ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ RET, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 A61P35/00 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к человеческим антителам и антигенсвязывающим фрагментам человеческих антител, которые специфически связываются с рецепторной тирозинкиназой RET (перестроенной во время трансфекции), и к композициям, содержащим такие антитела, а также терапевтическим способам применения данных антител.

Перечень последовательностей

[0002] Официальная копия перечня последовательностей подана одновременно с описанием в электронном виде через EFS-Web в виде перечня последовательностей в формате ASCII с именем файла 10582WO01_SeqList_ST25.TXT, дата создания 09 апреля 2020 г., и размером приблизительно 168 килобайт. Перечень последовательностей, содержащийся в настоящем документе в формате ASCII, является частью настоящего описания и включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[0003] Рецепторная тирозинкиназа RET (REarranged during Transfection - перестроенная во время трансфекции) экспрессируется в ходе развития в различных тканях, в том числе в периферической и центральной нервной системе и в почке (Arighi, Е. et al, (2005), Cytokine Growth Factor Rev 16:441-467; Borrello, MG, et al, (2013), Expert Opin. Ther. Targets, 17(4):403-419; Golden, JP, et al. (1998), J. Сотр. Neurol. 398:139-150; Golden, JP, et al. (1999), Exp. Neurol. 158:504-528). Она также экспрессируется в клетках нервного гребня и регулирует пролиферацию, миграцию и выживаемость клеток (Coulpier, М. et al, (2002), J Biol Chem, 277:1991-1999; Golden, JP, et al. (1998), J. Comp. Neurol. 398:139-150; Golden, JP, et al. (1999), Exp. Neurol. 158:504-528). У мышей, нокаутных no RET, обнаруживается агенезия почек и отсутствуют кишечные нейроны в пищеварительном тракте. Очень похожий фенотип наблюдается у нокаутных как по GFRα1, так и по GDNF мышей, что подтверждает основную роль GDNF/GFRα1 в активации передачи сигналов RET в ходе развития.

[0004] RET является сигнальным рецептором для лигандов семейства глиальных нейротрофических факторов (GDNF), которое включает GDNF, артемин, нейртурин и персефин. Лиганды семейства GDNF взаимодействуют и активируют RET только в присутствии одного из четырех GPI-связанных корецепторов, известных как α-рецепторы семейства GDNF, GFRcc(1-4) (Baloh, RH, et al. (2000), Curr Opin Neurobiol 10:103-110; Borrello, MG, et al (2013), Expert Opin. Ther. Targets, 17(4):403-419). Первичными лигандами для корецепторов GFRα1, GFRα2, GFRα3 и GFRα4 являются GDNF, нейртурин (NRTN), артемин (ARTN) и персефин (PSPN) соответственно, хотя в условиях in vitro наблюдаются перекрестные реакции между лигандами и корецепторами.

[0005] Роль RET как фактора влияния на туморогенез была установлена с помощью активирующих мутаций, которые зачастую наблюдаются при синдромах множественной эндокринной неоплазии MEN2A и MEN2B и при наследственном медуллярном раке щитовидной железы (Mulligan, LM, et al, (1994), Nat. Genet. 6:70-74). Кроме того, соматические активирующие мутации в RET присутствуют в большой доле спорадических медуллярных форм рака щитовидной железы (Fusco, A. et al, (1987), Nature 328:170-172; Grieco, M. et al, (1990), Cell 60:557-563). Такие мутации могут иметь место в киназном домене или во внеклеточном домене, где они приводят к образованию неспаренных цистеинов, которые, как считается, способствуют лиганд-независимой димеризации и активации RET. Таким образом, с помощью генетических исследований был четко установлен канцерогенный потенциал RET у людей.

[0006] Помимо его роли при эндокринных формах рака, в недавней работе RET была выявлена как потенциальная терапевтическая мишень при раке молочной железы. RET и GFRα1 экспрессируются в линиях клеток рака молочной железы и в образцах первичного рака молочной железы человека. Интересно, что экспрессия RET и GFRα1 может быть индуцирована эстрогеном в условиях in vitro. В соответствии с данным наблюдением, RET и GFRα1 преимущественно экспрессируются в подгруппе положительных по рецепторам эстрогена форм рака молочной железы. Кроме того, GDNF-индуцированная передача сигналов RET способствует независимому от заякоривания росту клеток положительного по рецептору эстрогена рака молочной железы и усиливает эффекты эстрогена на рост и выживание данных клеток, что указывает на функциональное взаимодействие между такими двумя путями. Таким образом, передача сигналов RET, судя по всему, является важным фактором влияния на развитие онкогенного фенотипа у клеток рака молочной железы (Wang, С. et al (2012), Breast Cancer Res Treat 133(2):487-500; Stine, ZE, et al, (2011), Human Molecular Genetics 20(19):3746-3756).

[0007] Активация RET инициируется связыванием GDNF с GFRα1. Затем комплекс GDNF/GFRα1 связывается с RET, что в результате приводит к димеризации и активации рецептора. Есть несколько малых молекул, которые обладают способностью ингибировать RET, в том числе средство (вандетаниб), которое проявляет свою активность у пациентов с медуллярным раком щитовидной железы (см., Wells, SA et al, (2012), J Clin Oncol 30:134-141; Leboulleux, S. et al, (2012), Lancet Oncol 13:897-905). Были выявлены и другие малые молекулы, которые связываются и ингибируют передачу сигналов RET (Borrello, MG, et al, (2013), Expert Opin. Ther. Targets, 17(4):403-419). К сожалению, по причине отсутствия специфичности у некоторых из таких соединений в клинических испытаниях наблюдали побочные эффекты, которые помешали дальнейшей их разработке.

[0008] До настоящего момента не было сообщений о терапевтических моноклональных антителах к RET для применения в клинических условиях для лечения экспрессирующих RET опухолей. Представленные в настоящем документе результаты исследований описывают получение полностью человеческих моноклональных антител, которые связываются с RET и предотвращают взаимодействие RET с одним или несколькими представителями семейства GDNF в комплексе с их соответствующими корецепторами.

[0009] Доменная структура внеклеточного участка RET показана на фиг. 1 и состоит из четырех кадгерин-подобных доменов, за которыми следует богатый цистеином домен (см. Borrello, MG, et al (2013), Expert Opin. Ther. Targets, 17(4):403-419). Хотя структура активного сигнального комплекса RET все еще не была установлена, похоже, что комплекс GDNF/GFRα1 имеет контакты с внеклеточным доменом RET в нескольких сайтах, включая четвертый кадгерин-подобный домен и богатый цистеином домен. Таким образом, антитела к некоторым доменам RET могут эффективно ингибировать передачу сигналов. Антитела к RET были описаны и могут быть найдены в US6861509 и US2009/0136502.

[0010] Тем не менее, учитывая роль, которую RET играет в росте и пролиферации опухолевых клеток, и учитывая тот факт, что существует несколько средств, одобренных для целенаправленного воздействия на данную молекулу, все еще существует потребность в ингибиторах RET, например, человеческих антителах, которые специфически связываются с RET, которые обладают высокой эффективностью и не вызывают побочных эффектов, препятствующих получению одобрения для клинического применения.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

[0011] Настоящее изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам (mAb) или их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с RET и ингибируют связывание или взаимодействие RET с одним или несколькими лигандами-представителя семейства GDNF (GDNF, нейртурином, артемином и персефином) в комплексе с их соответствующими корецепторами (GFRα1, GFRα2, GFRα3 и GFRα4 соответственно). В соответствии с одним вариантом осуществления, описываемые в настоящем документе человеческие антитела к RET предупреждают взаимодействие RET с комплексом GDNF/GFRα1. В соответствии с родственным вариантом осуществления, описываемые в настоящем документе человеческие антитела к RET предупреждают взаимодействие RET с комплексом артемин/GFRα3. В соответствии с родственным вариантом осуществления, описываемые в настоящем документе человеческие антитела к RET предотвращают взаимодействие RET с комплексом нейртурин/GFRα2 или комплексом персефин/GFRα4.

[0012] Из описываемых в настоящем документе результатов исследования видно, что такие антитела способны модулировать лиганд-зависимую передачу сигналов RET. В соответствии с определенными вариантами осуществления, были выявлены антитела, которые оказывают антагонистическое действие на лиганд-зависимую передачу сигналов RET.

[0013] Учитывая роль, которую RET играет в развитии синдромов множественной эндокринной неоплазии, а также при других формах рака, антитела по настоящему изобретению, которые оказывают антагонистическое действие/ингибируют сигнальную активность RET, можно применять при лечении таких неопластических синдромов и форм рака для ингибирования роста/пролиферации опухолевой клетки. Примеры раковых состояний, которые можно лечить с помощью антагонистических антител к RET по настоящему изобретению, включают без ограничения опухоли щитовидной железы, опухоли легких, опухоли поджелудочной железы, формы рака кожи, рак молочной железы и лейкозы. К опухоли щитовидной железы, которая поддается лечению с помощью антагонистического антитела к RET по настоящему изобретению, можно отнести папиллярную карциному щитовидной железы (РТС) или медуллярную карциному щитовидной железы (МТС). К медуллярной карциноме щитовидной железы, которая поддается лечению с помощью антагонистических антител к RET по настоящему изобретению, можно отнести наследственную форму МТС, выбранную из группы, состоящей из MEN2A, MEN2B и синдрома семейной медуллярной карциномы щитовидной железы (FMTC), или медуллярная карцинома щитовидной железы может представлять собой спорадическую форму МТС. Антитела по настоящему изобретению также можно применять для лечения боли, связанной с такими раковыми состояниями, а также боли, связанной с другими заболеваниями, нарушениями или патологическими состояниями, при которых определенную роль может играть активность или передача сигналов RET.

[0014] Антитела можно применять как отдельную терапию или можно применять в сочетании со вторым средством, пригодным для лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией RET. В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитела можно вводить в терапевтических целях в сочетании со вторым средством для лечения заболевания или нарушения или для облегчения по меньшей мере одного симптома, связанного с заболеванием или нарушением. Если антитело ингибирует активность или передачу сигналов RET и рассматривается для применения при лечении, например, ракового состояния, второе средство может быть химиотерапевтическим средством или средством для восстановления костного мозга или может быть лучевой терапией для лечения опухоли. Если антитело ингибирует активность или передачу сигналов RET и рассматривается для лечения боли, связанной с определенным патологическим состоянием, и если лечение требует применения второго обезболивающего средства, вторым средством может быть любое средство, которое также пригодно для облегчения боли, связанной с таким патологическим состоянием, такое как аспирин или другой NS AID, морфин, стероиды (например, преднизон), ингибитор фактора роста нервов (NGF) (например, низкомолекулярный антагонист NGF или антитело к NGF), антитело к Na_v1.7 или низкомолекулярный ингибитор Na_v1.7, антагонист Na_v1.8 (например, антитело к Na_v1.8 или низко молекулярный ингибитор Na_v1.8), антагонист Na_v1.9 (например, антитело к Na_v1.9 или низкомолекулярный ингибитор Na_v1.9), ингибитор цитокинов (например, ингибитор интерлейкина-1 (IL-1) (такой как, рилонацепт («ловушка IL-1») или анакинра (KINERET®), низкомолекулярный антагонист IL-1 или антитело к IL-1; ингибитор IL-18 (такой как низкомолекулярный антагонист IL-18 или антитело к IL-18); ингибитор IL-6 или IL-6R (такой как низкомолекулярный антагонист IL-6, антитело к IL-6 или антитело к рецептору IL-6), ингибиторы каспазы-1, р38, IKK1/2, CTLA-4Ig или опиоид.

[0015] Антитела по настоящему изобретению могут быть полноразмерными (например, антитело IgG1 или IgG4) или могут представлять собой только антигенсвязывающую часть (например, Fab-, F(ab')₂- или scFv-фрагмент) и могут быть модифицированными для изменения функциональности, например, для устранения остаточных эффекторных функций (Reddy et al, (2000), J. Immunol. 164:1925-1933).

[0016] Соответственно, согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с рецепторной тирозинкиназой RET (перестроенной во время трансфекции), причем антитело обладает одной или несколькими из следующих характеристик:

(a) представляет собой полностью человеческое антитело;

(b) характеризуется K_D в диапазоне от приблизительно 1,0×10^-7 М до приблизительно 1,0×10^-12 М по результатам измерения с помощью поверхностного плазмонного резонанса;

(c) ингибирует или блокирует связывание или взаимодействие RET с одним или несколькими лигандами-представителя семейства GDNF (GDNF, нейртурином, артемином и персефином) в комплексе с их соответствующими корецепторами (GFRα1, GFRα2, GFRα3 и GFRα4 соответственно);

(d) ингибирует передачу сигналов RET, опосредованную одним или несколькими лигандами-представителями семейства GDNF, выбранными из GDNF, нейртурина, артемина и персефина;

(e) усиливает интернализацию/разрушение RET после связывания антитела с рецептором RET;

(f) содержит вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274 и 290; или

(g) содержит вариабельный участок легкой цепи (LCVR) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 и 298.

[0017] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, блокируют связывание человеческой RET с совместным комплексом GDNF:GFRα1 со значением IC₅₀ в диапазоне от приблизительно 100 пМ до приблизительно 7,0 нМ.

[0018] В соответствии с родственным вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, блокируют связывание человеческой RET с совместным комплексом GDNF:GFRα1 со значением IC₅₀ в диапазоне от приблизительно 250 пМ до приблизительно 5,2 нМ.

[0019] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, блокируют связывание человеческой RET с совместным комплексом GDNF:GFRα1 на величину, варьирующую от приблизительно 40% до приблизительно 100%.

[0020] В соответствии с родственным вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, блокируют связывание человеческой RET с совместным комплексом GDNF:GFRα1 на величину, варьирующую от приблизительно 57% до приблизительно 97%.

[0021] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, ингибируют GDNF-опосредованную передачу сигналов RET со значением IC₅₀ в диапазоне от приблизительно 50 пМ до более чем 100 нМ.

[0022] В соответствии с родственным вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, ингибируют GDNF-опосредованную передачу сигналов RET со значением IC₅₀ в диапазоне от приблизительно 143 пМ до более чем 100 нМ.

[0023] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, ингибируют GDNF-опосредованную передачу сигналов RET на величину, варьирующую от приблизительно 40% до приблизительно 100%.

[0024] В соответствии с родственным вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, ингибируют GDNF-опосредованную передачу сигналов RET на величину, варьирующую от приблизительно 60% до приблизительно 100%.

[0025] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, ингибируют артемин-опосредованную передачу сигналов RET со значением IC₅₀ в диапазоне от приблизительно 100 пМ до приблизительно 500 нМ.

[0026] В соответствии с родственным вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, ингибируют артемин-опосредованную передачу сигналов RET со значением IC₅₀ в диапазоне от приблизительно 250 пМ до приблизительно 341 нМ.

[0027] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, ингибируют артемин-опосредованную передачу сигналов RET на величину, варьирующую от приблизительно 57% до приблизительно 100%.

[0028] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, содержат вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274 и 290.

[0029] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, содержат вариабельный участок легкой цепи (LCVR) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 и 298.

[0030] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, содержат вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274 и 290; и вариабельный участок легкой цепи (LCVR), имеющий аминокислотную последовательность выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 и 298.

[0031] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, содержат пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282 и 290/298.

[0032] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, содержат HCVR, содержащий три CDR тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащиеся в пределах аминокислотной последовательности HCVR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274 и 290; и LCVR, содержащий три CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащиеся в пределах аминокислотной последовательности LCVR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 и 298.

[0033] Способы и методики выявления CDR в аминокислотных последовательностях HCVR и LCVR хорошо известны из уровня техники и могут быть применены для выявления CDR в раскрываемых в настоящем документе указанных аминокислотных последовательностях HCVR и/или LCVR. К иллюстративным общепринятым способам, которые можно применять для выявления границ CDR, относятся, например, определение по Kabat, определение по Chothia и определение по AbM. В общих чертах: определение по Kabat основано на вариабельности последовательности, определение по Chothia основано на местоположении участков структурной петли, а определение по AbM является компромиссом между подходами Kabat и Chothia. См., например, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al, (1997), J. Mol. Biol 275:927-948; и Martin et al, (1989), Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:9268-9272. Также для выявления последовательностей CDR в антителе доступны открытые базы данных.

[0034] В соответствии с одним вариантом осуществления, выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с RET, содержат:

(a) домен HCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276 и 292;

(b) домен HCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 и 294;

(c) домен HCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280 и 296;

(d) домен LCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284 и 300;

(e) домен LCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286 и 302; и

(f) домен LCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288 и 304.

[0035] В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с RET, которые конкурирует за специфическое связывание с RET с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, содержащим пары последовательностей тяжелой и легкой цепи, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282 и 290/298.

[0036] В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с RET, которые связывают тот же эпитоп на RET, который распознается антителом, содержащим пары последовательностей тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282 и 290/298.

[0037] В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к полностью человеческому моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с RET, причем антитело или его фрагмент обладают одной или несколькими из следующих характеристик: (i) содержат HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274 и 290, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; (ii) содержат LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 и 298, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; (iii) содержат домен HCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280 и 296, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; и домен LCDR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288 и 304, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; (iv) содержат домен HCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276 и 292, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; (v) домен HCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 и 294, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; (vi) домен LCDR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284 и 300, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; (vii) и домен LCDR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286 и 302, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; (viii) характеризуются K_D в диапазоне от приблизительно 1×10^-7 М до приблизительно 1×10^-12 М; (ix) способны блокировать связывание человеческой RET с совместным комплексом GDNF:GFRα1 со значением IC₅₀ менее чем приблизительно 5,2 нМ; или (х) обладают способностью ингибировать лиганд-зависимую передачу сигналов RET приблизительно на 60-100% со значением IC₅₀ в диапазоне от приблизительно 143 пМ до более чем 100 нМ.

[0038] Согласно второму аспекту, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитела или их фрагменты, которые специфически связываются с RET. Рекомбинантные векторы экспрессии, несущие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, и клетки-хозяева, в которые были введены такие векторы, также охватываются настоящим изобретением, равно как и способы получения антител путем культивирования клеток-хозяев в условиях, позволяющих продуцировать антитела, и путем выделения продуцированных антител.

[0039] В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, содержащему HCVR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273 и 289, или практически идентичной последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична с нею.

[0040] В соответствии с одним вариантом осуществления, антитело или его фрагмент дополнительно содержит LCVR, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281 и 297, или практически идентичной последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична с нею.

[0041] В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение также относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту антитела, дополнительно содержащему домен HCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279 и 295, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; и домен LCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287 и 303, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности.

[0042] В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, дополнительно содержащему домен HCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275 и 291, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; домен HCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53,69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197,213,229, 245, 261, 277 и 293, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; домен LCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283 и 299, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности; и домен LCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285 и 301, или практически схожей с ней последовательностью, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична такой последовательности.

[0043] Согласно третьему аспекту, настоящее изобретение относится к человеческому антителу или антигенсвязывающему фрагменту, специфическому к RET, содержащему HCVR, кодируемый сегментами нуклеотидной последовательности, полученными из последовательностей зародышевого типа V_H, D_H и J_H, и LCVR, кодируемый сегментами нуклеотидной последовательности, полученными из последовательности зародышевого типа V_K и J_K.

[0044] Настоящее изобретение относится к антителам с модифицированным паттерном гликозилирования. В некоторых областях применения может быть полезна модификация, например, удаляющая нежелательные сайты гликозилирования или, например, удаление фукозного фрагмента для повышения функции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В других областях применения для модификации комплементзависимой цитотоксичности (CDC) можно выполнить модификацию галактозилирования.

[0045] Согласно четвертому аспекту, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно выделенное полностью человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с RET, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей два полностью человеческих моноклональных антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые либо связываются с одним и тем же эпитопом, либо связываются с двумя разными эпитопами на RET, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Следует понимать, что для достижения требуемых результатов у контингента пациентов, нуждающихся в такой терапии, в фармацевтической композиции можно применять любую комбинацию описываемых в настоящем документе антител. Например, в композиции можно применять два антитела, которые распознают и/или связывают RET.

[0046] В соответствии с одним вариантом осуществления, композиция содержит антитело, которое связывается с RET и имеет пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282 и 290/298.

[0047] В соответствии с одним вариантом осуществления, фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно антитело, которое связывает RET, причем указанное антитело содержит три определяющих комплементарность участка тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащихся в любой из аминокислотных последовательностей вариабельного участка тяжелой цепи (HCVR), выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274 и 290, и три определяющих комплементарность участка легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащихся в любой из аминокислотных последовательностей вариабельного участка легкой цепи (LCVR), выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 и 298.

[0048] В соответствии с одним вариантом осуществления, антитела по настоящему изобретению или композиции, содержащие одно или несколько антител по настоящему изобретению, можно применять для ингибирования по меньшей мере одной активности или функции, связанной с RET, экспрессируемой на клетке. В соответствии с одним вариантом осуществления, клетка может быть опухолевой клеткой. В соответствии с одним вариантом осуществления, активность может заключаться в передаче клеточных сигналов.

[0049] В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к композиции, которая представляет собой комбинацию антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению и второго терапевтического средства.

[0050] Второе терапевтическое средство может представлять собой низкомолекулярное лекарственное средство, белок/полипептид, антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, такую как антисмысловая молекула, или siRNA. Второе терапевтическое средство может быть синтетическим или природным.

[0051] Вторым терапевтическим средством может быть любое средство, которое объединено в преимущественной комбинации с антителом или его фрагментом по настоящему изобретению, например, если антитело к RET является ингибитором RET, применяемым для лечения ракового состояния, то второе средство может быть выбрано из химиотерапевтического средства, радионуклида, siRNA, специфической к RET, второго антитела, специфического к RET, низкомолекулярного ингибитора RET и средства для восстановления костного мозга, такого как G-CSF, GM-CSF или M-CSF, или биологических средств, обладающих колониестимулирующей или восстанавливающей костный мозг активностью. В соответствии с определенными вариантами осуществления, вторым терапевтическим средством может быть средство, которое помогает нейтрализовать или уменьшить любой один или несколько возможных побочных эффектов, связанных с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела по настоящему изобретению, при появлении такого одного или нескольких побочных эффектов. В соответствии с определенными вариантами осуществления, второе терапевтическое средство может быть средством, пригодным для уменьшения боли, связанной с определенными патологическими состояниями, характеризующимися болью и/или воспалением. К такому второму средству можно отнести ингибитор фактора роста нервов (NGF) (например, низкомолекулярный антагонист NGF или антитело к NGF), аспирин или другой NSAID, морфин, стероиды (например, преднизон), антитело к Na_v1.7 или низкомолекулярный ингибитор Na_v1.7, антагонист Na_v1.8 (например, антитело к Na_v1.8 или низкомолекулярный ингибитор Na_v1.8), антагонист Na_v1.9 (например, антитело к Na_v1.9 или низкомолекулярный ингибитор Na_v1.9), ингибитор цитокинов (например, ингибитор интерлейкина-1 (IL-1) (такой как рилонацепт («ловушка IL-1»); Regeneron) или анакинра (KINERET®, Amgen), низкомолекулярный антагонист IL-1 или антитело к IL-1; ингибитор IL-18 (такой как низкомолекулярный антагонист IL-18 или антитело к IL-18); ингибитор IL-6 или IL-6R (такой как низкомолекулярный антагонист IL-6, антитело к IL-6 или антитело к рецептору IL-6), ингибиторы каспазы-1, р38, IKK1/2, CTLA-4Ig или опиоид.

[0052] Также будет понятно, что антитела и фармацевтически приемлемые композиции по настоящему изобретению можно использовать в комбинированной терапии, то есть антитела и фармацевтически приемлемые композиции можно вводить одновременно с, до или после одного или нескольких других необходимых терапевтических средств или медицинских процедур. Конкретная комбинация форм терапии (терапевтических средств или процедур) для использования в комбинированной схеме будет учитывать совместимость необходимых терапевтических средств и/или процедур и необходимый терапевтический эффект, который должен быть достигнут. Также будет понятно, что используемые формы терапии могут позволить достичь необходимого эффекта в отношении одного и того же нарушения (например, антитело можно вводить одновременно с другим средством, применяемым для лечения одного и того же нарушения), или они могут позволить достичь различных эффектов (например, контроля за какими-либо побочными эффектами). В контексте настоящего документа дополнительные терапевтические средства, которые обычно вводят для лечения или предупреждения конкретного заболевания или патологического состояния, подходят для подвергаемого лечению заболевания или патологического состояния.

[0053] Если предполагается, что низкомолекулярный ингибитор RET должен быть объединен в комбинацию с антителом по настоящему изобретению, низкомолекулярный ингибитор RET может быть выбран из группы, состоящей из вандетаниба, сорафениба, сунитиниба, кабозантиниба, мотесаниба, RPI-1, РР-1 и NVP-AST478, цедираниба, (AZD2171), гефитиниба, эрлотиниба, SU14813, ваталаниба, (BAY43-9006), XL-647, XL-999, AG-013736, BIBF1120, TSU68, GW786034, АЕЕ73288, CP-54KRN951, CHIR258, СЕР-7055, OSI-930, АВТ-869, Е7080, ZK-304709, BAY57-9352, L-21649, BMS582664, XL-880, XL-184, XL-820, RPI-1, РР-1 и NVP-AST478.

[0054] При одновременном введении нескольких терапевтических средств дозы могут быть соответственно скорректированы, как это известно в соответствующей области техники.

[0055] Пятый аспект по настоящему изобретению относится к способу лечения нарушения или патологического состояния, связанного с экспрессией, активацией или передачей сигнала гена тирозинкиназы рецептора RET или его перестроенной формы, или боли, связанной с нарушением или патологическим состоянием, причем способ предусматривает введение нуждающемуся в том пациенту антитела или антигенсвязывающего фрагмента любого из описываемых в настоящем документе антител к RET вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

[0056] В соответствии с одним вариантом осуществления, нарушение или патологическое состояние представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из рака щитовидной железы, рака легких, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака молочной железы и рака крови. В соответствии с одним вариантом осуществления, нарушение или патологическое состояние, связанное с экспрессией, активацией или передачей сигнала гена рецепторной тирозинкиназы RET или его перестроенной формы, выбрано из группы, состоящей из острой боли, хронической боли, невропатической боли, воспалительной боли, артрита, остеоартрита, мигрени, кластерных головных болей, невралгии тройничного нерва, герпетической невралгии, общих форм невралгии, нейродегенеративных нарушений, нейроэндокринных нарушений, висцеральной боли, острой подагры, постгерпетической невралгии, диабетической невропатии, пояснично-крестцового радикулита, позвоночной боли, боли в голове или шее, сильной или неустранимой боли, прорывной боли, послеоперационной боли, зубной боли, ринита, боли при раке или нарушений, связанных с мочевым пузырем.

[0057] Согласно родственному аспекту, настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста опухоли или пролиферации опухолевых клеток, причем опухоль или опухолевая клетка экспрессирует RET или ее перестроенную форму, причем способ предусматривает введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению нуждающемуся в том пациенту.

[0058] В соответствии с одним вариантом осуществления, опухоль представляет собой солидную опухоль или опухоль клеток крови.

[0059] В соответствии с одним вариантом осуществления, солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из опухоли щитовидной железы, опухоли легкого, опухоли поджелудочной железы, опухоли кожи и опухоли молочной железы.

[0060] В соответствии с одним вариантом осуществления, опухоль щитовидной железы представляет собой папиллярную карциному щитовидной железы (РТС) или медуллярную карциному щитовидной железы (МТС).

[0061] В соответствии с одним вариантом осуществления, медуллярная карцинома щитовидной железы представляет собой наследственную форму МТС, выбранную из группы, состоящей из MEN2A, MEN2B и синдрома семейной медуллярной карциномы щитовидной железы (FMTC), или причем медуллярная карцинома щитовидной железы представляет собой спорадическую форму МТС.

[0062] В соответствии с одним вариантом осуществления, опухоль легкого представляет собой аденокарциному легкого.

[0063] В соответствии с одним вариантом осуществления, опухоль легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

[0064] В соответствии с одним вариантом осуществления, рак кожи представляет собой меланому.

[0065] В соответствии с одним вариантом осуществления, опухоль клеток крови представляет собой лейкоз.

[0066] В соответствии с одним вариантом осуществления, лейкоз представляет собой хронический миеломоноцитарный лейкоз.

[0067] Согласно родственному аспекту, настоящее изобретение относится к способу подавления экспрессии и/или функции RET, причем способ предусматривает введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.

[0068] В соответствии с одним вариантом осуществления, подавление экспрессии и/или функции RET приводит к нарушению регуляции последующего сигнального пути, выбранного из группы, состоящей из путей RAS/RAF/ERK и PI3K. В соответствии с определенными вариантами осуществления, подавление экспрессии и/или функции RET приводит к нарушению регуляции сигнального пути, выбранного из группы, состоящей из путей PKC, SRC и STAT3.

[0069] В соответствии с одним вариантом осуществления, антитело к RET по настоящему изобретению может препятствовать или предупреждать взаимодействие RET с одним или несколькими лигандами-представителя семейства GDNF (GDNF, нейртурином, артемином и персефином) в комплексе с их соответствующими корецепторами (GFRα1, GFRα2, GFRα3 и GFRα4 соответственно). В соответствии с одним вариантом осуществления, описываемые в настоящем документе человеческие антитела к RET могут препятствовать или предупреждать взаимодействие RET с комплексом GDNF/GFRα1. В соответствии с родственным вариантом осуществления, описываемые в настоящем документе человеческие антитела к RET могут препятствовать или предупреждать взаимодействие RET с комплексом артемин/GFRα3. В соответствии с другими родственными вариантами осуществления, описываемые в настоящем документе человеческие антитела к RET могут препятствовать или предупреждать взаимодействие RET с комплексами нейртурин/GFRα2 или персефин/GFRα4.

[0070] После активации RET рекрутирует ряд сигнальных молекул, которые опосредуют биологические ответы. RET может активировать различные сигнальные пути, такие как RAS/RAF/ERK (киназа, регулируемая внеклеточными сигналами), фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K)/AKT, PKC и SRC. Такие сигнальные пути активируются посредством связывания адаптерных белков с внутриклеточными остатками тирозина в RET, фосфорилируемой благодаря ее собственной киназной активности.

[0071] Соответственно, согласно определенным аспектам настоящего изобретения, антитело к RET по настоящему изобретению может блокировать биологические ответы, связанные, по меньшей мере частично, с активацией других сигнальных путей с помощью RET. В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитело к RET по настоящему изобретению может препятствовать передаче сигнала по пути, в котором задействованы RET и RAS. В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитело к RET может препятствовать пролиферации, миграции или инвазии клеток или фосфорилированию ERK1/2 (киназы 1/2, регулируемой внеклеточными сигналами). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, антитело к RET может препятствовать передаче сигнала по пути, в котором задействованы RET и PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназа). В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитело к RET может препятствовать пролиферации, миграции или инвазии клеток или фосфорилированию Акт (протеинкиназы В).

[0072] Антитело или антигенсвязывающий фрагмент можно вводить пациенту в комбинации со вторым терапевтическим средством, подходящим для лечения заболевания, нарушения или патологического состояния. Если заболевание или патологическое состояние, подлежащее лечению антителом к RET, является раковым состоянием, второе терапевтическое средство может быть выбрано из группы, состоящей из химиотерапевтического средства, радионуклида (отдельно или как часть схемы нацеливания лекарственного средства), конъюгата антитела с лекарственным средством, низкомолекулярного ингибитора RET, противоопухолевого средства, siRNA, специфической к RET, и второго антитела, специфического к RET. Если антитело к RET предусмотрено для лечения боли, связанной с раковым состоянием, или для лечения боли, связанной с другими патологическими состояниями, которые могут быть отнесены, по меньшей мере частично, к активации или передаче сигналов RET, второе терапевтическое средство может быть выбрано из любого одного или нескольких из следующих: ингибитора фактора роста нервов (NGF) (например, низкомолекулярного антагониста NGF или антитела к NGF), аспирина или другого NSAID, морфина, стероидов (например, преднизона), антитела к Na_v1.7 или низкомолекулярного ингибитора Na_v1.7, антагониста Na_v1.8 (например, антитела к Na_v1.8 или низкомолекулярного ингибитора Na_v1.8), антагониста Na_v1.9 (например, антитела к Na_v1.9 или низкомолекулярного ингибитора Na_v1.9), ингибитора цитокинов (например, ингибитора интерлейкина-1 (IL-1) (такого как рилонацепт («ловушка IL-1»); Regeneron) или анакинры (KINERET®, Amgen), низкомолекулярного антагониста IL-1 или антитела к IL-1; ингибитора IL-18 (такого как низкомолекулярный антагонист IL-18 или антитело к IL-18); ингибитора IL-6 или IL-6R (такого как низкомолекулярный антагонист IL-6, антитело к IL-6 или антитело к рецептору IL-6), ингибиторов каспазы-1, р38, IKK1/2, CTLA-4Ig или опиоида.

[0073] Другие варианты осуществления станут понятны после рассмотрения следующего подробного описания.

Краткое описание чертежей

[0074] Фиг. 1. Схематическая диаграмма человеческого рецептора RET.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

[0075] Перед раскрытием настоящих способов необходимо понять, что настоящее изобретение не ограничено конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Также следует понять, что применяемая в настоящем описании терминология приведена только с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

[0076] Если не указано иное, все применяемые в настоящем документе технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно понимается рядовым специалистом в настоящей области техники, к которой относится настоящее изобретение. В контексте настоящего документа термин «приблизительно» при использовании в отношении конкретного указанного числового значения означает, что значение может отличаться от указанного значения не более чем на 1%. Например, используемое в настоящем документе выражение «приблизительно 100- включает 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).

[0077] Несмотря на то, что при осуществлении на практике или испытании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем документе, далее описаны предпочтительные способы и материалы. Все упомянутые в настоящем документе публикации включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Определения

[0078] «Перестроенная во время трансфекции», также называемая «RET», представляет собой рецепторную тирозинкиназу, которая экспрессируется в ходе развития в различных тканях, в том числе в периферической и центральной нервной системе и в почке. Онкоген ЛЕТ был выявлен в 1985 году Takahashi et al.,, которые сообщили о новой перестройке гена с трансформирующей активностью в клетках NIH/3T3, которые были трансфицированы ДНК лимфомы человека (см. Takahashi, М., et al., (1985) Cell, 42:581-588). Позднее было подтверждено, что RET является онкогеном, который соматически перестраивается в ДНК пациентов с папиллярной карциномой щитовидной железы (РТС), и позже был назван RET/PTC. (Fusco, A. et al., (1987), Nature, 328:170-172; Grieco, M. et al., (1990), Cell, 60:557-63). Белок RET состоит из трех доменов: внеклеточного лиганд-связывающего домена, гидрофобного транс мембранного домена и цитоплазматической части с тирозинкиназным доменом, разделенным вставкой из 27 аминокислот (см. фиг. 1). Есть две основные изоформы RET, получаемые в результате альтернативного сплайсинга. Короткие и длинные изоформы RET, которые отличаются 9 и 51 неродственными С-концевыми аминокислотами, называются RET9 и RET51 соответственно. Они характеризуются высокой степенью консервативности у широкого спектра видов (Carter, МТ, et al. (2001), Cytogenet Cell Genet, 95:169-76). Обе изоформы обладают трансформирующей активностью по данным анализа бляшкообразования (Rossel, М. et al. (1997), Oncogene, 14:265-75).

[0079] Последовательность кДНК и аминокислотная последовательность изоформы A RET (также известной как RET51) представлены в GenBank под номерами доступа NM_020975.4 и NP_066124.1 соответственно и представлены в настоящем документе под SEQ ID NO: 309 и 310 соответственно.

[0080] Последовательность кДНК и аминокислотная последовательность изоформы С RET (также известной как RET9) представлены в GenBank под номерами доступа NM_020630.4 и NP 065681.1 соответственно и представлены в настоящем документе под SEQ ID NO: 311 и 312 соответственно. RET или его иммуногенные фрагменты можно применять при получении человеческих моноклональных антител, специфических к RET. Белок RET или его фрагменты можно получить рекомбинантными методами с помощью стандартных способов, известных в настоящей области техники. Иллюстративные слитые белки, содержащие эктодомен RET, показаны под SEQ ID NO: 305, 306, 307 и 309. Такие слитые белки можно применять в качестве иммуногенов или их можно применять для нацеливания терапевтических средств на клетки или ткани, экспрессирующие RET.

[0081] RET представляет собой сигнальный рецептор для лигандов «семейства глиальных нейротрофических факторов (GDNF)», которое включает GDNF (см. номер доступа в GenBank NP 000505.1), артемин (см. номер доступа в GenBank Q5T4W7), нейртурин (см. номер доступа в GenBank NM_004558) и персефин (см. номер доступа в GenBank AF040962). Лиганды семейства GDNF взаимодействуют с RET и активируют ее только в присутствии или в комплексе с одним из четырех GPI-связанных «корецепторов», известных как □-рецепторы семейства GDNF: GFRα1 (см. номер доступа в GenBank NP 005255.1), GFRα2 (см. номер доступа в GenBank NM_001495.4), GFRα3 (см. номер доступа в GenBank NP 001487.2) и GFRα4 (см. номер доступа в GenBank NM_022139 для GFRα4a и NM 145762.2 для GFRα4b) (Baloh, RH, et al. (2000), Curr Opin Neurobiol 10:103-110; Borrello, MG, et al (2013), Expert Opin. Ther. Targets, 17(4):403-419). Первичными лигандами корецепторов GFRα1, GFRα2, GFRα3 и GFRα4 являются GDNF, нейртурин (NRTN), артемин (ARTN) и персефин (PSPN) соответственно.

[0082] Термин «IC₅₀» относится к «полумаксимальной ингибирующей концентрации», величина которой позволяет измерять эффективность ингибирования соединением (например, антителом к RET) в отношении биологической или биохимической полезности. При помощи такого количественного показателя указывают количество, необходимое для конкретного ингибитора, чтобы наполовину ингибировать данный биологический процесс.

[0083] В контексте настоящего документа термины «лечить», «лечение» и «процесс лечения» относятся либо к снижению прогрессирования заболевания, нарушения или патологического состояния, которое частично приписывается на счет или связано с экспрессией RET в клетке или ткани у субъекта, например, замедлению скорости пролиферации опухолевых клеток у пациентов с опухолью, экспрессирующей RET, при введении антагонистического/ингибиторного антитела по настоящему изобретению, либо к уменьшению боли, связанной с раковым состоянием, или боли, связанной с любым другим заболеванием или патологическим состоянием, которое, по меньшей мере частично, обусловлено экспрессией RET.

[0084] В контексте настоящего документа термины «предупреждать», «процесс предупреждения» и «предупреждение» относятся к ингибированию развития или начала заболевания, нарушения или патологического состояния, частично приписываемого на счет или связанного с экспрессией RET в клетке или ткани у субъекта, например, некоторых форм рака, или к ингибированию повреждения ткани, которое происходит у пациента после травмы, или к ингибированию или облегчению боли, связанной с заболеванием или патологическим состоянием, частично приписываемым на счет экспрессии RET.

[0085] Термин «антитело» в контексте настоящего документа подразумевают как обозначающий молекулы иммуноглобулинов, состоящие из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, соединенных между собой дисульфидными связями (т.е. «полноразмерных молекул антитела»), а также их мультимеров (например, IgM) или их антигенсвязывающих фрагментов. В состав каждой тяжелой цепи входят вариабельный участок тяжелой цепи («HCVR» или «V_H») и константный участок тяжелой цепи (в его состав входят домены C_H1, C_H2 и C_H3). В состав каждой легкой цепи входят вариабельный участок легкой цепи («LCVR» или «V_L») и константный участок легкой цепи (C_L). Участки V_H и V_L дополнительно можно подразделить на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), чередующиеся с участками, которые являются более консервативными, называемыми каркасными участками (FR). В состав каждого V_H и V_L входят три CDR и четыре FR, располагающиеся от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения, FR антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) могут быть идентичными с человеческими последовательностями зародышевого типа или могут быть модифицированными естественным или искусственным путем. Консенсусную аминокислотную последовательность можно определить на основании анализа на основе прямого сравнения двух или более CDR.

[0086] Также возможна замена одного или нескольких остатков CDR или исключение одного или нескольких CDR. В научной литературе описаны антитела, для функции связывания у которых могут быть не важны один или два CDR. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) проанализировали участки контактов между антителами и их антигенами, исходя из опубликованных кристаллических структур, и сделали заключение, что только приблизительно от одной пятой до одной третьей остатков CDR в действительности контактируют с антигеном. Padlan также обнаружил множество антител, у которых один или два CDR не имели аминокислот, вступающих в контакт с антигеном (см. также Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).

[0087] Остатки CDR, которые не вступают в контакт с антигеном, можно выявить на основании результатов предыдущих исследований (например, остатки Н60-Н65 в CDRH2 зачастую не нужны) среди CDR-участков по Kabat, находящихся за пределами CDR по Chothia, путем молекулярного моделирования и/или опытным путем. При исключении CDR или его остатка(остатков) обычно происходит замена на аминокислоту, занимающую соответствующее положение в последовательности другого человеческого антитела или консенсусной последовательности таких последовательностей. Положения для замены в CDR и аминокислотах для замены можно также подобрать опытным путем. Эмпирические замены могут быть консервативными или неконсервативными заменами.

[0088] Раскрываемые в настоящем документе полностью человеческие моноклональные антитела могут содержать одну или несколько аминокислотных замен, вставок и/или делеций в каркасных участках и/или CDR-участках вариабельных доменов тяжелых и легких цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевого типа. Такие мутации можно легко установить путем сравнения раскрытых в настоящем документе аминокислотных последовательностей с последовательностями зародышевого типа, доступными, например, из находящихся в общем доступе баз данных последовательностей антител. Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые получены из любой из раскрываемых в настоящем документе аминокислотных последовательностей, причем одна или несколько аминокислот в одном или нескольких каркасных участках и/или CDR-участках являются мутировавшими по соответствующему остатку(остаткам) последовательности зародышевого типа, из которой было получено антитело, или по соответствующему остатку(остаткам) другой человеческой последовательности зародышевого типа, или по консервативной аминокислотной замене соответствующего остатка(остатков) зародышевого типа (такие изменения последовательности собирательно называют в настоящем документе «мутациями зародышевого типа»). Рядовой специалист в настоящей области, исходя из раскрываемых в настоящем документе последовательностей вариабельных участков тяжелых и легких цепей, легко сможет получить многочисленные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько отдельных мутаций зародышевого типа или их комбинации. В соответствии с определенными вариантами осуществления, все каркасные остатки и/или CDR-остатки в доменах V_H и/или V_L являются мутировавшими обратно в остатки, встречающиеся в первоначальной последовательности зародышевого типа, из которой было получено антитело. В соответствии с другими вариантами осуществления, только определенные остатки являются мутировавшими обратно до исходной последовательности зародышевого типа, например, только мутировавшие остатки, встречающиеся в первых 8 аминокислотах FR1 или в последних 8 аминокислотах FR4, или мутировавшие остатки, встречающиеся только в CDR1, CDR2 или CDR3. В соответствии с другими вариантами осуществления, один или несколько каркасных остатков и/или CDR-остатков являются мутировавшими в соответствующий(соответствующие) остаток(остатки) отличной последовательности зародышевого типа (т.е. последовательности зародышевого типа, которая отличается от последовательности зародышевого типа, из которой первоначально было получено антитело). Вместе с тем, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию из двух или более мутаций зародышевого типа в каркасных участках и/или CDR-участках, в которой, например, некоторые отдельные остатки являются мутировавшими в соответствующий остаток конкретной последовательности зародышевого типа, в то время как некоторые другие остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевого типа, сохранены или являются мутировавшими в соответствующий остаток отличной последовательности зародышевого типа. После получения антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько мутаций зародышевого типа, можно легко протестировать на предмет одного или нескольких необходимых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или увеличенные антагонистические или агонистические биологические свойства (при соответствующих обстоятельствах), уменьшенная иммуногенность и т.д. Настоящее изобретение относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые, в целом, получены таким способом.

[0089] Настоящее изобретение также относится к полностью человеческим моноклональным антителам, содержащим варианты любых из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе, с одной или несколькими консервативными заменами. Например, настоящее изобретение относится к антителам с аминокислотными последовательностями HCVR, LCVR и/или CDR, например, с 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее и т.д. консервативными аминокислотными заменами относительно любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе.

[0090] Термин «человеческое антитело» в контексте настоящего документа подразумевают как включающий антитела, имеющие вариабельные и константные участки, полученные из человеческих иммуноглобулиновых последовательностей зародышевого типа. Человеческие mAb по настоящему изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевого типа (например, мутации, введенные в результате неспецифического или сайт-направленного мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. Тем не менее, термин «человеческое антитело» в контексте настоящего документа не подразумевают как включающий mAb, у которых последовательности CDR, полученные из зародышевого типа других видов млекопитающих (например, мыши), были привиты на человеческие FR-последовательности.

[0091] Термин «специфически связывает» или «специфически связывается с» или ему подобный означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который является относительно стабильным в физиологических условиях. Специфическое связывание можно охарактеризовать при помощи равновесной константы диссоциации, составляющей по меньшей мере приблизительно 1×10^-6 М или менее (например, меньшее значение KD означает более сильное связывание). Способы определения, специфически ли связываются две молекулы, хорошо известны в настоящей области техники и к ним относятся, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и т.п. Описываемые в настоящем документе антитела, которые специфически связываются с RET, были выявлены с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, на системе BIACORE™. Более того, в контексте настоящего документа мультиспецифические антитела, которые связываются с белком RET и одним или несколькими дополнительными антигенами, или биспецифическое антитело, которое связывается с двумя различными участками RET, все же считают антителами, которые «связываются специфически».

[0092] Термин антитело с «высокой аффинностью» относится к mAb, обладающим аффинностью связывания с RET, выраженной как K_D, которая составляет по меньшей мере 10^-7 М, по меньшей мере 10^-8 М, предпочтительно 10^-9 М, более предпочтительно 10^-10 М, более предпочтительно 10^-11 М, более предпочтительно 10^-12 М, по результатам измерения с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, на системе BIACORE™, или с помощью ELISA на аффинность в растворе.

[0093] Под термином «медленная скорость диссоциации», «Koff» или «kd» подразумевают антитело, которое диссоциирует от RET с константой скорости реакции, которая составляет 1×10^-3 с^-1 или менее, предпочтительно 1×10^-4 с^-1 или менее, по результатам определения с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, на системе BIACORE™.

[0094] Термины «антигенсвязывающая часть» антитела, «антигенсвязывающий фрагмент» антитела и т.п. в контексте настоящего документа включают любой встречающийся в природе, получаемый ферментативным путем, синтетический или полученный методами генетической инженерии полипептид или гликопротеин, который специфически связывает антиген с образованием комплекса. Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «фрагмент антитела» в контексте настоящего документа относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность связываться с RET.

[0095] В соответствии с конкретными вариантами осуществления, антитело или фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с терапевтическим фрагментом («иммуноконъюгат» или «конъюгат антитела и лекарственного средства»), таким как низкомолекулярный ингибитор RET, противоопухолевое средство, радионуклид, фактор роста, средство для восстановления костного мозга или колониестимулирующий фактор, или любой другой терапевтический фрагмент, пригодный для лечения заболевания, нарушения или патологического состояния, связанного с экспрессией RET, такого как рак или поврежденная ткань.

[0096] Термин «выделенное антитело» в контексте настоящего документа подразумевают как обозначающий антитело, которое практически не содержит других антител (Ab), имеющих иные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с RET, или его фрагмент, который практически не содержит Ab, которые специфически связывают антигены, отличные от RET).

[0097] В контексте настоящего документа термин «блокирующее антитело» или «нейтрализующее антитело» (или «антитело, которое нейтрализует активность RET») подразумевают как обозначающий антитело, связывание которого с RET в результате приводит к ингибированию по меньшей мере одной биологической активности RET, такой как передача клеточных сигналов. Например, антитело по настоящему изобретению может способствовать блокированию связывания RET с его лигандом или с одним из корецепторов GFRα или предупреждать или лечить заболевание, связанное с экспрессией RET. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может обладать способностью облегчать по меньшей мере один симптом заболевания или патологического состояния, связанного с экспрессией RET. Такое ингибирование биологической активности RET можно оценить путем измерения одного или нескольких индикаторов биологической активности RET с помощью одного или нескольких стандартных анализов in vitro (таких как любой из анализов, описанных в настоящем документе) или анализов in vivo, известных в настоящей области техники (например, модели на животных для изучения ингибирования роста опухолевых клеток in vivo) после введения одного или нескольких описываемых в настоящем документе антител.

[0098] Термин «поверхностный плазмонный резонанс» в контексте настоящего документа относится к оптическому феномену, который делает возможным анализ биомолекулярных взаимодействий в реальном времени посредством детекции изменений концентраций белков в биосенсорной матрице, например, при помощи системы BIAcore™ (Biacore Life Sciences, подразделение GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси).

[0099] В контексте настоящего документа термин «K_D» подразумевают как обозначающий равновесную константу диссоциации конкретного взаимодействия антитела и антигена.

[00100] Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим сайтом в вариабельном участке молекулы антитела, известном как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Таким образом, различные антитела могут связываться с различными областями на антигене и могут оказывать различные биологические эффекты. Термин «эпитоп» также относится к сайту на антигене, на который реагируют В- и/или Т-клетки. Он также относится к участку антигена, с которым связывается антитело. Эпитопы можно определить как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы обычно представляют собой подгруппу структурных эпитопов и содержат такие остатки, которые вносят непосредственный вклад в аффинность взаимодействия. Также эпитопы могут быть конформационными, т.е. состоять из нелинейных аминокислот. В соответствии с определенными вариантами осуществления, эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группировки таких молекул, как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и, в соответствии с определенными вариантами осуществления, могут обладать специфическими характеристиками трехмерных структур и/или специфическими характеристиками заряда.

[00101] Термин «существенная идентичность» или «существенно идентичный» по отношению к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту указывает на то, что при оптимальном выравнивании соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей вставки или делеции, с другой последовательностью нуклеиновой кислоты (или ее комплементарной нитью) идентичность нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере приблизительно 90%, а более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидных оснований по результатам измерения при помощи хорошо известного алгоритма определения идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или GAP, которые рассмотрены ниже. Молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся существенной идентичностью с эталонной молекулой нуклеиновой кислоты, может, в определенных случаях, кодировать полипептид, имеющий такую же или существенно схожую аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый эталонной молекулой нуклеиновой кислоты.

[00102] Применительно к полипептидам термин «существенное сходство» или «существенно схожий» означает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как посредством программ GAP или BESTFIT, с применением штрафов за открытие гэпов по умолчанию, по меньшей мере на 90% идентичны, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, 98% или 99% идентичны. Предпочтительно, положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются по консервативным аминокислотным заменам. «Консервативная аминокислотная замена» является заменой, при которой аминокислотный остаток заменен на другой аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь (группу R) со схожими химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В целом, консервативная аминокислотная замена не будет существенно изменять функциональные свойства белка. В случаях, когда две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга по консервативным заменам, процент или степень схожести можно скорректировать в сторону увеличения для внесения поправки по консервативной природе замены. Способы осуществления такой корректировки хорошо известны специалистам в настоящей области техники. См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Примеры групп аминокислот, которые содержат боковые цепи со схожими химическими свойствами, включают: 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические боковые цепи с гидроксильными группами: серии и треонин; 3) амидосодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислые боковые цепи: аспартат и глутамат; и 7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. Альтернативно, консервативной заменой является любое изменение с положительным значением в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250, раскрытой в публикации Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. «Умеренно консервативной» заменой является любое изменение, имеющее неотрицательное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.

[00103] Схожесть последовательностей для полипептидов обычно измеряют при помощи программного обеспечения для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белка сопоставляет схожие последовательности при помощи измерений схожести, присвоенной различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные аминокислотные замены. Например, программное обеспечение GCG содержит программы, такие как GAP и BESTFIT, которые можно применять с параметрами по умолчанию для определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды от различных видов организмов, или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, GCG версии 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать при помощи FASTA с параметрами по умолчанию или рекомендованными параметрами, программы в GCG версии 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) выводит результаты выравнивания и процент идентичности последовательности для участков с наилучшим совпадением между запрашиваемой и поисковой последовательностями (Pearson (2000), ранее). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности по настоящему изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей от различных организмов, является компьютерная программа BLAST, в особенности BLASTP или TBLASTN, с применением параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 и (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки.

[00104] В соответствии с конкретными вариантами осуществления, антитело или фрагмент антитела для применения в способе по настоящему изобретению может быть моноспецифическим, биспецифическим или мультиспецифическим. Мультиспецифические антитела могут быть специфическими к различным эпитопам одного целевого полипептида или могут содержать антигенсвязывающие домены, специфические к эпитопам более одного целевого полипептида. Иллюстративный биспецифический формат антитела, который можно применять в контексте настоящего изобретения, предусматривает применение первого домена C_H3 иммуноглобулина (Ig) и второго домена C_H3 Ig, причем первый и второй домены C_H3 Ig отличаются друг от друга по меньшей мере по одной аминокислоте, и причем по меньшей мере одно аминокислотное отличие уменьшает связывание биспецифического антитела с белком А по сравнению с биспецифическим антителом без аминокислотного отличия. В соответствии с одним вариантом осуществления, первый домен C_H3 Ig связывается с белком А, а второй домен C_H3 Ig содержит мутацию, которая уменьшает или ликвидирует связывание белка А, такую как модификация H95R (согласно нумерации экзонов IMGT; H435R согласно нумерации EU). Второй C_H3 может дополнительно иметь модификацию Y96F (по IMGT; Y436F по EU). К дополнительным модификациям, которые можно обнаружить во втором C_H3, относятся следующие: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (согласно IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I согласно EU) в случае mAb IgG1; N44S, K52N и V82I (IMGT; N384S, K392N и V422I согласно EU) в случае mAb IgG2; и Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (согласно IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I согласно EU) в случае mAb IgG4. Описанные выше варианты биспецифического формата антител предусмотрены объемом настоящего изобретения.

[00105] Под фразой «терапевтически эффективное количество» подразумевают количество, которое производит необходимый эффект у того, кому его вводят. Точное количество будет зависеть от цели лечения и может быть установлено специалистом в настоящей области с помощью известных методик (см., например, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

Общее раскрытие настоящего изобретения

[00106] «Перестроенная во время трансфекции», также называемая «RET», представляет собой рецепторную тирозинкиназу, которая экспрессируется в ходе развития в различных тканях, в том числе в периферической и центральной нервной системе и в почке (Arighi, Е. et al. (2005), Cytokine Growth Factor Rev 16:441-67; Borrello, MG, et al, (2013), Expert Opin. Ther. Targets, 17(4): 403-419). Онкоген RET был выявлен в 1985 году Takahashi et al.,, которые сообщили о новой перестройке гена с трансформирующей активностью в клетках NIH/3T3, которые были трансфицированы ДНК лимфомы человека (см. Takahashi, М., et al, (1985) Cell, 42:581-588). Позднее было подтверждено, что RET является онкогеном, который соматически перестраивается в ДНК пациентов с папиллярной карциномой щитовидной железы (РТС), и позже был назван RET/PTC. (Fusco, A. et al, (1987), Nature, 328:170-172; Grieco, M. et al, (1990), Cell, 60:557-63). Белок RET состоит из трех доменов: внеклеточного лиганд-связывающего домена, гидрофобного трансмембранного домена и цитоплазматической части с тирозинкиназным доменом, разделенным вставкой из 27 аминокислот (см. фиг. 1). Есть две основные изоформы RET, получаемые в результате альтернативного сплайсинга. Короткие и длинные изоформы RET, которые отличаются 9 и 51 неродственными С-концевыми аминокислотами, называются RET9 и RET51 соответственно. Они характеризуются высокой степенью консервативности у широкого спектра видов (Carter, МТ, et al. (2001), Cytogenet Cell Genet, 95:169-76). Обе изоформы обладают трансформирующей активностью по данным анализа бляшкообразования (Rossel, М. et al. (1997), Oncogene, 14:265-75).

[00107] Было показано, что генетические изменения RET вовлечены в этиологию различных форм рака щитовидной железы, а более свежие данные свидетельствуют о том, что RET также участвует в развитии различных форм аденокарциномы легких (Viglietto, G. et al. (1995), Oncogene, 11:1207-10; Fischer, AH, et al., (1998), Am J Pathol. 153:1443-50). Результаты других исследований свидетельствуют, что RET может быть вовлечена в развитие и других опухолей, в том числе молочной железы, поджелудочной железы, различных форм лейкоза и меланомы (Ballerini, P. et al, (2012), Leukemia, 26:2384-9; Sawai, H. et al. (2005), 65(24): 11536-44; Narita, N. et al, (2009), Oncogene, 28:3058-68).

[00108] Вандетаниб (ZD6474, CAPRELSA®, Astra Zeneca) представляет собой доступное в форме для перорального приема аминохиназолиновое соединение, которое первоначально было разработано как ингибитор VEGFR2, но позже было обнаружено, что он обладает активностью к RET, VEGFR3, EGFR и PDGFR. Вандетаниб в настоящее время одобрен FDA и ЕМА для лечения поздних стадий и метастатической формы медуллярной карциномы щитовидной железы (МТС) (Wells, SA, et al, (2012), J. Clin. Oncol. 30:134-41).

[00109] Сорафениб (BAY43-9006, NEXAVAR®, Bayer Pharmaceuticals) представляет собой соединение бисарилмочевины, первоначально разработанное для целенаправленного воздействия на серин-треониновую киназу BRAF, но впоследствии было установлено, что он является эффективным средством против Flt-3, VEGFR1-3, PDGFR, c-kit и RET (Wilhelm, S. et al, (2006), Nat Rev Drug Discov, 5:835-44). Сорафениб был одобрен FDA для лечения форм рака печени и почек на поздних стадиях.

[00110] Сунитиниб (SU11248, SUTENT®, Pfizer) представляет собой соединение индолинона, которое нацелено преимущественно на киназы VEGFR2, PDGFR, c-kit, FLT3 и RET ((Chow, LQ, et al, (2007), J. Clin. Oncol. 25:884-96). Сунитиниб был одобрен FDA для пациентов с резистентными к иматинибу формами GIST, а также для лечения поздних стадий нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы и почечно-клеточного рака.

[00111] Кабозантиниб (Cometriq, ранее известный как XL-184, Exelixis) представляет собой низкомолекулярный мультикиназный ингибитор, нацеленный на МЕТ, VEGFR2 и RET. В настоящее время он проходит клинические испытания на большом количестве типов опухолей, в том числе медуллярном раке щитовидной железы, раке предстательной железы, раке яичников, немелкоклеточном раке легкого (NSCLC), гепатоклеточном, почечно-клеточном раке и раке молочной железы, а также меланоме и глиобластоме ((Zhang, Y. et al, (2010), IDrugs 13:112-21).

[00112] Другим нацеленным на RET средством, находящимся в клинической разработке, является мотесаниб (AMG-706, Amgen), который представляет собой мультикиназный ингибитор, который нацелен на VEGFR1-3, Flt3, Kit, PDGFR и RET.

[00113] Другими ингибиторами RET, находящимися в стадии доклинической разработки, являются RPI-1, который представляет собой соединение индолина; РР-1, который представляет собой соединение пиразолопиримидина, активное в отношении RET и Src; и NVP-AST478, который представляет собой соединение бифенилмочевины, обладающее эффективной активностью в отношении киназы RET in vitro и in vivo (Cuccuru, G. et al. (2004), J Natl Cancer Inst 96:1006-14).

[00114] Однако одним проблемным аспектом вышеупомянутых ингибиторов RET является то, что они не специфичны к RET, то есть, по-видимому, действуют через несколько механизмов и, как таковые, потенциально могут оказывать другие неблагоприятные эффекты in vivo. Например, некоторые из указанных выше ингибиторов вызывают такие побочные эффекты, как гипертония и удлинение интервала QTc. Таким образом, неселективный профиль таких средств может ограничивать спектр терапевтического действия. Было бы полезно найти такие средства, как антитело к RET, которое селективно связывается с RET, что могло бы привести в результате к превосходной клинической эффективности с более благоприятным профилем безопасности.

[00115] Соответственно, все еще существует потребность в эффективных средствах терапии против RET-индуцируемых опухолей, и, кроме того, существует потребность в выявлении средства, специфического к RET, для предупреждения и лечения других заболеваний, нарушений или патологических состояний, связанных с экспрессией RET, без неблагоприятных побочных эффектов, связанных с описанными выше средствами. Такая специфичность и эффективность могут быть достигнуты посредством применения антител к RET, таких как описанные в настоящем документе.

[00116] В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитела по настоящему изобретению получают от мышей, иммунизированных первичным иммуногеном, таким как цельный белок RET человека, или рекомбинантной формой белка, или его фрагментом, или слитым белком, который содержит внеклеточный/эктодомен человеческой RET (см. под номером доступа в GenBank NP_066124.1 (SEQ ID NO: 310) или под номером доступа в GenBank NP_065681.1 (SEQ ID NO: 312)), или полученным рекомбинантными методами слитым белком RET (см. SEQ ID NO: 305, 306, 307 и 313), с последующей иммунизацией вторичным иммуногеном (очищенным белком человеческой RET) или иммуногенно активным фрагментом белка RET, таким как эктодомен из RET.

[00117] Иммуноген может представлять собой ДНК, кодирующую белок человеческой RET (см. под номером доступа в GenBank NM_020975.4 и SEQ ID NO: 309 для изоформы А; или под номером доступа в GenBank NM_020630.4 и SEQ ID NO: 311 для изоформы С) или его активный фрагмент.

[00118] Иммуноген может происходить из внеклеточного домена белка RET, который охватывает аминокислотные остатки 1-635 любой из последовательностей под SEQ ID NO: 305, 307, 310, 312 и 313 (включая сигнальную последовательность); из аминокислотных остатков 1-636 последовательности под SEQ ID NO: 306 (включая сигнальную последовательность). Иммуноген может происходить из фрагмента любого из вышеупомянутых участков белка RET.

[00119] Полноразмерная аминокислотная последовательность RET51 представлена под SEQ ID NO: 310, а также представлена под номером доступа в GenBank NP_066124.1. Полноразмерная аминокислотная последовательность RET9 представлена под SEQ ID NO: 312, а также представлена под номером доступа в GenBank NP_065681.1. В качестве иллюстративных иммуногенов можно привести рекомбинантные конструкции, представленные под SEQ ID NO: 307 или 313.

[00120] В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитела, которые специфически связываются с RET, можно получить с помощью фрагментов вышеупомянутых участков или пептидов, которые выходят за пределы обозначенных участков приблизительно на 5 - приблизительно на 20 аминокислотных остатков от любого одного или обоих N- или С-концов описанных в настоящем документе участков. В соответствии с определенными вариантами осуществления, при получении специфических к RET антител можно применять любую комбинацию указанных выше участков или их фрагментов. В соответствии с определенными вариантами осуществления, для получения моноспецифических, биспецифических или мультиспецифических антител можно применять любой один или несколько из указанных выше участков RET или их фрагментов.

Антигенсвязывающие фрагменты антител

[00121] Если специально не указано иное, в контексте настоящего документа термин «антитело» необходимо понимать как охватывающий молекулы антител, содержащих две иммуноглобулиновые тяжелые цепи и две иммуноглобулиновые легкие цепи (т.е. «полные молекулы антител»), а также их антигенсвязывающие фрагменты. Термины «антигенсвязывающая часть» антитела, «антигенсвязывающий фрагмент» антитела и т.п. в контексте настоящего документа включают любой встречающийся в природе, получаемый ферментативным путем, синтетический или полученный методами генетической инженерии полипептид или гликопротеин, который специфически связывает антиген с образованием комплекса. Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «фрагмент антитела» в контексте настоящего документа относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с RET. К фрагменту антитела можно отнести Fab-фрагмент, Е(ab')₂-фрагмент, Fv-фрагмент, dAb-фрагмент, фрагмент, содержащий CDR, или выделенный CDR. Антигенсвязывающие фрагменты антитела можно получить, например, из полных молекул антител с помощью любых подходящих стандартных методик, таких как протеолитическое расщепление или рекомбинантные методики генной инженерии, предусматривающих манипуляцию с ДНК, кодирующей вариабельные и (необязательно) константные домены антитела, и ее экспрессию. Такая ДНК известна и/или легко доступна, например, из коммерческих источников, библиотек ДНК (в том числе, например, фаговых библиотек антител), или может быть синтезирована. ДНК можно секвенировать и с ней можно проводить химические манипуляции или манипуляции с применением методик молекулярной биологии, например, для организации одного или более вариабельных и/или константных доменов в подходящей конфигурации или для введения кодонов, включения остатков цистеина, модификации, добавления или удаления аминокислот и т.д.

[00122] Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: (i) Fab-фрагменты; (ii) F(ab')2-фрагменты; (iii) Fd-фрагменты; (iv) Fv-фрагменты; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) dAb-фрагменты и (vii) минимальные единицы распознания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельный участок антитела (например, выделенный определяющий комплементарность участок (CDR), такой как пептид CDR3), или пептид FR3-CDR3-FR4 с ограниченной конформационной свободой. Также в контексте настоящего документа выражением «антигенсвязывающий фрагмент» охватываются и другие модифицированные методами инженерии молекулы, такие как домен-специфические антитела, однодоменные антитела, антитела с удаленным доменом, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела (например, моновалентные антитела, бивалентные антитела и т.д.), иммунофармацевтические препараты на основе модульного белка малого размера (SMIP) и вариабельные домены IgNAR акулы.

[00123] Антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно будет содержать по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может быть любого размера или аминокислотного состава и будет, как правило, содержать по меньшей мере один CDR, который находится в рамке считывания с одной или более каркасными последовательностями или прилегает к ним. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих домен V_H, связанный с доменом V_L, домены V_H и V_L могут располагаться друг относительно друга в любом подходящем порядке. Например, вариабельный участок может быть димерным и содержать димеры V_H-V_H, V_H-V_L или V_L-V_L. В качестве альтернативы, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный V_H- или V_L-домен.

[00124] В соответствии с определенными вариантами осуществления, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный по меньшей мере с одним константным доменом. Неограничивающие иллюстративные конфигурации вариабельных или константных доменов, которые могут быть в антигенсвязывающем фрагменте антитела по настоящему изобретению, включают: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; и (xiv) V_L-C_L. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, в том числе любой из иллюстративных конфигураций, перечисленных выше, вариабельные и константные домены могут быть либо непосредственно соединены друг с другом, либо могут быть соединены при помощи полного или частичного шарнирного или линкерного участка. Шарнирный участок может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, которые обеспечивают образование гибкой или полугибкой связи между смежными вариабельными и/или константными доменами в единой полипептидной молекуле. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) в любой из перечисленных выше конфигураций вариабельных и константных доменов в нековалентной связи друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными доменами V_H или V_L (например, посредством одной или нескольких дисульфидных связей).

[00125] Как и в случае с полными молекулами антител, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент антитела, как правило, будет содержать по меньшей мере два различных вариабельных домена, причем каждый вариабельный домен способен специфически связываться с отдельным антигеном или с отличным эпитопом на одном антигене. Любой мультиспецифический формат антитела, включая раскрываемые в настоящем документе иллюстративные биспецифические форматы антител, можно адаптировать для применения в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению с помощью доступных в настоящей области техники стандартных методик.

Получение человеческих антител

[00126] Способы создания человеческих антител в трансгенных мышах известны из уровня техники. Любые такие известные способы можно применять в контексте настоящего изобретения для получения человеческих антител, которые специфически связываются с RET.

[00127] При помощи технологии VELOCIMMUNE® (см., например, патентный документ US 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) или любого другого известного способа создания моноклональных антител первоначально выделяют высокоаффинные химерные антитела к RET с человеческим вариабельным участком и мышиным константным участком. Технология VELOCIMMUNE® предусматривает создание трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий локусы человеческих вариабельных участков тяжелых и легких цепей, функционально связанные с эндогенными локусами мышиных константных участков, так, чтобы мышь в ответ на стимуляцию антигеном продуцировала антитело, содержащее человеческий вариабельный участок и мышиный константный участок. ДНК, кодирующую вариабельные участки тяжелых и легких цепей антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей человеческие константные участки тяжелых и легких цепей. Затем ДНК экспрессируют в клетке, способной экспрессировать полностью человеческое антитело.

[00128] Как правило, мыши VELOCIMMUNE® вводят провокационную дозу представляющего интерес антигена и из мышей, которые экспрессируют антитела, выделяют лимфатические клетки (такие как В-клетки). Лимфатические клетки можно подвергнуть слиянию с линией миеломных клеток с получением иммортализированных линий гибридомных клеток, и такие линии гибридомных клеток подвергают скринингу и отбирают для выявления линий гибридомных клеток, которые продуцируют антитела, специфические к представляющему интерес антигену. ДНК, кодирующую вариабельные участки тяжелой цепи и легкой цепи, можно выделить и соединить с необходимыми изотипическими константными участками тяжелой цепи и легкой цепи. Такой белок, представляющий собой антитело, может продуцироваться в клетке, такой как клетка СНО. Альтернативно, ДНК, кодирующую антигенспецифические химерные антитела или вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, можно выделить непосредственно из антигенспецифических лимфоцитов.

[00129] Изначально выделяют высокоаффинные химерные антитела с человеческим вариабельным участком и мышиным константным участком. Так же, как и в приведенном ниже экспериментальном разделе, у антител определяют характеристики и их отбирают по необходимым характеристикам, в том числе аффинности, селективности, эпитопу и т.д. Мышиные константные участки заменяют необходимыми человеческими константными участками для создания полностью человеческого антитела по настоящему изобретению, например, дикого типа или модифицированного IgG1 или IgG4. Несмотря на то, что выбранный константный участок может варьировать в соответствии с конкретным назначением, вариабельному участку должны быть присущи характеристики высокоаффинного связывания антигена и специфичности к мишени.

[00130] В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитела по настоящему изобретению обладают аффинностями (K_D) в диапазоне от приблизительно 1,0×10^-7 М до приблизительно 1,0×10^-12 М, при измерении по связыванию с антигеном, иммобилизированным либо на твердой фазе, либо в жидкой фазе. Для создания полностью человеческих антител мышиные константные участки замещают необходимыми человеческими константными участками. Несмотря на то, что выбранный константный участок может варьировать в соответствии с конкретным назначением, вариабельному участку должны быть присущи характеристики высокоаффинного связывания антигена и специфичности к мишени.

Биоэквиваленты

[00131] Антитела к RET и фрагменты антител по настоящему изобретению охватывают белки с аминокислотными последовательностями, которые отличаются от последовательностей описанных антител, но которые сохраняют способность связывать RET. Такие варианты антител и фрагментов антител характеризуются наличием одного или нескольких из добавлений, делеций или замен аминокислот при сравнении с исходной последовательностью, но проявляют биологическую активность, которая фактически эквивалентна активности у описанных антител. Аналогичным образом, кодирующие антитела последовательности ДНК по настоящему изобретению охватывают последовательности, которые характеризуются наличием одного или нескольких добавлений, делеций или замен нуклеотидов по сравнению с раскрываемой последовательностью, но которые кодируют антитело или фрагмент антитела, которые фактически биоэквивалентны антителу или фрагменту антитела по настоящему изобретению.

[00132] Два антигенсвязывающих белка или антитела считаются биологическими эквивалентами, если, например, они являются фармацевтическими эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, скорость и/или степень абсорбции которых значительно не отличается от таких показателей при введении одинаковой мольной дозы в аналогичных экспериментальных условиях, либо в однократных дозах, либо в многократных дозах. Некоторые антитела считаются эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они являются эквивалентами по их степени абсорбции, но не по их скорости абсорбции, и по прежнему могут считаться биоэквивалентом, поскольку такие различия в скорости абсорбции предусмотрены и учитываются при введении метки, и не являются существенными для достижения в организме эффективных концентраций лекарственного средства, например, при длительном применении, и считаются несущественными с медицинской точки зрения для конкретного исследуемого фармацевтического продукта.

[00133] В соответствии с одним вариантом осуществления, два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если они не имеют клинически существенных отличий по их безопасности, чистоте или активности.

[00134] В соответствии с одним вариантом осуществления, два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если у пациента можно заменить один или несколько раз эталонный продукт на биологический продукт и наоборот без предположительного повышения риска отрицательных эффектов, включая клинически значимое изменение иммуногенности или сниженную эффективность, по сравнению с продолжительной терапией без такой замены.

[00135] В соответствии с одним вариантом осуществления, два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если они оба действуют по общему механизму или механизмам действия по отношению к условию или условиям применения, при условии, что такие механизмы известны.

[00136] Биоэквивалентность можно продемонстрировать посредством способов in vivo и/или in vitro. Измерения биологической эквивалентности включают, например, (а)in vivo тестирование на людях или других млекопитающих, при котором концентрацию антитела или его метаболитов измеряют в крови, плазме крови, сыворотке крови или других биологических жидкостях в зависимости от времени; (b) in vitro тестирование, результаты которого коррелируют с данными in vivo тестирования биологической доступности у человека и позволяют обоснованным образом их прогнозировать; (с) in vivo тестирование у людей и других млекопитающих, у которых соответствующий ранний фармакологический эффект антитела (или его мишени) измеряют в зависимости от времени; и (d) строго контролируемое клиническое испытание, в котором устанавливают безопасность, эффективность, или биологическую доступность, или биологическую эквивалетность антитела.

[00137] Биоэквивалентные варианты антител по настоящему изобретению можно сконструировать, например, путем выполнения различных замен остатков или последовательностей или удаления концевых или внутренних остатков или последовательностей, которые не являются необходимыми для биологической активности. Например, остатки цистеина, не являющиеся значимыми для биологической активности, можно удалить или заменить на другие аминокислоты для предупреждения образования нежелательных или несоответствующих внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. Согласно другим контекстам, биоэквивалентные антитела могут включать варианты антител, содержащие аминокислотные изменения, которые модифицируют характеристики гликозилирования у антител, например, мутации, которые исключают или удаляют участки гликозилирования.

Антитела к RET, содержащие Fc-варианты

[00138] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения, представлены антитела к RET, содержащие Fc-домен, содержащий одну или несколько мутаций, которые усиливают или ослабляют связывания антитела с FcRn-рецептором, например, при кислом значении рН по сравнению с нейтральным значением рН. Например, настоящее изобретение относится к антителам к RET, содержащим мутацию в участке C_H2 или C_H3 Fc-домена, причем мутация(мутации) увеличивает аффинность Fc-домена к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, где рН варьирует в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Результатом таких мутаций может быть увеличение периода полужизни антитела в сыворотке крови при введении животному. Неограничивающие примеры таких Fc-модификаций включают, например, модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/E/D или Т), или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, H/L/R/S/P/Q или K), и/или 434 (например, H/F или Y), или модификацию в положении 250 и/или 428, или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В соответствии с одним вариантом осуществления, указанная модификация предусматривает модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 2591 (например, V259I) и 308F (например, V308F); модификацию 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т и 256Е); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р).

[00139] Например, настоящее изобретение относится к антителам к RET, содержащим Fc-домен, содержащий одну или несколько пар или групп мутаций, выбранных из группы, состоящей из: 250Q и 248L (например, T250Q и M248L); 252Y, 254Т и 256Е (например, M252Y, S254T и Т256Е); 428L и 434S (например, M428L и N434S); и 433K и 434F (например, H433K и N434F). Все возможные комбинации вышеуказанных мутаций в Fc-доменах и других мутаций в раскрываемых в настоящем документе вариабельных доменах антител рассматривают как входящие в объем настоящего изобретения.

Биологические характеристики антител

[00140] Обычно антитела по настоящему изобретению могут функционировать путем связывания с RET и тем самым блокировать или предупреждать активацию и/или передачу сигналов RET. Антитела по настоящему изобретению также могут функционировать путем связывания с RET и тем самым препятствовать или предупреждать взаимодействие или связывание RET с одним или несколькими представителями семейства GDNF в комплексе с их соответствующими корецепторами, например: GDNF/GFRα1, нейртурин/ GFRα2, артемин/GFRα3 или персефин/GFRα4. Исходя из того факта, что у людей был установлен канцерогенный потенциал RET, антагонистическое антитело, которое специфически связывается с RET, может оказывать положительный эффект при ингибировании роста опухолевых клеток у страдающих от ракового состояния пациентов.

[00141] В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитела по настоящему изобретению могут функционировать путем блокирования или ингибирования активности RET при связывании с любым участком или фрагментом полноразмерного белка, аминокислотная последовательность которого представлена под SEQ ID NO: 310 (RET51), также представлена под номером доступа в GenBank NP_066124.1 и под SEQ ID NO: 312 (RET9), также представлена под номером доступа в GenBank NP_065681.1. Антитела также могут связываться с любым участком, который находится в последовательности под SEQ ID NO: 310 или 312, или с фрагментом, который находится в последовательности под SEQ ID NO: 310 или 312.

[00142] В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к полностью человеческому моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с белком RET, причем антитело или его фрагмент обладают одной или несколькими из следующих характеристик:

(a) представляет собой полностью человеческое антитело;

(b) характеризуется K_D в диапазоне от приблизительно 1,0×10^-7 М до приблизительно 1,0×10^-12 М по результатам измерения с помощью поверхностного плазмонного резонанса;

(c) ингибирует или блокирует связывание или взаимодействие RET с одним или несколькими лигандами-представителя семейства GDNF (GDNF, нейртурином, артемином и персефином) в комплексе с их соответствующими корецепторами (GFRα1, GFRα2, GFRα3 и GFRα4 соответственно);

(d) ингибирует передачу сигналов RET, опосредованную одним или несколькими лигандами-представителями семейства GDNF, выбранными из GDNF, нейртурина, артемина и персефина;

(e) усиливает интернализацию/разрушение RET после связывания антитела с рецептором RET;

(f) содержит вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274 и 290; или

(g) содержит вариабельный участок легкой цепи (LCVR) с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282 и 298.

[0142] Некоторые антитела к RET по настоящему изобретению способны связываться с белком RET и ингибировать активацию и/или передачу сигналов, связанных с RET. При этом антитела могут осуществлять свою функцию, ингибируя рост опухолей, который зависит от активации передачи сигналов RET для роста. Такие антагонистические антитела к RET можно применять отдельно для лечения ракового состояния или можно применять в качестве вспомогательной терапии с любым другим противораковым средством, таким как химиотерапевтическая малая молекула, или лучевая терапия, или со средством для восстановления костного мозга.

[0143] В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитела к RET могут быть способны ингибировать несколько сигнальных путей, включая путь RAS/RAF, что приводит к активации митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK) ERK1 и ERK2 (Trapp, М. et al., (1999), J Biol. Chem. 274:20885-94; Santoro, M. et al, (1994), Mol. Cell Biol. 14:663-75; van Weering, DHJ, et al. (1995), 11:2207-14; Worby, CA, et al., (1996), J Biol Chem, 271:23619-22), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K),что приводит в результате к активации серин-треониновой киназы Akt (Trupp, М. et al., (1999), J Biol. Chem. 274:20885-94; van Weering, DHJ, (1997), J Biol Chem 272:249-54; Segouffin-Cariou, C, et al, (2000), 275:3568-76; Maeda, K. et al, (2004), 323: 345-54).

[0144] Неограничивающие иллюстративные анализы in vitro по измерению способности антител к RET по настоящему изобретению блокировать связывание RET с комплексом GFRal/GDNF и анализы in vitro по измерению влияния антител на передачу сигналов, активацию или интернализацию RET проиллюстрированы соответственно в примерах 4 и 5. В примере 3 значения аффинности связывания и кинетические константы человеческих антител к RET определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса, а измерения проводили на приборе Biacore 4000 или Т200. В примере 4 способность антител блокировать связывание RET с совместным комплексом GFRα1/GDNF тестировали с помощью конкурентного сэндвич-анализа ELISA. В примере 5 продемонстрирована способность антител по настоящему изобретению ингибировать лиганд-зависимую передачу сигналов RET в анализе сывороточного фактора отклика (SRE) с люциферазным репортером. Более конкретно, данные, представленные в примере 5, позволяют увидеть, что антитела к RET по настоящему изобретению характеризуются определенным спектром ингибирующей активности в отношении передачи сигналов RET в присутствии лигандов глиального семейства, т.е. GDNF и артемина.

Картирование эпитопов и родственные методики

[0145] Для определения того, «взаимодействует ли антитело с одной или несколькими аминокислотами» в полипептиде или белке, можно применять различные методики, известные рядовым специалистам в настоящей области. Примеры методик, которые можно использовать, включают, например, стандартные эпитоп-перекрестные конкурентные анализы, такие как описанные в работе Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). К другим способам относятся анализ при помощи сканирующего аланином мутагенеза, пептидный блот-анализ (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63), анализ расщепления пептидов, кристаллографические исследования и NMR-анализ. Кроме того, можно использовать такие способы, как вырезание эпитопов, экстракция эпитопов и химическая модификация антигенов (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Другим способом, который можно применять для выявления в полипептиде аминокислот, с которыми взаимодействует антитело, является водородно/дейтериевый обмен, определяемый посредством масс-спектрометрии. В общих чертах способ водород/дейтериевого обмена предусматривает мечение дейтерием представляющего интерес белка с последующим связыванием антитела с помеченным дейтерием белком. Затем комплекс белок/антитело переносят в воду, и способные к обмену протоны в аминокислотах, которые защищены комплексом с антителом, подвергаются обратному обмену дейтерия-на-водород с более медленной скоростью, чем способные к обмену протоны в аминокислотах, которые не являются частью границы раздела. Как результат, аминокислоты, которые формируют часть границы раздела белок/антитело, могут удерживать дейтерий и, таким образом, характеризуются относительно более высокой массой по сравнению с аминокислотами, не включенными в границу раздела. После диссоциации антитела белок-мишень подвергают протеазному расщеплению и масс-спектрометрическому анализу, таким образом выявляя меченные дейтерием остатки, которые соответствуют конкретным аминокислотам, с которыми взаимодействует антитело. См., например, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 75:256A-265A.

[0146] Термин «эпитоп» относится к сайту на антигене, на который реагируют В-и/или Т-клетки. В-клеточные эпитопы могут быть сформированы как из заменимых аминокислот, так и из незаменимых аминокислот, входящих в соприкосновение в результате образования третичной структуры белка. Эпитопы, сформированные из заменимых аминокислот, обычно остаются под воздействием денатурирующих растворителей, при этом эпитопы, сформированные в результате образования третичной структуры, обычно теряются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3 или, что более характерно, по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

[0147] Анализ антител на основе модификаций (MAP), также известный как анализ антител на основе структуры антигена (ASAP), является способом, с помощью которого классифицируют большие количества моноклональных антител (mAb) к одному антигену в соответствии со схожестью профиля связывания у каждого антитела с поверхностями химически или ферментативно модифицированных антигенов (US 2004/0101920, полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки). Каждая категория может отражать уникальный эпитоп, либо явно отличающийся от эпитопа, представленного в другой категории, либо практически совпадающий с ним. Такая методика позволяет быстро отфильтровывать генетически идентичные антитела так, чтобы при выяснении характеристик можно было сфокусироваться на генетически отличных антителах. Применительно к скринингу гибридом MAP может облегчить определение редких гибридомных клонов, которые продуцируют mAb с необходимыми характеристиками. MAP можно применять для разделения антител по настоящему изобретению на группы антител, связывающих различные эпитопы.

[0148] Настоящее изобретение относится к антителам к RET, которые связываются с тем же эпитопом, что и любое из конкретных иллюстративных антител, описанных в настоящем документе в таблице 1. Аналогичным образом, настоящее изобретение также относится к антителам к RET, которые конкурируют за связывания с RET или его фрагментом с любым из специфических иллюстративных антител, описанных в настоящем документе в таблице 1.

[0149] С помощью стандартных известных из уровня техники способов можно легко определить, связывается ли антитело с тем же эпитопом, что и эталонное антитело к RET, или же конкурирует за связывание с ним. Например, для определения того, связывается ли тестовое антитело с тем же эпитопом, что и эталонное антитело к RET по настоящему изобретению, эталонному антителу позволяют связаться с белком или пептидом RET в насыщающих условиях. Затем оценивают способность тестового антитела связываться с молекулой RET. Если тестовое антитело способно связываться с RET после насыщающего связывания с эталонным антителом к RET, то можно прийти к заключению, что тестовое антитело связывается с эпитопом, отличным от эталонного антитела к RET. С другой стороны, если тестовое антитело не способно связываться с молекулой RET после насыщающего связывания с эталонным антителом к RET, то тестовое антитело может связываться с тем же эпитопом, что и эпитоп, связываемый эталонным антителом к RET по настоящему изобретению.

[0150] Для определения того, конкурирует ли антитело за связывание с эталонным антителом к RET, осуществляют описанную выше методологию связывания в двух адаптациях. Согласно первой адаптации, эталонному антителу позволяют связаться с молекулой RET в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания тестового антитела с молекулой RET. Согласно второй адаптации, тестовому антителу позволяют связаться с молекулой RET в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания эталонного антитела с молекулой RET. Если в обоих адаптациях только первое (насыщающее) антитело способно связываться с молекулой RET, то делают вывод, что тестовое антитело и эталонное антитело конкурируют за связывание RET. Рядовому специалисту в настоящей области техники будет понятно, что антитело, которое конкурирует за связывание с эталонным антителом, не обязательно может связываться с идентичным эпитопом, что и эталонное антитело, а может стерически блокировать связывание эталонного антитела посредством связывания совпадающего или смежного эпитопа.

[0151] Два антитела связываются с одинаковым или перекрывающимся эпитопом, если каждое конкурентно ингибирует (блокирует) связывание другого с антигеном. А именно, 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток одного антитела ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, но предпочтительно на 75%, 90% или даже 99%, согласно результатам измерения в анализе конкурентного связывания (см., например, Junghans et at, Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Альтернативно, два антитела характеризуются одинаковыми эпитопами, если фактически все аминокислотные мутации в антигене, которые уменьшают или исключают связывание одного антитела, уменьшают или исключают связывание другого. Два антитела характеризуются перекрывающимися эпитопами, если несколько аминокислотных мутаций, которые уменьшают или исключают связывание одного антитела, уменьшают или исключают связывание другого.

[0152] Затем можно осуществить дополнительный стандартный эксперимент (например, анализы на мутации и связывание пептида) для подтверждения того, является ли наблюдаемое отсутствие связывания тестового антитела фактическим следствием связывания с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, или же за отсутствие наблюдаемого связывания ответственно стерическое блокирование (или другое явление). Эксперименты такого рода можно осуществить при помощи ELISA, RIA, поверхностного плазмонного резонанса, проточной цитометрии или любого другого количественного или качественного анализа связывания антитела, который доступен в настоящей области техники.

Иммуноконъюгаты

[0153] Настоящее изобретение охватывает человеческое моноклональное антитело к RET, конъюгированное с терапевтическим компонентом («иммуноконъюгат»), таким как средство, которое способно ингибировать пролиферацию опухолевых клеток или ослаблять по меньшей мере один симптом, связанный с патологическим состоянием, связанным с RET, таким как раковое состояние. Такое средство может быть вторым антителом, отличным от RET, или противоопухолевым химиотерапевтическим средством, или может быть радионуклидом, который при нацеливании на опухолевую клетку, экспрессирующую RET, действует таким образом, что уничтожает опухолевую клетку. Для типа терапевтического компонента, который может быть конъюгирован с антителом к RET, будут принимать в учет подлежащее лечению патологическое состояние и подлежащий достижению необходимый терапевтический эффект. В качестве альтернативы, если необходимый терапевтический эффект заключается в лечении последствий или симптомов, связанных с экспрессией RET определенными тканями, или любого другого патологического состояния, возникающего в результате экспрессии RET, такого как без ограничения рак, преимущественным может быть конъюгирование средства, которое подходит для лечения последствий или симптомов патологического состояния или для облегчения любых побочных эффектов антител по настоящему изобретению. Примеры подходящих средств для формирования иммуноконъюгатов известны в настоящей области техники, см., например, WO 05/103081.

Мультиспецифические антитела

[0154] Антитела по настоящему изобретению могут быть моноспецифическими, биспецифическими или мультиспецифическими. Мультиспецифические антитела могут быть специфическими к различным эпитопам одного целевого полипептида или могут содержать антигенсвязывающие домены, специфические к нескольким целевым полипептидам. См., например, Tutt et at, 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et at, 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Антитела по настоящему изобретению могут быть связаны или совместно экспрессироваться с другой функциональной молекулой, например, с другим пептидом или белком. Например, антитело или его фрагмент могут быть функционально связаны (например, путем химического связывания, генетического слияния, нековалентного связывания или иным образом) с одним или несколькими другими молекулярными объектами, такими как другое антитело или фрагмент антитела, с образованием биспецифического или мультиспецифического антитела со второй специфичностью связывания.

[0155] Иллюстративный биспецифический формат антитела, который можно применять в контексте настоящего изобретения, предусматривает применение первого домена C_H3 иммуноглобулина (Ig) и второго домена C_H3 Ig, причем первый и второй домены C_H3 Ig отличаются друг от друга по меньшей мере по одной аминокислоте, и причем по меньшей мере одно аминокислотное отличие уменьшает связывание биспецифического антитела с белком А по сравнению с биспецифическим антителом без аминокислотного отличия. В соответствии с одним вариантом осуществления, первый домен C_H3 Ig связывается с белком А, а второй домен C_H3 Ig содержит мутацию, которая уменьшает или ликвидирует связывание белка А, такую как модификация H95R (согласно нумерации экзонов IMGT; H435R согласно нумерации EU). Второй C_H3 может дополнительно иметь модификацию Y96F (по IMGT; Y436F по EU). К дополнительным модификациям, которые можно обнаружить во втором C_H3, относятся следующие: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (согласно IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I согласно EU) в случае антител IgG1; N44S, K52N и V82I (IMGT; N384S, K392N и V422I согласно EU) в случае антител IgG2; и Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (согласно IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I согласно EU) в случае антител IgG4. Описанные выше варианты биспецифического формата антител предусмотрены объемом настоящего изобретения.

Терапевтическое введение и составы

[0156] Настоящее изобретение относится к терапевтическим композициям, содержащим антитела к RET или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению. Введение терапевтических композиций, в соответствии с настоящим изобретением, будут осуществлять с подходящими носителями, наполнителями и другими средствами, которые включены в составы для обеспечения улучшенного переноса, доставки, стойкости и т.п. Множество подходящих составов можно найти в справочнике, хорошо известном всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. К таким составам относятся, например, порошки, пасты, мази, желе, разновидности воска, масла, липиды, содержащие липиды (катионные или анионные) везикулы (такие как LIPOFECTIN™), ДНК-конъюгаты, безводные абсорбционные пасты, эмульсии по типу «масло в воде» и «вода в масле», эмульсии карбовакса (полиэтиленгликоли с различными молекулярными массами), полужидкие гели и полужидкие смеси, содержащие карбовакс.См. также Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0157] Доза каждого из антител по настоящему изобретению может варьировать в зависимости от возраста и размера субъекта, которому будут осуществлять введение, целевого заболевания, патологических состояний, пути введения и им подобных. При применении антител по настоящему изобретению для лечения связанного с RET заболевания или патологического состояния у пациента, или для лечения одного или нескольких симптомов, связанных с патологическим состоянием, которое зависит от активации или передачи сигналов RET, таких как определенные опухоли, экспрессирующие RET, у пациента, или для уменьшения тяжести заболевания, преимущественным будет введение каждого из антител по настоящему изобретению внутривенно или подкожно, как правило, в однократной дозе от приблизительно 0,01 до приблизительно 30 мг/кг массы тела субъекта, более предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг массы тела субъекта, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 15 мг/кг массы тела субъекта, или от приблизительно 0,02 до приблизительно 7 мг/кг массы тела субъекта, от приблизительно 0,03 до приблизительно 5 мг/кг массы тела субъекта, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 3 мг/кг массы тела субъекта, или приблизительно 1 мг/кг массы тела субъекта, или приблизительно 3,0 мг/кг массы тела субъекта, или приблизительно 10 мг/кг массы тела субъекта, или приблизительно 20 мг/кг массы тела субъекта. При необходимости можно вводить несколько доз. В зависимости от тяжести состояния, частоту введения и длительность лечения можно откорректировать. В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно вводить в виде изначальной дозы, составляющей по меньшей мере от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 800 мг, от приблизительно 1 до приблизительно 600 мг, от приблизительно 5 до приблизительно 300 мг или от приблизительно 10 до приблизительно 150 мг, до приблизительно 100 мг или до приблизительно 50 мг. В соответствии с определенными вариантами осуществления, после изначальной дозы может следовать введение второй или нескольких последующих доз антител или их антигенсвязывающих фрагментов в количестве, которое может быть примерно таким же или меньшим, чем в изначальной дозе, причем последующие дозы разделены по меньшей мере 1-3 сутками, по меньшей мере одной неделей, по меньшей мере 2 неделями, по меньшей мере 3 неделями, по меньшей мере 4 неделями, по меньшей мере 5 неделями, по меньшей мере 6 неделями, по меньшей мере 7 неделями, по меньшей мере 8 неделями, по меньшей мере 9 неделями, по меньшей мере 10 неделями, по меньшей мере 12 неделями или по меньшей мере 14 неделями.

[0158] Известны различные системы доставки, и их можно применять для введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению, например, инкапсуляция в липосомах, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, опосредованный рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способы введения предусматривают без ограничения внутрикожный, чрезкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Композицию можно вводить любым удобным способом, например, инфузией или болюсной инъекцией, абсорбцией через эпителиальные или кожно-слизистые покровы (например, слизистую ротовой полости, слизистую носа, слизистую прямой кишки и кишечника и др.), и ее можно вводить совместно с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным. Доставку можно осуществлять в виде аэрозольного состава (см. US2011/0311515 и US2012/0128669). Все более широко распространенной становится доставка средств, пригодных для лечения респираторных заболеваний путем ингаляции (см. A. J. Bitonti and J. A. Dumont, (2006), Adv. Drug Deliv. Rev, 58:1106-1118). Помимо эффективности при лечении местного легочного заболевания, такой механизм доставки также может быть пригоден для системной доставки антител (см. Maillet et al. (2008), Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 6, 2008).

[0159] Фармацевтическую композицию также можно доставлять в везикуле, в частности, липосоме (см., например, Langer (1990) Science 249:1527-1533).

[0160] В определенных ситуациях фармацевтическую композицию можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением. В соответствии с одним вариантом осуществления, можно применять помпу. В соответствии с другим вариантом осуществления, можно применять полимерные материалы. В соответствии с еще одним вариантом осуществления, систему с контролируемым высвобождением можно поместить вблизи цели композиции, делая таким образом необходимой лишь часть системной дозы.

[0161] К инъекционным препаратам можно отнести лекарственные формы для внутривенных, подкожных, интракутанных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, капельных внутривенных вливаний и т.д. Такие инъекционные препараты можно получить посредством общеизвестных способов. Например, инъекционные препараты можно получить, например, путем растворения, суспендирования или эмульгирования описанного выше антитела или его соли в стерильной водной среде или масляной среде, обычно применяемых для инъекций. В качестве водной среды для инъекций выступает, например, физиологический раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные средства и т.д., которые можно применять в комбинации с соответствующим солюбилизирующим средством, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионогенное поверхностно-активное вещество [например, полисорбат 80, НСО-50 (аддукт полиоксиэтилена (50 моль) и гидрогенизованного касторового масла)] и т.д. В качестве масляной среды используют, например, сезамовое масло, соевое масло и т.д., которые можно применять в комбинации с солюбилизирующим средством, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.п. Полученный таким образом инъекционный препарат предпочтительно заполняют в подходящую ампулу.

[0162] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно доставлять подкожно или внутривенно при помощи стандартной иглы и шприца. Кроме того, что касается подкожной доставки, то при доставке фармацевтической композиции по настоящему изобретению с легкостью можно применять устройство для доставки по типу шприц-ручка. Такое устройство для доставки по типу шприц-ручка может быть многоразовым или одноразовым. В многоразовом устройстве для доставки по типу шприц-ручка обычно используют сменный картридж, который содержит фармацевтическую композицию. После того, как вся фармацевтическая композиция из картриджа была введена и картридж опустел, пустой картридж можно легко выбросить и заменить на новый картридж, который содержит фармацевтическую композицию. Устройство для доставки по типу шприца-ручки затем можно применять повторно. В случае одноразового устройства для доставки по типу шприца-ручки сменный картридж отсутствует. Вернее, одноразовое устройство для доставки по типу шприц-ручка заполнено фармацевтической композицией, удерживаемой в резервуаре устройства. После опустошения из резервуара фармацевтической композиции выбрасывают все устройство.

[0163] При подкожной доставке фармацевтической композиции по настоящему изобретению применяют разнообразные многоразовые шприц-ручки и автоинжекторные устройства для доставки. Примеры включают, разумеется, без ограничения AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Вудсток, Великобритания), шприц-ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Бургдорф, Швейцария), шприц-ручку HUMALOG MIX 75/25™, шприц-ручку HUMALOG™, шприц-ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Индианаполис, Индиана), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), шприц-ручку BD™ (Becton Dickinson, Франклин-Лэйкс, Нью-Джерси), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Франкфурт, Германия), и это лишь некоторые из них. Примеры одноразовых устройств для доставки по типу шприц-ручка, применяемых при подкожной доставке фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включают без ограничения шприц-ручку SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоинжектор SURECLICK™ (Amgen, Таузенд-Оукс, Калифорния), PENLET™ (Haselmeier, Штутгарт, Германия), EPIPEN (Dey, L.P.) и шприц-ручку HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, Иллинойс), и это лишь некоторые из них.

[0164] Преимущественно, описанные выше фармацевтические композиции для перорального или парентерального применения получают в лекарственных формах в стандартной дозе, подобранной в соответствии с дозой активных ингредиентов. К таким лекарственным формам в стандартной дозе относятся, например, таблетки, пилюли, капсулы, инъекционные препараты (ампулы), суппозитории и т.п. Количество содержащегося упомянутого выше антитела обычно составляет от приблизительно 5 до приблизительно 500 мг на лекарственную форму в стандартной дозе; особенно в форме инъекционного препарата предпочтительно, чтобы упомянутого выше антитела содержалось в количестве от приблизительно 5 до приблизительно 100 мг и от приблизительно 10 до приблизительно 250 мг в случае иных лекарственных форм.

Схемы введения

[0165] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения, субъекту на протяжении определенного периода времени можно вводить многократные дозы антитела к RET. Способы, в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения, предусматривают последовательное введение субъекту многократных доз антитела к RET. В контексте настоящего документа термин «последовательное введение» означает, что каждую дозу антитела к RET вводят субъекту в отдельный момент времени, например, в разные сутки, разделенные заранее определенным интервалом (например, часы, сутки, недели или месяцы). Настоящим изобретением предусмотрены способы, которые предусматривают последовательное введение пациенту одной начальной дозы антитела к RET, затем одной или нескольких вторичных доз антитела к RET, а затем необязательно одной или нескольких третичных доз антитела к RET.

[0166] Термины «начальная доза», «вторичные дозы» и «третичные дозы» относятся к временной последовательности введения антитела к RET. Таким образом, «начальная доза» представляет собой дозу, которую вводят в начале схемы лечения (также обозначается как «исходная доза»); «вторичные дозы» представляют собой дозы, которые вводят после начальной дозы; а «третичные дозы» представляют собой дозы, которые вводят после вторичных доз. Как начальная, так и вторичные и третичные дозы могут содержать одинаковое количество антитела к RET, но обычно могут отличаться друг от друга касательно частоты введения. Однако, в соответствии с определенными вариантами осуществления, количества антитела к RET, содержащиеся в начальной, вторичной и/или третичной дозах, отличаются друг от друга (например, при необходимости их корректируют в сторону повышения или понижения) на протяжении курса лечения. В соответствии с определенными вариантами осуществления, две или более (например, 2, 3, 4 или 5) доз вводят в начале схемы лечения в качестве «ударных доз», за которыми следуют последующие дозы, которые вводят не так часто (например, «поддерживающие дозы»).

[0167] В соответствии с одним иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, каждую вторичную и/или третичную дозу вводят через 1-26 недель (например, 1, 11, 21, 21 ^½, 22, или более) после непосредственно предшествующей дозы. В контексте настоящего документа фраза «непосредственно предшествующая доза» в случае последовательности многократных введений означает дозу антитела к RET, которую вводят пациенту до введения следующей дозы в последовательности без каких-либо промежуточных доз.

[0168] Способы, в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения, могут предусматривать введение пациенту любого количества вторичных или третичных доз антитела к RET. Например, в соответствии с определенными вариантами осуществления, пациенту вводят только одну вторичную дозу. В соответствии с другими вариантами осуществления, пациенту вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более) вторичных доз. Аналогичным образом, в соответствии с определенными вариантами осуществления, пациенту вводят только одну третичную дозу. В соответствии с другими вариантами осуществления, пациенту вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более) третичных доз.

[0169] В соответствии с вариантами осуществления, предусматривающими несколько вторичных доз, каждую вторичную дозу можно вводить с той же частотой, что и остальные вторичные дозы. Например, каждую вторичную дозу можно вводить пациенту через 1-2 недели после непосредственно предшествующей дозы. Аналогично, в соответствии с вариантами осуществления, предусматривающими несколько третичных доз, каждую третичную дозу можно вводить с той же частотой, что и остальные третичные дозы. Например, каждую третичную дозу можно вводить пациенту через 2-4 недели после непосредственно предшествующей дозы. Альтернативно, частота, с которой вторичные и/или третичные дозы вводят пациенту, может варьировать в ходе схемы лечения. Врач может корректировать частоту введения в ходе курса лечения в зависимости от потребностей отдельного пациента после клинического обследования.

Терапевтические применения антител

[0170] Благодаря их связыванию/взаимодействию с белком RET, экспрессируемым на определенных клетках и тканях, настоящие антитела пригодны для предупреждения взаимодействия белка RET с одним или несколькими комплексами лиганд/корецептор, например: GDNF/GFRα1, артемин/GFRα3, нейртурин/GFRα2 или персефин/GFRα4. Учитывая способность антител к RET по настоящему изобретению предупреждать или ингибировать данное взаимодействие, антагонистические антитела по настоящему изобретению могут оказаться полезными для ингибирования роста опухолевых клеток при зависимости опухолевой клетки от передачи сигналов RET для роста, или они могут оказаться полезными для подавления боли, связанной с раковым состоянием, а также боли, связанной с другими заболеваниями или нарушениями, при которых определенную роль играет активация или передача сигналов RET. Антитела по настоящему изобретению можно применять для замедления роста и/или метастазирования опухолей у субъекта с опухолью, экспрессирующей RET, или для лечения боли, связанной с раковым состоянием, при введении отдельно или в сочетании с другим противоопухолевым средством или согласно другой терапевтической схеме или с одним или несколькими средствами, применяемыми для дополнительного облегчения боли, связанной с данным патологическим состоянием. Альтернативно, антитела по настоящему изобретению могут быть пригодны для облегчения по меньшей мере одного симптома, связанного с раковым состоянием.

[0171] Предусмотрено, что антитела по настоящему изобретению можно применять отдельно или в сочетании со вторым средством или третьим средством для лечения заболевания или патологического состояния, связанного с RET, или для облегчения по меньшей мере одного симптома или осложнения, связанного с заболеванием или патологическим состоянием, связанным с RET. Термин «заболевание или патологическое состояние, связанное с RET» означает любое заболевание или патологическое состояние, при котором, как известно, в клетках или тканях, пораженных данным заболеванием или патологическим состоянием, экспрессируется RET и при котором достигается благоприятный ответ на лечение либо низкомолекулярным терапевтическим средством, о котором известно, что оно ингибирует активацию и/или передачу сигналов RET, или при котором достигается благоприятный ответ на лечение антителом к RET по настоящему изобретению. Второе или третье средство можно доставлять одновременно с антителами по настоящему изобретению или их можно вводить раздельно, либо до, либо после антител по настоящему изобретению. Второе или третье средство может представлять собой малую органическую молекулу или биологическое средство, такое как белок или полипептид. Второе или третье средство может быть синтетическим или природным. Второе или третье средство может быть противоопухолевым средством, таким как химиотерапевтическое лекарственное средство или лучевая терапия, или средством для восстановления костного мозга, или другими средствами для уменьшения лихорадки или боли, другим вторым, но отличающимся антителом, которое специфически связывает RET, средством (например, антителом), которое связывается с лигандом RET, например, GDNF, нейртурином, артемином или персефином, или которое связывается с корецептором RET, таким как GFRα1, GFRα2, GFRα3 или GFRα4, или siRNA, специфической к молекуле RET.

[0172] В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения, настоящие антитела применяют для получения фармацевтической композиции для лечения пациентов, страдающих заболеванием или патологическим состоянием, связанным с RET. В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения, настоящие антитела применяют для получения фармацевтической композиции для уменьшения пролиферации опухолевых клеток или уменьшения опухолевой массы у пациента, у которого есть опухоль, рост которой зависит от передачи сигналов RET. В соответствии со следующем вариантом осуществления настоящего изобретения, настоящие антитела применяют в качестве вспомогательной терапии с любым другим средством, пригодным для лечения связанного с RET заболевания или патологического состояния, в том числе химиотерапевтическим средством, лучевой терапией, средством для восстановления костного мозга, вторым антителом к RET, или любым другим антителом, специфическим к RET-антигену, или антителом, специфическим к GDNF или GFRα1, или любым другим средством паллиативной терапии, известным специалистам в настоящей области техники.

[0173] Антитела по настоящему изобретению пригодны для лечения, предупреждения и/или облегчения любого заболевания, нарушения или патологического состояния, связанного с активностью RET, или для облегчения по меньшей мере одного симптома, связанного с таким заболеванием, нарушением или патологическим состоянием, или для облегчения боли, связанной с таким заболеванием, нарушением или патологическим состоянием. К иллюстративным патологическим состояниям, заболеваниям и/или нарушениям и/или боли, которая связана с такими патологическими состояниями, заболеваниями или нарушениями, которые можно лечить с помощью антител к RET по настоящему изобретению, относятся острая или хроническая боль, в том числе без ограничения невропатическая боль, воспалительная боль, артрит, мигрень, кластерные головные боли, невралгия тройничного нерва, герпетическая невралгия, общие формы невралгии, синдром раздраженного кишечника, синдром воспаленного кишечника, висцеральная боль, в том числе боль в животе, боль при остеоартрите, подагра, постгерпетическая невралгия, диабетическая невропатия, радикулит, пояснично-крестцовый радикулит, позвоночная боль, боль в голове или шее, прорывная боль, послеоперационная боль, боль в костях, боль при раке. К другим патологическим состояниям, которые поддаются лечению с помощью антител и терапевтических способов по настоящему изобретению, относятся формы рака щитовидной железы, синдром семейной медуллярной карциномы щитовидной железы (FMTC), спорадическая медуллярная карцинома (МТС), синдромы множественной эндокринной неоплазии MEN2A и MEN2B, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки или рак мочевого пузыря и боль, связанная с данными патологическими состояниями. Формы рака, которые поддаются лечению с помощью антител по настоящему изобретению, могут быть солидными опухолями или они могут быть опухолями клеток крови, такими как лейкоз. Антитела по настоящему изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты также можно применять для лечения следующих патологических состояний: острой, хронической боли при незлокачественных заболеваниях или боли при переломах костей; ревматоидного артрита, стеноза позвоночного канала; невропатической боли в нижнем отделе позвоночника; миофасциального болевого синдрома; фибромиалгии; боли в височно-нижнечелюстном суставе; боли в поджелудочной железе; хронической головной боли; головной боли напряжения; связанной с ВИЧ невропатии; невропатии Шарко - Мари - Тута; наследственных форм сенсорной невропатии; повреждения периферических нервов; различных форм болезненной невриномы; эктопических проксимальных и дистальных выделений; радикулопатии; невропатической боли, вызванной химиотерапией; невропатической боли, вызванной лучевой терапией; боли после мастэктомии; центральной боли; боли при травме спинного мозга; постинсультной боли; таламической боли; рефлекторной симпатической дистрофии; фантомной боли; непереносимой боли; скелетно-мышечной боли; боли в суставах; острой падагрической боли; механической боли в нижних отделах позвоночника; боли в шее; тендинита; боли при травме/физической нагрузке; пиелонефрита; аппендицита; холецистита; кишечной непроходимости; грыжи; боли в области груди, в том числе сердечной боли; боли в области таза, боли при почечной колике, острой акушерской боли, в том числе боли при родах; боли при кесаревом сечении; ожоговой и травматической боли; эндометриоза; боли при опоясывающем герпесе; серповидноклеточной анемии; острого панкреатита; боли в районе рта и лица, в том числе боли при синусите, зубной боли; боли при рассеянном склерозе; проказной боли; боли при болезни Бехчета; адипозалгии; флебитической боли; боли при болезни Гийена - Барре; болезненных ног и боли при шевеление пальцами ног; синдрома Хаглунда; боли при болезни Фабри; заболевания мочевого пузыря и мочеполовой системы; гиперактивности мочевого пузыря; синдрома болезненного мочевого пузыря; интерстициального цистита; или простатита.

Средства комбинированной терапии

[0174] Как отмечено выше, способы по настоящему изобретению, в соответствии с определенными вариантами осуществления, предусматривают введение субъекту одного или нескольких дополнительных терапевтических средств в комбинации с антителом к RET. В контексте настоящего документа выражение «в комбинации с» означает, что дополнительные терапевтические средства вводят до, после или одновременно с фармацевтической композицией, содержащей антитело к RET. Термин «в комбинации с» также включает последовательное или параллельное введение антитела к RET и второго терапевтического средства.

[0175] Например, при введении «до» фармацевтической композиции, содержащей антитело к RET, дополнительное терапевтическое средство можно вводить приблизительно за 72 часа, приблизительно за 60 часов, приблизительно за 48 часов, приблизительно за 36 часов, приблизительно за 24 часа, приблизительно за 12 часов, приблизительно за 10 часов, приблизительно за 8 часов, приблизительно за 6 часов, приблизительно за 4 часа, приблизительно за 2 часа, приблизительно за 1 час, приблизительно за 30 минут, приблизительно за 15 минут или приблизительно за 10 минут до введения фармацевтической композиции, содержащей антитело к RET. При введении «после» фармацевтической композиции, содержащей антитело к RET, дополнительное терапевтическое средство можно вводить приблизительно через 10 минут, приблизительно через 15 минут, приблизительно через 30 минут, приблизительно через 1 час, приблизительно через 2 часа, приблизительно через 4 часа, приблизительно через 6 часов, приблизительно через 8 часов, приблизительно через 10 часов, приблизительно через 12 часов, приблизительно через 24 часа, приблизительно через 36 часов, приблизительно через 48 часов, приблизительно через 60 часов или приблизительно через 72 часа после введения фармацевтической композиции, содержащей антитела к RET. Введение «одновременно» или с фармацевтической композицией, содержащей антитело к RET, означает, что дополнительное терапевтическое средство вводят субъекту в отдельной лекарственной форме в пределах менее 5 минут (до, после или одновременно) с введением фармацевтической композиции, содержащей антитело к RET, или вводят субъекту в виде единой комбинированной лекарственной формы, содержащей как дополнительное терапевтическое средство, так и антитело к RET.

[0176] Средства комбинированной терапии могут включать антитело к RET по настоящему изобретению и любое дополнительное терапевтическое средство, которое можно успешно объединять в комбинацию с антителом по настоящему изобретению или с биологически активным фрагментом антитела по настоящему изобретению.

Например, второе или третье терапевтическое средство можно использовать для помощи в уменьшении опухолевой массы у пациента, такое как химиотерапевтическое средство или средство лучевой терапии, эффективные при ингибировании пролиферации опухолевых клеток у субъекта. Альтернативно, антитела можно применять в качестве средства вспомогательной терапии после хирургического удаления опухоли и можно применять отдельно или в сочетании с химиотерапевтическим средством, с лучевой терапией или со средством для восстановления костного мозга. Антитела также можно применять в сочетании с другими средствами терапии, как указано выше, в том числе со вторым антителом, специфическим к RET, или антителом, специфическим к лиганду RET, или с антителом или слитой молекулой, которые связывают GFRα1 (см. SEQ ID NO: 308).

Диагностические применения антител

[0177] Антитела к RET по настоящему изобретению также можно применять для детектирования и/или измерения RET в образце, например, для диагностических целей. Предусматривается, что подтверждение заболевания или патологического состояния, которое, как считается, связано с RET, можно осуществить путем измерения наличия RET, например, в образце биоптата из опухоли (т.е. опухолевых клеток), которое зависит от роста при передаче сигналов RET. Иллюстративные диагностические анализы на RET могут предусматривать, например, приведение в контакт образца, полученного от пациента, с антителом к RET по настоящему изобретению, причем антитело к RET помечено детектируемой меткой или репортерной группой, или его применяют в качестве захватывающего лиганда для избирательного выделения клетки, экспрессирующей белок RET, из образцов пациента. Альтернативно, непомеченное антитело к RET можно применять в диагностических целях в комбинации со вторичным антителом, которое само помечено детектируемой меткой. Детектируемая метка или репортерная группа могут представлять собой радиоизотоп, такой как ³Н, ¹⁴С, ³²Р, ³⁵S или ¹²⁵I; флуоресцентный или хемилюминесцентный фрагмент, такой как флуоресцеинизотиоцианат или родамин, или такой фермент, как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. К конкретным иллюстративным анализам, которые можно применять для детекции или измерения RET, содержащего белок F, в образце, относятся твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ (RIA) и сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS).

[0178] К образцам, которые можно применять в диагностических анализах на RET, в соответствии с настоящим изобретением, относится любой образец ткани или жидкости, получаемый от пациента, который содержит детектируемые количества либо белка RET, либо его фрагментов при нормальных или патологических состояниях. Обычно, для первоначального определения исходного или стандартного уровня белка RET будут измерять уровни RET в конкретном образце, полученном от здорового пациента (например, пациента, не пораженного заболеванием или патологическим состоянием, связанным с наличием RET). Такой исходный уровень RET затем можно сравнить с уровнями RET, измеренными в образцах, полученных от индивидуумов, у которых подозревают наличие связанного с RET заболевания или патологического состояния либо симптомов, связанных с такими патологическими состояниями.

ПРИМЕРЫ

[0179] Следующие примеры приведены с целью предоставления специалистам в настоящей области техники полного раскрытия и описания того, как осуществлять и применять способы и композиции по настоящему изобретению, и не предназначены для ограничения рассматриваемого авторами объема настоящего изобретения. Были предприняты попытки обеспечить точность в отношении используемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, то части являются частями по массе, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура представлена в градусах Цельсия, а давление является атмосферным или близким к атмосферному.

Пример 1

Создание человеческих антител к белку RET

[0180] Для создания антител к RET можно применять иммуноген, включая любой из приведенных далее. В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитела по настоящему изобретению получены от мышей, иммунизированных первичным иммуногеном, таким как полноразмерный белок RET (см, например, SEQ ID NO: 310 в случае человеческой изоформы RET51, которую также можно найти под регистрационным номером АТСС NP_066124.1; и SEQ ID NO: 312 в случае человеческой изоформы RET9, которую также можно найти под регистрационным номером АТСС NP_065681.1; обе из которых имеют сигнальные последовательности из остатков под номерами 1-28). Мышам можно сделать одну или несколько бустерных инъекций, содержащих одну и ту же молекулу, или их можно бустировать их имму ноге иными фрагментами, такими как внеклеточный домен человеческой RET, который состоит из аминокислот в диапазоне 1-635 из последовательности под SEQ ID NO: 313, которую также можно найти под регистрационным номером АТСС NP_066124.1 с сигнальной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков 1-28). В соответствии с определенными вариантами осуществления, мышам вводят полноразмерный белок RET с последующей бустеризацией любой из конструкций, представленных под SEQ ID NO: 305, 306, 307 и 313, или полученной рекомбинантными методами молекулой.

[0181] В соответствии с определенными вариантами осуществления, антитела по настоящему изобретению получены от мышей, иммунизированных первичным иммуногеном, таким как биологически активная молекула RET, или иммуногенный фрагмент белка RET, или ДНК, кодирующая полноразмерный белок или его активный фрагмент. Иммуноген животному можно доставлять любым путем, в том числе без ограничения внутримышечно, подкожно, внутривенно или интраназально.

[0182] В соответствии с определенными вариантами осуществления, полноразмерный белок RET или его фрагменты можно применять для получения моноспецифических, биспецифических или мультиспецифических антител.

[0183] Полноразмерный белок или его фрагмент, которые были использованы в качестве иммуногенов, как упоминалось выше, вводили непосредственно с адъювантом для стимуляции иммунного ответа мышам VELOCIMMUNE^®, содержащим ДНК, кодирующую вариабельные участки тяжелой цепи и легкой каппа-цепи человеческого иммуноглобулина. Иммунный ответ с продуцированием антител отслеживали с помощью иммуноанализа на RET. При достижении требуемого иммунного ответа собирали спленоциты и гибридизировали с мышиными миеломными клетками для сохранения их жизнеспособности и создания линий гибридомных клеток. Линии гибридомных клеток подвергали скринингу и отбирали для выявления клеточных линий, которые продуцировали специфические к RET антитела. С помощью такой методики и различных описанных выше иммуногенов получали несколько химерных антител (т.е. антител, обладающих человеческими вариабельными доменами и мышиными константными доменами); полученные таким образом определенные иллюстративные антитела обозначали, например, H2M7086N.

[0184] Антитела к RET также выделяли непосредственно из антиген-положительных В-клеток без гибридизации с миеломными клетками, как описано в U.S. 2007/0280945А1, которая прямо включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. С помощью данного способа получали несколько полностью человеческих антител к RET (т.е. антител, обладающих человеческими вариабельными доменами и человеческими константными доменами); полученные таким образом иллюстративные антитела обозначали следующим образом: Н4Н8044Р, Н4Н8045Р, Н4Н8046Р, Н4Н8048Р, Н4Н8056Р, Н4Н8058Р, Н4Н8060Р, Н4Н8062Р, Н4Н8066Р, Н4Н8067Р, Н4Н8071Р, Н4Н8076Р, Н4Н8079Р, Н4Н8080Р, Н4Н8083Р, Н4Н8084Р, Н4Н8085Р и Н4Н8087Р.

[0185] Биологические свойства иллюстративных антител, полученных в соответствии со способами согласно настоящему примеру, подробно описаны в приведенных ниже примерах.

Пример 2

Аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепи

[0186] В таблице 1 представлены пары аминокислотных последовательностей вариабельных участков тяжелой и легкой цепи отобранных антител, специфических к белку RET, и их соответствующие идентификаторы антител. В настоящем документе антитела, как правило, обозначены согласно следующей номенклатуре: приставка Fc (например, «Н4Н», «Н1М», «Н2М»), с последующим числовым идентификатором (например, «7086», как представлено в таблице 1), с последующим суффиксом «Р» или «N». Таким образом, согласно данной номенклатуре, антитело можно назвать, например, «H2M7086N». Приставки Н4Н, H1M и Н2М в используемых в настоящем документе обозначениях антител указывают на конкретный Fc-участок антитела. Например, антитело «Н2М» имеет мышиный Fc IgG2, тогда как антитело «Н4Н» имеет человеческий Fc IgG4. Как будет понятно рядовому специалисту в настоящей области техники, антитело H1M или Н2М можно преобразовать в антитело Н4Н и наоборот, но, в любом случае, вариабельные домены (в том числе CDR), которые обозначены числовыми идентификаторами, приведенными в таблице 1, останутся прежними. Антитела, имеющие одинаковое числовое обозначение антител, но отличающиеся буквенным суффиксом N, В или Р, относятся к антителам, имеющим тяжелую и легкую цепи с идентичными последовательностями CDR, но с вариациями последовательностей в участках, которые находятся за пределами последовательностей CDR (т.е. в каркасных участках). Таким образом, варианты N, В и Р у конкретного антитела имеют идентичные последовательности CDR в вариабельных участках тяжелой и легкой цепей, но отличаются друг от друга в их каркасных участках.

Пример 3

Значения аффинности связывания, полученные по результатам поверхностного плазменного резонанса, и кинетические константы у человеческих моноклональных антител к RET

[0187] Значения аффинности связывания и кинетические константы у человеческих антител к RET определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Biacore Т200) при 25°С и 37°С (таблицы 2-3). Антитела, экспрессируемые в виде человеческого Fc IgG4 (т.е. с обозначениями «Н4Н»), иммобилизировали на поверхности датчика с антителами к человеческому Fc (формат с иммобилизацией mAb) и на поверхность датчика вводили растворимый мономерный (hRET.mmh; SEQ ID NO: 305, RET.mmh от Macaca fascicularis (mf); SEQ ID NO: 306) или димерный (hRET.mFc; SEQ ID NO: 307) белок RET. Равновесные константы диссоциации связывания (K_D) и периоды полудиссоциации (t_1/2) рассчитывали из констант скорости реакции следующим образом: K_D[М]=k_d/k_a; и t_1/2 (мин.)=(ln2/(60*k_d). Расчеты производили с использованием пробного выпуска программы BiacoreT200 v1.0.

[0188] Некоторые антитела по настоящему изобретению характеризовались суб-наномолярными значениями аффинности к человеческому и обезьяньему белку RET (таблицы 2-3).

Пример 4

Антитела к RET эффективно блокируют связывание человеческой RET с совместным комплексом GFRα1/GDNF

[0189] Способность антител к RET блокировать связывание человеческой RET с предварительно образованным комплексом на планшете GDNF:GFRα1 оценивали с помощью конкурентной сэндвич-ELISA. Большинство антител к RET эффективно блокировали связывание RET со связанным с планшетом совместном комплексом GDNF/GFRα1 (таблица 4). Значения IC₅₀ варьировали в диапазоне от 5,2 нМ до уровня, который был ниже теоретического дна анализа (250 пМ), с максимальным блокированием в диапазоне 72-96%.

Подробное описание способов

[0190] Рекомбинантный человеческий димерный GDNF (R&D systems) и человеческий GFRα1.mFc (SEQ ID: 308) смешивали в мольном соотношении 1:1 в PBS с получением конечного совместного комплекса в концентрации ~2,0 мкг/мл. Совместный комплекс GDNF-GFRα1 инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре (RT) перед нанесение покрытием в 96-луночные микротитровальные планшеты в течение ночи при температуре 4°С. Сайты неспецифического связывания блокировали с помощью BSA.

[0191] Отдельно титровали 1 нМ биотинилированного мономерного белка RET (biot-hRET.mmh; SEQ ID: 305) различными количествами серийно разведенных антител в диапазоне 0-120 нМ. Смеси антитела с RET инкубировали в течение 1 часа при RT, а затем переносили на микротитровальные планшеты с предварительно нанесенным покрытием совместного комплекса hGDNF/hGFRα1. Оставляли для прохождения связывания на 1 час при комнатной температуре с последующей обширной промывкой. Связанный с планшетом biot-hRET.mmh детектировали с помощью конъюгированного с HRP стрептавидина и проявляли с помощью ТМВ. Планшеты считывали на 450 нм, а для анализа данных использовали сигмоидальную модель зависимости дозы от ответа в программном обеспечении Prism™.

[0192] В качестве показателя эффективности блокирования использовали значения IC₅₀, рассчитанные как концентрация антитела, необходимая для блокировки 50% связывания hRET с hGDNF/hGFRα1. Максимальными значениями блокировки представлена способность антител к RET блокировать связывание hRET относительно исходного уровня. Значения исходного уровня рассчитывали как поглощение, измеренное при постоянном количестве hRET на кривой дозы (0% блокирования), и поглощение, измеренное без добавления hRET (100% блокировка). Значения поглощения в лунках, содержащих наиболее высокую концентрацию для каждого антитела, использовали для определения процента блокировки при максимальной тестируемой концентрации антитела. Сводка по IC₅₀ и проценту максимальной блокировки показана в таблице 4.

Пример 5

Антитела к RET ингибируют лиганд-зависимую передачу сигналов RET в анализе с SRE-люциферазой и характеризуются сильной интернализацией

[0193] В данном примере воздействие антител к RET на передачу сигналов и интернализацию RET изучали с использованием линий клеток со сконструированными репортерами MCF7 и hRET.

[0194] Лиганды глиального семейства GDNF и артемин запускают активацию RET посредством образования высокоаффинного совместного комплекса с GFRα1 или 3 соответственно, объединяя совместно две молекулы RET и инициируя фосфорилирование конкретных остатков тирозина. Трансфосфорилирование RET активирует несколько последующих внутриклеточных каскадов, а повышающая регуляция передачи сигналов RET задействована в патологиях нескольких заболеваний, в том числе рака (Borrello, MG, et al., (2013), Expert. Opin. Ther. Targets 17(4): 403-419).

[0195] Для тестирования способности антител к RET блокировать передачу сигналов, опосредованную GDNF, линию клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF7, экспрессирующую RET и GFRα1, модифицировали методом трансдукции репортерным геном люциферазы, регулируемым сывороточными факторами отклика (SRE), с получением линии MCF7/SRE-Luc. Антитела по настоящему изобретению характеризовались эффективным ингибированием стимулируемой посредством GDNF передачи сигналов RET со значениями IC₅₀ в диапазоне от 143 пМ до >100 нМ (таблица 5). Процент ингибирования варьировал в диапазоне 60-100%. Также были выявлены несколько неблокирующих антител; Н4Н8085Р стимулировал люциферазную активность до 50% от уровней, наблюдаемых для GDNF, тогда как Н4Н8044Р, Н4Н8076Р и Н4Н8046Р были более слабыми активаторами люциферазного отклика (активация на уровне 2-5%).

[0196] Для определения того, будут ли антитела, которые блокировали GDNF-опосредованную передачу сигналов RET, также эффективны против запускаемой артемином активности, были сконструированы модифицированные методами инженерии линии клеток HEK293/hGFRα3/hRET SRELuc. Большинство GDNF-зависимых блокаторов передачи сигналов RET также были блокаторами артемин-зависимой сигнальной активности в данной линии клеток (таблица 5; столбцы 5-6). Интересно отметить, что было выявлено, что Н4Н8048Р был более мощным блокатором в отношении артемин-зависимой передачи сигналов по сравнению с GDNF-зависимой передачей сигналов, что, возможно, отражает различные эпитопы, связываемые совместными комплексами GDNF-GFRα1 и артемин-GFRα3 на рецепторе RET.

[0197] Наконец, чтобы понять, может ли наблюдаемая блокирующая активность быть следствием разрушения рецептора RET при связывании антителом, несколько антител тестировали в анализе интернализации (таблица 6). Среди семи протестированных антител Н4Н8087Р было выявлено как наиболее сильный интернализатор, при этом у Н4Н8079Р и Н4Н7086Р также наблюдали сильную интернализацию.

[0198] В заключение необходимо отметить, что в данном примере проиллюстрировано, что антитела к RET по настоящему изобретению характеризуются определенным спектром активирующей и ингибирующей активности в отношении передачи сигналов RET в присутствии лигандов глиального семейства, т.е. GDNF и артемина.

Подробное описание способов

Создание стабильных линий клеток с MCFJ/SRE-люциферазой

[0199] Клетки MCF7 естественным образом экспрессируют RET и GFRα1. Для получения клеток MCF7/SRELuc использовали стабильно встроенную SRE-люциферазу, полученную путем трансдукции MCF7 с помощью набора Cignal Lenti SRE Reporter (SABiosciences) и двухнедельной селекции в пуромицине. Лентивирус экспрессирует ген люциферазы светлячка под контролем минимального промотора CMV и тандемных повторов сывороточных элементов отклика (SRE).

Получение стабильных линий клеток с Hek293/ hGFRa1 (или 3) / hRET/SRE-люциферазой

[0200] Человеческий GFRα (1 или 3) и hRET вводили на стабильной основе в клетки HEK293 посредством последовательных раундов опосредованной липофектамином 2000 трансфекции и подвергали отбору в течение по меньшей мере двух недель в 500 мкг/мл G418 (hGFRa1 или 3) и 100 мкг/мл гигромицина В (hRET). Модифицированные по двум факторам стабильные линии HEK293, экспрессирующие hGFRa1/hRET или hGFRa3/hRET, затем трансдуцировали с помощью набора Cignal Lenti SRE Reporter, как описано выше, с получением линии клеток HEK293/hGFRal/hRET/SRE-Luc и артемин-чувствительной линии клеток HEK293/GFRa3/hRET/SRE-Luc.

Ингибирование GDNF-стимулируемой люциферазной активности в линиях клеток, модифицированных методами инженерии по MCF7/SRE-люциферазе

[0201] Двадцать тысяч клеток MCF7-SRE-luc высевали в 96-луночные планшеты с покрытием PDL в среду Optimem + 0,5% FBS и выращивали в течение ночи при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Для построения кривых ингибирования клетки инкубировали в течение 1 часа с серийно разведенными mAb к hRET в диапазоне концентраций от 1,6 пМ до 1 мкМ. Затем вносили постоянную дозу человеческого GDNF (4-10 пМ) и инкубировали клетки в течение дополнительных 6 часов.

[0202] Для оценки активирующих свойств mAb к RET клетки MCF7-SRE-Luc инкубировали в течение 6 часов с серийно разведенными mAb к hRET в диапазоне концентраций от 1,6 пМ до 1 мкМ в условиях отсутствия лиганда.

[0203] Кривые зависимости ответа от дозы GDNF строили с применением серийно разведенного GDNF в диапазоне концентраций от 0,05 пМ до 10 нМ, внесенного в лунки без антител и инкубированного в течение 6 часов при 37°С. Люциферазную активность измеряли с помощью реагента ONE GLO™ (Promega), а относительные световые единицы (RLU) измеряли на люминометре Victor (Perkin Elmer).

Ингибирование артемин-стимулируемой люциферазной активности в линиях клеток, модифицированных методами инженерии по HEK293/hGFRa3/hRET

[0204] Ингибирование артемин-стимулируемой люциферазной активности в линиях клеток HEK293/hGFRa3/ hRET/SRE-Luc оценивали с применением антител к RET с помощью способа, описанного для клеток MCF7/SRE-Luc. Для получения кривых ингибирования клетки инкубировали в течение 1 часа с серийно разведенными антителами к hRET в диапазоне концентраций от 1,6 пМ до 1 мкМ. Затем клетки стимулировали постоянной дозой человеческого артемина (hArtemin) (100 мкМ) в течение 6 часов. Кривые зависимости ответа от дозы артемина строили путем добавления серийно разведенного hArtemin (от 0,17 пМ до 10 нМ) к клеткам на 6 часов при 37°С без добавления антитела. Измерения люциферазной активности и построение кривой выполняли так, как описано для GDNF-стимулируемой люциферазной активности.

Расчет значений EC₅₀/IC₅₀

[0205] Значения EC₅₀/IC₅₀ определяли из четырехпараметрического логистического уравнения по 12-точечной кривой ответа с применением GraphPad Prism. Процент блокирования представлен для наивысшей дозы антител, а данные представлены как среднее±стандартное отклонение (SD).

Количественный анализ интернализационных свойств антител к RET [0206] Для тестирования mAb к hRET на интернализацию клетки HEK293/hGFRa1/hRET/SRE-Luc инкубировали с антителами (10 мкг/мл) в течение 30 минут на льду с последующей одной промывкой. Затем клетки инкубировали с конъюгированными с красителем alexa488 вторичными антителами с Fab к hFc в течение 30 минут с последующей второй промывкой. Антителам давали интернализоваться в течение 4 часов при температуре 37°С или оставляли при температуре 4°С для предотвращения интернализации. Клетки фиксировали в 4% формальдегиде, а краситель alexa488 на поверхности клеток блокировали путем инкубации с блокирующим антителом к alexa488 в течение 1 часа при температуре 4°С. Ядра окрашивали красителем Hoechst и получали изображения на knageXpress micro XL (Molecular Devices).

[0207] Общую интенсивность красителя alexa488 во внутриклеточных везикулах при температуре 37°С в подвергнутых блокировке образцах количественно оценивали с помощью программного обеспечения для анализа изображений Columbus (Perkin Elmer). Общая интенсивность интернализованных mAb выражали в процентах от наиболее сильного интернализованного mAb.

Пример 6

Создание биспецифического антитела

[0208] Создавали различные биспецифические антитела для применения на практике в способах по настоящему изобретению. Например, специфические к RET антитела получали в биспецифическом формате («биспецифической молекулы»), в котором вариабельные участки, связывающиеся с различными доменами белка RET, соединены вместе для придания специфичности к двум доменам в одной связывающей молекуле. Соответствующим образом сконструированные биспецифические молекулы могут усиливать общую RET-нейтрализующую эффективность за счет увеличения как специфичности, так и авидности связывания. Вариабельные участки со специфичностью к отдельным доменам спарены на структурном каркасе, что позволяет каждому участку одновременно связываться с отдельными эпитопами или с разными участками в одном домене. В одном примере биспецифической молекулы вариабельные участки тяжелых цепей (V_H) из молекулы связывания со специфичностью к одному домену рекомбинировали с вариабельными участками легких цепей (V_L) из ряда молекул связывания со специфичностью ко второму домену для выявления неродственных V_L-партнеров, которые могут образовывать пары с исходным V_H без нарушения исходной специфичности у такого V_H. Таким образом, отдельный V_L-сегмент (например, V_L1) можно было объединить в комбинацию с двумя различными V_H-доменами (например, V_H1 и V_H2) с получением биспецифической молекулы, состоящей из двух связывающих «плеч» (V_H1-V_L1 и V_H2-V_L1). Применение отдельного V_Lсегмента уменьшало сложность системы и, таким образом, упрощало и повышало эффективность способов клонирования, экспрессии и очистки, используемых для получения биспецифической молекулы (см., например, USSN13/022759 и US2010/0331527).

[0209] Альтернативно, антитела, которые связываются с RET и второй целью, такой как без ограничения, например, опухолевый антиген, можно получить в формате биспецифической молекулы с применением описываемых в настоящем документе методик или других, известных специалистам в настоящей области методик. Вариабельные участки антител, связывающиеся с различными участками, можно соединить с вариабельными участками, которые связываются с соответствующими сайтами, например, на другом антигене, для придания специфичности к двум антигенам в одной связывающей молекуле. Соответственно сконструированные биспецифические молекулы такой природы выполняли двойную функцию. Например, в случае биспецифического антитела, которое связывалось, например, с RET и одним из его лигандов, можно было лучше ингибировать рост опухолевых клеток без необходимости применения композиции, содержащей два отдельных антитела. Вариабельные участки со специфичностью к RET объединяли с вариабельным участком со специфичностью к одному из его лигандов и спаривали на структурном каркасе, что позволяло каждому вариабельному участку связываться с отдельными антигенами.

[0210] Биспецифические связывающие молекулы тестировали на связывание и функциональное блокирование целевого антигена, например, RET, в любом из анализов, описанных выше для антител. Например, для оценки биспецифического взаимодействия использовали стандартные способы измерения связывания растворимого белка, такие как Biacore, ELISA, эксклюзионная хроматография, многоугловое рассеяние лазерного света, прямая сканирующая калориметрия и другие способы. Связывание биспецифических антител как с RET, так и с одним из его лигандов определяли с применением ELISA-анализа связывания, в котором синтетические пептиды, представлявшие собой различные антигены, наносили покрытием в лунки микротитровальных планшетов и связывание биспецифической молекулы определяли с применением вторичного детектирующего антитела. Эксперименты по связыванию также можно было проводить с помощью экспериментов по поверхностному плазмонному резонансу, в которых связывающее взаимодействие пептида с антителом измеряли в реальном времени по прохождению пептида или биспецифической молекулы по поверхности датчика, на которой иммобилизированы соответственно биспецифическая молекула или пептид. Функциональное блокирование в условиях in vitro как RET, так и одного из его лигандов биспецифической молекулой определяли с помощью любого биоанализа, такого как описанные в настоящем документе анализы, или с помощью исследований защиты в условиях in vivo на соответствующих модельных животных, таких как модельные животные с опухолями.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены полностью человеческие антитела, которые связываются с рецепторной тирозинкиназой RET, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные антитела, векторы экспрессии, включающие указанные нуклеиновые кислоты. Также предложено применение антител к RET для лечения заболеваний, нарушений или патологических состояний, связанных с экспрессией, активацией или передачей сигнала гена рецепторной тирозинкиназы RET или его перестроенной формы. В том числе предложено применение антител по изобретению для лечения рака и боли, связанной с раком, или для облегчения боли, связанной с другими патологическими состояниями, связанными, по меньшей мере частично, с экспрессией, активацией или передачей сигналов RET. Предложенные антитела, специфически связывающие RET, могут быть полезны для замедления роста или пролиферации опухолевых клеток, а также для облегчения боли, связанной с раком и другими патологическими состояниями. 6 н. и 26 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с рецепторной тирозинкиназой RET (REarranged during Transfection - перестроенной во время трансфекции), причем антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), содержащий три CDR тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), и вариабельный участок легкой цепи (LCVR), содержащий три CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащиеся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282 и 290/298.

2. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем антитело представляет собой полноразмерное человеческое антитело.

3. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащее:

(a) HCDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:16; или

(b) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:20, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:22, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:24, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:28, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:30 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:32; или

(c) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:36, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:38, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:40, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:44, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:48; или

(d) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:52, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:54, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:56, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:60, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:62 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:64; или

(e) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:68, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:70, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:72, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:76, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:78 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:80; или

(f) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:84, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:86, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:88, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:92, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:94 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:96; или

(g) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:100, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:102, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:104, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:108, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:110 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:112; или

(h) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:116, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:118, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:120, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:124, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:126 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:128; или

(i) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:132, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:134, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:136, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:140, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:142 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:144; или

(j) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:148, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:150, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:152, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:156, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:158 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:160; или

(k) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:164, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:166, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:168, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:172, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:174 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:176; или

(l) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:180, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:182, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:184, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:188, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:190 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:192; или

(m) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:196, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:198, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:200, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:204, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:206 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:208; или

(n) HCDR1, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:212, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:214, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:216, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:220, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:222, и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:224; или

(o) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:228, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:230, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:232, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:236, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:238 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:240; или

(p) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:244, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:246, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:248, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:252, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:254, и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:256; или

(q) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:260, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:262, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:264, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:268, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:270 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:272; или

(r) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:276, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:278, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:280, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:284, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:286 и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:288; или

(s) HCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:292, HCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:294, HCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:296, LCDR1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:300, LCDR2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:302, и LCDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:304.

4. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 212, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 214, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 216, LCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 220, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 222, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 224.

5. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, LCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48.

6. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, где HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148, HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 150, HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152, LCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 158, и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160.

7. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.3, содержащее:

(a) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10; или

(b) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:18, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:26; или

(c) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:34, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:42; или

(d) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:50, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:58; или

(e) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:66, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:74; или

(f) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:82, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:90; или

(g) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:98, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:106; или

(h) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:114, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:122; или

(i) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:130, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:138; или

(j) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:146, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:154; или

(k) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:162, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:170; или

(l) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:178, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:186; или

(m) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:194, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:202; или

(n) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:210, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:218; или

(o) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:226, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:234; или

(p) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:242, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:250; или

(q) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:258, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:266; или

(r) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:274, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:282; или

(s) HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:290, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:298.

8. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 210, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 218.

9. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 34, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42.

10. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 146, и LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 154.

11. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10.

12. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 11.

13. Применение фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько антител или его антигенсвязывающих фрагментов по любому из пп. 1-10 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в лечении нарушения или патологического состояния, связанного с экспрессией, активацией или передачей сигнала гена рецепторной тирозинкиназы RET или его перестроенной формы, или боли, связанной с нарушением или патологическим состоянием, предусматривающее введение нуждающемуся в этом пациенту композиции.

14. Применение по п. 13, причем нарушение или патологическое состояние, связанное с экспрессией, активацией или передачей сигнала гена рецепторной тирозинкиназы RET или его перестроенной формы, представляет собой рак, и причем рак выбран из группы, состоящей из рака щитовидной железы, рака легких, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака молочной железы и рака крови.

15. Применение по п. 13, причем нарушение или патологическое состояние, связанное с экспрессией, активацией или передачей сигнала гена рецепторной тирозинкиназы RET или его перестроенной формы, выбрано из группы, состоящей из острой боли, хронической боли, невропатической боли, воспалительной боли, артрита, остеоартрита, мигрени, кластерных головных болей, невралгии тройничного нерва, герпетической невралгии, общих форм невралгии, нейродегенеративных нарушений, нейроэндокринных нарушений, висцеральной боли, острой подагры, постгерпетической невралгии, диабетической невропатии, пояснично-крестцового радикулита, позвоночной боли, боли в голове или шее, сильной или неустранимой боли, прорывной боли, послеоперационной боли, зубной боли, ринита, боли при раке или нарушений, связанных с мочевым пузырем.

16. Применение фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько антител или его антигенсвязывающих фрагментов по любому из пп. 1-10 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в ингибировании роста опухоли или пролиферации опухолевых клеток, причем опухоль или опухолевая клетка экспрессирует RET или ее перестроенную форму, предусматривающее введение нуждающемуся в этом пациенту композиции.

17. Применение по п. 16, причем опухоль представляет собой солидную опухоль или опухоль клеток крови.

18. Применение по п. 17, причем солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из опухоли щитовидной железы, опухоли легкого, опухоли поджелудочной железы, опухоли кожи и опухоли молочной железы.

19. Применение по п. 18, причем опухоль щитовидной железы представляет собой папиллярную карциному щитовидной железы (PTC) или медуллярную карциному щитовидной железы (MTC).

20. Применение по п. 19, причем медуллярная карцинома щитовидной железы представляет собой наследственную форму MTC, выбранную из группы, состоящей из множественной эндокринной неоплазии 2-го или 3-го типа (MEN2A, MEN2B) и синдрома семейной медуллярной карциномы щитовидной железы (FMTC), или причем медуллярная карцинома щитовидной железы представляет собой спорадическую форму MTC.

21. Применение по п. 18, причем опухоль легкого представляет собой аденокарциному легкого.

22. Применение по п. 18, причем опухоль легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

23. Применение по п. 18, причем опухоль кожи представляет собой меланому.

24. Применение по п. 23, причем опухоль клеток крови представляет собой лейкоз.

25. Применение по п. 24, причем лейкоз представляет собой хронический миеломоноцитарный лейкоз.

26. Применение фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько антител или его антигенсвязывающих фрагментов по любому из пп. 1-10 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в подавлении экспрессии и/или функции RET, предусматривающее введение нуждающемуся в этом пациенту композиции.

27. Применение по п. 26, причем подавление экспрессии и/или функции RET приводит к нарушению регуляции последующего сигнального пути, выбранного из группы, состоящей из пути RAS/RAF и пути PI3K.

28. Применение по любому из пп. 13-27, причем антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят пациенту в комбинации со вторым терапевтическим средством.

29. Применение по п. 28, причем второе терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из низкомолекулярного ингибитора тирозинкиназы, противоопухолевого средства, siRNA, специфической к RET, второго антитела, специфического к RET, и уменьшающего боль средства.

30. Применение по п. 29, причем низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы выбран из группы, состоящей из вандетаниба, цедираниба (AZD2171), гефитиниба, эрлотиниба, SU14813, ваталаниба, сорафениба, сорафениба (BAY43-9006), сунитиниба, кабозантиниба, мотесаниба, XL-647, XL-999, AG-013736, BIBF1120, TSU68, GW786034, AEE788, CP-547632, KRN951, CHIR258, CEP-7055, OSI-930, ABT-869, E7080, ZK-304709, BAY57-9352, L-21649, BMS582664, XL-880, XL-184, XL-820, RPI-1, PP-1 и NVP-AST478.

31. Применение по п. 29, причем противоопухолевое средство выбрано из группы, состоящей из химиотерапевтического средства, радионуклида и конъюгата антитела с лекарственным средством.

32. Применение по п. 29, причем уменьшающее боль средство выбрано из группы, состоящей из ингибитора фактора роста нервов (NGF) (например, низкомолекулярного антагониста NGF или антитела к NGF), аспирина или другого NSAID, морфина, стероидов (например, преднизона), антитела к Na_v1.7 или низкомолекулярного ингибитора Na_v1.7, антагониста Na_v1.8 (например, антитела к Na_v1.8 или низкомолекулярного ингибитора Na_v1.8), антагониста Na_v1.9 (например, антитела к Na_v1.9 или низкомолекулярного ингибитора Na_v1.9), ингибитора цитокинов (например, ингибитора интерлейкина-1 (IL-1) (такого как рилонацепт («ловушка IL-1»); Regeneron) или анакинры (KINERET®, Amgen), низкомолекулярного антагониста IL-1 или антитела к IL-1; ингибитора IL-18 (такого как низкомолекулярный антагонист IL-18 или антитело к IL-18); ингибитора IL-6 или IL-6R (такого как низкомолекулярный антагонист IL-6, антитело к IL-6 или антитело к рецептору IL-6), ингибиторов каспазы-1, p38, IKK1/2, CTLA-4Ig или опиоида.