АНТИТЕЛА PD-1 Российский патент 2019 года по МПК C07K16/30 C12N15/00 A61K39/395 A61P35/00 

Данное изобретение относится к области медицины. Более конкретно, данное изобретение относится к антителам, которые связывают белок программируемой гибели клеток 1 человека (PD-1) и могут быть полезны для лечения рака в одиночку и в сочетании с химиотерапией и другими противораковыми терапиями.

Клетки опухоли избегают обнаружения и элиминации иммунной системой посредством множества механизмом. Пути иммунной контрольной точки используются при поддержании толерантности и активации Т-клеточного контроля, но клетки рака могут использовать пути для предотвращения разрушения. Путь PD-1/лиганд 1 программированной клеточной гибели 1 (PD-L1) является одной из таких иммунных контрольных точек. PD-1 человека обнаружен на Т-клетках, и связывание PD-L1 и лиганда-2 программируемой клеточной смерти 1 человека (PD-L2) с PD-1 ингибирует пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов. Таким образом, продуцирование клетками опухоли PD-L1 и PD-L2 позволяет избежать контроля со стороны Т-клеток.

Было показано, что полностью человеческое антитело IgG4 (S228P) против PD-1 человека – ниволумаб, ингибирует связывание PD-1 с PD-L1 и PD-L2, и оно было протестировано в различных клинических испытаниях. (Wang et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(9):846). Было показано, что гуманизированное антитело IgG4 (S228P) против PD-1 – пемпбролизумаб (бывший ламбролизумаб), ингибирует связывание PD-1 с PD-L1 и PD-L2, и оно было протестировано в различных клинических испытаниях. (WO2008156712 и Hamid et al., N Engl J Med (2013) 369:2).

Остается необходимость предоставить альтернативные антитела, которые связывают и нейтрализуют взаимодействие PD-1 человека с PD-L1 и PD-L2. В частности, остается потребность в предоставлении антител, которые связывают PD-1 человека с более высокой аффинностью, чем некоторые антитела предшествующего уровня техники. Кроме того, остается потребность в предоставлении антител, которые более эффективно блокируют взаимодействие PD-1 человека с PD-L1 и PD-L2, чем некоторые антитела предшествующего уровня техники. Более высокое сродство и лучшее блокирование, отдельно или вместе, могут привести к большей активности in vivo или снижению требуемых дозирующих количеств.

Некоторые антитела по данному изобретению связывают PD-1 человека с более высоким сродством, чем ниволумаб и пембролизумаб. Кроме того, некоторые антитела по данному изобретению опосредуют предпочтительную улучшенную аллореактивность по сравнению с ниволумабом и пембролизумабом в модели in vivo.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), содержащее легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (HC), где легкая цепь содержит области, определяющие комплементарность легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3 состоящие из аминокислотных последовательностей RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) и QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), соответственно, и где тяжелая цепь содержит области, определяющие комплементарность тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем HCDR1 состоит из аминокислотных последовательностей KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2) или KASGGTLSSYAIS (SEQ ID NO: 3), при этом HCDR2 состоит из аминокислотных последовательностей LIIPMFGTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 4), LIIPMFDTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 5) или LIIPMFGAAGYAQRFQG (SEQ ID NO: 6), и при этом HCDR3 состоит из аминокислотных последовательностей ARAEYSSTGTFDY (SEQ ID NO: 7) или ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8).

В некоторых вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, где LCDR1, LCDR2 и LCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) и QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), соответственно, и где HCDR1, HCDR2 и HCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2), LIIPMFGTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 4) и ARAEYSSTGTFDY (SEQ ID NO: 7), соответственно.

В некоторых вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, где LCDR1, LCDR2 и LCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) и QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), соответственно, и где HCDR1, HCDR2 и HCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2), LIIPMFDTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 5) и ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8), соответственно.

В некоторых вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, где LCDR1, LCDR2 и LCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) и QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11), соответственно, и где HCDR1, HCDR2 и HCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей KASGGTLSSYAIS (SEQ ID NO: 3), LIIPMFGAAGYAQRFQG (SEQ ID NO: 6) и ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8), соответственно.

В некоторых вариантах осуществления в данном изобретение предложено антитело, содержащее легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (HC), где легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (LCVR), а тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), где LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, а HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14.

В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, а HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, а HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, а HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.

В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23. В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24. В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.

В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20. В других вариантах осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23. В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24. В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антителу, в котором одна из тяжелых цепей образует межцепочечную дисульфидную связь с одной из легких цепей, а другая тяжелая цепь образует межцепочечную дисульфидную связь с другой легкой цепью, и одна из тяжелых цепей образует две межцепочечные дисульфидные связи с другой тяжелой цепью.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, в котором антитело является гликозилированным.

В одном варианте осуществления в данном изобретение предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), содержащее легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (HC), где легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (LCVR), а тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), где LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, а HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14.

В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, а HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, а HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, а HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.

В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.

В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а HC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.

В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23. В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24. В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи, в котором каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антителу, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором одна из тяжелых цепей образует межцепочечную дисульфидную связь с одной из легких цепей, а другая тяжелая цепь образует межцепочечную дисульфидную связь с другой легкой цепью, и одна из тяжелых цепей образует две межцепочечные дисульфидные связи с другой тяжелой цепью.

В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), в котором антитело является гликозилированным.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложена клетка млекопитающего, содержащая молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 19, причем клетка способна экспрессировать антитело, содержащее легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 19.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложена клетка млекопитающего, содержащая молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 20, причем клетка способна экспрессировать антитело, содержащее легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 20.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложена клетка млекопитающего, содержащая молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 21, причем клетка способна экспрессировать антитело, содержащее легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 21.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложен способ получения антитела, содержащего легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 19, включающий культивирование клетки млекопитающего по данному изобретению в условиях, при которых антитело экспрессируется, и восстановление экспрессированного антитела.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложен способ получения антитела, содержащего легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 20, включающий культивирование клетки млекопитающего по данному изобретению в условиях, при которых антитело экспрессируется, и восстановление экспрессированного антитела.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложен способ получения антитела, содержащего легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 21, включающий культивирование клетки млекопитающего по данному изобретению в условиях, при которых антитело экспрессируется, и восстановление экспрессированного антитела.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело, продуцируемому способом по данному изобретению.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело по данному изобретению и приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела по данному изобретению. В другом варианте осуществления в данном изобретении предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела по данному изобретению, причем рак представляет собой меланому, рак легкого, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичника или гепатоцеллюлярную карциному.

В другом варианте осуществления данные способы включают введение эффективного количества антитела по данному изобретению в одновременной, отдельной или последовательной комбинации с одним или более противоопухолевыми агентами. Неограничивающие примеры противоопухолевых агентов включают рамуцирумаб, нецитумумаб, оларатумаб, галунисертиб, абемациклиб, цисплатин, карбоплатин, дакарбазин, липосомальный доксорубицин, доцетаксел, циклофосфамид и доксорубицин, навелбин, эрибулин, паклитаксел, частички паклитаксела, связанные с белками для инъекционной суспензии, иксабепилон, капецитабин, FOLFOX (лейковорин, фторурацил и оксалиплатин), FOLFIRI (лейковорин, фторурацил и иринотекан) и цетуксимаб.

В другом варианте осуществления данные способы включают введение эффективного количества соединения по данному изобретению в одновременной, отдельной или последовательной комбинации с одним или более иммуноонкологическими агентами. Неограничивающие примеры иммуноонкологических агентов включают ниволумаб, ипилимумаб, пидилизумаб, пембролизумаб, тремелимумаб, урелумаб, лирилумаб, атезолизумаб и дурвалумаб.

В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело по данному изобретению для применения в терапии. В одном варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело по данному изобретению для применения в лечении рака. В следующем варианте осуществления в данном изобретении предложено антитело по данному изобретению для применения при лечении рака, причем рак представляет собой меланому, рак легкого, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичника или гепатоцеллюлярную карциному. В другом варианте осуществления, в данном изобретении предложено антитело по данному изобретению для применения в одновременной, отдельной или последовательной комбинации с одним или более противоопухолевыми агентами. В другом варианте осуществления, в данном изобретении предложено антитело по данному изобретению для применения в одновременной, отдельной или последовательной комбинации с одним или более противоопухолевыми агентами, выбранными из группы, состоящей из рамуцирумаба, нецитумумаба, оларатумаба, галунисертиба, абемациклиба, цисплатина, карбоплатина, дакарбазина, липосомального доксорубицина, доцетаксела, циклофосфамида и доксорубицина, навелбина, эрибулина, паклитаксела, частичек паклитаксела, связанных с белками для инъекционной суспензии, иксабепилона, капецитабина, FOLFOX (лейковорин, фторурацил и оксалиплатин), FOLFIRI (лейковорин, фторурацил и иринотекан) и цетуксимаба, для лечения рака.

В другом варианте осуществления, в данном изобретении предложено антитело по данному изобретению для применения в одновременной, отдельной или последовательной комбинации с одним или более иммуноонкологическими агентами. В другом варианте осуществления, в данном изобретении предложено антитело по данному изобретению для применения в одновременной, отдельной или последовательной комбинации с одним или более иммуноонкологическими агентами, выбранным из группы, состоящей из ниволумаба, ипилимумаба, пидилизумаба, пембролизумаба, тремелимумаба, урелумаба, лирилумаба, атезолизумаба и дурвалумаба, для лечения рака.

В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено применению антитела по данному изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения рака. В следующем варианте осуществления в данном изобретении предложено применение антитела по данному изобретению для изготовления лекарственного средства для применения при лечении рака, причем рак представляет собой меланому, рак легкого, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичника или гепатоцеллюлярную карциному.

В другом варианте осуществления в данном изобретении предложено применению антитела по данному изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения рака, причем указанное лекарственное средство предназначено для одновременного, отдельного или последовательного введения с одним или более противоопухолевым агентом. В другом варианте осуществления, в данном изобретении предложено антитело по данному изобретению для производства лекарственного средства для лечения рака, причем указанное лекарственное средство предназначено для одновременного, отдельного или последовательного введения с одним или более противоопухолевыми агентами, выбранными из группы, состоящей из рамуцирумаба, нецитумумаба, оларатумаба, галунисертиба, абемациклиба, цисплатина, карбоплатина, дакарбазина, липосомального доксорубицина, доцетаксела, циклофосфамида и доксорубицина, навелбина, эрибулина, паклитаксела, частичек паклитаксела, связанных с белками для инъекционной суспензии, иксабепилона, капецитабина, FOLFOX (лейковорин, фторурацил и оксалиплатин), FOLFIRI (лейковорин, фторурацил и иринотекан) и цетуксимаба.

Антитело по данному изобретению представляет собой сконструированный, не встречающийся в природе полипептидный комплекс. Молекула ДНК по данному изобретению представляет собой неприродную молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность одного из полипептидов в антителе по данному изобретению.

Антитело по данному изобретению сконструировано так, чтобы иметь сконструированные CDR и иметь некоторые части антитела (все или части каркасов, шарнирные области и константные области), которые имеют человеческое происхождение, которые идентичны или по существу идентичны (по существу человеческие) с каркасами и константными областями, полученными из геномных последовательностей человека. Полностью человеческие каркасы, шарнирные области и постоянные области представляют собой последовательности зародышевой линии человека, а также последовательности с естественными соматическими мутациями и те, у кого есть искусственные мутации. Антитело по данному изобретению может содержать каркасные, шарнирные или константные области, полученные из полностью человеческой каркасной, шарнирной или константной области, содержащей одну или более аминокислотных замен, делеций или добавок в ней. Кроме того, антитело по данному изобретению предпочтительно является по существу неиммуногенным у людей.

Антитело по данному изобретению представляет собой антитело типа IgG и имеет «тяжелые» цепи и «легкие» цепи, которые сшиты посредством внутри- и межцепочечных дисульфидных связей. Каждая тяжелая цепь состоит из N-концевой HCVR и константной области тяжелой цепи («HCCR»). Каждая легкая цепь состоит из LCVR и константной области легкой цепи («LCCR»). При экспрессии в определенных биологических системах антитела, имеющие природные последовательности Fc человека, являются гликозилированными в области Fc. Как правило, гликозилирование происходит в области Fc антитела в высококонсервативном сайте N-гликозилирования. N-гликаны обычно прикрепляются к аспарагину. Антитела могут быть гликозилированы и в других положениях.

Необязательно, антитело по данному изобретению содержит часть Fc, которая получена из области Fc IgG₄ человека из-за уменьшенной способности связываться с опосредованными Fc-рецепторами механизмами воспаления или активировать комплемент, что приводит к уменьшению эффекторной функции.

Некоторые антитела по данному изобретению содержат Fc-часть IgG₄, которая имеет мутацию серин на пролин в положении 228. Кроме того, некоторые антитела по данному изобретению содержат Fc-часть IgG4-PAA. Fc-часть IgG4-PAA имеет мутацию серин на пролин в положении 228, мутацию фенилаланина на аланин в положении 234 и мутацию лейцина на аланин в положении 235. Мутация S228P является шарнирной мутацией, которая предотвращает образование полу-антител (явление динамического обмена полумолекул в антителах IgG₄). Мутации F234A и L235A дополнительно уменьшают эффекторную функцию уже низкого изотипа IgG₄ человека. Кроме того, некоторые антитела по данному изобретению содержат Fc-часть IgG₄-PAA с удаленным С-концевым лизином (des-Lys) из тяжелой цепи.

Области HCVR и LCVR могут быть далее подразделены на области с гипервариабельностью, называемые областями, определяющими комплементарность («CDR»), перемежающиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями («FR»). Каждый HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В данном документе три CDR тяжелой цепи называются «HCDR1, HCDR2 и HCDR3», а три CDR легкой цепи называются «LCDR1, LCDR2 и LCDR3». CDR содержат большую часть остатков, которые участвуют в специфическом взаимодействии с антигеном. В данное время существуют три системы назначений CDR для антител, которые используются для определения последовательности. Определение CDR по Kabat (Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) основано на изменчивости последовательности антител. Определение CDR по Chothia (Chothia et al., “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., “Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) основано на трехмерных структурах антител и топологиях CDR-петель. Определения CDR по Chothia идентичны определениям CDR по Kabat, за исключением HCDR1 и HCDR2. Определение CDR по North (North et al., “A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)) основано на кластеризации распространения аффинности с большим количеством кристаллических структур. Для целей данного изобретения используются определения CDR по North.

Выделенную ДНК, кодирующую область HCVR, можно превратить в ген полноразмерной тяжелой цепи, путем функционального связывания ДНК, кодирующей HCVR, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи. Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека, а также других млекопитающих известны в данной области техники. Фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены, например, путем стандартной амплификации ПЦР.

Выделенную ДНК, кодирующую область LCVR, можно превратить в ген полноразмерной легкой цепи, путем функционального связывания ДНК, кодирующей LCVR, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области легкой цепи. Последовательности генов константной области легкой цепи человека, а также других млекопитающих известны в данной области техники. Фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены, путем стандартной амплификации ПЦР. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда.

Полинуклеотиды согласно данному изобретению будут экспрессироваться в клетке-хозяине после того, как последовательности функционально связываются с последовательностью, контролирующей экспрессию. Экспрессионные векторы обычно реплицируются в организмах-хозяевах либо в виде эписом, либо как неотъемлемая часть хромосомной ДНК хозяина. Обычно экспрессионные векторы будут содержать селекционные маркеры, например, тетрациклин, неомицин и дигидрофолатредуктазу, для возможности обнаружения этих клеток, трансформированных желаемыми последовательностями ДНК.

Антитело по данному изобретению можно легко получить в клетках млекопитающих, таких как клетки CHO, NS0, HEK293 или COS. Клетки-хозяева культивируют с использованием методик, хорошо известных в данной области техники.

Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотидные последовательности (например, полинуклеотиды, кодирующие полипептиды антитела и последовательности контроля экспрессии), могут быть перенесены в клетку-хозяин с помощью известных способов, которые варьируются в зависимости от типа клетки-хозяина.

Могут быть использованы различные способы очистки белка, и такие способы известны в данной области и описаны, например, в Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) и Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994).

В другом варианте осуществления данного изобретения антитело или нуклеиновые кислоты, кодирующие его, получают в выделенной форме. Используемый в данном документе термин «выделенный» относится к белку, пептиду или нуклеиновой кислоте, которые свободны или практически не содержат других макромолекулярных видов, обнаруженных в клеточной среде. «По существу свободный», используемый в данном документе, означает, что представляющий интерес белок, пептид или нуклеиновая кислота содержит более 80 % (на основании молярности) присутствующих макромолекулярных компонентов, предпочтительно более 90 % и более предпочтительно более 95 %.

Антитело по данному изобретению или фармацевтические композиции, содержащие его, можно вводить парентеральными способами (например, подкожно и внутривенно). Антитело по данному изобретению можно вводить пациенту самостоятельно с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или эксципиентами в виде однократной или множественной дозы. Фармацевтические композиции по данному изобретению могут быть получены способами, хорошо известными в данной области техники (например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) и содержат антитело, описанное в данном документе, и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или эксципиентов.

Термин «лечение» (или «лечить») относится к замедлению, прерыванию, остановке, облегчению, уменьшению или изменению прогрессии или тяжести существующего симптома, расстройства, состояния или заболевания.

«Связывает», используемый в данном документе в отношении сродства антитела к PD-1 человека, подразумевает, если не указано иное, K_D менее около 1×10^-6 М, предпочтительно менее около 1×10^-9 М, определенную общепринятыми способами, известными в данной области техники, в том числе с использованием биосенсора поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при 37 ^oC, по существу, как описано в данном документе.

Для целей данного раскрытия термин «высокое сродство» относится к K_D менее чем около 150 пМ для PD-1 человека, как определено при помощи MSD или SPR. Значения K_D устанавливаются кинетикой связывания, как описано в «Кинетика связывания и сродство» в разделе «Анализы».

«Эффективное количество» означает количество антитела по данному изобретению или фармацевтической композиции, содержащей антитело по данному изобретению, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ, или желаемый терапевтический эффект на ткань, систему, животное, млекопитающее или человека, которое является необходимым исследователю, врачу или другому клиницисту. Эффективное количество антитела может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и масса индивидуума, а также способность антитела вызывать желаемый ответ у индивидуума. Эффективным количеством является также количеством, при котором любой токсический или вредный эффект антитела перевешивается терапевтически благоприятными эффектами.

Данное изобретение далее проиллюстрировано следующим неограничивающим примером.

Пример 1: Экспрессия и очистка антитела

Полипептиды вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, целые аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела А - антитела I и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, перечислены ниже в разделе «Аминокислотные и нуклеотидные последовательности». Кроме того, SEQ ID NO для легкой цепи, тяжелой цепи, вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи антитела A - антитела I представлены в таблице 1.

Антитела по данному изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, антитело А - антитело I, могут быть получены и очищены по существу следующим образом. Соответствующая клетка-хозяин, такая как HEK 293 или CHO, может быть либо временно или стабильно трансфицирована с помощью экспрессионной системы для секреции антител с использованием оптимального заданного векторного отношения HC:LC, либо системы единичного вектора, кодирующей как HC, так и LC. Осветленные среды, в которые было выделено антитело, могут быть очищены с использованием любой из многих часто используемых методик. Например, среда может быть удобно применена к колонке MabSelect (GE Healthcare) или колонке KappaSelect (GE Healthcare) для Fab-фрагмента, которая была уравновешена совместимым буфером, таким как забуференный фосфатом физиологический раствор (pH 7,4). Колонку можно промыть для удаления неспецифических связывающихся компонентов. Связанное антитело может быть элюировано, например, с помощью градиента рН (такого как, 20 мМ Трис-буфер с рН 7 – 10 мМ натрий-цитратный буфер с рН 3,0 или фосфатно-буферный солевой раствор рН 7,4 – 100 мМ глициновый буфер, рН 3,0). Могут быть обнаружены фракции антител, такие как SDS-PAGE, и затем могут быть объединены. Дальнейшая очистка является необязательной, в зависимости от предполагаемого использования. Антитело может быть сконцентрировано и/или стерильно отфильтровано с использованием общих методик. Растворимые агрегат и мультимеры могут быть эффективно удалены при помощи общих методик, включая эксклюзионную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия или ионообменную хроматографию. Чистота антитела после этих этапов хроматографии превышает 95 %. Продукт может быть немедленно заморожен при -70 °C или может быть лиофилизирован. 

Таблица 1: SEQ ID NO

Антитело A
S228P IgG4 Антитело B
PAA IgG4 des-Lys Антитело C
VK1-12 IgG4 HCVR 12 12 12 LCVR 15 15 15 Тяжелая цепь 16 19 23 Легкая цепь 22 22 22

Антитело D
S228P IgG4 Антитело E
PAA IgG4 des-Lys Антитело F
VK1-12 IgG4 HCVR 13 13 13 LCVR 15 15 15 Тяжелая цепь 17 20 24 Легкая цепь 22 22 22

Антитело G
S228P IgG4 Антитело H
PAA IgG4 des-Lys Антитело I
VK1-12 IgG4 HCVR 14 14 14 LCVR 15 15 15 Тяжелая цепь 18 21 25 Легкая цепь 22 22 22

Анализы

Активность in vivo – анализ WINN

Антитела по данному изобретению могут быть измерены на иммуномодулирующую активность in vivo с помощью анализа Winn. В анализе Winn опухолевые клетки человека и иммунные клетки человека (аллогенные) вводят вместе в иммунодефицитную мышь, а затем вводят дозы иммуномодулирующего средства. Объем опухоли измеряют для определения влияния агента в анализе.

Усиление иммунного ответа на алло-антигены с помощью антител по данному изобретению может быть протестировано в модели ксенотрансплантата NSCLC человека NCI-H292. На 0-е сутки мышей NSG из лабораторий Jackson (7 недельного возраста, самки, в группах по 8-10 мышей) имплантировали в бок подкожно или 2 x10⁶ клеток H292, или смесь 2 x10⁶ клеток H292 и 1×106 РВМС человека в HBSS (общий объем 0,2 мл). Начиная с 1-х суток, мышей обрабатывали путем в/б (внутрибрюшинной) инъекции IgG человека в дозе 10 мг/кг, один раз в неделю. Состояние и поведение животных, включая уход за внешностью и передвижение, контролировали не реже двух раз в неделю. Массу тела и объем опухоли измеряют два раза в неделю.

В экспериментах, выполненных по существу так, как описано в данном анализе, антитело А или антитело D, дозированное в дозе 10 мг/кг, qw (раз в неделю), в/б хорошо переносятся и безопасны, поскольку контролируются массой тела и клиническими наблюдениями. Результаты роста опухоли и T/C % представлены в таблице 2. Опухоли в мышах, совместно имплантированных NCI-H292 и PBMC, и дозированных антителом А или антителом D в дозе 10 мг/кг qw, росли значительно медленнее и регрессировали с течением времени. В этих условиях антитело А и антитело D оба опосредуют предпочтительную улучшенную аллореактивность по сравнению с ниволумабом и пембролизумабом.

Таблица 2: анализ WINN

Сутки после
инокуляции опухоли 4 суток 7 суток 11 суток 14 суток 18 суток hIgG Среднее ± SEM 22,5 ± 7,3 106,1 ± 14,5 322,2 ± 27,3 365,5 ± 36,7 838,8 ± 134,7 hIgG + hPBMC Среднее ± SEM 56,7 ± 11,5 170,7 ± 20,2 178,5 ± 15,7 157,9 ± 17,1 86,7 ± 16,2 Ниволумаб + hPBMC Среднее ± SEM 61,0 ± 7,5 135,5 ± 11,2 215,8 ± 18,7 180,0 ± 31,8 93,5 ± 14,3 T/C % 108 % 79 % 121 % 114 % 108 % Пембролизумаб + hPBMC Среднее ± SEM 63,3 ± 5,4 145,0 ± 19,4 197,2 ± 22,1 144,9 ± 14,0 107,9 ± 15,9 T/C % 112 % 85 % 110 % 92 % 125 % Антитело A + hPBMC Среднее ± SEM 29,7 ± 5,0 49,7 ± 5,9 89,1 ± 12,8 40,7 ± 9,8 31,1 ± 17,9 T/C % 52 % 29 % 50 % 26 % 36 % Антитело D + hPBMC Среднее ± SEM 31,9 ± 2,6 69,2 ± 6,6 99,8 ± 13,3 52,6 ± 12,3 21,9 ± 7,9 T/C % 56 % 41 % 56 % 33 % 25 %

* T/C % представляет собой отношение объема опухоли в контроле (hIgG + hPBMC) против леченых мышей в указанное время.

Кинетика связывания и сродство

Кинетику и константу равновесной диссоциации (K_D) для PD-1 человека определяли для антител по данному изобретению с использованием методов анализа MSD, поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) и биослойной интерферометрии (ForteBio).

Используемый в данном документе термин ниволумаб представляет собой антитело человека IgG4 против PD-1, временно экспрессируемое заявителями в 293 клетках HEK, которое использует последовательности тяжелой цепи и легкой цепи из предлагаемого INN: Список 107 (№ CAS 946414-94-4). Используемый в данном документе термин пембролизумаб представляет собой антитело человека IgG4 против PD-1, временно экспрессируемое заявителями в 293 клетках HEK, которое использует последовательности тяжелой цепи и легкой цепи из предлагаемого INN: Список 72.

анализ MSD

Измерения равновесного сродства выполняли, как описано выше (Estep, P., et al., MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8). Титрование уравновешивающих растворов (SET) выполняли в PBS + 0,1 % BSA без IgG (PBSF), где антиген (мономер b-PD-1) поддерживали постоянным при 10-100 пМ и инкубировали с 3-5-кратным серийным разведением Fab или mAb, начиная с 5-100 нМ (экспериментальное состояние зависит от образца). Антитела, разведенные при 20 нМ в PBS, покрывали на стандартных связующих MSD-ECL-планшетах в течение ночи при 4 °С или при комнатной температуре в течение 30 мин. Планшеты блокировали BSA в течение 30 мин при встряхивании со скоростью 700 об/мин. Затем планшеты промывали 3 раза промывочным буфером (PBSF + 0,05 % Tween 20). SET образцы наносили и инкубировали на планшетах в течение 150 с при встряхивании со скоростью 700 об/мин с последующей промывкой. Антиген, захваченный на планшете, обнаруживали с 250 нг/мл меченого сульфометкой стрептавидина в PBSF путем инкубации на планшете в течение 3 мин. Планшеты промывали три раза промывочным буфером и затем считывали на приборе MSD Sector Imager 2400 с использованием 1x буфера чтения T с ПАВ. Процент свободного антигена изображали как функцию титрованного антитела в Prism и соответствует квадратичному уравнению для извлечения KD. Для повышения пропускной способности роботы для обработки жидкости используются во всех экспериментах MSD-SET, в том числе для подготовки образца SET.

В экспериментах, выполненных по существу так, как описано в данном анализе, антитела D и G в формате IgG1 и экспрессированные в дрожжах связывают PD-1 человека с K_D 12 пМ и 14 пМ соответственно. Пембролизумаб и ниволумаб, оба в формате IgG1, связывают PD-1 с K_D 130 пМ и 640 пМ соответственно. Измерения авидности для антител D и G продемонстрировали K_Dг приблизительно 0,9 пМ и 1 пМ соответственно. Пембролизумаб и ниволумаб связывают PD-1 человека с K_D приблизительно 3 пМ и 5 пМ соответственно.

Таблица 3: Связывание MSD антител по изобретению в формате IgG1

Название Моновалентная KD (пМ) против PD-1 человека Авидная KD (пМ) против PD-1 человека Антитело D в формате IgG1 12 0,9 Антитело G в формате IgG1 14 1 Пембролизумаб (IgG1) 130 3 Ниволумаб (IgG1) 640 5

Био-слойная интерферометрия

Измерения сродства ForteBio обычно выполняли, как описано выше (Estep, P., et al., High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8.). Кратко, измерения сродства ForteBio выполняли путем загрузки IgG онлайн на датчики AHQ. Датчики уравновешивали в автономном режиме в буфере для анализа в течение 30 минут, а затем контролировали в режиме онлайн в течение 60 секунд для установления базовой линии. Датчики с загруженными IgG подвергали воздействию 100 нМ антигена в течение 5 мин, после чего их переносили в буфер для анализа в течение 5 мин для измерения скорости. Кинетику анализировали с использованием модели связывания 1:1.

Таблица 4: Связывание с помощью био-слойной интерферометрии антител по изобретению

Моновалентная K_D (пМ)
Fab в растворе,
hPD-1_Fc на наконечнике датчика Моновалентная K_D (пМ)
hPD-1_HIS в растворе, IgG на наконечнике датчика Моновалентная K_D (пМ)
Fab в растворе,
cynoPD-1_Fc на наконечнике датчика Антитело D в формате IgG1 560 310 670 Антитело G в формате IgG1 490 440 590 Пембролизумаб в формате IgG1 2000 2000 470 Ниволумаб в формате IgG1 1700 4100 1200

В экспериментах, выполненных по существу так, как описано в данном анализе, антитела D и G связывают PD-1_Fc человеческий с K_D примерно в три-четыре раза ниже, чем ниволумаб и пембролизумаб, когда PD-1_Fc находится на кончике датчика. Когда антитело находилось на кончике датчика, антитела D и G связывали PD-1_Fc человека с KD примерно в четыре раза и в шесть раз ниже, чем ниволумаб и пембролизумаб. Антитела D и G связывали cynoPD-1_Fc с аналогичной K_D с ниволумабом и пембролизумабом.

Поверхностный плазмонный резонанс (SPR)

Иммобилизацию PD-1-Fc человека (R & D Systems) в качестве лиганда на поверхности чипа датчика выполняли при 25 °C. Антитела по данному изобретению использовали в качестве аналита и вводили через поверхность чипа иммобилизованного сенсора PD-1-Fc человека. Все анализируемые образцы исследовали в 3-кратных серийных разведениях от их начальной концентрации (90 нМ), 8 полных разведений с одним дубликатом при средней концентрации и нулем. Анализ проводили при 37 °С. Время контакта для каждого образца составляло 180 с при 30 мкл/мин. Время диссоциации: 300 секунд для 5 более низких концентраций и 1200 (Fab) или 2400 (T=0) или 3000 (4 недели 4 °C, 25 °C, 40 °C) секунд для 3 более высоких концентраций. Иммобилизованная поверхность регенерировали в течение 6-8 секунд с 0,4 % SDS при 30 мкл/мин, а затем стабилизировали в течение 5 секунд. Кинетику связывания анализировали с использованием программного обеспечения Biacore T200 Evaluation (версия 3.0). Данные относятся к пустой проточной ячейке, и данные приравнены к модели привязки 1:1.

В экспериментах, проведенных, по существу, как описано в данном анализе, антитело D связывается с K_D с PD-1 человека 102 пМ, ниволумабом с K_D 246 пМ и пембролизумабом с K_D 181 пМ. Как показано в таблице 6, антитело D сохраняло активность связывания в течение 4 недель в условиях повышенной температуры.

Таблица 5: Связывание с помощью SPR антитела D при длительной экспозиции и температурах

Связывание с
PD-1-Fc человека Kon (1/мс) Koff (1/с) K_D (пМ) Антитело D 2,86E+05 2,98E-05 104 Антитело D, 4 недели 4°C 3,77E+05 3,86E-05 103 Антитело D, 4 недели 25°C 3,54E+05 3,60E-05 102 Антитело D, 4 недели 40°C 3,58E+05 4,22E-05 118

Блокирование Elisa PD-1 человека к PD-L1 и PD-L2.

Для анализа блокирования рецептор-лиганд различные количества (антитела против PD-1 или контрольного IgG) смешивали с фиксированным количеством биотинилированного слитого белка PD-1-Fc (100 нг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь переносили в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые PD-L1-Fc (100 нг/лунка) или PD-L2-Fc (100 нг/лунка), а затем инкубировали при комнатной температуре еще 1 час. Планшеты промывали и добавляли конъюгат стрептавидин-HRP. Планшеты считывали с поглощением при 450 нм. IC50 представляет собой концентрацию антител, необходимую для 50 % ингибирования связывания PD-1 с PD-L1 или связывания с PD-L2.

В экспериментах, выполненных, по существу, как описано, антитело D блокирует взаимодействие PD-1 с PD-L1 с IC50 0,30 нМ и взаимодействие PD-1 с PD-L2 с IC50 0,34 нМ.

Таблица 6: Анализ блокирования Elisa PD-1 человека

Антитело D Ниволумаб Пембролизумаб Блокирование PD-1/PD-L1 (IC50 нМ) 0,30 0,25 0,24 Блокирование PD-1/PD-L2 (IC50 нМ) 0,34 0,26 0,27

Связывание с PD-1 человека на клетках СНО

Связывание антитела по данному изобретению с PD-1 человека можно измерить в анализе проточной цитометрии.

Клетки CHO (0,2 × 106) инкубировали с антителом от 200 нМ, титровали 19 раз в 2 раза до самой низкой концентрации 3,185 пМ в течение 30 мин в PBS 1 % BSA на льду. Затем клетки промывали 3 раза и инкубировали со вторичным антителом (меченое PE с конечной концентрацией 5 мкг/мл) в PBS 1 % BSA в течение 30 мин на льду (защищенное от света). Клетки промывали 3 раза и анализировали с помощью проточной цитометрии. Проточную цитометрию выполняли на системе Accuri C6 (BD Biosciences), а MFI рассчитывали с помощью программного обеспечения C6. EC50 рассчитывали на программном обеспечение Graphpad.

В экспериментах, выполненных по существу так, как описано в этом анализе, антитело G связывает PD-1 дозозависимым образом со значением EC50 (n = 1), равным 1,756 нМ, а пембролизумаб связывает PD-1 со значением EC50 (n = 1), равным 1,429 нМ. Антитело D связывает PD-1 дозозависимым образом со значением EC50 (n = 1), равным 0,9784 нМ, пембролизумаб со значением EC50 (n = 1), равным 0,9510 нМ, а ниволумаб со значением EC50 (n = 1), равным 0,9675 нМ. Антитело D и антитело G связываются с аналогичным EC50 с PD-1 человека, как и ниволумаб и пембролизумаб в этих условиях.

Блокирование человеческого PD-1 к PD-L2 в клетках CHO.

Способность антитела по данному изобретению блокировать связывание PD-1 человека с PD-L1 и PD-L2 может быть измерена при помощи проточной цитометрии.

Клетки CHO (0,2 × 10⁶) инкубировали с экспериментальным антителом 100 нМ в течение 30 мин в PBS 1 % BSA на льду. Затем клетки промывали 3 раза и инкубировали с PD-L2, связанным с NHS-флуоресцеин (Promega) в PBS 1 % BSA в течение 30 мин на льду (защищенное от света). Клетки промывали 3 раза и анализировали с помощью проточной цитометрии. Проточную цитометрию выполняли на системе Accuri C6 (BD Biosciences), а среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) рассчитывали с помощью программного обеспечения C6.

В экспериментах, выполненных по существу так, как описано в данном анализе, антитела D и G в формате IgG1, экспрессированные в дрожжах, блокировали связывание PD-L2-FITC человека, в результате чего MFI составлял 24697,7 и 31390,5 соответственно по сравнению с контрольным IgG, который приводил к MFI, равной 182959,1. Пембролизумаб и ниволумаб приводили к меньшему блокированию связывания PD-L2 с PD-1, чем антитела D и G с MFI 46245,9 и 54509,8 соответственно.

Таблица 7: Блокирование PD-1 человека на клетках СНО

Тестовый образец MFI (PD-L2-FITC) Только клетки 33449,7 Без IgG 199716,0 Контрольный IgG 182959,1 Ниволумаб 54509,8 Пембролизумаб 46245,9 Антитело D в формате IgG1 24697,7 Антитело G в формате IgG1 31390,5

Смешанная реакция лимфоцитов

Блокирование сигналов PD-1 антителами по данному изобретению может быть оценено путем измерения высвобождения ингибирующих сигналов во время активации Т-клеток. Ожидается, что уровни некоторых цитокинов, таких как ИЛ-2, увеличиваются, если пролиферация Т-клеток стимулируется обработкой антителами по данному изобретению.

2 × 106 PBMC высевали на лунку в 6-луночный планшет для культивирования ткани или колбу для культивирования ткани T25 в полной Т-клеточной среде. Клетки инкубировали в течение 2-3 часов, чтобы обеспечить адгезию моноцитов. Если адгезия недостаточна, используют бессывороточные среды. Неприкрепленные клетки удаляют, осторожно перемешивая колбу со свежей средой 3X.

Незрелые миелоидные DC генерируют путем культивирования моноцитов (1 × 10⁶ клеток/мл) из PBMC в средах X-VIVO 15, содержащих 1 % сыворотки AB, 10 мМ HEPES, 50 мкМ β-Me, ИЛ-4 (1000 ед/мл) и GM-CSF (1000 ед/мл), или 25-50 нг/мл каждого. Через 2 дня добавляли свежую среду, дополненную ИЛ-4 и GM-CSF. На 5-е сутки клетки либо замораживали, либо созревание индуцируется добавлением коктейля для стимуляции, содержащего rTNFa (1000 ед/мл), ИЛ-1b (5 нг/мл), ИЛ-6 (10 нг/мл) и 1 мкМ PGE2 в течение 2 суток при плотности клеток 3 × 10⁵ клеток/мл.

Выделение Т-клеток выполняли в соответствии с инструкциями производителя в нетронутом наборе для выделения CD4 + Т-клеток (Invitrogen). Для удаления нежелательных магнитных шариков (QIAGEN) используется магнит с 1,5-миллиметровой трубкой.

100000-200000 изолированных Т-клеток смешивали с 10000-20000 аллогенных монокристаллов в общем объеме 200 мкл в 96-круглых планшетах для культивирования тканей в течение 4-5 суток при 37 °С. Т-клетки стимулировали с использованием анти-CD3/CD28 DynaBeads в соотношении 3:1 (клетки:шарики) в качестве положительного контроля; шарики подготовлены в соответствии с инструкциями производителя. Тестируемые антитела добавляли в начале MLR и инкубировали в течение периода культивирования.

Обнаружение ИЛ-2 и ИФН-γ осуществляли в соответствии с инструкциями производителя (eBioscience). Измерения OD определяли в системе Multiskan FC (Thermo).

В экспериментах, проведенных, по существу, как описано в данном анализе, антитело D при каждой концентрации увеличивало ИЛ-2 больше, чем ниволумаб и пембролизумаб. Антитело D и G приводило к сопоставимому увеличению ИФН-γ также как ниволумаб и пембролизумаб.

Таблица 8: Изменение степени секреции ИЛ-2 против контрольного IgG

Концентрации IgG 100 нМ 10 нМ 1 нМ 0,1 нМ 0,01 нМ Пембролизумаб 2,03 2,49 2,04 1,47 1,06 Ниволумаб 2,37 2,44 1,72 1,26 1,09 Антитело D 3,08 2,63 2,45 1,64 1,25 Антитело G 2,45 2,62 3,12 1,91 1,36

Таблица 9: Изменение степени секреции ИФН-γ против контрольного IgG

Концентрации IgG 100 нМ 10 нМ 1 нМ 0,1 нМ 0,01 нМ Пембролизумаб 1,78 1,77 1,76 1,99 1,03 Ниволумаб 1,97 1,88 1,58 1,53 0,84 Антитело D 1,72 1,99 2,26 1,94 1,32 Антитело G 2,07 2,04 2,48 1,91 1,17

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой антитела, которые связывают белок программируемой гибели клеток 1 человека (PD-1). Данные антитела могут быть полезны для лечения рака в одиночку и в сочетании с химиотерапией и другими средствами лечения рака. 10 н. и 25 з.п. ф-лы, 9 табл.

1. Антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), содержащее легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (НС), где легкая цепь содержит области LCDR1, LCDR2 и LCDR3, определяющие комплементарность легкой цепи, состоящие из аминокислотных последовательностей RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) и QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11) соответственно, и где тяжелая цепь содержит области HCDR1, HCDR2 и HCDR3, определяющие комплементарность тяжелой цепи, где HCDR1 состоит из аминокислотных последовательностей KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2) или KASGGTLSSYAIS (SEQ ID NO: 3), где HCDR2 состоит из аминокислотных последовательностей LIIPMFGTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 4), LIIPMFDTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 5) или LIIPMFGAAGYAQRFQG (SEQ ID NO: 6), и где HCDR3 состоит из аминокислотных последовательностей ARAEYSSTGTFDY (SEQ ID NO: 7) или ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8).

2. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что LCDR1, LCDR2 и LCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) и QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11) соответственно, и тем, что HCDR1, HCDR2 и HCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2), LIIPMFGTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 4) и ARAEYSSTGTFDY (SEQ ID NO: 7) соответственно.

3. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что LCDR1, LCDR2 и LCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) и QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11) соответственно, и тем, что HCDR1, HCDR2 и HCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2), LIIPMFDTAGYAQKFQG (SEQ ID NO: 5) и ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8) соответственно.

4. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что LCDR1, LCDR2 и LCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 9), SAASSLQS (SEQ ID NO: 10) и QQANHLPFT (SEQ ID NO: 11) соответственно, и тем, что HCDR1, HCDR2 и HCDR3 состоят из аминокислотных последовательностей KASGGTLSSYAIS (SEQ ID NO: 3), LIIPMFGAAGYAQRFQG (SEQ ID NO: 6) и ARAEHSSTGTFDY (SEQ ID NO: 8) соответственно.

5. Антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), содержащее легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (НС), где легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (LCVR), а тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), при этом LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, a HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14.

6. Антитело по п. 5, отличающееся тем, что LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, a HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12.

7. Антитело по п. 5, отличающееся тем, что LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, a HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13.

8. Антитело по п. 5, отличающееся тем, что LCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, a HCVR имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

9. Антитело, которое связывает PD-1 человека (SEQ ID NO: 1), содержащее легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (НС), LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а НС имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.

10. Антитело по п. 9, отличающееся тем, что LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а НС имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16.

11. Антитело по п. 9, отличающееся тем, что LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а НС имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.

12. Антитело по п. 9, отличающееся тем, что LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а НС имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18.

13. Антитело по п. 9, отличающееся тем, что LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а НС имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19.

14. Антитело по п. 9, отличающееся тем, что LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а НС имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20.

15. Антитело по п. 9, отличающееся тем, что LC имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а НС имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.

16. Антитело по п. 9, содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи, где каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.

17. Антитело по п. 16, отличающееся тем, что каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16.

18. Антитело по п. 16, отличающееся тем, что каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.

19. Антитело по п. 16, отличающееся тем, что каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18.

20. Антитело по п. 16, отличающееся тем, что каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19.

21. Антитело по п. 16, отличающееся тем, что каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20.

22. Антитело по п. 16, отличающееся тем, что каждая легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, а каждая тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21.

23. Антитело по любому из пп. 16-22, отличающееся тем, что одна из тяжелых цепей образует межцепочечную дисульфидную связь с одной из легких цепей, а другая тяжелая цепь образует межцепочечную дисульфидную связь с другой легкой цепью, и одна из тяжелых цепей образует две межцепочечные дисульфидные связи с другой тяжелой цепью.

24. Антитело по любому из пп. 1-23, отличающееся тем, что является гликозилированным.

25. Клетка млекопитающего для экспрессии антитела, содержащего легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 20, где клетка содержит молекулу ДНК, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 20.

26. Способ получения антитела, содержащего легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 20, включающий культивирование клетки млекопитающего по п. 25 в условиях, при которых антитело экспрессируется, и выделение экспрессированного антитела.

27. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая антитело по любому из пп. 1-24 в эффективном количестве и приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

28. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела по любому из пп. 1-24.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что рак представляет собой меланому, рак легкого, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичника или гепатоцеллюлярную карциному.

30. Способ по п. 28 или 29, дополнительно включающий введение одновременно, отдельно или последовательно одного или более противоопухолевых агентов.

31. Применение антитела по любому из пп. 1-24 для блокирования взаимодействия PD-1 человека с PD-L1 или PD-L2.

32. Применение антитела по любому из пп. 1-24 в лечении рака.

33. Применение по п. 32, отличающееся тем, что рак представляет собой меланому, рак легкого, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичника или гепатоцеллюлярную карциному.

34. Применение антитела по любому из пп. 1-24 в одновременной, отдельной или последовательной комбинации с одним или несколькими противоопухолевыми агентами при лечении рака.

35. Применение по п. 34, отличающаяся тем, что рак представляет собой меланому, рак легкого, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичника или гепатоцеллюлярную карциному.