СПОСОБ АКТИВАЦИИ ХЕЛПЕРНЫХ Т-КЛЕТОК И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ДАННОМ СПОСОБЕ Российский патент 2019 года по МПК C12N5/783 C07K14/82 A61K39/00 G01N33/50 A61P35/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу активации хелперных Т-клеток, включающему добавление пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам и, посредством этого, активации хелперных Т-клеток, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501, и композиции для этого, фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака путем активации хелперных Т-клеток и им подобных.

Предшествующий уровень техники

Ген WT1 (ген опухоли Вильмса 1) был идентифицирован как ген, ответственный за опухоль Вильмса, которая представляет собой почечный рак у детей (непатентные документы 1 и 2). WT1 представляет собой транскрипционный фактор, имеющий цинковую пальцевую структуру. В начале, ген WT1 считали геном, подавляющим опухоль. Однако последующие стадии (непатентные документы 3, 4, 5 и 6) показали, что ген WT1 скорее функционирует в качестве онкогена в гематопоэтических опухолях и солидных формах рака.

Было показано, что Т-лимфоциты, специфичные для пептида WT1 (CTL), могут быть индуцированы стимуляцией in vitro мононуклеарных клеток периферической крови пептидом WT1, и такой CTL повреждает раковые клетки, такие как гематопоэтические опухолевые клетки и клетки солидного рака, которые эндогенно экспрессируют WT1. CTL распознает пептид WT1 в виде формы комплекса, в котором пептид WT1 связывается с молекулой класса I MHC (главного комплекса тканевой совместимости). Поэтому, такой пептид WT1 отличается в зависимости от подтипов класса I MHC (патентный документ 1, непатентный документ 7 и патентные документы 2, 3 и 4).

Существование хелперных Т-клеток, специфичных для ракового антигена, важно для эффективной индукции CTL (непатентный документ 8). Хелперные Т-клетки индуцируются и активируются путем распознавания комплекса молекулы класса II MHC и антигенного пептида на антиген-презентирующих клетках. Активированные хелперные Т-клетки продуцируют цитокин, такой как IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, или интерферон для содействия росту, дифференциации или созреванию В-клетки. Активированные хелперные Т-клетки выполняют функцию содействия росту, дифференциации или созреванию других субпопуляций Т-клеток (например, клетки Tc и TD). Таким образом, Т-клетки несут функцию активации иммунной системы содействием росту или активации В-клеток или Т-клеток. Поэтому, считается полезным усиление функции хелперных Т-клеток посредством антигенного пептида, связывающего класс II MHC (хелперного пептида) при иммунотерапии рака, для увеличения эффекта противораковой вакцины (непатентный документ 9). К настоящему времени, только пептид, связывающийся с молекулой HLA-DRB1*0401 (непатентный документ 10), пептид, связывающийся с молекулой HLA-DRB1*0405, и пептид, связывающийся с молекулой HLA-DRB1*1502 (патентный документ 5), были обнаружены в качестве хелперного пептида. Поэтому, имеется потребность в обнаружении пептидов, каждый из которых связывается с молекулой HLA-DRB1*1501, HLA-DRB1*0901 или HLA-DRB1*0501.

Кроме того, было показано, что среди хелперных пептидов, имеется перспективный хелперный пептид, который может связываться с множеством молекул класса II MHC и индуцировать хелперные Т-клетки (непатентные документы 11 и 12). Однако было очень трудно идентифицировать перспективный хелперный пептид, который связывается с тремя или более типами молекул класса II MHC, и оказывает достаточный эффект.

Патентный документ 1: WO 2003/106682

Патентный документ 2: WO 2005/095598

Патентный документ 3: WO 2007/097358

Патентный документ 4: международная заявка на патент № PCT/JP2007/074146

Патентный документ 5: WO 2005/045027

Непатентный документ 1: Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29;61(7):1257-69.

Непатентный документ 2: Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9;60(3):509-20.

Непатентный документ 3: Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998;181:151-212. Review.

Непатентный документ 4: Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr 1;87(7):2878-84.

Непатентный документ 5: Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15;91(8):2969-76.

Непатентный документ 6: Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May;23(5):499-505.

Непатентный документ 7: Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb;51(2):99-107.

Непатентный документ 8: Gao FG et al., Cancer Res. 2002 Nov 15;62(22):6438-41.

Непатентный документ 9: Zeng G, J Immunother. 2001 May;24(3):195-204

Непатентный документ 10: Knights AJ et al., Cancer Immunol Immunother. 2002 Jul;51(5):271-81.

Непатентный документ 11: Sotiriadou R et al., Br J Cancer. 2001 Nov 16;85(10):1527-34.

Непатентный документ 12: Hural JA et al., J Immunol. 2002 Jul 1;169(1):557-65

Описание изобретения

Проблемы, подлежащие решению изобретением

Проблемы, решаемые изобретением, представляют собой: предоставление способа активации хелперных Т-клеток пептидом WT1, который способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DRB1*0901 или молекулой HLA-DRB1*0501, и композиции для достижения этого, а также фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака путем активации хелперных Т-клеток и тому подобного.

Средства для решения указанных проблем

В результате интенсивных исследований в связи с описанной выше ситуацией, заявитель обнаружил, что среди пептидов WT1, которые связываются с молекулой HLA-DRB1*0405 и молекулой HLA-DRB1*1502, пептид WT1, имеющий аминокислотную последовательность: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His, также связывается с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DRB1*0901 и молекулой HLA-DRB1*0501. Таким образом, было создано настоящее изобретение.

Настоящее изобретение предоставляет:

(1) способ активации хелперных Т-клеток, включающий добавление пептида WT1 к антиген-презентирующей клетке и, посредством этого, активацию хелперных Т-клеток, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501;

(2) способ по п.(1), где пептид WT1 способен связываться, по меньшей мере, с двумя из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501;

(3) способ по п.(1) или (2), где пептид WT1, кроме того, способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502;

(4) способ по любому из пп.(1)-(3), где пептид WT1 способен связываться, по меньшей мере, с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DRB1*0901, молекулой HLA-DRB1*0501, молекулой HLA-DRB1*0405 и молекулой HLA-DRB1*1502;

(5) способ по любому из пп.(1)-(4), где пептид WT1 представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2);

(6) способ по любому из пп.(1)-(5), где добавление пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам осуществляется добавлением пептида WT1, добавлением вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, или добавлением клеток, включающих вектор экспрессии;

(7) композиция для активации хелперных Т-клеток добавлением пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам, содержащим пептид WT1, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501;

(8) способ лечения или профилактики рака у субъекта, включающий добавление пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам и, посредством этого, активацию хелперных Т-клеток, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501;

(9) фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака активацией хелперных Т-клеток добавлением пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам, содержащим пептид WT1, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501;

(10) антитело, специфически связывающееся с пептидом WT1, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501;

(11) способ определения присутствия или количества пептида WT1 у любого из HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного и HLA-DRB1*0501-положительного субъекта, включающий:

(а) взаимодействие анти-WT1 антитела с образцом от субъекта; и

(b) определение присутствия или количества анти-WT1 антитела, специфически связывающегося с пептидом WT1, содержащимся в образце;

(12) способ лечения или профилактики рака, включающий добавление пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам и, посредством этого, активацию хелперных Т-клеток, и введение субъекту активированных хелперных Т-клеток, где пептид WT1 способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DRB1*0901 или молекулой HLA-DRB1*0501;

(13) фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака, содержащая хелперные Т-клетки, активированные добавлением пептида WT1, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501;

(14) способ определения присутствия или количества WT1-специфичных хелперных Т-клеток у любого из HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного и HLA-DRB1*0501-положительного субъекта, включающий:

(а) взаимодействие комплекса пептида WT1 антитела и молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 или молекулы HLA-DRB1*0501 с образцом от субъекта; и

(b) определение присутствия или количества хелперных Т-клеток, распознающих комплекс, содержащийся в образце; и

(15) способ определения присутствия или количества WT1-специфичных хелперных Т-клеток у HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного, HLA-DRB1*0501-положительного, HLA-DRB1*0405-положительного или HLA-DRB1*1502-положительного субъекта, включающий:

(а) стимуляцию мононуклеарных клеток периферической крови, инвазивных лимфоцитов, опухолевых клеток, клеток в асцитической жидкости, клеток в плевральной жидкости, клеток в спинномозговой жидкости, клеток костного мозга или клеток лимфоузлов пептидом WT1; и

(b) определение продукции цитокина или реакции хелперных Т-клеток,

где присутствие или увеличение количества продуцируемого цитокина или реакции хелперных Т-клеток указывает на присутствие или количество WT1-специфических хелперных Т-клеток.

Эффекты изобретения

Настоящее изобретение предоставляет способ активации хелперных Т-клеток пептидом WT1, который связывается с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DRB1*0901, молекулой HLA-DRB1*0501; молекулой HLA-DRB1*0405 и молекулой HLA-DRB1*1502, и композицию для этого, а также фармацевтическую композицию для лечения и/или профилактики рака активацией хелперных Т-клеток и тому подобное. Поэтому можно активировать in vivo и in vitro хелперные Т-клетки у субъекта, имеющего любую из таких молекул II класса MHC, для лечения и профилактики рака. Ввиду того, что 90% населения Японии охвачено пятью типами подклассов II класса MHC, хелперные Т-клетки могут активироваться для лечения и/или профилактики рака у очень широкого диапазона субъектов.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показан график, который представляет количество IFN-γ, продуцируемого клетками ТА28.1. На чертеже продольная ось представляет концентрацию IFN-γ (пкг/мл). Графики соответствуют «случаю культивирования мононуклеарных клеток периферической крови от HLA-DRB1*1501-положительного субъекта в отсутствие пептида WT1», «случаю культивирования клеток ТА28.1 в присутствии пептида WT1 (черные столбцы)», «случаю культивирования мононуклеарных клеток периферической крови от HLA-DRB1*1501-положительного субъекта в отсутствие пептида WT1», «случаю культивирования мононуклеарных клеток периферической крови от HLA-DRB1*1501-отрицательного субъекта в присутствии пептида WT1», соответственно, начиная слева.

На фиг.2 показан график, представляющий количества IFN-γ, IL-4 и IL-10, продуцируемые клетками ТА28.1. На чертеже продольная ось представляет концентрацию (пкг/мл). Графики соответствуют величинам IFN-γ, IL-4 и IL-10, начиная слева.

На фиг.3 показан график, представляющий количества IFN-γ, IL-4 и IL-10, продуцируемые клетками Е15.2. На чертеже продольная ось представляет концентрацию (пкг/мл). Графики соответствуют величинам IFN-γ, IL-4 и IL-10, начиная слева.

На фиг.4 представлена продукция IFN-γ и IL-17 HLA-DPB1*0501/*0501-положительными мононуклеарными клетками. На чертеже горизонтальная ось представляет IFN-γ, а продольная ось представляет IL-17. На фиг.4а представлены клетки без стимуляции пептидом WT1, а на фиг.4b представлены клетки, стимулированные пептидом WT1.

На фиг.5 показан график, который представляет рост Т-клеток ТА28.1. На чертеже продольная ось представляет имп/мин (×10⁴). Графики соответствуют «случаю совместного культивирования клеток ТА28.1 с мононуклеарными клетками периферической крови без пульсирующего воздействия пептидом WT1», «случаю совместного культивирования клеток ТА28.1 с мононуклеарными клетками периферической крови с пульсирующим воздействием пептидом WT1 (черные столбцы)», «случаю культивирования клеток ТА28.1 с мононуклеарными клетками периферической крови при пульсирующем воздействии пептидом WT1 в присутствии антитела против I класса МНС», «случаю совместного культивирования клеток ТА28.1 с мононуклеарными клетками периферической крови с пульсирующим воздействием пептидом WT1 в присутствии анти-HLA-DR антитела (заштрихованные столбцы)», «случаю совместного культивирования клеток ТА28.1 с мононуклеарными клетками периферической крови с пульсирующим воздействием пептидом WT1 в присутствии анти-HLA-DQ антитела», «случаю совместного культивирования клеток ТА28.1 с мононуклеарными клетками периферической крови с пульсирующим воздействием пептидом WT1 в присутствии анти-HLA-DP антитела», начиная слева.

На фиг.6 показан график, который представляет рост Т-клеток Е15.2. На чертеже продольная ось представляет имп/мин (×10⁴). Графики соответствуют «случаю совместного культивирования клеток Е15.2 с мононуклеарными клетками периферической крови от HLA-DPB1*0901-положительного субъекта без пульсирующего воздействия пептидом WT1», «случаю совместного культивирования клеток Е15.2 с мононуклеарными клетками периферической крови от HLA-DPB1*0901-положительного субъекта с пульсирующим воздействием пептидом WT1 (черные столбцы)», «случаю совместного культивирования клеток Е15.2 с мононуклеарными клетками периферической крови от HLA-DPB1*0901-отрицательного субъекта без пульсирующего воздействия пептидом WT1», «случаю совместного культивирования клеток Е15.2 с мононуклеарными клетками периферической крови от HLA-DPB1*0901-отрицательного субъекта с пульсирующим воздействием пептидом WT1», начиная слева.

На фиг.7 показан график, который представляет рост Т-клеток Е15.2. На чертеже продольная ось представляет имп/мин. Графики соответствуют «случаю совместного культивирования клеток Е15.2 с мононуклеарными клетками периферической крови без пульсирующего воздействия пептидом WT1», «случаю совместного культивирования клеток Е15.2 с мононуклеарными клетками периферической крови с пульсирующим воздействием пептидом WT1 (черные столбцы)», «случаю совместного культивирования клеток Е15.2 с мононуклеарными клетками периферической крови с пульсирующим воздействием пептидом WT1 в присутствии антитела против I класса МНС», «случаю совместного культивирования клеток Е15.2 с мононуклеарными клетками периферической крови с пульсирующим воздействием пептидом WT1 в присутствии анти-HLA-DR антитела», «случаю совместного культивирования клеток Е15.2 с мононуклеарными клетками периферической крови с пульсирующим воздействием пептидом WT1 в присутствии анти-HLA-DQ антитела», и «случаю совместного культивирования клеток Е15.2 с мононуклеарными клетками периферической крови с пульсирующим воздействием пептидом WT1 в присутствии анти-HLA-DP антитела (заштрихованные столбцы)», начиная слева.

На фиг.8 показан график, представляющий рост HLA-DPB1*0501/*0501-положительных мононуклеарных клеток. На чертеже горизонтальная ось представляет имп/мин. Графики соответствуют слева направо «случаю без стимуляции пептидом WT1» и «случаю со стимуляцией пептидом WT1».

На фиг.9 представлено, что рост HLA-DPB1*0501/*0501-положительных мононуклеарных клеток подавляется анти-HLA-DP антителами. На чертеже горизонтальная ось представляет имп/мин. Графики соответствуют слева направо «случаю без стимуляции пептидом WT1», «случаю со стимуляцией контрольным пептидом из ВИЧ», «случаю со стимуляцией пептидом WT1», «случаю со стимуляцией пептидом WT1 в присутствии анти-HLA-DR антитела», «случаю со стимуляцией пептидом WT1 в присутствии анти-HLA-DQ антитела» и «случаю со стимуляцией пептидом WT1 в присутствии анти-HLA-DR антитела».

На фиг.10 показан график, который представляет рост Т-клеток Е15.2 в случаях использования различной концентрации пептида WT1. На чертеже продольная ось соответствует имп/мин (×10⁴), а горизонтальная ось представляет концентрацию пептида WT1.

Лучший способ осуществления изобретения

В одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу активации хелперных Т-клеток, включающему добавление пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам и, посредством этого, активации хелперных Т-клеток, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501. В настоящем изобретении, пептид WT1 относится к пептиду, состоящему из части аминокислотной последовательности человеческого белка WT1, показанного в SEQ ID NO: 1, пептида, который имеет замещение, модификацию или делецию одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности и способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501, или пептид, в котором различные вещества, такие как аминокислота, пептид или его аналог могут быть присоединены на N-конце и/или С-конце пептида. Вещество может быть переработано, например, ферментом в живом организме посредством процесса, такого как внутриклеточная переработка, и, наконец, пептид WT1 становится формой, которая может связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501. Вещество может представлять собой вещество, которое модулирует растворимость пептида WT1 по настоящему изобретению или увеличивает его устойчивость (резистентность к протеазе и т.д.). Альтернативно, оно может представлять собой вещество, которое специфически доставляет пептид WT1 по настоящему изобретению, например, к данной ткани или органу, или увеличивает эффективность захвата антиген-презентирующими клетками или тому подобное. Альтернативно, оно может представлять собой пептид WT1, который ограничивается тем же типом молекулы I класса МНС, что и у субъекта, от которого получены антиген-презентирующие клетки.

Пептид WT1 по настоящему изобретению способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501. Таким образом, пептид WT1 может представлять собой пептид, который способен связываться, по меньшей мер, с двумя из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501, или пептид, который способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501 и/или молекулой HLA-DRB1*0901 и/или молекулой HLA-DRB1*0501, и молекулой II класса HLA, отличной от них, например, пептид, который способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502, пептид, который способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0901, молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*0502, пептид, который способе связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502, или пептид, который способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DRB1*0901, молекулой HLA-DRB1*0501, молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502. Ввиду того, что пептид WT1, имеющий аминокислотную последовательность: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2) способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DRB1*0901 и молекулой HLA-DRB1*0501, молекулой HLA-DRB1*0405 и молекулой HLA-DRB1*1502, предпочтителен пептид WT1, имеющий такую аминокислотную последовательность. В целом, пептид, связывающий II класс MHC. Поэтому, пептид WT1 предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, состоящую из 10-25 аминокислот.

Пептид WT1 по настоящему изобретению может быть синтезирован способами, в целом используемыми в настоящей области, или их модификациями. Такие способы описаны, например, в Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd., 1975; Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co., Ltd., 1985; и Iyakuhin No Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptide-Gosei, Hirokawa - Book store, 1991.

Пептид WT1 по настоящему изобретению может быть также получен с использованием методик генетической инженерии, основанных на сведениях о нуклеотидной последовательности, которая кодирует пептид WT1. Такие методики генетической инженерии хорошо известны специалисту в данной области.

Антиген-презентирующие клетки относятся к клеткам, таким как дендритные клетки, которые могут представлять пептид WT1 вместе с молекулой II класса МНС хелперных Т-клеток или им подобных. Таким образом, субъект, у которого получены антиген-презентирующие клетки, должен иметь такой же подкласс II класса МНС (например, HLA-DRB1*1501, HLA-DRB1*0901, HLA-DRB1*0501, HLA-DRB1*0405 или HLA-DRB1*1502), как тот, с которым связывается добавленный пептид WT1.

В целом, хелперные Т-клетки активируются распознаванием пептида антигена посредством молекулы II класса МНС на поверхности антиген-презентирующих клеток комплексом TCR-CD3 на поверхности Е-клеток, и стимуляции интегрина на поверхности Т-клеток лигандом интегрина на поверхности антиген-презентирующих клеток. В настоящем изобретении, активация хелперных Т-клеток охватывает не только активацию хелперных Т-клеток, но также индукцию и рост хелперных Т-клеток. Как описано выше, активированные хелперные Т-клетки выполняют функцию активации иммунной системы увеличением индукции, роста или активации В-клеток или Т-клеток. Таким образом, способ активации хелперных Т-клеток по настоящему изобретению может использоваться в качестве адъювантной терапии при лечении рака или ему подобных заболеваний. Альтернативно, хелперные Т-клетки, активированные in vitro с использованием способа по настоящему изобретению, могут использоваться для лечения или профилактики рака или ему подобного заболевания, или могут использоваться в качестве адъювантной терапии при них. Активацию хелперных Т-клеток можно определить измерением количества продуцируемого или секретируемого цитокина, такого как интерферон и интерлейкин, и им подобных.

Добавление пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам может осуществляться непосредственно добавлением пептида WT1, или косвенно добавлением вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, или добавлением клеток, содержащих вектор экспрессии. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, и клетки, содержащие вектор экспрессии, могут быть получены способом, хорошо известным специалисту в данной области.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к композиции для активации хелперных Т-клеток добавлением пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам, содержащим пептид WT1, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501. Когда композиция по настоящему изобретению вводится DRB1*1501, HLA-DRB1*0901 или HLA-DRB1*0501-полоджительному субъекту, иммунная система у субъекта активируется путем активации хелперных Т-клеток у субъекта. Ген WT1 экспрессирован на высоких уровнях при различных формах рака и опухолей, включая гемопоэтические опухоли, такие как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома или злокачественная лимфома, и солидные формы рака, такие как рак желудка, рак ободочной кишки, рак легких, рак молочной железы, зародышевоклеточный рак, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников. Поэтому, композицию по настоящему изобретению можно использовать в качестве адъювантной терапии при лечении или профилактике рака. Альтернативно, хелперные Т-клетки, активированные с использованием композиции по настоящему изобретению, можно использовать, например, в качестве адъюванта при лечении рака.

Как описано выше, пептид WT1 по настоящему изобретению может представлять собой пептид, который способен связываться, по меньшей мере, с двумя из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501, или пептид, который способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501 и/или молекулой HLA-DRB1*0901 и/или молекулой HLA-DRB1*0501, и молекулой II класса МНС, отличной от них. Таким образом, пока антиген-презентирующие клетки получены у субъекта, положительного по подклассу II класса МНС, с которым может связываться пептид WT1 по настоящему изобретению, может быть получен эффект активации хелперных Т-клеток композиции по настоящему изобретению.

Композиция по настоящему изобретению может содержать, в дополнение к пептиду WT1, например, носитель, эксципиент, добавку или им подобный ингредиент. Ввиду того, что пептид WT1, содержащийся в композиции по настоящему изобретению, активирует хелперный пептид специфично для пептида WT1, композиция может содержать пептид WT1, ограниченный I классом МНС, или может использоваться с эти пептидом.

Способ применения композиции по настоящему изобретению может быть соответствующим образом выбран, в зависимости от таких условий как желательная активация хелперных Т-клеток, состояние антиген-презентирующей клетки. Примеры таких способов включают без ограничения внутрикожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, внутривенное введение, интраназальное введение и пероральное введение, добавление к культуральной среде антиген-презентирующей клетки. Количество пептида WT1, содержащегося в композиции по настоящему изобретению, а также форма, количество раз применения композиции по настоящему изобретению и тому подобное, можно соответствующим образом выбрать, в зависимости от таких условий как желательная активация хелперных Т-клеток, состояние антиген-презентирующей клетки.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к композиции для активации хелперных Т-клеток добавлением пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам, содержащим вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, клеткам, содержащим вектор экспрессии, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501. Вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, и клетки, содержащие вектор экспрессии, описаны выше.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к применению вектора экспрессии, содержащему полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, и клеткам, содержащим вектор экспрессии, для получения композиции.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к набору для активации хелперных Т-клеток добавлением пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам, содержащему пептид WT1, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501. Предпочтительно, набор применяется в способе активации хелперных Т-клеток. Набор по настоящему изобретению может содержать, в дополнение к пептиду WT1, например, средство для получения антиген-презентирующих клеток, средство для определения активности хелперных Т-клеток или им подобное. В целом, к набору приложено руководство по применению. Путем применения набора по настоящему изобретению, можно эффективно индуцировать хелперные Т-клетки.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к набору для активации хелперных Т-клеток добавлением пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам, содержащим вектор экспрессии, включающему полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, или клетки, содержащие вектор экспрессии, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики рака у субъекта, включающему добавление пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам и, посредством этого, активацию хелперных Т-клеток, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501. Способ по настоящему изобретению представляет собой способ, при котором иммунная система у субъекта активируется активацией хелперных Т-клеток и происходит лечение или предотвращение рака у субъекта. Добавление пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам может осуществляться непосредственно добавлением пептида WT1, или косвенно добавлением вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, или добавлением клеток, содержащих вектор экспрессии.

Как описано выше, хелперные Т-клетки распознают комплекс любой из молекул II класса МНС, в частности, молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 или молекулы HLA-DRB1*0501 и пептида WT1. Поэтому, субъект представляет собой субъекта, имеющего молекулу II класса МНС, с которой связывается пептид WT1, например, HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного или HLA-DRB1*0501-положительного субъекта. Как описано выше, пептид WT1 по настоящему изобретению может представлять собой пептид, который способен связываться, по меньшей мер, с двумя из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501, или пептид, который способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501 и/или молекулой HLA-DRB1*0901 и/или молекулой HLA-DRB1*0501, и молекулой II класса HLA, отличной от них. Следовательно, в таком случае, можно лечить или предотвратить рак у субъекта, положительного по подклассу II класса МНС, с которым может связываться пептид WT1 по настоящему изобретению. Рак, подлежащий лечению или профилактике, может представлять собой любой рак, и его примеры включают гематопоэтические опухоли, такие как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому или злокачественную лимфому, и солидные формы рака, такие как рак желудка, рак ободочной кишки, рак легких, рак молочной железы, зародышевоклеточный рак, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников. Кроме того, способ по настоящему изобретению можно применять со способом лечения или профилактики рака пептидом WT1, ограниченным I классом МНС, или фармацевтической композиции для него.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или профилактики рака у субъекта активацией хелперных Т-клеток добавлением пептида WT1 к антиген-презентирующей клетке, содержащей пептид WT1, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501. Ген WT1 экспрессирован на высоких уровнях при различных формах рака и опухолей, включая гемопоэтические опухоли, такие как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома или злокачественная лимфома, и солидные формы рака, такие как рак желудка, рак ободочной кишки, рак легких, рак молочной железы, зародышевоклеточный рак, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников. Поэтому, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для лечения или профилактики рака.

Как описано выше, пептид WT1 по настоящему изобретению может представлять собой пептид, который способен связываться, по меньшей мере, с двумя из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501, или пептид, который способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501 и/или молекулой HLA-DRB1*0901 и/или молекулой HLA-DRB1*0501, и молекулой II класса HLA, отличной от них. Таким образом, пока антиген-презентирующие клетки получены от субъекта, положительного по подклассу II класса МНС, с которым может связываться пептид WT1 по настоящему изобретению, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может применяться для лечения или профилактики рака.

Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению вводится, например, HLA-DRB1*1501-положительному, HLA-DRB1*0901-положительному и HLA-DRB1*0501-положительному субъекту, иммунная система может активироваться активацией хелперных Т-клеток пептидом WT1, содержащимся в фармацевтической композиции, посредством этого, осуществляя лечение или профилактику рака. Таким образом, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может применяться вместе со способом лечения или профилактики рака или с другой фармацевтической композицией, предназначенной для того же.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать, в дополнение к пептиду WT1 в качестве активного ингредиента, например, носитель, эксципиент или им подобные ингредиенты. Пептид WT1, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, связывается с молекулой II класса МНС на поверхности антиген-презентирующей клетки и активирует хелперные Т-клетки. Поэтому, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может, кроме того, содержать активатор, ростовой фактор, индуктор хелперных Т-клеток или им подобных, или может содержать пептид WT1, ограниченный I классом МНС.

Способ введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть соответствующим образом выбран, в зависимости от таких условий как тип заболевания, состояние субъекта или участок-мишень. Примеры таких способов включают без ограничения внутрикожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, внутривенное введение, интраназальное введение и пероральное введение. Количество пептида, содержащееся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, а также в лекарственной форме, количество раз введения и тому подобное фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть соответствующим образом подобрано, в зависимости от таких условий как тип заболевания, состояние субъекта или участок-мишень. Одна доза пептида обычно составляет от 0,0001 мг до 1000 мг, предпочтительно, от 0,001 мг до 1000 мг.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или профилактики рака у субъекта путем активации хелперных Т-клеток добавлением пептида WT1 к антиген-презентирующей клетке, содержащей вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, или клетку, содержащую вектор экспрессии, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к применению пептида WT1, вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, или клетку, содержащую вектор экспрессии, для получения фармацевтической композиции.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к антителу, специфически связывающемуся с пептидом WT1, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501. Антитело по настоящему изобретению может быть получено средством или способом, известным специалисту в данной области. Антитело по настоящему изобретению может применяться для диагностики различных форм рака, их прогноза или тому подобного.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу определения присутствия или количества пептида WT1 у HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного или HLA-DRB1*0501-положительного субъекта, включающему:

(а) взаимодействие анти-WT1 антитела с образцом от субъекта; и

(b) определение присутствия или количества анти-WT1 антитела, специфически связывающегося с пептидом WT1, содержащимся в образце. Например, можно диагностировать рак, его прогноз или тому подобное путем инкубации анти-WT1 антитела с образцом от HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного или HLA-DRB1*0501-положительного субъекта, или введения анти-WT1 антитела HLA-DRB1*1501-положительному, HLA-DRB1*0901-положительному или HLA-DRB1*0501-положительному субъекту, и определение, например, их положения, участка или количества. Анти-WT1 антитело по настоящему изобретению относится к антителу, которое специфически распознает пептид WT1 по настоящему изобретению. Анти-WT1 антитело может представлять собой моноклональное антитело или поликлональное антитело. Анти-WT1 антитело может быть меченым. В качестве метки, может использоваться известная метка, такая как флуоресцентная метка или радиоактивная метка. Присутствие или количество пептида WT1 можно легко и быстро определить его мечением.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к набору для определения присутствия или количества пептида WT1, содержащего анти-WT1 антитело в качестве существенного компонента.

Кроме того, при определении присутствия или количества пептида WT1, когда пептид WT1 способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502, можно определить присутствие или количество пептида WT1 у субъекта с таким подклассом II класса МНС.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или профилактики рака, содержащей хелперные Т-клетки, активированные пептидом WT1, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501. Лечение или профилактика рака осуществляется индукцией, ростом или активацией В-клеток или Т-клеток активированными хелперными Т-клетками. Таким образом, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению в данном аспекте может использоваться вместе с другим способом лечения или профилактики рака или с фармацевтической композицией, предназначенной для того же. Активация хелперных Т-клеток пептидом WT1 охватывает не только прямую активацию пептидом WT1, но также косвенную активацию вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, кодирующий пептид WT1, или клетку, содержащую веток экспрессии.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать, в дополнение к активированным хелперным клеткам в качестве активного ингредиента, например, носитель, эксципиент или им подобные. Способ введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно соответствующим образом выбрать, в зависимости от таких условий как тип заболевания, состояние субъекта или участок-мишень. Примеры таких способов включают, без ограничения, внутрикожное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, внутривенное введение, интраназальное введение и пероральное введение. Количество хелперных Т-клеток, содержащихся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, а также в лекарственной форме, количество раз введения и тому подобное, фармацевтической композиции по настоящему изобретению, можно соответствующим образом выбрать, в зависимости от таких условий как тип заболевания, состояние субъекта или участок-мишень.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики рака у субъекта, включающему добавление пептида WT1 к антиген-презентирующей клетке и, посредством этого, активацию хелперных Т-клеток, и введение активированных Т-клеток субъекту, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к применению пептида WT1 для получения фармацевтической композиции, содержащей активированные Т-клетки.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу определения присутствия или количества WT1-специфичных хелперных Т-клеток у любого из HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного и HLA-DRB1*0501-положительного субъекта, включающий:

(а) взаимодействие комплекса пептида WT1 антитела и молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 или молекулы HLA-DRB1*0501 с образцом от субъекта; и

(b) определение присутствия или количества хелперных Т-клеток, распознающих комплекс, содержащийся в образце. Образец от субъекта может представлять собой любой, пока имеется возможность того, что он содержит лимфоцит. Примеры образцов включают такую биологическую жидкость как кровь или лимфу и ткань. Комплекс пептида WT1 антитела и молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 или молекулы HLA-DRB1*0501 может быть получен, например, в виде тетрамера или пентамера с использованием способа, известного специалисту в данной области, такого как биотин-стрептавидиновый способ. Присутствие или количество хелперных Т-клеток, распознающих такой комплекс, может быть измерено с использованием способа, известного специалисту в данной области. В данном аспекте настоящего изобретения, комплекс может быть меченым. В качестве метки, может использоваться известная метка, такая как флуоресцентная метка или радиоактивная метка. Присутствие или количество пептида WT1 можно легко и быстро определить его мечением. Способ по настоящему изобретению в данном аспекте может использоваться для диагностики рака, его прогноза или тому подобного.

Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет композицию для определения присутствия или количества хелперных Т-клеток у любого из HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного и HLA-DRB1*0501-положительного субъекта, содержащую комплекс пептида WT1 антитела и молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 или молекулы HLA-DRB1*0501.

Кроме того, настоящее изобретение предоставляет набор для определения присутствия или количества хелперных Т-клеток у любого из HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного и HLA-DRB1*0501-положительного субъекта, содержащий комплекс пептида WT1 антитела и молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 или молекулы HLA-DRB1*0501.

Кроме того, при определении присутствия или количества хелперных Т-клеток, когда пептид WT1 способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502 при определении присутствия или количества хелперных Т-клеток, можно определить присутствие или количество хелперных клеток у субъекта с таким подклассом II класса МНС. В таком случае, используется комплекс пептида WT1 и молекулы II класса МНС, с которой связывается пептид WT1.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения хелперных Т-клеток с использованием комплекса пептида WT1 и молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 или молекулы HLA-DRB1*0501, включающему:

(а) взаимодействие образца с комплексом; и

(b) получение хелперных Т-клеток, распознающих комплекс, содержащийся в образце. Комплекс описан выше. Образец может представлять собой любой образец, пока имеется возможность того, что он содержит лимфоцит. Примеры образцов включают образец от субъекта, такой как кровь и клеточная культура. Хелперные Т-клетки, распознающие комплекс, могут быть получены с использованием способа, известного специалисту в данной области, такого как FACS и MACS. Настоящее изобретение обеспечивает возможность культивирования полученных хелперных Т-клеток и использования их для лечения или профилактики различных форм рака.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к хелперным Т-клеткам, которые могут быть получены способом получения хелперных Т-клеток с использованием комплекса пептида WT1 и молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 или молекулы HLA-DRB1*0501.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору для получения хелперных Т-клеток, содержащему комплекс пептида WT1 и молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 или молекулы HLA-DRB1*0501.

Кроме того, при получении хелперных Т-клеток, когда пептид WT1 способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502, можно получить хелперные Т-клетки, распознающие комплекс такого подкласса II класса МНС и пептида WT1. В таком случае, используется комплекс пептида WT1 и молекулы II класса МНС, с которой он связывается.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу определения присутствия или количества WT1-специфичных хелперных Т-клеток у любого из HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного и HLA-DRB1*0501-положительного субъекта, включающему:

(а) стимуляцию мононуклеарных клеток периферической крови, инвазивных лимфоцитов, опухолевых клеток, клеток в асцитической жидкости, клеток в плевральной жидкости, клеток в спинномозговой жидкости, клетки костного мозга или клетки лимфоузлов пептидом WT1; и

(b) определение продукции цитокина или реакции хелперных Т-клеток,

где присутствие или увеличение количества цитокина или реакции хелперных Т-клеток указывает на присутствие или количество, распознающих комплекс, содержащийся в образце WT1-специфичных хелперных Т-клеток. Клетки, такие как мононуклеарные клетки периферической крови, инвазивные лимфоциты, опухолевые клетки, клетки в асцитической жидкости, клетки в плевральной жидкости, клетки в спинномозговой жидкости, клетки костного мозга или клетки лимфоузлов, используемые в способе по настоящему изобретению, могут быть получены у здорового субъекта или пациента, страдающего раком. Путем использования клеток от здорового субъекта, можно определить, страдает ли пациент раком или нет, имеет ли субъект предрасположенность к нему или нет, и тому подобное. Путем использования клеток от пациента, страдающего раком, можно прогнозировать, окажет ли эффект иммунотерапия с применением WT1 у пациента, страдающего раком, или ему подобного, или нет. Стимуляция клеток пептидом WT1 может осуществляться in vitro или in vivo. Ввиду легкости, предпочтительна стимуляция in vitro. Присутствие продукции цитокинов или реакции хелперных Т-клеток, или количество продуцируемых цитокинов или реакции хелперных Т-клеток может определяться известным способом.

Следующие примеры более детально иллюстрируют настоящее изобретение, но их не следует рассматривать как ограничивающие его объем.

Примеры

1. Получение антиген-презентирующих клеток

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из периферической крови, которую брали у здорового донора (HLA-DRB1*1501-положительного, HLA-DRB1*0901-положительного или HLA-DRB1*0501-положительного). РВМС высевали в 6-луночный пластиковый планшет при плотности 1×10⁷ клеток/лунку в 1% сыворотке АВ (Nabi, Miami, FL), среде X-VIVO 15 (Cambrex) и культивировали в течение 2 часов. После культивирования, суспензированные клетки удаляли, и оставшиеся прилипшие клетки культивировали в 1000 МЕ/мл (PeproTech), 1000 МЕ/мл GM-CSF (PeproTech), 1% сыворотке АВ и среде X-VIVO 15. На 2-й и 4-й день, среду меняли и добавляли IL-4 и GM-CSF. На 6-й день к зрелым антиген-презентирующим клеткам добавляли 100 МЕ/мл TNF-α.

2. Индукция специфичных для пептида WT1 CD4-положительных Т-клеток

CD4-положительные Т-клетки были выделены из крови, полученной от того же донора, с использованием RosetteSep для разделения CD4 положительных Е-клеток (StemCell). CD4-положительные Т клетки (3×10⁶ клеток) были добавлены к каждой лунке 24-ячеечной планшеты. Они были стимулированы аутологичными антиген-презентирующими клетками (3×10⁵ клеток), с инъекцией 20 мкг/мл пептида WT1 (SEQ ID No:2), и подвергнуты облучению дозой в 25 Грей. На следующий день после стимуляции добавляли 20 Ед/мл IL-2. Аналогично, стимулированные CD4-положительные Т-клетки подвергались стимулированию инъекцией 20 мкг/мл пептида WT1 каждую последующую неделю. Кроме того, в каждый последующий день после второй стимуляции, проводили замену среды на среду, которая содержала IL-2. CD4-положительные Т-клетки, индуцированные за счет трехкратной стимуляции (HLA-DRB1*1501 и HLA-DRB1*0901-положительные Т-клетки, обозначенные соответственно как клетки ТА28.1 и клетки Е15.2,), использовались для последующих экспериментов.

3. Измерение IFN-γ

Клетки ТА28.1 и мононуклеарные клетки периферической крови от субъекта, у которого были получены клетки ТА28.1, культивировали в присутствии 20 мкг/мл пептида WT1 мкг/мл в течение 24 часов. После культивирования, количество IFN-γ в супернатанте определяли с использованием набора ELISA (иммуноферментного анализа). В качестве контроля, использовали мононуклеарные клетки периферической крови от HLA-DRB1*1501-отрицательного субъекта. Результаты показаны на фиг.1. Было подтверждено, что клетки ТА28.1 распознают пептид WT1 специфично для молекулы HLA-DRB1*1501 для увеличения продуцируемого количества IFN-γ (т.е. активации).

Кроме того, при использовании набора ELISA было подтверждено, что клетки ТА28.1 и Е15.2 не продуцируют IL-4 и IL-10. Результаты показаны на фиг.2 и 3. Было подтверждено, что клетки ТА28.1 и Е15.2 представляют собой клетки Th1.

HLA-DRB1*0501/*0501-положительные мононуклеарные клетки использовали для выполнения следующих экспериментов. Клетки суспендировали в среде X-VIVO (1% сыворотка АВ) и добавляли 20 мкг/мл пептида WT1, 10 мкг/мл Брефелдина А и 0,5 мкг/мл CD28/49d. Их инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 4 часов. В качестве контроля использовали клетки, инкубированные без добавления пептида WT1. После промывания буфером, добавляли анти-CD3-perCP антитело и анти-CD4-APC антитело, и их инкубировали при 4°С в течение 30 минут. После промывания буфером, клетки фиксировали и пермеабилизировали с использованием BD Cytofix/Cytoperm (4°С, 20 минут). После промывания пермеабилизацинно/промывным буфером BD, добавляли анти-INF-γ-FITC (BD, клон: В27) и анти-IL-PE (eBioscience, клон: eBio64DEC17), и их инкубировали при 4°С в течение 30 минут. После промывания буфером, клетки анализировали лазерным сортировщиком клеток по интенсивности их флуоресценции FACSAria. Результаты показаны на фиг.4. Было подтверждено, что HLA-DRB1*0501-положительные мононуклеарные клетки растут и продуцируют IFN-γ и IL-17.

4. Анализ роста

Анализ роста выполняли способом включения [³H]-тимидина. Клетки ТА28.1 (3×10⁴) и мононуклеарные клетки периферической крови (HLA-DRB1*1501-положительные; 1×10⁵ клеток), которые были подвергнуты пульсирующей обработке пептидом WT1 и облучению, культивировали в 96-луночном планшете. После культивирования в течение 80 часов, добавляли 37 кБк/лунку [³H]-тимидина (Amersham Biosciences). Их инкубировали в течение еще 16 часов и измеряли, используя β-сцинтилляционный счетчик. Данные измерений представляли в виде импульсов/минуту (имп/мин). В качестве контроля, использовали мононуклеарные клетки периферической крови без пульсирующей обработки. Кроме того, для подтверждения того, что сигнал активации специфичен для молекулы HLA-DRB1*1501, использовали антитело против I класса МНС, анти-HLA-DR антитело, анти-HLA-DQ антитело и анти-HLA-DP антитело. Результаты показаны на фиг.5. Было подтверждено, что клетки ТА28.1 были активированы сигналом через пептид WT1 и HLA-DRB1*1501 и проявили рост. Кроме того, было подтверждено, что рост был специфичным для HLA-DRB1*1501, потому что она подавлялась анти-HLA-DR антителом.

Аналогичным образом, клетки Е15.2 использовали для выполнения анализа роста. В качестве дополнительного контроля, использовали мононуклеарные клетки периферической крови от HLA-DPB1*0901-отрицательного субъекта. Результаты показаны на фиг. 6 и 7. Было подтверждено, что клетки Е15.2 были активированы сигналом через пептид WT1 и HLA-DPB1*0901 и проявили рост. Кроме того, было подтверждено, что рост был специфичным для HLA-DPB1*0901, потому что она подавлялась анти-HLA-DP антителом.

Кроме того, HLA-DPB1*0501/*0501-положительные мононуклеарные клетки использовали для выполнения анализа роста. В качестве контроля, также использовали мононуклеарные клетки периферической крови от HLA-DPB1*0501-отрицательного субъекта. Результаты показаны на фиг.8 и 9. Было подтверждено, что HLA-DPB1*0501/*0501-положительные мононуклеарные клетки были активированы сигналом через пептид WT1 и HLA-DPB1*0501 и проявили рост. Кроме того, было подтверждено, что рост был специфичным для HLA-DPB1*0501, потому что она подавлялась анти-HLA-DP антителом.

Кроме того, анализ роста клеток Е15.2 был выполнен с различными концентрациями пептида WT1. Концентрация использованного пептида WT1 составляла 0,08, 0,4, 2, 10, 50, 100 или 150 мкг/мл. Результаты показаны на фиг.10. Было подтверждено, что пептиды WT1 стимулируют рост Т-клеток Е15.2 зависимым от концентрации образом.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение предоставляет способ активации хелперных Т-клеток пептидом WT1, который способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DRB1*0901 и молекулой HLA-DRB1*0501, и композицию для этого, а также фармацевтическую композицию для лечения и/или профилактики рака путем активации хелперных Т-клеток и им подобных. Поэтому, настоящее изобретение может использоваться в областях медицины и подобных областях, например, в областях разработки и получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения различных гематопоэтических опухолей и солидных форм рака, которые на высоком уровне экспрессируют ген WT1.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к активации хелперных Т-клеток, которые специфичны к пептиду WT1, и может быть использовано в медицине для индукции иммунного ответа против WT1-экспрессирующей злокачественной опухоли. Способ активации хелперных Т-клеток включает приведение антиген-презентирующей клетки, положительной по меньшей мере по одной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501, в контакт с пептидом WT1 с SEQ ID NO: 2, способным связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501. Изобретение позволяет получить хелперные Т-клетки, экспрессирующие комплекс TCR-CD3, который распознает комплекс пептида WT1 и молекулы HLA, выбранной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 10 ил., 4 пр.

1. Способ активации хелперных Т-клеток, включающий

приведение антиген-презентирующей клетки в контакт с пептидом WT1 и, таким образом, активацию хелперных Т-клеток, где

(a) пептид WT1 обладает способностью связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501, и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности:

Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и

(b) антиген-презентирующая клетка является положительной по меньшей мере по одной из молекул, выбранных из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501; и

(c) хелперные Т-клетки экспрессируют комплекс TCR-CD3, который распознает комплекс пептида WT1 и молекулы HLA, выбранной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501.

2. Способ по п.1, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502.

3. Способ по п.1, в котором стадию приведения антиген-презентирующей клетки в контакт с пептидом WT1 осуществляют путем добавления пептида WT1 к антиген-презентирующей клетке.

4. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, страдающего WT1-специфическим злокачественным новообразованием, включающий приведение антиген-презентирующей клетки субъекта в контакт с пептидом WT1 in vivo и, таким образом, активацию хелперных Т-клеток у субъекта, где

(a) пептид WT1 обладает способностью связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501 и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности:

Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и

(b) антиген-презентирующая клетка является положительной по меньшей мере по одной из молекул, выбранных из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501; и

(c) хелперные Т-клетки экспрессируют комплекс TCR-CD3, который распознает комплекс пептида WT1 и молекулы HLA, выбранной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501.

5. Способ по п.4, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502.

6. Способ по п.4, в котором стадию приведения антиген-презентирующей клетки в контакт с пептидом WT1 осуществляют путем добавления пептида WT1 к антиген-презентирующей клетке.

7. Способ по п.4, где WT1-специфическое злокачественное новообразование представляет собой гематопоэтическую опухоль или солидный рак.

8. Способ по п.7, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому или злокачественную лимфому.

9. Способ по п.7, где солидный рак представляет собой рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, рак клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников.

10. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, страдающего WT1-специфическим злокачественным новообразованием, включающий приведение антиген-презентирующей клетки субъекта в контакт с пептидом WT1 in vitro и, таким образом, активацию хелперных Т-клеток, и введение активированных хелперных Т-клеток субъекту, где

(a) пептид WT1 способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501, и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности:

Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и

(b) антиген-презентирующая клетка является положительной по меньшей мере по одной из молекул, выбранных из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501; и

(c) хелперные Т-клетки экспрессируют комплекс TCR-CD3, который распознает комплекс пептида WT1 и молекулы HLA, выбранной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501.

11. Способ по п.10, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502.

12. Способ по п.10, где WT1-специфическое злокачественное новообразование представляет собой гематопоэтическую опухоль или солидный рак.

13. Способ по п.12, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому или злокачественную лимфому.

14. Способ по п.12, где солидный рак представляет собой рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, рак клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников.

15. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, страдающего WT1-специфическим злокачественным новообразованием, включающий введение пептида WT1 субъекту, у которого было диагностировано WT1-специфическое злокачественное новообразование, где

(a) пептид WT1 обладает способностью связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501, и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности:

Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и

(b) субъект имеет молекулу HLA, выбранную из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501.

16. Способ по п.15, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502.

17. Способ по п.15, где WT1-специфическое злокачественное новообразование представляет собой гематопоэтическую опухоль или солидный рак.

18. Способ по п.17, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому или злокачественную лимфому.

19. Способ по п.17, где солидный рак представляет собой рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, рак клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников.