 1 3 5 >0,05 Филлигенин 10 0 1 3 1 5 >0,05 Пилокарпин
35,0 мг/кг 10 0 0 2 1 6 <0,05* Композиция А филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 0 0 1 4 5 >0,05 5,0 мг/кг 10 0 2 1 1 6 <0,05*^#▲ 10,0 мг/кг 10 0 1 2 4 6 <0,05*^#▲ Композиция В филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 0 0 2 3 5 >0,05 5,0 мг/кг 10 0 3 0 1 6 <0,05*^#▲ 10,0 мг/кг 10 0 1 1 1 6 <0,05*^#▲

Таблица 2-4. Влияние композиции филлирина/филлигенина на секрецию пота лапой крыс в норме (метод окрашивания)

Группы Число животных Число животных с пятнами пота каждого уровня спустя 15 минут после нанесения раствора В (крысы) Значение Р - + ++ +++ ++++ Контрольная группа 10 0 3 2 4 1 Филлирин 10 0 1 2 4 5 <0,05* Филлигенин 10 0 1 1 3 5 >0,05 Пилокарпин
35,0 мг/кг 10 0 0 2 1 6 <0,05* Композиция А филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 0 2 1 1 6 <0,05*^▲ 5,0 мг/кг 10 0 1 2 1 6 <0,05*^▲ 10,0 мг/кг 10 0 0 3 1 6 <0,05*^#▲ Композиция В филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 0 3 0 1 6 <0,05*^▲ 5,0 мг/кг 10 0 2 1 1 6 <0,05*^▲ 10,0 мг/кг 10 0 1 2 1 6 <0,05*^#▲

Таблица 2-5. Влияние композиции филлирина/филлигенина на секрецию пота лапой крыс в норме (метод окрашивания)

Группы Число животных Число животных с пятнами пота каждого уровня спустя 20 минут после нанесения раствора В (крысы) Значение Р - + ++ +++ ++++ Контрольная группа 10 0 3 2 4 1 Филлирин 10 0 0 4 0 6 <0,05* Филлигенин 10 0 0 1 4 5 <0,05* Пилокарпин
35,0 мг/кг 10 0 0 2 1 6 <0,05* Композиция А филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 0 1 2 1 6 <0,05* 5,0 мг/кг 10 0 0 3 1 6 <0,05* 10,0 мг/кг 10 0 0 2 2 6 <0,05*^#▲ Композиция В филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 0 2 1 1 6 <0,05* 5,0 мг/кг 10 0 1 2 1 6 <0,05* 10,0 мг/кг 10 0 0 2 2 6 <0,05*^#▲

Стандарт оценки уровня точек секреции пота

«-» - нет точек секреции пота на поверхности подушечки лапы крысы;

«+» - точки секреции пота изредка наблюдаются на поверхности подушечки лапы крысы, при этом площадь выделения пота составляет менее примерно 10% от поверхности лапы;

«++» - точки секреции пота распределены на поверхности подушечки лапы крысы, при этом площадь выделения пота составляет примерно 11-40% поверхности лапы;

«+++» - точки секреции пота распределены на поверхности подушечки лапы крысы, при этом площадь выделения пота составляет примерно 41-70% поверхности лапы;

«++++» - точки секреции пота равномерно распределены на поверхности подушечки лапы крысы, при этом площадь выделения пота составляет более 70% поверхности лапы.

Сравнение каждой опытной группы и группой вирусного контроля, ^*P<0,05; сравнение композиции филлирина/филлигенина и филлирина, ^#P<0,05. Сравнение композиции филлирина/филлигенина и филлигенина, ^▲P<0,05.

2.2. Анализ влияния композиции филлирина/филлигенина на секрецию пота лапой крысы (метод наблюдения морфологии ткани)

(1) Материалы и методы

Этот анализ основан том, что при возбуждении потовой железы крысы в дополнение к повышению секреции пота также меняется морфология эпителиальных клеток потовой железы. Повышение числа и расширение пустых клеток эпителия потовой железы можно наблюдать под оптическим микроскопом. Такая увеличенная вакуоль представляет митохондрии при набухании эпителиальных клеток потовой железы, разрыве, слиянии и увеличении секреторной везикулы под электронным микроскопом. Таким образом, при гистоморфологическом анализе эпителиальных клеток потовой железы лапы крысы можно изучить секреторную активность потовой железы.

В этом анализе отбирали 300 крыс Вистар с равным числом самцов и самок, с массой тела 120-160 г. Этих крыс распределяли на 30 групп по массе и полу, а именно в группу контроля (0,5% карбоксиметилцеллюлозы), группу филлигенина, группу филлирина, группы низкой, средней и высокой дозы (2,5; 5 и 10 мг/кг) композиций А и В филлирина/филлигенина по отдельности, и группу лекарства положительного контроля пилокарпина (35 мг/кг). Использовали по 10 крыс на каждую группу, тест повторяли 3 раза для каждой группы. Раствор пилокарпина применяли путем подкожного введения, в остальных группах осуществляли внутрижелудочное применение. После применения 0,5% метилцеллюлозы в контрольной группе, спустя 30 минут после применения пилокарпина в группе лекарства положительного контроля, и спустя один час после применения филлирина, филлигенина и композиции филлирина/филлигенина, правую нижнюю конечность немедленно отрезали по суставу для немедленного отделения подушечки правой нижней конечности, и помещали в 10% раствор формальдегида. Подушечки лапы фиксировали, подвергали дегидратации, заливали парафином, готовили срезы и окрашивали ГЭ с применением обычных методов. Наблюдали изменение эпителиальных клеток в потовых железах подушечек лапы крысы в каждой группе под оптическим микроскопом, главным образом для наблюдения процента вакуолизации. Разницу между группами определяли с помощью X² теста для статистического анализа. Вышеуказанный тест повторяли 3 раза.

Процент вакуолизации = (число вакуолизованных потовых желез)/(число наблюдаемых потовых желез) ×100%

(2) Результаты

По сравнению с контрольной группой, наблюдалось сильно выраженное стимулирующее влиянием на секрецию пота лапами крысы (p<0,001) в группах с применением 2,5; 5 и 10 мг/кг композиций А и В филлирина/филлигенина. В группах с применением 2,5; 5 и 10 мг/кг композиций А и В филлирина/филлигенина отмечены значительно лучшие терапевтические эффекты, чем для филлирина и филлигенина (p<0,001 или p<0,01). Это свидетельствует, что композиции филлирина/филлигенина обладают синергетическими эффектами. Подробности результатов анализа показаны в таблице 2-6.

Таблица 2-6. Влияние композиции филлирина/филлигенина на секрецию пота лапами крыс (метод гистоморфологического анализа, n=3)

Группы Число животных Число наблюдаемых потовых желез Число вакуолизованных потовых желез Процент вакуолизации (%) Контрольная группа 10 242 14 5,78 Филлирин 10 209 86 22,15^** Филлигенин 10 212 79 20,26^** Пилокарпин (35,0 мг/кг) 10 208 57 27,40^*** Композиция А филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 221 25 30,31 ^***##▲▲ 5,0 мг/кг 10 213 73 34,27 ^{***###▲▲▲} 10,0 мг/кг 10 207 85 41,63 ^{***###▲▲▲} Композиция А филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 10 225 66 29,30 ^***##▲▲ 5,0 мг/кг 10 219 69 31,51 ^{***###▲▲▲} 10,0 мг/кг 10 208 85 40,86 ^{***###▲▲▲}

Сравнение с группой вирусного контроля: ^**p<0,01, ^***p<0,001; сравнение композиции филлирина/филлигенина с филлирином: ^##p<0,01, ^###p<0,001; сравнение композиции филлирина/филлигенина с филлигенином: ^▲▲p<0,01^{, ▲▲▲}p<0,001.

2.3. Влияние композиции филлирина/филлигенина на жар, индуцированный пивными дрожжами (Saccharomyces cerevisiae), у крыс.

(1) Материалы и методы

Отбирали самцов крыс Вистар с массой тела 180-200 г. Нормальную анальную температуру у каждой крысы измеряли дважды (с определенным интервалом) с портативным цифровым термометром WSC-411P, и регистрировали среднее значение по результатам двух измерений в качестве нормальной температуры тела крысы. Затем отбирали 300 крыс с температурой тела от 36,5°С до 38°С для произвольного распределения на 30 групп по массе: модельная группа (0,5% карбоксиметилцеллюлозы), композиции А и В филлирина/филлигенина были разделены на группы низкой, средней и высокой дозы (2,5; 5 и 10 мг/кг), соответственно; группы филлирина (13 мг/кг), группы филлигенина (13 мг/кг), и группы лекарства положительного контроля парацетамола (100 мг/кг). В каждой группе было 10 крыс, и тест повторяли 3 раза для каждой группы. У каждой группы крыс осуществляли подкожную инъекцию в спину 10% свежей суспензии Saccharomyces cerevisiae по 10 мг/кг для индукции жара. Спустя 6 часов после применения 10% суспензии свежих дрожжей Saccharomyces cerevisiae, композицию филлирина/филлигенина и лекарство положительного контроля парацетамол применяли путем внутрижелудочного введения, а в контрольной группе внутрижелудочно вводили равный объем 0,5% карбоксиметилцеллюлозы. Измеряли ректальную температуру спустя 1 час, 2 часа, 3 часа и 4 часа после применения, соответственно. Наблюдали изменения температуры тела, и разницу между группами сравнивали путем t-теста между группами, выражая в проценте жаропонижающего эффекта. Вышеуказанный тест повторяли в целом три раза.

Процент жаропонижающего эффекта = ((Температура тела в определенное время после применения - температура тела спустя 6 часов после индукции жара)/(Температура тела спустя 6 часов после индукции жара)) × 100%

(2) Результаты

Спустя 6 часов после подкожного введения 10% свежей суспензии Saccharomyces cerevisiae у крыс каждой группы температура тела повышалась примерно на 1,5°С, что существенно отличалось от температуры перед индукцией жара (p<0,001). Это указывало, что модель индукции жара пивными дрожжами (Saccharomyces cerevisiae) успешно осуществлена. По сравнению с модельной группой, значительные гипотермические эффекты при жаре у крыс, индуцированном Saccharomyces cerevisiae (p<0,05~p<0,001), наблюдались в группах средней и высокой дозы композиций А и В филлирина/филлигенина спустя 1, 2, 3 и 4 часа после применения, а также в группе с низкой дозой спустя 2, 3 и 4 часа после применения. При этом гипотермические эффекты в группах с различными дозами композиций А и В филлирина/филлигенина были значительно выше эффектов филлирина и филлигенина (p<0,0011 или p<0,01), что указывало, что композиции филлирина/филлигенина обладают явным синергетическим эффектом. См. вышеуказанные результаты анализов в таблице 2-7.

2.4. Влияние композиции филлирина/филлигенина на жар, индуцированный тифозной и паратифозной вакциной у кроликов

(1) Материалы и методы

Использовали японских длинноухих белых кроликов-самцов с массой тела 1,5-2,0 кг. Перед анализом использовали портативный цифровой термометр WSC-411P для измерения нормальной ректальной температуры дважды (с определенным интервалом каждый раз), и среднее значение использовали в качестве нормальной температуры тела. Затем отбирали 198 кроликов с температурой тела 38-39,6°С, и произвольно распределяли в 33 группы по массе; а именно: группа холостого контроля (с введением физиологического солевого раствора), группа модельного контроля (0,5% карбоксиметилцеллюлозы); группы низкой, средней и высокой дозы (1,25; 2,5; 5 мг/кг) композиций А и В филлирина/филлигенина; группы филлирина, группы филлигенина и группы лекарства положительного контроля парацетамола (500 мг/кг). В каждой группе было 6 кроликов, и тест повторяли 3 раза для каждой группы. Кроликов фиксировали посредством фиксатора. В группе холостого контроля вводили внутривенно физиологический солевой раствор 1 мл/кг в краевую вену уха. В группе модельного контроля и группах лекарств вводили внутривенно тифозную и паратифозную вакцину по 0,8 мл/кг в краевую вену уха. Когда температура тела кроликов повышалась на 1°С или больше (для этого требовалось примерно 1-1,5 часов, что было ограничено до 1 часа в этом анализе), в группе холостого контроля и модельной группе применяли внутрижелудочно 0,5% карбоксиметилцеллюлозу 1 мл/кг, а в лекарственных группах вводили внутрижелудочно композиции филлирина/филлигенина и парацетамол, соответственно. Измеряли ректальную температуру спустя 30, 60, 90, 120, 180 и 240 минут после применения для наблюдения изменения температуры тела, и определяли разницу между группами посредством межгруппового t-теста, выражая результаты в процентах жаропонижающего эффекта.

Процент жаропонижающего эффекта = ((Температура тела в определенное время после применения - температура тела спустя 1 час после индукции жара)/(Температура тела спустя 1 час после индукции жара)) × 100%

(2) Результаты

Спустя 1 час после внутривенного введения тифозной и паратифозной вакцины в краевую вену уха кроликов, температура тела повышалась примерно на 1°С, что указывало, что тифозную и паратифозную вакцину можно применять для модели индукции лихорадки у кроликов. По сравнению с группой холостого контроля, температура тела в модельной группе постоянно увеличивалась во время периода наблюдения 300 минут (p<0,05-p<0,001). По сравнению с модельной группой, в группе с высокой, средней и низкой дозой композиции филлирина/филлигенина после применения в течение 30-240 минут, 60-240 минут и 90-240 минут отмечался значительный жаропонижающий эффект при лихорадке у кроликов, индуцированной тифозной и паратифозной вакциной (p<0,05-p<0,001), который был существенно лучше эффектов в группе филлирина и группе филлигенина (p<0,01), что свидетельствовало, что композиции филлирина/филлигенина обладают явным синергетическим эффектом. См. вышеуказанные результаты в таблице 2-8.

2.5. Влияние композиций филлирина/филлигенина на отек конечностей крысы, индуцированный каррагенином

(1) Материалы и методы

70 крыс-самцов Вистар с массой тела 120-150 г произвольно распределяли в 7 групп по массе, т.е. группу холостого контроля (0,5% карбоксиметилцеллюлозы), группы с низкой, средней и высокой дозой (2,5; 5 и 10 мг/кг) композиции А филлирина/филлигенина, группу филлирина, группу филлигенина и группу лекарства положительного контроля аспирина (100 мг/кг). В каждой группе было по 10 крыс. В каждой группе проводили применение путем подкожной инъекции через сублингвальную вену. Нормальный объем правой нижней лапы у каждой крысы определяли посредством способа измерения с увеличением капилляров. Чтобы избежать ошибок, участок измерения фиксировали, и операцию проводил один индивидуум до и после применения. Среднее значение по результатам двух измерений брали в качестве нормального объема правой задней лапы у крыс перед применением. После применения немедленно проводили подкожную инъекцию 1% каррагенина 0,1 мл в подушечку правой задней лапы для индукции воспаления. Объем правой лапы крыс измеряли спустя 15, 30, 60, 120, 180, 240, 300 и 360 минут после индукции воспаления. Разницу между группами определяли посредством межгруппового t-теста, анализируя процент разницы (отношение отека) объема лапы до и после индукции воспаления у крыс.

Отношение отека = ((Объем правой задней лапы после индукции воспаления - объем правой задней лапы до применения)/(Объем правой задней лапы перед применением)) × 100%.

Результаты

По сравнению с группой холостого контроля, в группе высокой дозы (10 мг/кг) композиции филлирина/филлигенина спустя 15-360 минут после применения, а также в группе средней дозы (5 мг/кг) и группе низкой дозы (2,5 мг/кг) композиции филлирина/филлигенина спустя 30-360 минут после применения отмечался значительный ингибирующий эффект (p<0,05 или p<0,01) в отношении отека лапы крысы, индуцированного каррагенином, который был значительно лучше, чем у пролекарства филлигенина (p<0,05-p<0,001); а терапевтический эффект был значительно лучше эффектов в группе филлирина (10 мг/кг) и группе филлигенина (10 мг/кг) (p<0,05 или p<0,01); далее, терапевтические эффекты в группе с каждой дозой композиции спустя 60 и 240 минут после применения были существенно лучше эффектов в группе филлигенина (p<0,01). Результаты вышеуказанного теста свидетельствуют, что комбинированное применение филлирина и филлигенина в композиции филлирина/филлигенина обеспечивает явный синергетический эффект (см. подробности в таблице 2-9).

Таблица 2.7. Влияние композиций филлирина/филлигенина на температуру тела кроликов при индукции жара тифозной и паратифозной вакциной ( ±s,n=3)

Группы Норма Спустя 6 часов после индукции жара Температура тела (°С) Время после применения (часы) 1 2 3 4 Модельная контрольная группа 37,72±0,90 39,30±0,54 39,44±0,58 39,42±0,47 38,88±0,46 38,57±0,49 (%) 4,22±2,11^### 0,37±1,66 0,31±1,77 -1,07±1,54 -1,86±1,20 Парацетамол 100 мг/кг 37,55±0,70 39,48±0,62 38,66±0,59 38,19±0,59 37,98±0,19 37,84±0,32 (%) 5,14±1,42^### -2,07±0,54** -3,27±0,77 *** -3,80±1,43 *** -4,15±1,59 *** Филлирин 10 мг/кг 37,58±0,59 39,53±0,63 39,13±0,52 38,77±0,42 38,63±0,40 38,46±0,31 (%) 5,18±1,52^### -0,60±0,39 -0,92±0,93** -1,29±1,18* -1,70±1,23* Филлигенин 10 мг/кг 37,50±0,59 39,44±0,47 39,31±0,48 39,04±0,45 38,91±0,40 38,70±0,31 (%) 5,17±1,37^### -0,33±0,41 -0,69±0,93* -1,03±1,18* -1,55±1,23* Композиция А филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 7,33±0,51 39,23±0,63 38,86±0,47 38,20±0,44 37,85±0,52 38,52±0,59 (%) 5,10±1,45 ^### -0,95±1,02^▲ -1,70±1,11^▲ -2,61±1,65 ** ^{Δ ▲} -3,45±1,88 **
^Δ▲ 5,0 мг/кг 7,41±0,55 39,37±0,41 38,61±0,52 38,46±0,55 38,22±0,32 37,84±0,41 (%) 5,25±1,25 ^### -1,92±0,42 *^Δ▲▲ -2,31±0,57 ** ^{Δ ▲} -2,93±0,36 ** ^{Δ ▲} -3,93±0,50 *** ^{Δ Δ ▲▲} 10,0 мг/кг 7,53±0,59 39,54±0,62 38,69±0,57 37,72±0,40 37,27±0,42 37,08±0,35 (%) 5,36±1,52 ^### -2,16±0,51 ** ^{Δ Δ ▲▲} -2,85±0,93 ** ^{Δ ▲▲} -3,66±1,18 *** ^{Δ Δ ▲▲} -4,16±1,23
*** ^{Δ Δ ▲▲} Композиция В филлирина/филлигенина 2,5 мг/кг 7,64±0,42 39,60±0,63 39,26±0,47 38,97±0,41 38,59±0,35 38,30±0,50 (%) 5,21±1,40 ^### -0,87±1,12^▲ -1,59±1,18^▲ -2,54±1,32 ** ^{Δ ▲} -3,29±1,81 *** ^{Δ ▲} 5,0 мг/кг 7,47±0,63 39,47±0,43 38,76±0,56 38,57±0,52 38,35±0,40 37,95±0,38 (%) 5,33±1,27 ^### -1,80±0,50 *
^{Δ ▲▲} -2,27±0,50
** ^{Δ ▲} -2,84±0,31 ** ^{Δ ▲} -3,85±0,44 *** ^{Δ Δ ▲▲} 10,0 мг/кг 7,55±0,76 39,48±0,67 38,71±0,49 38,39±0,48 38,24±0,37 37,90±0,31 (%) 5,13±1,50 ^### -1,95±0,58 ** ^{Δ Δ ▲▲} -2,76±0,85
** ^{Δ ▲▲} -3,15±1,10 *** ^{Δ Δ ▲▲} -4,00±1,12 ***^▲▲

Сравнение с модельной контрольной группой: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; сравнение с нормальной группой (перед индукцией жара): ^###p<0,001. Сравнение процента снижения жара для композиции филлирина/филлигенина и филлирина: ^Δp<0,05; ^ΔΔp<0,01; ^ΔΔΔp<0,001; Сравнение процента снижения жара для композиции филлирина/филлигенина и филлигенина: ^▲p<0,05; ^▲▲p<0,01; ^▲▲▲p<0,001.

Таблица 2.8. Влияние композиций филлирина/филлигенина на температуру тела кроликов при индукции жара тифозной и паратифозной вакциной ( ±s,n=3)

Группы Норма Спустя 1 час после индукции жара Температура тела (°С) Время после применения (мин) 30 60 90 120 180 240 Группа холостого контроля 39,47±0,25 39,50±0,21 39,56±0,24 39,45±0,20 39,54±0,22 39,49±0,23 39,56±0,27 39,59±0,26 (%) 0,15±0,25 0,15±0,25 -0,13±0,15 0,11±0,14 -0,02±0,10 0,15±0,24 0,23±0,08 Группа модельного
контроля 39,68±0,54 41,10±0,51 ^### 41,23±0,52 41,27±0,52 ^## 41,22±0,52^# 41,21±0,51^# 40,95±0,48 ^## 40,49±0,57 ^### (%) 3,60±1,03 0,32±0,28 0,41±0,19 0,28±0,15 0,26±0,29 -0,36±0,22 -1,48±0,25 Парацетамол 50 мг/кг 39,53±0,49 40,09±0,41 ^### 40,53±0,65 ^** 40,10±0,49 ^*** 39,83±0,58 ^*** 39,72±0,56 ^*** 39,61±0,41 ^*** 39,53±0,47 ^*** (%) 3,71±0,27 -1,14±0,56 -2,18±0,17 -2,83±0,15 -3,11±0,20 -3,38±0,22 -3,58±0,38 Филлирин 5,2 мг/кг 39,59±0,30 40,98±0,23 ^### 40,83±0,26 40,58±0,21 40,43±0,22 40,37±0,27 40,16±0,23 39,92±0,25 (%) 3,52±0,41 -0,37±0,15 -0,61±0,12 -0,97±0,27 -1,13±0,14^** -1,65±0,12 ^** -2,22±0,11 ^*** Филлигенин 5,2 мг/кг 39,63±0,30 41,10±0,24 ^### 41,06±0,26 40,86±0,21 40,74±0,22 40,65±0,27 40,49±0,23 40,30±0,25 (%) 3,71±0,41 -0,10±0,11 -0,49±0,10 -0,77±0,22 -1,00±0,18 ^** -1,39±0,17 ^** -1,85±0,15 ^** Композиция А филлирина/филлигенина 1,3 мг/кг 39,56±0,21 41,13±0,47 ^### 41,94±0,49 41,52±0,42 41,36±0,33 41,13±0,46 40,94±0,33 40,61±0,31 (%) 3,99±0,52 -0,46±0,18 -0,90±0,12 -1,29±0,27 ^{** Δ Δ ▲▲} -1,83±0,34^** -2,30±0,46 ^{*** Δ Δ ▲▲} -3,08±0,25 ^{*** Δ ▲▲} 2,6 мг/кг 39,72±0,29 41,23±0,35 ^### 40,88±0,32 40,43±0,38 40,21±0,23 39,94±0,25 39,73±0,26 39,35±0,22 (%) 3,79±0,46 -0,85±0,02 -1,09±0,03
^{** Δ Δ ▲▲} -1,65±0,19 ^{** Δ Δ ▲▲} -2,30±0,44 ^{*** Δ Δ ▲▲} -2,82±0,22 ^{*** Δ Δ ▲▲} -3,75±0,31 ^{*** Δ ▲▲} 5,2 мг/кг 39,77±0,30 41,17±0,23 ^### 40,75±0,26 40,03±0,21 39,85±0,22 39,58±0,27 39,32±0,23 38,99±0,25 (%) 3,51±0,41 -1,02±0,15
^{** Δ Δ ▲▲} -1,77±0,12
^{** Δ Δ ▲▲} -2,21±0,27 ^{*** Δ Δ ▲▲} -2,93±0,14 ^{*** Δ Δ ▲▲} -3,50±0,12 ^{*** Δ Δ ▲▲} -4,33±0,11 ^{*** Δ ▲▲} Композиция В филлирина/филлигенина 1,3 мг/кг 39,56±0,32 41,15±0,39 ^### 39,44±0,46 39,85±0,36 39,94±0,35 38,95±0,49 38,76±0,29 39,25±0,20 (%) 4,02±0,44 -0,29±0,10 -0,73±0,20 -0,95±0,29
^{** Δ ▲▲} -1,53±0,30 ^** -2,02±0,30 ^{*** Δ ▲▲} -0,78±0,41 ^{*** Δ ▲▲} 2,6 мг/кг 39,72±0,25 41,24±0,40^### 39,50±0,38 39,40±0,31 39,20±0,32 38,92±0,29 38,71±0,12 38,48±0,32 (%) 3,83±0,41 -0,55±0,17 -0,81±0,09 ^{** Δ ▲▲} -1,30±0,20
^{** Δ ▲▲} -2,01±0,44 ^{** Δ ▲▲} -2,54±0,37 ^{*** Δ ▲▲} -3,11±0,24 ^{*** Δ ▲▲} 5,2 мг/кг 39,77±0,33 41,16±0,21 ^### 39,40±0,19 39,16±0,34 38,97±0,24 38,75±0,25 38,54±0,26 38,19±0,11 (%) 3,51±0,32 -0,94±0,23
^{** Δ ▲▲} -1,52±0,20
^{** Δ ▲▲} -2,00±0,21 ^{*** Δ ▲▲} -2,56±0,20 ^{*** Δ ▲▲} -3,10±0,18 ^{*** Δ ▲▲} -3,97±0,09 ^{*** Δ ▲▲}

Сравнение с модельной контрольной группой: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; сравнение с группой нормального контроля (перед индукцией жара): ^###p<0,001. Сравнение процента жаропонижающего эффекта композиции филлирина/филлигенина и филлирина: ^Δp<0,05;

^ΔΔp<0,01. Сравнение процента жаропонижающего эффекта композиции филлирина/филлигенина и филлигенина: ^▲p<0,05; ^▲▲p<0,01.

Таблица 2-9. Ингибирующее влияние композиций филлирина/филлигенина на отек лапы крысы, индуцированный каррагенином

( ±s, n=10)

Группы Отношение отека (%) 15 мин 30 мин 60 мин 120 мин 180 мин 240 мин 300 мин 360 мин Контрольная группа 18,7±12,6 28,9±14,6 33,8±10,5 46,5±18,2 46,7±15,3 48,8±21,9 49,1±14,6 47,4±15,5 Аспирин, 100 мг/кг 8,90±6,70* 15,6±12,2* 20,3±10,9* 21,6±12,1 ** 26,1±21,1 ** 26,1±16,3 ** 34,9±14,6* 31,9±12,2* Филлирин, 10,0 мг/кг 12,9 ±8,41 19,9±9,55 21,8±11,8* 28,9±14,0* 30,8±15,4* 29,9±11,1* 33,5±10,0* 32,2±11,9* Филлигенин, 10 мг/кг 14,9 ±6,13 21,9±9,72 27,1±13,5 30,7±10,2* 33,8±12,1* 31,0±11,3* 35,8±13,5* 36,4±10,2 Композиция А филлирина/ филлигенина 2,5 мг/кг 13,6 ±8,40 24,2±16,3 20,1±14,8 *^▲▲ 22,0±16,0 ** ^{Δ ▲} 26,8±16,1 ** ^{Δ ▲} 26,8±23,3 ** ^{Δ ▲} 29,5±16,1 ** ^{Δ ▲} 32,4±23,4 *^▲▲ 5,0 мг/кг 11,4 ±8,90 15,2±6,20
* ^Δ▲ 18,0±9,00 *^▲▲ 19,7±12,1 ** ^{Δ ▲} 22,0±14,9 ** ^{Δ ▲} 24,2±12,0 ** ^{Δ ▲} 27,8±13,1 ** ^{Δ ▲} 30,0±16,0 ** ^{Δ ▲▲} 10,0 мг/кг 9,0±7,90
*^Δ▲ 13,2±9,50
*^Δ▲ 15,8±11,6 ** ^{Δ ▲▲} 17,9±14,3 ** ^{Δ ▲} 19,7±15,2 ** ^{Δ ▲} 22,5±11,8 ** ^{Δ ▲} 25,4±10,6 ** ^{Δ ▲} 28,7±11,4 ** ^{Δ ▲▲} Композиция В филлирина/ филлигенина 2,5 мг/кг 13,5 ±8,52 24,9±16,0 21,1±14,1 *^▲▲ 23,1±16,5 ** ^{Δ ▲} 27,4±15,6 ** ^{Δ ▲} 27,7±23,7 ** ^{Δ ▲} 30,4±16,9 ** ^{Δ ▲} 33,1±22,8 *^▲▲ 5,0 мг/кг 12,4 ±8,71 16,0±6,15
* ^{Δ ▲} 19,5±9,55 *^▲▲ 20,2±11,6 ** ^{Δ ▲} 23,2±15,2 ** ^{Δ ▲} 25,6±11,6 ** ^{Δ ▲} 28,89±12,7 ** ^{Δ ▲} 31,6±15,5 ** ^{Δ ▲▲} 10,0 мг/кг 9,9±7,80
*^Δ▲ 13,9±9,61
* ^{Δ ▲} 16,9±12,2 ** ^{Δ ▲▲} 18,2±14,8 ** ^{Δ ▲} 20,5±15,9 ** ^{Δ ▲} 23,8±12,0 ** ^{Δ ▲} 26,1±11,3 ** ^{Δ ▲} 29,8±11,9 ** ^{Δ ▲▲}

Сравнение с контрольной группой: *p<0,05; **p<0,01; сравнение процента жаропонижающего эффекта композиции филлирина/филлигенина и филлирина: ^Δp<0,05; ^ΔΔp<0,01; Сравнение процента жаропонижающего эффекта композиции филлирина/филлигенина и филлигенина: ^▲p<0,05; ^▲▲p<0,01.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к композиции филлирина/филлигенина при приготовлении медикамента или продукта медицинского назначения для облегчения и/или лечения гриппа и пневмонии. Применение композиции филлирина/филлигенина, которая включает филлирин и филлигенин, при этом массовое соотношение филлирина к филлигенину в композиции филлирина/филлигенина составляет 80-98:2-20, при приготовлении медикамента или продукта медицинского назначения для облегчения и/или лечения гриппа и пневмонии. Медикамент или продукт медицинского назначения для облегчения и/или лечения гриппа и пневмонии, включающий композицию филлирина/филлигенина, содержащую филлирин и филлигенин, отличающуюся тем, что массовое соотношение филлирина к филлигенину в композиции филлирина/филлигенина составляет 80-98:2-20. Вышеописанная композиция эффективна для облегчения и/или лечения гриппа и пневмонии. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 22 табл., 54 пр.

1. Применение композиции филлирина/филлигенина, которая включает филлирин и филлигенин, отличающейся тем, что массовое соотношение филлирина к филлигенину в композиции филлирина/филлигенина составляет 80-98:2-20, при приготовлении медикамента или продукта медицинского назначения для облегчения и/или лечения гриппа и пневмонии.

2. Применение по п. 1, где композиция филлирина/филлигенина дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.

3. Применение по п. 2, где отношение общей массы филлирина и филлигенина в композиции филлирина/филлигенина к массе фармацевтически приемлемого носителя составляет от 1:1 до 1:100.

4. Применение по п.1 или 2, где композиция филлирина/филлигенина образована филлирином и филлигенином в форме мономеров или является композицией экстракта филлигенина-филлирина, приготовленной путем тепловой экстракции с применением растворителя, или является композиций филлигенина-филлирина-циклодекстрина, образованной путем комбинации филлигенина и филлирина с циклодекстрином или производным циклодекстрина.

5. Применение по п.4, где композиция филлигенина-филлирина-циклодекстрина является смесью, образованной путем смешивания филлигенина и филлирина с α-циклодекстрином, β-циклодекстрином или γ-циклодекстрином или их производным, или композицией, образованной филлигенином, филлирином, и α-циклодекстрином, β-циклодекстрином или γ-циклодекстрином или их производным при физической или химической обработке.

6. Применение по п.4, где медикамент изготовлен в форме таблеток, капсул, пилюль, порошков, гранул, сиропов, растворов, эмульсий, инъекций, спреев, аэрозолей, гелей, кремов, припарок, липких пластырей или повязок.

7. Медикамент или продукт медицинского назначения для облегчения и/или лечения гриппа и пневмонии, включающий композицию филлирина/филлигенина, содержащую филлирин и филлигенин, отличающуюся тем, что массовое соотношение филлирина к филлигенину в композиции филлирина/филлигенина составляет 80-98:2-20.