СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2019 года по МПК A61K36/49 B01D11/02 A61P31/10 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности, к производству лекарственных средств в виде субстанций и индивидуальных биологически активных соединений и касается способа получения 7-О-метилкемпферола (рамноцитрина) из почек каштана конского обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.).

В настоящее время в мировой практике применяются семена и листья каштана конского обыкновенного, однако перспективным видом лекарственного растительного сырья являются почки растения ввиду их богатого химического состава (1).

Известен способ выделения 7-О-метилкемпферола из сырья ретамы обыкновенной (Retama raetam (Forssk.) Webb & Berthel) (2). Согласно данной методике проводится: измельчение пробы воздушно-сухого сырья (4 кг) травы ретамы обыкновенной, экстрагирование теплым этанолом (80%) и отгонка растворителя с помощью роторного испарителя. Упаренный экстракт (398 г) подвергается хроматографическому исследованию и определению биологической активности. Экстракт хроматографируется на колонке (6×70 см) с силикагелем с использованием элюента состава бензол : этилацетат, 9:1 с получением 100 фракций. Фракция номер 93 очищается колоночной флэш-хроматографией на сефадексе с использованием абсолютного этанола в качестве элюента и получением на выходе целевого соединения 7-О-метилкемпферола в количестве 17 мг.

Данный метод взят нами в качестве прототипа. Недостатками этого метода являются низкий выход целевого вещества - 7-О-метилкемпферола (17 мг, что составляет 0,000425% от массы воздушно-сухого сырья), продолжительность и многостадийность хроматографической очистки с использованием различных сорбентов и элюента, представляющего собой смесь сложных систем растворителей.

Таким образом, технической задачей изобретения является обеспечение возможности повышения выхода целевого вещества (7-О-метилкемпферола) и подтверждение его противогрибковой активности.

Технический результат достигается тем, извлечение из воздушно-сухого растительного сырья проводят с использованием хлороформа в аппарате Сокслета в соотношении сырье : экстрагент 1:3, последующее выделение целевого вещества из сгущенного хлороформного извлечения осуществляют методом колоночной хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента смесь хлороформа и этилового спирта в соотношении 99:1 объемом 1,5 л, а дальнейшую очистку целевого вещества осуществляют путем перекристаллизации упаренных под вакуумом элюатов, содержащих 7-О-метилкемпферол, смесью хлороформа и этилового спирта.

Способ реализуется следующим образом. Измельченные воздушно-сухие почки каштана конского обыкновенного (100,0 г) экстрагируют хлороформом в аппарате Сокслета в соотношении сырье : экстрагент 1:3 до полного истощения сырья. Хлороформное извлечение упаривают под вакуумом до густого остатка (около 100 мл), полученный упаренный экстракт смешивают с 50 г силикагеля (Silicagel L 100/160), высушивают и вносят на колонку (8×10 см), заполненную силикагелем в виде взвеси в хлороформе. Целевое вещество элюируют смесью хлороформ-этиловый спирт в соотношении 99:1 (1,5 л). Контроль за разделением веществ осуществляют хроматографированием на пластинках "Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ-254" в системе растворителей н-бутанол: уксусная кислота : вода 4:1:2. Содержащий 7-О-метилкемпферол элюат подвергают очистке методом перекристаллизации смесью хлороформа с этанолом. Полученный осадок представляет собой готовый продукт (7-О-метилкемпферол) с выходом 1,5% от массы воздушно-сухого сырья.

Предлагаемый способ поясняется следующим примером.

Воздушно-сухие почки каштана конского обыкновенного (100,0 г) измельчают, экстрагируют хлороформом в аппарате Сокслета в соотношении 3:1 к массе воздушно-сырья до полного истощения сырья. Хлороформное извлечение упаривают под вакуумом до густого остатка (около 100 мл), полученный упаренный экстракт смешивают с 50 г силикагеля (Silicagel L 100/160), высушивают и вносят на колонку (8×10 см), заполненную силикагелем в виде взвеси в хлороформе. Целевое вещество элюируют смесью хлороформ-этиловый спирт в соотношении 99:1 (1,5 л). Контроль за разделением веществ осуществляют хроматографированием на пластинках "Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ-254" в системе растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода 4:1:2. Элюат подвергают очистке методом перекристаллизации смесью хлороформа с этанолом. Полученный осадок представляет собой готовый продукт (7-О-метилкемпферол) с выходом 1,5 г, что составляет 1,5% от массы воздушно-сухого сырья.

Химическая структура 7-О-метилкемпферола представлена в Приложении 1 на фигуре 1.

Спектральные и физико-химические свойства 7-О-метилкемпферола. Желтый кристаллический порошок состава С₁₆Н₁₂О₆ (молекулярная масса 300 а.е.м.) с т.пл. 226-228°С; УФ- спектр: λ_max^EtOH - 272 и 334 нм.

¹Н-ЯМР спектр (300 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д., J/Гц): 12,48. (с, 1Н, 5-ОН), 10.12 (с, 1Н, 4¹-ОН), 9.50 (с, 1Н, 3-ОН), 8.07 (д, 2Н, 9 Гц, H-2¹,6¹), 6.95 (д, 2Н, 9 Гц, Н-3¹,5¹), 6.75 (д, 1Н, 2.5 Гц, Н-8), 6.34 (д, 1Н, 2.5 Гц, Н-6), 3.87 (с, 3Н, СН₃О).

¹³С-ЯМР спектр (50 МГц, ДМСО-d₆, δ_С, м.д.): С-4 (176,01), С-2 (164,89), С-7 (160,36), С-4¹ (159,31, С-5 (156,09), С-9 (136,95), С-2¹ (130,18), С-6¹ (129,56), С-1¹ (121,57), С-3¹ (115,64), С-5¹ (115,44), СН₃О (55,99).

Масс-спектр спектр (ESI-MS, 180°С, m/z): М⁺ 301 (300+Н), М⁺ 339 (300+K).

7-О-метилкемпферол, полученный разработанным способом, исследовали на наличие противомикробной активности.

Наличие противомикробной активности определяли на лабораторных штаммах Candida albicans (СР. Robin). Определение минимальной ингибирующей концентрации проводили методом двойных серийных разведений в бульоне в соответствии с МУ 4.2.1890-04 (3). Учет результатов анализа осуществляли через 48-72 часа после инкубации при температуре 37°С. При этом проводили визуальнуя оценку задержки роста. Из лунок с видимой задержкой роста осуществляли высев на питательные среды (5% кровяной агар-агар), через 24 часа отсутствие роста оценивали как фунгицидный эффект, а появление видимого роста, но с его задержкой - как фунгистатический.

Результаты исследования показали выраженную противогрибковую активность. Вплоть до разведения 1:256 включительно наблюдается фунгицидное действие, при дальнейшем разведении рост культуры возобновляется.

Таким образом, предлагаемый способ получения 7-О-метилкемпферола (рамноцитрина) из почек каштана конского обыкновенного методом колоночной хроматографии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:

1. Разработанный способ позволяет получать более высокий выход вещества 7-О-метилкемпферола - 1,5% вместо 0,000425% у прототипа, то есть в 3500 раз выше по сравнению с прототипом.

2. Разработанный способ менее трудоемок, поскольку включает однократную хроматографическую очистку на силикагеле с использованием элюента, представляющего собой смесь двух растворителей (хлороформ и этиловый спирт) вместо двухкратной хроматографической очистки в прототипе с использованием различных сорбентов и элюента, представляющего собой смесь сложных систем растворителей. Следовательно, заявленный способ включает 5 стадий в отличие от прототипа, в котором реализуется выделение целевого вещества в 8 этапов.

3. Целевой продукт (7-О-метилкемпферол), полученный разработанным способом, обладает выраженной противогрибковой активностью.

Разработанный способ может применяться в химико-фармацевтической промышленности для получения субстанций для производства лекарственных препаратов с противогрибковым действием.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Куцик, Р.В. Каштан конский (Aesculus hippocastanum L.). Аналитический обзор / Р.В. Куцик, Б.М. Зузук, В.В. Дьячок // Провизор. - 2002. - №4. - С. 12-18.

2. Albalawi, М. A. D. Isolation of Rhamnocitrin Insezcticide from Retamaraetam via Shephadex LH-20 / M. A. D. Albalawi // IOSR Journal of Applied Chemistry. - 2016. - Vol. 9. - p. 70-74.

3. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. МУК 4.2.1890-04 // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2004. - Т. 6, №4. - С. 306-359.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения вещества, обладающего противогрибковой активностью. Способ получения вещества, обладающего противогрибковой активностью, представляющего собой 7-О-метилкемпферол, путем подготовки лекарственного растительного сырья - почек каштана конского обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.), экстрагирования сырья органическими растворителями, упаривания и хроматографической очистки, при этом извлечение из воздушно-сухого растительного сырья проводят с использованием хлороформа в аппарате Сокслета в соотношении сырье : экстрагент 1:3, последующее выделение целевого вещества из сгущенного хлороформного извлечения осуществляют методом колоночной хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента смесь хлороформа и этилового спирта в соотношении 99:1 объемом 1,5 л, а дальнейшую очистку целевого вещества осуществляют путем перекристаллизации упаренных под вакуумом элюатов, содержащих 7-О-метилкемпферол, смесью хлороформа и этилового спирта. Вышеописанный способ позволяет получить высокий выход вещества 7-О-метилкемпферола - 1,5% от массы исходного воздушно-сухого сырья. 1 ил.

Способ получения вещества, обладающего противогрибковой активностью, путем подготовки лекарственного растительного сырья - почек каштана конского обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.), экстрагирования сырья органическими растворителями, упаривания и хроматографической очистки, отличающийся тем, что извлечение из воздушно-сухого растительного сырья проводят с использованием хлороформа в аппарате Сокслета в соотношении сырье : экстрагент 1:3, последующее выделение целевого вещества из сгущенного хлороформного извлечения осуществляют методом колоночной хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента смесь хлороформа и этилового спирта в соотношении 99:1 объемом 1,5 л, а дальнейшую очистку целевого вещества осуществляют путем перекристаллизации упаренных под вакуумом элюатов, содержащих 7-О-метилкемпферол, смесью хлороформа и этилового спирта.