Штамм Streptomyces tendae - продуцент противобактериального антибиотика ИНА 5812 Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12P1/06 A61P31/04 C12R1/465 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к медицине и биотехнологической промышленности и касается нового штамма актиномицета, образующего противобактериальный антибиотик ИНА 5812.

Антибиотик ИНА S812 по химическому строению является новым природным линейно-циклическим гликопептидным соединением, обладающим высокими показателями антибактериальной активности в отношении грамположительных патогенов in vitro и химиотерапевтической эффективностью в лабораторных опытах in vivo при лечении стафилококкового сепсиса у белых мышей.

Предшествующий уровень техники

Известен штамм Streptomyces roseoflavous ИНА-Ас-5812 - продуцент антибиотика ИНА 5812 (1), принятый в качестве прототипа. Недостатком данного штамма является низкая антибиотическая активность - 10 мкг в 1 мл ферментационной жидкости.

Раскрытие изобретения

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент антибиотика ИНА 5812 путем селекционного преобразования свойств почвенной культуры Streptomyces tendae (2) в результате последовательного многоступенчатого воздействия физических (УФ-, гамма-лучи ⁶⁰Со) и химических (N-нитрозосоединения) мутагенов на споры исходной культуры и отбора высокоактивного мутантного штамма №3117 среди мутагенизированной популяции колоний актиномицета, выросших на селективном фоне устойчивости к гликопептидным антибиотикам ристомицину, эремомицину и блеомицину.

Полученный новый штамм Streptomyces tendae №3117 принят на национальное патентное депонирование в коллекции культур БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт»-ГосНИИгенетика под номером штамм ВКПМ Ас-1980.

Штамм Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 обладает повышенной антибиотической активностью образования антибиотика ИНА 5812 (2500 мкг в 1 мл ферментационной жидкости) и характеризуется следующими таксономическими, культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Таксономические, культурально-морфологические и физиологические признаки штамма Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980

Таксономические признаки. Длительность выращивания для изучения таксономических признаков (7-21) суток при температуре 28°С. Для засева диагностических сред используется споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глицерин-ниратном агаре Линденбайна или на среде №2 Гаузе. Цвет определен по таблицам Бондарцева и Праузера.

Данные приведены в таблице №1.

Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия извилистые, цепочки спор извитые с редкими спиралями, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С, оптимум роста 28°С и в диапазонах значений рН (5,0-10,0) оптимум роста при рН 7,0. Желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом.

Использование источников углерода. При росте на средах с неорганическим источником азота хорошо утилизирует глюкозу, фруктозу, мальтозу; умеренно - сахарозу, арабинозу, лактозу; слабо использует сорбат, манит, раффинозу; не использует целлюлозу.

Антагонистические свойства. Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 при испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре №2 Гаузе подавляет рост грамположительных бактерий и дрожжеподобных грибов и не действует на грамотрицательные бактерии. Штамм фагоустойчив. Фаг в культуре отсутствует.

Хранение штамма. Штамм Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом.

Определение антибиотической активности в ферментационной жидкости

Антибиотическая активность штамма Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 при глубинном культивирвании определяется луночным методом диффузии в агар (среда №2 Гаузе) с использованием в качестве теста микроорганизма Bacillus subtilis АТСС6633 и сравнением диаметров зон подавления бактериального роста образцами ферментационной жидкости с калибровочной кривой стандарта субстанции антибиотика ИНА 5812 (6,25-50 мкг/мл). Биологическая активность получаемой биосинтезом и химически очищенной субстанции антибиотика определяется трехдозным вариантом метода (ГФХ, стр. 949).

Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 поясняется следующим примером.

Пример. Для получения спорового материала культуру Streptomyces tendae штамм ВКПМ Ас-1980 выращивают в течение 7 суток при 37°С на агаровой среде №2 Гаузе следующего состава, %

Триптон 0,3

Глюкоза 1,0

Пептон 0,5

Агар 3,0

NaCl 0,5

Вода водопроводная рН до стерилизации 7,0-7,2

Среда стерилизуется в течение 30 мин при давлении 0,6 атм и температуре 120°С.

Споровым материалом с мицелием засевают посевную жидкую питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) и культивируют при 28°С в течение 24-48 часов на круговой качалке со скоростью вращения 220-240 об/мин. Выросшим посевным мицелием засевают ферментационную питательную среду (100 мл колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) следующего состава, %:

Соевая мука 3,0

Глюкоза 3,0

NaCl 0,3

CaCo₃ 0,3

Вода водопроводная

рН до стерилизации 7,0-7,2

Стерилизация течение 30 мин при давлении 0,6 атм и температуре 120°С.

Количество посевного материала для инокуляции - (5-7)%

Ферментационное культивирование проводят при 28°С в течение 144 час на круговой качалке (скорость вращения 220-240 об/мин). Антибиотик ИНА 5812 накапливается в культуральной жидкости продуцента. Антибиотически активность штамма Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980, определенная биологическим методом диффузии в агар, составляет к окончанию ферментации 2500 мкг/мл. Выделение антибиотика проводят сорбционным методом, описанным в патенте РФ (1).

Таким образом, получен новый мутантный штамм Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980, отличающийся от известного по способности антибиотикообразования, которая в 200 раз превосходит активность продуцента-прототипа Streptomyces roseoflavus ИНА Ас-5812. (Таблица 2).

Использование нового штамма Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 позволит значительно увеличить выход целевого продукта для детального и всестороннего экспериментального изучения его физико-химических и химиотерапевтических свойств.

Источники информации

1. Патент RU 2572341 от 11.2015 г.

2. Г.Ф. Гаузе, Т.П. Преображенская, М.А. Свешникова и др., «Определение актиномицетов», М., 1983, стр. 42.

(+++) - хороший; (++) - умеренный; (+) - слабый

Изобретение может быть использовано в биотехнологии для производства противобактериального антибиотика ИНА 5812. Антибиотик ИНА 5812 по химическому строению является оригинальным линейно-циклическим гликопептидным соединением, активным в отношении грамположительных патогенов in vitro и высокоэффективным в опытах in vivo при экспериментальном лечении стафилококкового сепсиса у белых мышей. Предлагается новый штамм - продуцент антибиотика ИНА 55812 путем селекционного преобразования свойств почвенной культуры Streptomyces tendae. Штамм депонирован в коллекции культур БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт»-ГосНИИгенетика под номером ВКПМ Ас-1980. Штамм Streptomyces tendae ВКПМ Ас-1980 обладает повышенной антибиотической активностью и при глубинном культивировании накапливает 2500 мкг/мл противобактериального антибиотика ИНА 5812. 2 табл., 1 пр.

Штамм Streptomyces tendae ВКПМ Ac-1980 - продуцент противобактериального антибиотика ИНА 5812.