НОВЫЕ ДИМЕРЫ ПРОИЗВОДНЫХ ЦИТИДИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2019 года по МПК C07H19/73 A61P35/02 C07H1/00 A61P35/04 A61K31/7068 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение относится к противоопухолевому соединению и, в частности, относится к новому димеру производного цитидина и его применениям.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Рак является одним из самых распространенных заболеваний, несущих угрозу здоровью человека. Уровень смертности от рака занимает наивысшее место среди других заболеваний. Используемые в настоящее время противоопухолевые лекарственные средства обладают недостатком значительной токсичности при химиотерапии. В настоящее время важным направлением исследования противоопухолевых лекарственных средств является улучшение их терапевтического эффекта при снижении токсичности.

[0003] Существующие соединения цитидина применяются главным образом для лечения рака крови. Некоторые соединения цитидина также применяются для солидных опухолей. Тем не менее, их высокая токсичность, узкая область применения и небольшой терапевтический эффект вызывают трудности. Кроме того, организм человека предрасположен к формированию лекарственной устойчивости к существующим соединениям цитидина, что приводит к неэффективности лечения и рецидиву опухоли.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является обеспечение нового димера производного цитидина и его применения с высокой эффективностью, высокой противоопухолевой активностью и низкой токсичностью.

[0005] Техническое решение для достижения цели настоящего изобретения включает новый димер производного цитидина, имеющий следующую формулу (I):

(I)

где R1 представляет собой C₁-C₁₀ алкил, C₁-C₁₀ замещенный алкил, -(CH₂)_n-Ph, или замещенную -(CH₂)_n-Ph. В -(CH₂)_n-Ph n равно 0, 1, 2, 3-10, и Ph представляет собой фенил. Углеродная цепь замещенного алкила независимо замещена одним, двумя или тремя галогенами, цианогруппами, нитрогруппами, аминогруппами, гидроксильными группами или карбоксильными группами. В замещенной -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2, 3-10, и ее углеродная цепь или фенильное кольцо независимо замещены одним, двумя или тремя галогенами, цианогруппами, нитрогруппами, аминогруппами, гидроксильными группами или карбоксильными группами. R1 предпочтительно представляет собой C₁-C₁₀ алкил или -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2, 3-10; более предпочтительно, C₁-C₄ алкил или -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2, 3; и еще более предпочтительно, н-бутил или бензил.

[0006] R2 представляет собой C₁-C₁₀ алкил, C₁-C₁₀ замещенный алкил, -(CH₂)_n-Ph или замещенную -(CH₂)_n-Ph. В -(CH₂)_n-Ph n равно 0, 1, 2, 3-10. Углеродная цепь замещенного алкила независимо замещена одним, двумя или тремя галогенами, цианогруппами, нитрогруппами, аминогруппами, гидроксильными группами или карбоксильными группами. В замещенной -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2, 3-10, и ее углеродная цепь или фенильное кольцо независимо замещены одним, двумя или тремя галогенами, цианогруппами, нитрогруппами, аминогруппами, гидроксильными группами или карбоксильными группами. R1 предпочтительно представляет собой C₁-C₁₀ алкил или -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2, 3-10; более предпочтительно, C₁-C₄ алкил или -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2, 3; и еще более предпочтительно, н-бутил или бензил.

[0007] В наиболее предпочтительном случае R1 и R2 являются одинаковыми.

[0008] R3 представляет собой водород, алкоксикарбонил или замещенный алкоксикарбонил, где заместитель замещенного алкоксикарбонила представляет собой галоген, цианогруппу, нитрогруппу, аминогруппу, гидроксильную группу или карбоксильную группу. R3 предпочтительно представляет собой Н или алкоксикарбонил; и более предпочтительно, Н или н-бутоксикарбонил.

[0009] R4 представляет собой водород, алкоксикарбонил или замещенный алкоксикарбонил, где заместитель замещенного алкоксикарбонила представляет собой галоген, цианогруппу, нитрогруппу, аминогруппу, гидроксильную группу или карбоксильную группу. R4 предпочтительно представляет собой Н или алкоксикарбонил; и более предпочтительно, Н или н-бутоксикарбонил.

[0010] В наиболее предпочтительном случае R3 и R4 оба представляют собой водород.

[0011] R5 представляет собой -(CH₂)_n-, где n составляет от 1 до 15; или замещенную -(CH₂)_n-, углеродная цепь которой замещена заместителем, где заместитель представляет собой фенильную группу, замещенную фенильную группу, цианогруппу, нитрогруппу, аминогруппу, гидроксильную группу, карбоксильную группу или -(CH₂)_n-X₁-X₂-. В -(CH₂)_n-X₁-X₂- n равно 0, 1, 2 или 3, X₁ представляет собой O или S, и Х₂ представляет собой -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2 или 3, или Х₂ представляет собой пиримидил, пиранил, имидазолил, пиразинил или пиридил. R5 представляет собой, предпочтительно, -(CH₂)_n-, где n составляет от 1 до 15 или -(CH₂)_n-Х₁-Х₂-, где n равно 0, 1, 2 или 3, X₁ представляет собой O или S, и Х₂ представляет собой Ph; более предпочтительно, -(CH₂)_n-, где n составляет от 1 до 5 или -(CH₂)-O-Ph-; и еще более предпочтительно, -(CH₂)₂- или -(CH₂)₃-.

[0012] Применения вышеуказанного нового димера производного цитидина или его солевой формы для получения лекарственных средств для ингибирования опухоли.

[0013] Опухоль представляет собой рак крови или злокачественную солидную опухоль.

[0014] Фармацевтическая композиция включает: димер производного цитидина, представленный формулой (I), или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного вещества; и один или более лекарственных носителей или эксципиентов.

[0015] Форма композиции представляет собой форму для инъекций или лекарственную форму для перорального применения. Лекарственная форма для перорального применения включает: таблетку, порошок, гранулу, капсулу, пеллет, раствор, суспензию, эмульсию, сиропы или эликсиры; и форма для инъекций включает раствор для инъекций, суспензию для инъекций, эмульсию для инъекций или стерильный порошок для инъекций.

[0016] Способ получения вышеуказанного нового димера производного цитидина, включающий следующие стадии.

[0017] (1) Получают соединение общей формулы (II).

[0018] (2) Получают соединение общей формулы (III).

[0019] (3) Смешивают соединение общей формулы (II) с карбонатом натрия для добавления к системе, включающей 1,4-диоксан и воду. Затем добавляют (Вос)₂O для проведения реакции. После завершения реакции согласно измерениям ТСХ (тонкослойной хроматографии), экстрагируют продукт реакции, промывают и сушат, и затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Добавляют к высушенному соединению трихлорметан (т.е. хлороформ), и добавляют пиридин и диангидриды R₅(CO)₂O для проведения реакции в течение ночи; продукт реакции концентрируют с получением вязкого масла. Густое масло очищают колоночной хроматографией с получением соединения общей формулы (IV).

[0020] (4) После смешивания полученного соединения общей формулы (IV), полученного соединения общей формулы (III) и ДЦК (N,N'-дициклогексилкарбодиимида), смесь добавляют к дихлорметану и добавляют ДМАП (4-диметиламинопиридин). После завершения реакции согласно измерениям ТСХ, продукт реакции промывают, сушат и концентрируют с получением высушенного соединения. Затем добавляют TFA (трифторуксусную кислоту) и ДХМ (дихлорметан), и перемешивают при комнатной температуре. После охлаждения на ледяной бане белое твердое вещество отфильтровывают. Фильтрат концентрируют с получением вязкого масла, которое очищают колоночной хроматографией с получением продукта.

[0021] Настоящее изобретение также относится к лечению рака. В частности, настоящее изобретение направлено на лечение субъекта, страдающего опухолью, включая млекопитающее, в особенности человека. Введение терапевтически эффективной дозы нового соединения (I) субъекту в течение некоторого времени производит противоопухолевый эффект.

[0022] В самом широком определении, рак в общем относится к злокачественному новообразованию, представляющему собой патологическую ткань, растущую со скоростью, отличающейся от нормальной ткани, и продолжающую так же быстро расти после прекращения действия стимула. Кроме того, эта патологическая ткань не имеет назначения, поглощает питательные вещества хозяина и является почти автономной. Рак может также относится к злокачественной опухоли. Дополнительные пояснения в отношении новообразований можно найти в Главе 8 книги Robbins Pathologic Basis of Disease, шестое издание, за авторством RS Cotran, V. Kumar и Т. Collins RS Cotran (опубликована WB Saunders Company). Информация из Главы 8 этой книги включена в текст настоящего описания посредством ссылки. Примерами видов рака, поддающихся лечению путем введения раскрытого соединения, являются злокачественную опухоль или новообразование.

[0023] Раскрытые новые соединения эффективны при лечении новообразований, включая лейкоз и солидные опухоли. Солидные опухоли включают опухоли толстой кишки, прямой кишки, яичника, молочной железы, предстательной железы, легкого, почки и меланому. Диапазон дозировок лекарственного средства зависит от пути введения и возраста, массы тела и состояния пациента. Путь введения соединения может представлять собой парентеральный путь, включая внутримышечное введение, внутривенное введение или венозное введение.

[0024] В контексте настоящего описания пациент или субъект представляет собой позвоночное с раком или иным заболеванием. Предпочтительно, субъект представляет собой теплокровное животное, в частности млекопитающее, включая как человека, так и млекопитающих, отличных от человека. Примеры млекопитающих, отличных от человека, включают, не ограничиваясь указанными, сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы, лошади и ламы, и домашних животных, таких как собаки и кошки. Наиболее предпочтительно, субъект представляет собой человека. Посредством настоящего изобретения достигается противоопухолевый эффект путем введения субъекту терапевтически эффективной дозы соединения в течение некоторого времени.

[0025] Для млекопитающих, включая людей, эффективная доза может быть определена на основании площади поверхности тела. В Cancer Chemother. Rep., 50 (4): 219 (1966), Е.J. Freireich et al. продемонстрирована зависимость дозы от размера и типа животных и людей (на основании площади поверхности тела в мг/м²). Площадь поверхности тела может быть приблизительно определена на основании высоты и массы индивидуума (см., например, Scientific Tables, Geigy harmaceuticals, Ardsley, N.Y. стр. 537-538 (1970)). Подходящий диапазон доз может составлять от 1 до 1000 мг раскрытого соединения на квадратный метр площади поверхности тела. То есть, доза составляет 50-500 мг/м².

[0026] Настоящее изобретение обладает несколькими положительными действиями: (1) полученные путем молекулярной оптимизации разработки соединений на основе цитидина новые димеры производных цитидина по настоящему изобретению демонстрируют значительное ингибирующее воздействие на клетки рака толстой кишки человека НСТ-116, и демонстрируют сильное ингибирующее воздействие на ксенотрансплантаты рака толстой кишки человека НСТ-116, выращенные у бестимусных мышей; раскрытые новые димеры производных цитидина обеспечивают высокую противоопухолевую активность при низкой токсичности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0027] На ФИГ. 1 показан путь синтеза димера производного цитидина согласно Примеру 1, на фигуре TBSCI обозначает трет-бутилдиметилсилилхлорид, pyr обозначает пиридин, ДХМ обозначает дихлорметан, комн. темп. обозначает комнатную температуру, бутил карбонохлоридат обозначает бутилхлорформиат, HF.Et.₃N обозначает триэтиламина тригидрофторид, в течение ночи обозначает в течение ночи, ДЦК обозначает N,N'-дициклогексилкарбодиимид, и ДМАП обозначает 4-диметиламинопиридин;

[0028] на ФИГ. 2 показан путь синтеза димера производного цитидина согласно Примеру 2, на фигуре ГМДС обозначает гексаметилдисилазан, с обр. хол. обозначает с обратным холодильником, хлоридат обозначает хлоридат, ТЭА обозначает триэтиламин, (Boc)₂O обозначает ди-трет-бутилдикарбонат, диоксан обозначает 1,4-диоксан, янтарный ангидрид обозначает янтарный ангидрид, pyr обозначает пиридин, ДЦК обозначает N,N'-дициклогексилкарбодиимид, ДМАП обозначает 4-диметиламинопиридин, TFA обозначает трифторуксусную кислоту и ДХМ обозначает дихлорметан;

[0029] на ФИГ. 3 показан путь синтеза димера производного цитидина согласно Примеру 3, на фигуре ГМДС обозначает гексаметилдисилазан, с обр. хол. обозначает с обратным холодильником, хлоридат обозначает хлоридат, ТЭА обозначает триэтиламин, (Boc)₂O обозначает ди-трет-бутилдикарбонат, диоксан обозначает 1,4-диоксан, глутаровый ангидрид обозначает глутаровый ангидрид, pyr обозначает пиридин, ДЦК обозначает N,N'-дициклогексилкарбодиимид, ДМАП обозначает 4-диметиламинопиридин, TFA обозначает трифторуксусную кислоту и ДХМ обозначает дихлорметан;

[0030] на ФИГ. 4 показан путь синтеза димера производного цитидина согласно Примеру 4, на фигуре ДЦК обозначает N,N'-дициклогексилкарбодиимид, ДМАП обозначает 4-диметиламинопиридин, TFA обозначает трифторуксусную кислоту и ДХМ обозначает дихлорметан;

[0031] ФИГ. 5 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую степени ингибирования образования клонов клеток для клеток рака толстой кишки человека НСТ-116, обработанных четырьмя соединениями в концентрациях 50 нМ, 150 нМ и 450 нМ согласно Примеру применения 1; и

[0032] ФИГ. 6 представляет собой кривую, иллюстрирующую взаимосвязь «доза-ответ» между концентрациями соединений и степенями ингибирования клеток рака толстой кишки человека НСТ-116, обработанных четырьмя соединениями согласно Примеру применения 1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0033] В настоящем изобретении раскрывается димер производного цитидина, имеющий структурную формулу, представляющую собой формулу (I):

(I)

где R1 представляет собой C₁-C₁₀ алкил, C₁-C₁₀ замещенный алкил, -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2, 3-10, или замещенную -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2, 3-10, и Ph представляет собой фенил. Углеродная цепь замещенного алкила независимо замещена одним, двумя или тремя галогенами, цианогруппами, нитрогруппами, аминогруппами, гидроксильными группами или карбоксильными группами. Углеродная цепь или фенильное кольцо замещенной -(CH₂)_n-Ph независимо замещены одним, двумя или тремя галогенами, цианогруппами, нитрогруппами, аминогруппами, гидроксильными группами или карбоксильными группами.

[0034] R2 представляет собой C₁-C₁₀ алкил, C₁-C₁₀ замещенный алкил, -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2, 3-10, или замещенную -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2, 3-10, и Ph представляет собой фенил. Углеродная цепь замещенного алкила независимо замещена одним, двумя или тремя галогенами, цианогруппами, нитрогруппами, аминогруппами, гидроксильными группами или карбоксильными группами. Углеродная цепь или фенильное кольцо замещенной -(CH₂)_n-Ph независимо замещены одним, двумя или тремя галогенами, цианогруппами, нитрогруппами, аминогруппами, гидроксильными группами или карбоксильными группами.

[0035] R3 представляет собой водород, алкоксикарбонил или замещенный алкоксикарбонил. Заместитель замещенного алкоксикарбонила представляет собой галоген, цианогруппу, нитрогруппу, аминогруппу, гидроксильную группу или карбоксильную группу.

[0036] R4 представляет собой водород, алкоксикарбонил или замещенный алкоксикарбонил. Заместитель замещенного алкоксикарбонила представляет собой галоген, цианогруппу, нитрогруппу, аминогруппу, гидроксильную группу или карбоксильную группу.

[0037] R5 представляет собой -(CH₂)_n-, где n составляет от 1 до 15. Или R5 представляет собой замещенную -(CH₂)_n-, заместитель которой представляет собой фенильную группу, цианогруппу, нитрогруппу, аминогруппу, гидроксильную группу или карбоксильную группу. Альтернативно, R5 представляет собой -(CH₂)_n-Х₁-Х₂-, где n равно 0, 1, 2 или 3, X₁ представляет собой O или S, и Х₂ представляет собой -(CH₂)_n-Ph, где n равно 0, 1, 2 или 3, или Х₂ представляет собой пиримидил, пиранил или пиридил.

[0038] В Таблице 1 перечислены следующие соединения, представляющие собой димеры производных цитидина по настоящему изобретению. Тем не менее, димеры производных цитидина по настоящему изобретению не ограничиваются этими соединениями.

[0039] При получении соединений из вышеприведенной таблицы твердые реагенты, применяемые в процессе синтеза, используются непосредственно без дополнительной обработки, жидкие реагенты используются после повторной перегонки и сушки.

[0040] (Пример 1)

[0041] Димер производного цитидина в данном примере представляет собой 1,5-ди-[4-N-(н-бутилоксикарбонил)-3'-O-(н-бутоксикарбонил)-2'-деокси-2',2'-дифтор-цитидин]глутарат (условное обозначение D1, №101 в Таблице 1), имеющий следующую структурную формулу:

D1

[0042] Путь синтеза D1 показан на ФИГ. 1, подробный способ получения состоит в следующем.

[0043] 2'-деокси-2',2'-дифтор-цитидин гидрохлорид (3 г, 10 ммоль) и имидазол (0,875 г, 12,8 ммоль) добавляли к 10 мл безводного пиридина, охлаждали на ледяной бане и при 0°C добавляли трет-бутилдиметилсилилхлорид (3,3 г, 21 ммоль, здесь и далее трет-бутилдиметилсилилхлорид сокращенно именуется TBSCI). Смесь перемешивали в течение получаса и нагревали до комнатной температуры, и продолжали проведение реакции в течение 12 часов. Смесь обрабатывали метанолом (8,0 мл). После перемешивания в течение 60 минут растворитель удаляли при пониженном давлении и получали Соединение 2. Затем к реакционной системе добавляли дихлорметан (ДХМ) (50 мл) и пиридин (10 мл), и затем добавляли бутилхлорформиат (5,46 г, 40 ммоль) на ледяной бане и под защитой азота. Этот раствор перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре для проведения реакции, и затем сушили на центрифуге с получением осажденного твердого вещества. Осажденное твердое вещество растворяли в этилацетате (100 мл) и промывали охлажденным насыщенным раствором бикарбоната натрия (дважды по 30 мл) и насыщенным соляным раствором (30 мл). Полученный раствор сушили над безводным сульфатом натрия в течение 3 часов и затем фильтровали. Фильтрат очищали колоночной хроматографией (дихлорметан/метанол 40:1) с получением промежуточного Соединения 3 (3,6 г, выход для двух стадий 62%).

[0044] Соединение 3 (3,6 г, 6,23 ммоль) добавляли к 40 мл тетрагидрофурана (ТГФ) и охлаждали на ледяной бане до 0°C. Медленно добавляли 4 мл триэтиламин тригидрофторида (HF.Et₃N). После проведения реакции в течение 24 часов растворитель сушили на центрифуге в вакууме с получением оранжевого твердого вещества, которое очищали колоночной хроматографией (дихлорметан/метанол, 20:1) с получением Соединения 4 (1,68 г, выход 58%).

[0045] 30 мл хлороформа добавляли к промежуточному Соединению 4 (1,68 г, 3,62 ммоль), добавляли пиридин (30 мл) и затем добавляли глутаровый ангидрид (620 мг, 5,44 ммоль) для проведения реакции в течение ночи при перемешивании. После этого добавляли 4-диметиламинопиридин (ДМАП, 7 мг, 0,057 ммоль) и перемешивали смесь в течение 3 часов, и затем концентрировали с обеспечением вязкого маслянистого продукта, который очищали колоночной хроматографией с получением Соединения 5 (1,11 г, выход 53%).

[0046] Соединение 5 (58 мг, 0,1 ммоль), Соединение 4 (92 мг, 0,2 ммоль) и N,N'-дициклогексилкарбодиимид (ДЦК, 42 мг, 0.2 ммоль) смешивали и добавляли к дихлорметану (15 мл), затем добавляли ДМАП (6 мг, 0,049 ммоль) для проведения реакции при 24°C при перемешивании в течение 24 часов. После завершения реакции согласно измерениям ТСХ, к смеси добавляли дихлорметан (50 мл), промывали водой (10 мл) и насыщенным соляным раствором (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали досуха. Проводили колоночную хроматографию (дихлорметан/метанол, 20:1) с получением Соединения 6 (49 мг, выход 48%).

[0047] ¹Н-ЯМР (МеОD-d4, 400 МГц) δ: 7,97 (d, 2Н, J=7,68 Гц, Н6-1, Н6-2), 7,40 (d, 2Н, J=7,68 Гц, Н5-1, Н5-2), 6,35 (t, 2Н, J=7,24 Гц, Н1'-1, Н1'-2), 4,47 (m, 6Н, Н5а'-1, Н5а'-2, H5b'-1, Н5b'-2, Н4'-1, Н4'-2), 4,21 (m, 8Н, O-CH2×4), 2,53 (t, 4Н, J=7,16 ГЦ, CH2-CH2-CH2), 1,97 (m, 2Н, CH2-CH2-CH2), 1,64 (m, 8Н, O-CH2-CH2×4), 1,42 (m, 8Н, O-CH2-CH2-CH2×4), 0,98 (m, 12Н, CH2-СН3×4),

[0048] ¹³С ЯМР (МеOD-d4, 100 МГц) δ: 172,83, 164,51, 153,87, 144,53, 96,26, 77,52, 69,13, 65,89, 61,94, 32,42, 30,66, 30,47, 18,83, 18,67, 12,79, 12,74, 8,48.

[0049] ЭРИ-МС: рассчитано для C43H58F4N6O18 m/z 1023,37 (М+Н)+, найдено 1023,66.

[0050] Вышеуказанный путь синтеза может быть модифицирован путем замены глутарового ангидрида иным ангидридом для получения соединений №102-№105, приведенных в Таблице 1. Путем замены бутилхлорформиата на трет-бутилхлорформиат может быть получено соединение №106 из Таблицы 1.

[0051] (Пример 2)

[0052] Димер производного цитидина в данном примере представляет собой 1,5-ди-[4-N-(н-бутоксикарбонил)-2'-деокси-2',2,-дифторцитидин]сукцинат (условное обозначение D2, №107 в Таблице 1), имеющий следующую структурную формулу:

D2

[0053] Сначала получали промежуточное Соединение 8, ход реакции показан на ФИГ. 2, и способ получения состоит в следующем.

[0054] 2'-деокси-2',2'-дифтор-цитидин гидрохлорид (структурная формула 1, 300 мг, 1 ммоль), бис(триметилсилил)амин ГМДС (5 мл, 0,023 ммоль) и 5 мг (каталитическое количество) сульфата аммония растворяли в 1,4-диоксане (5 мл). Реакцию проводили при нагревании с обратным холодильником в течение 2 часов, и продукт реакции имел химическую структурную формулу 19. После завершения реакции с обратным холодильником реакционный раствор концентрировали, добавляли толуол и дважды концентрировали досуха. Полученный после концентрирования продукт растворяли в дихлорметане (10 мл).

[0055] N-метилимидазол (0,24 мл, 3 ммоль) и бутилхлорформиат (0,32 мл, 3 ммоль) добавляли к вышеуказанному раствору дихлорметана для проведения реакции при комнатной температуре при перемешивании в течение 4 часов. Затем реакционный раствор концентрировали с обеспечением вязкого маслянистого продукта.

[0056] Вышеуказанный вязкий маслянистый продукт растворяли в смешанном растворе триэтиламина (3 мл) и метанола (20 мл), и перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре. Растворитель удаляли перегонкой при пониженном давлении и очищали неочищенный продукт колоночной хроматографией на силикагеле с дихлорметаном/метанолом (20:1) с получением 230 мг Соединения 7. Выход для трех стадий составил 55,5%.

[0057] ЯМР-характеристики Соединения 7:

[0058] ¹Н-ЯМР (MeOD-d₄, 400 МГц) δ: 8,30 (d, 1Н, J=7,68 Гц, Н6), 7,34 (d, 1Н, J=7,68 Гц, Н5), 6,28 (t, 1Н, J=7,08 Гц, H1'), 4,33 (m, 1Н, Н5а'), 4,0 (m, 2Н, O-CH₂-CH₂-), 3,81 (m, 1Н, Н5b'), 3,79 (m, 1Н, Н4'), 1,68 (m, 2Н, O-CH₂-CH₂-), 1,45 (m, 2Н, O-CH₂-CH₂-CH₂), 0,98 (t, 3Н, J=7,4 Гц, -CH₂-СН₃).

[0059] ¹³С-ЯМР (МеОD-d₄, 100 МГц) δ 164,28, 156,27, 153,50, 144,39, 128,33, 122,72, 95,81, 84,90, 81,71, 74,87, 68,88, 63,69, 59,15, 30,66, 32,40, 18,81, 11,23, 8,06.

[0060] Соединение 7 (60 мг, 0,16 ммоль) и карбонат натрия (106 мг, 1 ммоль) смешивали и добавляли к 5 мл раствора 1,4-диоксана и воды (объемное отношение 4:1). К раствору добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (Вос)₂O (44 мг, 0,2 ммоль) и затем перемешивали при 24°C для проведения реакции. Во время реакции использовали ТСХ для оценки полноты реагирования Соединения 7. После завершения реакции систему после реакции разбавляли водой (2 мл) и дважды экстрагировали этилацетатом, каждый раз объемом 30 мл. Полученную экстракцией органическую фазу последовательно промывали водой (5 мл) и насыщенным соляным раствором (5 мл), после завершения промывания сушили над безводным сульфатом натрия и затем концентрировали досуха при пониженном давлении. Полученный после концентрирования продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле с дихлорметаном/ацетоном/метанолом (1:1:0,02) с получением 51 мг Соединения 8. Выход вышеуказанной реакции составил 76%.

[0061] Путь синтеза D2 показан на ФИГ. 2, способ получения состоит в следующем.

[0062] Полученное Соединение 8 (223 мг, 0,25 ммоль) растворяли в хлороформе (6 мл), добавляли пиридин (5 мл) и затем добавляли янтарный ангидрид (100 мг, 1 ммоль). Реакцию проводили в течение ночи при 45°C. Затем реакционную смесь концентрировали с получением вязкого масла и очищали колоночной хроматографией (ДХМ-МеОН 20:1-10:1) с получением Соединения 9 (211 мг, выход 75%).

[0063] Соединение 9 (56 мг, 0,1 ммоль), Соединение 8 (92 мг, 0,2 ммоль) и ДЦК (42 мг, 0,2 ммоль) смешивали и добавляли к дихлорметану (15 мл), и добавляли ДМАП (6 мг, 0,049 ммоль). Реакцию проводили при 24°C при перемешивании в течение 24 часов. После завершения реакции согласно измерениям ТСХ, к смеси добавляли дихлорметан (50 мл), промывали водой (10 мл) и насыщенным соляным раствором (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали досуха. К полученному продукту затем добавляли трифторуксусную кислоту (TFA, 5 мл) и дихлорметан (ДХМ, 10 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение получаса. После охлаждения на ледяной бане белое твердое вещество удаляли фильтрацией. Фильтрат концентрировали с получением вязкого масла, которое очищали колоночной хроматографией (ДХМ-МеОН от 20:1 до 10:1) с получением D2 (30 мг, выход 35%).

[0064] ¹Н-ЯМР (МеОD-d₄, 400 МГц) δ 7,85 (d, 2Н, J=7,68 Гц, Н6-1, Н6-2), 7,37 (d, 2Н, J=7,68 Гц, Н5-1, Н5-2), 6,26 (t, 2Н, J=7,24 Гц, Н1'-1, Н1'-2), 4,53 (m, 2Н, Н5а'-1, Н5а'-2), 4,40 (m, 4Н, H5b'-1, H5b'-2, Н4'-1, Н4'-2), 4,20 (m, 2Н, Н3-1, Н3-2), 2,73 (m, 4Н, -CH2-CH2-), 1,64 (m, 4Н, O-CH2-CH2), 1,37 (m, 4Н, O-CH2-CH2-CH₂), 0,93 (m, 6Н, CH2-СН3).

[0065] ¹³С-ЯМР (МеОD-d₄, 100 МГц) δ 172,41, 164,01, 155,95, 153,52, 144,36, 96,56, 70,53, 66,29, 62,49, 30,74, 28,76, 19,01, 13,49.

[0066] ЭРИ-МС: рассчитано для C₃₂H₄₀F₄N₆O₁₄ m/z 809,25 (М+Н)⁺, найдено 809,34.

[0067] Вышеуказанный способ получения может быть модифицирован путем взаимодействия Соединения 8 с другим(и) диангидридом(ами), таким как глутаровый ангидрид, для получения соединений №108-№110, приведенных в Таблице 1. Путем замены бутилхлорформиата на трет-бутилхлорформиат может быть получено соединение №111, приведенное в Таблице 1.

[0068] (Пример 3)

[0069] Димер производного цитидина в данном примере представляет собой 1,5-ди-[4-N-(бензилоксикарбонил)-2'-деокси-2',2'-дифторцитидин]глутарат (условное наименование D3).

D3

[0070] Путь синтеза D3 показан на ФИГ. 3, способ получения состоит в следующем.

[0071] Сначала получали Соединение 13: 2'-деокси-2',2'-дифтор-цитидин гидрохлорид (300 мг, 1 ммоль), бис(триметилсилил)амин (5 мл, 0,023 ммоль) и 5 мг (каталитическое количество) сульфата аммония растворяли в 1,4-диоксане (5 мл). Реакцию проводили при нагревании с обратным холодильником в течение 2 часов. После завершения реакции с обратным холодильником реакционный раствор концентрировали, добавляли толуол и дважды концентрировали досуха. Полученный продукт растворяли в дихлорметане (10 мл).

[0072] N-метилимидазол (0,24 мл, 3 ммоль) и бензилхлорформиат (340 мг, 3 ммоль) добавляли к вышеуказанному раствору дихлорметана для проведения реакции при комнатной температуре при перемешивании в течение 4 часов. Продукт реакции имел химическую структурную формулу 20. Реакционный раствор концентрировали с обеспечением вязкого маслянистого продукта.

[0073] Вышеуказанный вязкий маслянистый продукт растворяли в смешанном растворе триэтиламина (3 мл) и метанола (20 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем растворитель удаляли перегонкой при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле с дихлорметаном/метанолом (20:1) с получением 162 мг Соединения 12. Выход для трех стадий составил 41%.

[0074] ЯМР характеристики Соединения 12:

[0075] ¹Н-ЯМР (MeOD-d₄, 400 МГц) δ: 8,31 (d, 1Н, J=7,64 Гц, Н6), 7,39 (m, 5Н, J=7,68 Гц, Ph), 6,25 (t, 1Н, J=7,12 Гц, Н1'), 5,21 (s, 2Н, CH₂-Ph), 4,31 (m, 1Н, Н5а'), 3,82 (m, 2Н, Н5b, Н4'), 3,79 (m, 1Н, Н3').

[0076] ¹³С-ЯМР (MeOD-d₄, 100 МГц) δ: 164,22, 156,22, 153,27, 144,48, 135,87, 128,42, 128,10, 125,31, 122,74, 120,16, 95,89, 85,35, 84,91, 81,7, 81,66, 68,87, 67,54, 58,31.

[0077] Соединение 12 (80 мг, 0,2 ммоль) и карбонат натрия (106 мг, 1 ммоль) смешивали и добавляли к системе из 1,4-диоксана и воды (объемное отношение 4:1, 5 мл). Затем добавляли (Вос)₂O (44 мг, 0,2 ммоль) для проведения реакции при 24°C в течение 48 при перемешивании. После завершения реакции согласно измерениям ТСХ реакционную смесь разбавляли водой (2 мл) и дважды экстрагировали 30 мл этилацетата. Полученную экстракцией органическую фазу промывали водой (5 мл) и насыщенным соляным раствором (5 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и затем концентрировали досуха при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (дихлорметан/ацетон/этанол, 1:1:0,02) с получением Соединения 13 (64 мг, с выходом 64%).

[0078] Полученное Соединение 13 (248 мг, 0,5 ммоль) добавляли к хлороформу (15 мл), добавляли пиридин (5 мл), и затем добавляли глутаровый ангидрид (100 мг, 1 ммоль). Реакцию проводили в течение ночи при 45°C. Затем реакционную смесь концентрировали до вязкого масла и очищали колоночной хроматографией (ДХМ-МеОН от 20:1 до 10:1) с получением Соединения 14 (223 мг, с выходом 73%).

[0079] Полученное Соединение 14 (61 мг, 0,1 ммоль), Соединение 13 (99 мг, 0,2 ммоль) и ДЦК (42 мг, 0,2 ммоль) смешивали и добавляли к дихлорметану (15 мл), и добавляли ДМАП (6 мг, 0,049 ммоль). Реакцию проводили при 24°C при перемешивании в течение 24 часов. Когда согласно измерениям ТСХ реакция была завершена, к смеси добавляли дихлорметан (50 мл), промывали водой (10 мл) и насыщенным соляным раствором (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали досуха. Затем добавляли TFA (5 мл) и ДХМ (10 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение получаса. После охлаждения на ледяной бане белое твердое вещество удаляли фильтрацией. Затем фильтрат концентрировали с получением вязкого масла, которое очищали колоночной хроматографией (ДХМ-МеОН от 20:1 до 10:1) с обеспечением D3 (30 мг, с выходом 35%).

[0080] ¹Н-ЯМР (MeOD-d₄, 400 МГц) δ: 8,31 (d, 1Н, J=7,64 Гц, Н6), 7,39 (m, 5Н, J=7,68 Гц, Ph), 6,27 (t, 2Н, J=7,8 Гц, Н1'-1, Н1'-2), 5,17 (s, 4Н, CH₂-Ph×2), 4,46 (m, 4Н, Н5а'-1, Н5а'-2, H5b'-1, Н5b'-2), 4,21 (m, 2Н, Н4'-1, Н4'-2), 4,10 (m, 2Н, Н3'-1, Н3'-2),, 2,53 (t, 4Н, J=7,16 Гц, -CH2-CH2-CH2-), 1,99 (q, 2Н, J=7,2 Гц, -CH2-CH2-CH2-).

[0081] ¹³С ЯМР (МеОD-d₄, 100 МГц) δ 172,90, 164,21, 155,90, 153,31, 144,25, 141,03, 135,86, 128,41, 128,28, 128,10, 124,85, 123,25, 122,26, 96,14, 79,17, 74,97, 67,59, 62,06, 33,19, 32,51, 19,96.

[0082] ЭРИ-МС: рассчитано для C₃₉H₃₈F₄N₆O₁₄ m/z 891,24 (М+Н)⁺, найдено 891,31.

[0083] Вышеуказанный способ получения может быть модифицирован путем взаимодействия Соединения 14 с другим(и) диангидридом(ами), такими как COOHCHBr(CH₂)₂COOH, СООН CHPh(CH₂)₂COOH и СООН CHCNCH₂COOH, для получения соединений №113-№116, приведенных в Таблице 1.

[0084] (Пример 4)

[0085] Димер производного цитидина в данном примере представляет собой 1-O-(4-N-(бензилоксикарбонил)-гемцитабин)-4-O-(4-N-(н-бутоксикарбонил)-гемцитабин)-сукцинат (условное наименование D4), имеющий следующую структурную формулу:

[0086] Путь синтеза D4 показан на ФИГ. 4, конкретный способ получения состоит в следующем.

[0087] Соединение 9 (56 мг, 0,1 ммоль), Соединение 13 (99 мг, 0,2 ммоль) и ДЦК (42 мг, 0,2 ммоль) смешивали и добавляли к дихлорметану (15 мл), и добавляли ДМАП (6 мг, 0,049 ммоль). Реакцию проводили при 24°C при перемешивании в течение 24 часов. После завершения реакции согласно измерениям ТСХ к реакционной смеси добавляли дихлорметан (50 мл), промывали водой (10 мл) и насыщенным соляным раствором (20 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали досуха. Затем добавляли TFA (5 мл) и ДХМ (10 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение получаса. После охлаждения на ледяной бане белое твердое вещество удаляли фильтрацией. Фильтрат концентрировали с обеспечением вязкого масла и очищали колоночной хроматографией (ДХМ-МеОН от 20:1 до 10:1) с получением D4 (30 мг, выход 36%).

[0088] ¹Н-ЯМР (МеОD-d₄, 400 МГц) δ 7,98 (m, 2Н, Н6-1, Н6-2), 7,40 (d, 2Н, J=7,68 Гц, Н5-1, Н5-2), 7,38 (m, 6Н, Ph), 6,26 (t, 2Н, J=8 Гц, Н1'-1, Н1'-2), 5,21 (s, 2Н, CH₂-Ph), 4,43 (m, 2H, H5a'-1, H5a'-2), 4,29 (m, 2H, H5b'-1, H5b'-2), 4,21 (m, 6H, H4'-1, H4'-2 H3'-1, H3'-2), 2,74 (m, 4H, -CH₂-CH₂-), 1,43 (m, 2H, O-CH₂-CH₂-), 1,28 (m, 2H, O-CH₂-CH₂-CH₂-), 0,97 (t, 3H, J=7,4 Гц, -CH₂-CH₃).

[0089] ¹³C ЯМР (МеОD-d₄, 100 МГц) δ 172,56, 164,19, 155,89, 153,52, 144,61, 135,86, 128,09, 122,22, 96,21, 79,38, 78,91, 70,83, 67,60, 65,92, 62,11, 56,72, 30,64, 28,66, 28,51, 25,93, 18,82, 14,26, 12,77.

[0090] ЭРИ-МС: рассчитано для C₃₅H₃₈F₄N₆O₁₄ m/z 843,24 (M+H)⁺, найдено 843,33.

[0091] Вышеуказанный способ получения может быть модифицирован путем замены янтарного ангидрида другим(и) ангидридом(ами) для взаимодействия с Соединением 8 и получения промежуточного соединения. Промежуточное соединение может взаимодействовать с Соединением 13 с получением соединений №118-№120, приведенных в Таблице 1.

[0092] (Пример 5: гидрохлорид димера производного цитидина)

[0093] Этот пример включает получение гидрохлорида димера производного цитидина согласно Примеру 1.

[0094] 1,5-ди-[4-N-(н-бутоксикарбонил)-3'-O-(н-бутоксикарбонил)-2'-деокси-2',2'-дифтор-цитидин]глутарат (0,50 г) растворяли в этилацетате (60 мл), помещали на ледяную баню и обрабатывали сухим газом соляной кислоты. После перемешивания в течение 15 минут растворитель удаляли с получением белого твердого продукта.

[0095] Схожим образом может быть получена хлороводородная соль другого(их) димера(ов) производного(ых) цитидина.

[0096] Помимо вышеуказанной хлороводородной соли могут быть получены другие соли димера производного цитидина, включая фосфаты, сульфаты, карбонаты, нитраты, цитраты, тартраты, малеаты, сукцинаты, сульфонаты, пара-толуенсульфонаты, метансульфонаты, бензоаты или фумараты.

[0097] (Пример 6: Лиофилизированный порошок димера производного цитидина для инъекций)

[0098] Данный пример включает получение лиофилизированного порошка соединения D3 для инъекций согласно Примеру 3.

[0099] Лиофилизированный порошок D3 для инъекций включал соединение D3 (30 г), маннит (20% w/v, 300 г), буфер дигидрат дигидрофосфат натрия (7 г) и поверхностно-активное вещество полоксамер 188 (F68) (4,0 г).

[00100] Дигидрат дигидрофосфата натрия, полоксамер 188 (F68) (CAS №:9003-11-6) и маннит (20% масса/объем) точно взвешивали в соответствии с установленным количеством, как описано выше, и растворяли в воде для инъекций (300 г), предварительно охлажденной до температуры ниже 10°C. Для доведения значения pH раствора до 7,3-7,5 использовали NaOH (0,1 моль/л). Затем к раствору добавляли установленную дозу D3 и хорошо перемешивали. Для доведения значения pH до 7,3±0,2 (7,5 в данном Примере) может быть использован раствор NaOH (0,1 моль/л) или HCl (0,1 моль/л). К раствору добавляли воду до 2000 г, и фильтровали и стерилизовали посредством микропористой мембраны с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат распределяли в виалы по 2,0 грамма в каждую. Виалы частично закрывали пробками и помещали в сублиматор для лиофилизации. После сушки виалы упаковывали под вакуумом, запечатывали и маркировали с получением 1000 виал лиофилизированного порошка для инъекций. Температура хранения составляла 2°C-8°C.

[00101] Помимо лиофилизированного порошка для инъекций (т.е., стерильного порошка для инъекций), димер(ы) производного(ых) цитидина по настоящему изобретению могут быть выполнены в других подходящих для инъецирования формах, таких как раствор для инъекций, суспензия для инъекций, эмульсия для инъекций.

[00102] (Пример 7: Фармацевтическая композиция димера производного цитидина)

[00103] Фармацевтическая композиция димера производного цитидина в данном Примере включает фармацевтически активное вещество и эксципиент. Фармацевтически активное вещество может представлять собой димер производного цитидина или его соль, полученные в предыдущих Примерах. Массовый процент фармацевтически активного вещества в композиции может составлять от 1% до 95% (30% в данном Примере). Эксципиенты могут включать воду, лактозу, кукурузный крахмал, гидроксипропилметилцеллюлозу и стеарат магния. Форма фармацевтической композиции в данном Примере представляет собой таблетку.

[00104] Помимо вышеуказанной формы таблетки, фармацевтические композиции могут быть выполнены в других подходящих формах. Фармацевтически активное вещество может быть изготовлено для перорального приема в виде: порошков, гранул, капсул, пеллет, растворов, суспензий, эмульсий, сиропов или эликсиров, или составов с замедленным высвобождением и контролируемым высвобождением, или в виде других форм, подходящих для перорального приема. Эти вводимые перорально формы фармацевтической композиции могут содержать соответствующие общепринято используемые эксципиенты (подразделяемые на добавки, адъюванты и так далее, в зависимости от их функций). Добавки могут включать маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахар, соль, целлюлозу, сульфат магния и так далее по фармацевтическим категориям.

[00105] При получении вышеуказанной вводимой перорально формы фармацевтической композиции могут быть использованы фармакологические адъюванты как лекарственные носители для переноса фармацевтически активных веществ, которые включают материалы, известные из уровня техники, такие как: инертные твердые разбавители, водные растворители, липосомы, микросферы и/или нетоксичные органические растворители. Предпочтительные адъюванты включают: смачивающие агенты, эмульгирующие агенты, pH-буферы, человеческий сывороточный альбумин, антиоксиданты, консерванты, бактериостатические агенты, декстрозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, лецитин, глицин, сорбиновую кислоту, пропиленгликоль, полиэтилен, протамин, борную кислоту, хлорид натрия, хлорид калия, минеральное масло, растительное масло и т.д. Один или более типов может быть выбрано и совмещено в качестве лекарственного носителя.

[00106] Целевые опухоли для раскрытых фармацевтических композиций включают рак крови или злокачественные солидные опухоли. В частности, целевые опухоли включают рак легкого, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак печени, рак пищевода, опухоль мозга, рак яичника, рак матки, рак почки, рак головы и шеи, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак вульвы, рак яичка, колоректальный рак, хориокарциному, герминогенные опухоли, злокачественную лимфому, лейкоз и множественную миелому. Кроме того, предпочтительные целевые опухоли могут включать рак поджелудочной железы (при терапии первой или второй линии), немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак яичника и сквамозно-клеточную карциному головы и шеи, и/или рак толстой кишки. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничено перечисленным.

[00107] (Пример применения 1: Исследование ингибирования серией соединений образования колоний клеток рака толстой кишки человека НСТ-116)

[00108] 1. Исследование ингибирования образования колоний клеток было проведено для оценки ингибирующего воздействия четырех представляющих интерес соединений (D1, D2, D3 и D4) с концентрациями 50 нМ, 150 нМ и 450 нМ на пролиферацию клеточной линии рака толстой кишки человека НСТ-116.

[00109] 2. Материал для исследований: клеточные линии: НСТ-116 рака толстой кишки человека, приобретенные в Шанхайском клеточном ресурсном центре Китайской Академии наук (Chinese Academy of Sciences Shanghai Cell Resource Center), кат. № TCHu 99.

[00110] 3. Получение реагентов

[00111] Культуральная среда клеток рака толстой кишки человека НСТ-116: DMEM (среда Игла, модифицировнная Дульбекком) + 10% FBS (эмбриональной бычьей сыворотки).

[00112] Получение соединения: для разбавления соединения использовали ДМСО (диметилсульфоксид) до достижения конечной концентрации 100 мкМ.

[00113] Получения раствора для окрашивания клеток: готовили 0,5% раствор кристаллического фиолетового с использованием безводного этанола и хранили в темноте. Перед окрашиванием раствор смешивали с буферным раствором PBS (натрий-фосфатный буфер) в объемном отношении 1:4 в качестве раствора для окрашивания клеток.

[00114] 4. Клеточная культура: клетки в логарифмической фазе роста собирали, подсчитывали и ресуспендировали в полной культуральной среде. Концентрацию клеток приводили к необходимому значению, засеивали 6-луночные культуральные планшеты, помещая в каждую лунку приблизительно по 300 клеток и по 1,8 мл культуральной среды. Клетки инкубировали в течение 5 часов в инкубаторе при 37°C, 100% относительной влажности и 5% CO₂.

[00115] 5. Исследование ингибирования образования колоний клеток и обработка данных

[00116] (1) Клетки в логарифмической фазе роста собирали и подсчитывали. Клетки ресуспендировали в культуральной среде, содержащей 5% FBS, и подсчитывали. Засеивали шестилучночные планшеты в количестве 300 клеток на лунку. Клетки инкубировали в течение 5 часов в инкубаторе при 37°C, 100% относительной влажности и 5% CO₂.

[00117] (2) Соединения разбавляли культуральной средой (содержащей 5% FBS) до получения концентраций 0,5 мкМ, 1,5 мкМ и 4,5 мкМ, и добавляли к клеткам в количестве 200 мкл на лунку, с получением конечных концентраций 50 нМ, 150 нМ и 450 нМ. Каждую концентрацию повторно исследовали три раза.

[00118] (3) Клетки инкубировали в течение 72 часов в инкубаторе при 37°C, 100% относительной влажности и 5% CO₂.

[00119] (4) Культуральную среду из планшетов (культуральную среду, содержащую соединения) отсасывали. Планшеты дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS) и заменяли свежей культуральной средой (среда DMEM с 15% FBS).

[00120] (5) Клетки инкубировали в течение 7-10 дней в инкубаторе при 37°C, 100% относительной влажности и 5% CO₂, до образования видимых клонированных бляшек.

[00121] (6) Культуральную среду отсасывали из планшетов. Планшеты дважды промывали раствором PBS.

[00122] (7) Остаточный PBS абсорбировали и удаляли, и добавляли этанол в количестве 1 мл на планшет, фиксируя в течение 30 минут.

[00123] (8) Этанол абсорбировали и удаляли, и добавляли раствор для окрашивания клеток, окрашивали в течение 3 минут.

[00124] (9) Окрашивающий раствор отсасывали. После трехкратного промывания PBS клетки подсчитывали.

[00125] Обработка данных:

[00126] Эффективность образования клонов = [As/Ас] × 100%; степень ингибирования образования клонов = 1 - эффективность образования клонов, где As обозначает количество колоний клеток при обработке образцами (клетки + исследуемые соединения), и Ас обозначает количество колоний клеток в отрицательном контроле (без обработки образцами) (клетки + 1% ДМСО).

[00127] 6. Результаты и обсуждение

[00128] В Таблице 2 перечислены количества клонированных клеток для клеток рака толстой кишки человека НСТ-116, обработанных четырьмя соединениями.

% ингибирования: степень ингибирования

[00129] На ФИГ. 5 изображены степени ингибирования образования клонов клеток для клеток рака толстой кишки человека НСТ-116, обработанных четырьмя соединениями в концентрациях 50 нМ, 150 нМ и 450 нМ.

[00130] Таблица 2 и ФИГ. 5 демонстрируют, что раскрытые соединения обладают существенным ингибирующим воздействием на опухолевые клетки.

[00131] На ФИГ. 6 изображены кривые взаимосвязи «доза-ответ» между степенями ингибирования и концентрациями соединений при обработке клеток рака толстой кишки человека НСТ-116 четырьмя соединениями. Как показано на ФИГ. 6, значение IC50 для D1 составило 245,3 нМ, значение IC50 для D2 составило 226,6 нМ, значение IC50 для D3 составило 99,80 нМ, и значение IC50 для D4 составило 111,7 нМ.

[00132] (Пример применения 2: Воздействие серии соединений на ингибирование опухолевого роста)

[00133] Путем наблюдения за образованием и ростом опухолей на местах высевания и изменением массы тела подопытных животных в данном примере применения проведена оценка ингибирования опухолевого роста ксенотрансплантатов рака толстой кишки НСТ-116 и токсичности разовой интраперитонеальный инъекции соединений D1-D4 для имеющих опухоль толстой кишки НСТ-116 бестимусных мышей.

[00134] 1. Целями исследования являлись оценка ингибирования опухолевого роста ксенотрансплантатов рака толстой кишки человека НСТ-116 и токсичности разовой интраперитонеальный инъекции раскрытых соединений димеров производных цитидина для имеющих опухоль толстой кишки НСТ-116 бестимусных мышей.

[00135] 2. Получение исследуемого вещества

[00136] Источники растворителей, использованных для растворения исследуемого вещества, представляли собой следующие:

[00137] Соответствующее исследуемое соединение взвешивали и помещали в стеклянную пробирку объемом 5 мл, и растворяли в этаноле при перемешивании магнитной мешалкой размером 5 мм. После полного растворения добавляли Кремофор EL при постоянном перемешивании. Непосредственно перед использованием исследуемого соединения добавляли отмеченное количество физиологического солевого раствора и перемешивали. Полученные этанол, Кремофор EL, физиологический солевой раствор имели объемное отношение 5:5:90.

[00138] 3. Животные для исследований.

[00139] Породы и линии: бестимусные мыши Balb/c; статус: свободные от видоспецифических патогенов (SPF); пол: самки.

[00140] Поставщик: Shanghai Sippr/BK Lab Animal Ltd.

[00141] Количество животных: было заказано 40 животных, из которых для проведения исследований были отобраны животные с требуемым состоянием здоровья.

[00142] Номер сертификата соответствия животных: 0123627.

[00143] Возраст животных в начале исследований: от 7 недель до 9 недель.

[00144] Масса животных в начале исследований: от 18 граммов до 22 граммов.

[00145] Продолжительность акклиматизации: от 5 дней до 7 дней.

[00146] Нумерация животных: номером на хвосте.

[00147] Помещение для животных поддерживали при 23±2°C, влажности 40%-70%, с чередующимися по 12 часов темнотой и светом.

[00148] Корм для животных (SLAC-M01) приобретали в Beijing Ке Ао Xie Li Cooperation Limited. Для подопытных животных использовали стерилизованную фильтрованную воду. В процессе проведения исследования животные могли спокойно есть и пить.

[00149] 4. Обеспечение способов проведения исследования.

[00150] 4.1 Опухолевые клетки: клетки рака толстой кишки НСТ-116 были приобретены в Институте клинической биологии Китайской Академии наук. Среда F-12 (содержащая 10% FBS) была использована для культивирования клеток при 37°C с насыщенной влажностью в инкубаторе с диоксидом углерода, содержащим объемные доли 5% CO₂ и 95% воздуха. Перед высеванием собирали клетки в логарифмической фазе роста. После дезагрегации 0,25% трипсином клетки однократно промывали PBS. Клетки ресуспендировали и подсчитывали. Для ресуспендирования использовали бессывороточную среду и доводили концентрацию клеток до 3×10^Λ7 клеток/мл.

[00151] 4.2 Высевание и группировка животных: в стерильных условиях каждой бестимусной мыши подкожно вводили 0,1 мл суспензии клеток в заднюю правую ногу (3×10^Λ6 клеток/мышь). Когда размер опухоли увеличивался до объема приблизительно 60-150 мм³, бестимусных мышей со схожими объемами опухолей и требуемой формой (в основном формой отдельной сферы, без неправильных форм или сгруппированных множественных опухолей) отбирали и группировали, распределяя мышей в каждую группу. Группировка имела следующий вид.

IP: интраперитонеальная инъекция, раз в сут.×1: одна инъекция.

[00152] Мышам в контрольной группе вводили смешанный раствор, включающий этанол, Кремофор EL и нормальный солевой раствор в отношении 5:5:90.

[00153] 4.3 Введение лекарственного средства и наблюдение за животными

[00154] Наблюдали за образованием и ростом опухолей в местах высевания у бестимусных мышей в каждой группе. Измеряли диаметры (D) узлов опухолей трижды в неделю при помощи линейки для измерения окружностей. Кроме того, использовали следующую формулу для расчета объема узла опухоли (V): V=3/4π(D/2)³.

[00155] Критериями оценки противоопухолевой активности являлись степень ингибирования опухолевого роста TGI (%) и степень относительной опухолевой пролиферации Т/С (%).

[00156] Формула расчета TGI была следующей: TGI (%) = (V_{контроля} - V_{лечения})/V_{контроля}) × 100%. Относительный объем опухоли (RTV) рассчитывали следующим образом: RTV=Vt/V0, где V0 представляет собой объем опухоли во время введения группе, и Vt представляет собой объем опухоли во время измерения.

[00157] Формула расчета степени относительной опухолевой пролиферации Т/С (%) была следующей: Т/С (%) = T_RTV/C_RTV × 100%. T_RTV обозначает RTV для группы лечения; и C_RTV обозначает RTV для группы отрицательного контроля. Мышей взвешивали по 3 раза каждую неделю.

[00158] 4.4 Клинические симптомы

[00159] Все клинические симптомы для каждого животного записывали в начале проведения исследований и во время проведения исследований. Наблюдения осуществляли каждый день в одно и то же время.

[00160] После введения исследуемого вещества, когда уменьшение массы составляло более 20%, когда животное умирало или когда объем опухоли превышал 2800 мм³, животное усыпляли посредством применения CO₂. Опухоль отделяли и взвешивали, производили вскрытие и проводили визуальное исследование и запись того, наблюдались ли в органах патологические изменения.

[00161] 4.5 Данные и статистический анализ

[00162] Если не указано иное, экспериментальные данные представлены как среднее ± SEM (средняя ошибка среднего); для сравнения двух групп использовали непарный Т-тест, результат считался значимо отличающимся при P менее 0,05.

[00163] 5. Результаты исследования

[00164] (1) Воздействие исследуемых соединений на массу мышей, имеющих опухоли рака толстой кишки человека НСТ-116

В таблице день означает день; "*" обозначает p менее 0,05 в сравнении с контрольной группой; и "**" обозначает p менее 0,01 в сравнении с контрольной группой.

В таблице день означает день; "*" обозначает p менее 0,05 в сравнении с контрольной группой; и "**" обозначает p менее 0,01 в сравнении с контрольной группой.

[00165] Как указывают данные в вышеприведенных таблицах, после интраперитонеального введения каждого соединения бестимусным мышам с опухолями рака толстой кишки НСТ-116, масса животных группы D1 с дозой 400 мг/кг существенно снизилась на 4 день введения лекарственного средства с устойчивым ростом массы в последующие дни. В период с 14 по 30 день введения масса существенно увеличилась по сравнению с контрольной группой. Между другими группами, подвергавшимися лекарственной терапии, и контрольной группой не было существенных различий.

[00166] (2) Воздействие исследуемых соединений на объем опухоли ксенотрансплантатов рака толстой кишки человека НСТ-116 у имеющих опухоли мышей

"*" обозначает р менее 0,05 в сравнении с контрольной группой; и "**" обозначает р менее 0,01 в сравнении с контрольной группой.

[00167] Как указывают вышеприведенные данные об объемах опухолей в каждой группе, раскрытые димеры производных цитидина существенно ингибировали опухолевый рост.

[00168] (3) Степень ингибирования опухолевого роста (TGI%) для исследуемых соединений в отношении опухолей рака толстой кишки человека НСТ-116 у имеющих опухоли мышей

[00169] Степени ингибирования опухолевого роста (TGI%) для исследуемых соединений в отношении опухолей рака толстой кишки человека НСТ-116 у имеющих опухоли мышей приведены в следующей Таблице 7.

[00170] Степень ингибирования опухолевого роста для группы соединения D1 с дозой 400 мг/кг достигла максимального значения 91,49% на 7 день, составила 72,62% на 16 день, и составила 43,36% на 30 день. Степень ингибирования опухолевого роста для группы соединения D2 с дозой 400 мг/кг достигла максимального значения 94,79% на 9 день, составила 90,63% на 16 день, и составила 67,91% на 30 день. Степень ингибирования опухолевого роста для группы соединения D3 с дозой 350 мг/кг достигла максимального значения 98,54% на 11 день, составила 95,58% на 16 день, и составила 82,93% на 30 день. Степень ингибирования опухолевого роста для группы соединения D4 с дозой 300 мг/кг достигла максимального значения 97,32% на 11 день, составила 92,12% на 16 день и составила 72,14% на 30 день.

[00171] (4) Воздействия исследуемых соединений на относительный объем опухоли (RTV) в отношении опухолей рака толстой кишки человека НСТ-116 у имеющих опухоли мышей

[00172] В Таблице 8 приведены существенные воздействия исследуемых соединений D1-D4 на относительный объем опухоли (RTV) в отношении опухолей рака толстой кишки человека НСТ-116 у имеющих опухоли мышей, где "*" обозначает значение p менее 0,05 в сравнении с контрольной группой, и "**" обозначает значение p менее 0,01 в сравнении с контрольной группой.

"*" обозначает p менее 0,05 в сравнении с контрольной группой; и "**" обозначает p менее 0,01 в сравнении с контрольной группой.

[00173] (5) Воздействия четырех исследуемых соединений на относительную степень опухолевой пролиферации (Т/С %) опухолей рака толстой кишки человека НСТ-116 у имеющих опухоли мышей

[00174] В Таблице 9 показаны воздействия исследуемых соединений на относительную степень опухолевой пролиферации опухолей рака толстой кишки человека НСТ-116 у имеющих опухоли мышей.

[00175] Относительная степень опухолевой пролиферации для группы соединения D1 с дозой 400 мг/кг достигла минимального значения 28,36% на 7 день, и составила 89,47% на 16 день. Относительная степень опухолевой пролиферации для группы соединения D2 с дозой 400 мг/кг достигла минимального значения 14,41% на 9 день, и составила 21,64% на 16 день. Относительная степень опухолевой пролиферации для группы соединения D3 с дозой 350 мг/кг достигла минимального значения 3,41% на 11 день, и составила 10,49% на 16 день. Относительная степень опухолевой пролиферации для группы соединения D4 с дозой 300 мг/кг достигла минимального значения 25,94% на 11 день, и составила 37,96% на 16 день.

[00176] В исследовании ингибирования опухолей серией соединений в отношении ксенотрансплантатов рака толстой кишки человека НСТ-116 у имеющих опухоли бестимусных мышей соединения D2, D3, D4 показали более высокие степени ингибирования ксенотрансплантатов рака толстой кишки человека НСТ-116 у имеющих опухоли бестимусных мышей. После интраперитонеального введения лекарственного средства один раз в сутки до 16 дня наблюдалось существенное ингибирующее воздействие на опухоли в отсутствие очевидного воздействия на массу тела животных, указывая на высокую противоопухолевую активность раскрытых димеров производных цитидина при очень низких токсических побочных эффектах.

Настоящее изобретение относится к димеру производного цитидина формулы (I), его применению для получения противоопухолевого средства, фармацевтическим композициям на его основе и способу его получения, которые могут применяться в медицине и фармацевтической промышленности

(I),

где R1 и R2 независимо представляют собой C₄-алкил или -(CH₂)-Ph; R3 представляет собой водород или C₄-алкоксикарбонил; R4 представляет собой водород или C₄-алкоксикарбонил; R5 представляет собой -(CH₂)_2-3-. Способ включает получение соединений формул (II) и (III), превращение соединения формулы (II) в соединение формулы (IV) и реакцию соединений (IV) и (III) с получением димера формулы (I)

(II)(III)

(IV)

Предложены новые соединения, эффективные для лечения злокачественных солидных опухолей, фармацевтические композиции на их основе и эффективный способ их получения. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 пр., 9 табл., 6 ил.

1. Димер производного цитидина, имеющий общую формулу (I),

(I)

где:

R1 представляет собой C₄ алкил или -(CH₂)-Ph;

R2 представляет собой C₄ алкил или -(CH₂)-Ph;

R3 представляет собой водород или C₄ алкоксикарбонил;

R4 представляет собой водород или C₄ алкоксикарбонил; и

R5 представляет собой -(CH₂)_2-3-.

2. Димер производного цитидина по п. 1, отличающийся тем, что R3 представляет собой водород, и R4 представляет собой водород.

3. Димер производного цитидина по п. 2, отличающийся тем, что R1 и R2 являются одинаковыми.

4. Применение димера производного цитидина по п. 1 для получения лекарственного средства, ингибирующего опухоли.

5. Применение по п. 4, отличающееся тем, что опухоль представляет собой рак крови или злокачественную солидную опухоль.

6. Фармацевтическая композиция для ингибирования опухоли, содержащая димер производного цитидина по п. 1 в качестве активного вещества и один или более лекарственных носителей или эксципиентов.

7. Фармацевтическая композиция п. 6, отличающаяся тем, что форма фармацевтической композиции представляет собой форму для инъекций или форму для перорального приема, где:

форма для перорального приема включает таблетку, порошок, гранулу, капсулу, пеллет, раствор, суспензию, эмульсию, сироп или эликсир; и

форма для инъекций включает раствор для инъекций, суспензию для инъекций, эмульсию для инъекций или стерильный порошок для инъекций.

8. Способ получения димера производного 2’-деокси-2’,2’-дифтор-цитидина по п. 1, включающий следующие стадии:

1) получение соединения общей формулы (II);

(II)

2) получение соединения общей формулы (III);

(III)

3) проведение реакции соединения формулы (II) в системе, включающей 1,4-диоксан и воду, с карбонатом натрия с последующим добавлением (Boc)₂O, после завершения реакции согласно измерениям ТСХ экстрагирование продукта реакции, промывание и сушка, затем концентрирование досуха при пониженном давлении, добавление высушенного соединения к хлороформу с последующим добавлением пиридина и диангидрида R₅(CO)₂O, проведение реакции в течение ночи, концентрирование с получением вязкого масла, очистка масла колоночной хроматографией с получением соединения формулы (IV):

(IV)

(4) смешивание соединения формулы (IV) с соединением формулы (III) и N,N'-дициклогексилкарбодиимидом, добавление полученной смеси к дихлорметану, добавление к полученной смеси 4-диметиламинопиридина, после завершения реакции согласно измерениям ТСХ промывание продукта реакции, сушка и концентрирование досуха, добавление к полученному продукту трифторуксусной кислоты и дихлорметана, перемешивание при комнатной температуре, охлаждение на ледяной бане, отфильтровывание белого твердого вещества и концентрирование фильтрата с получением вязкого масла, очистка масла колоночной хроматографией с получением димера производного 2’-деокси-2’,2’-дифтор-цитидина, где значения R1, R2, R5 соответствуют указанным в п. 1.