ПРОТИВОРАКОВАЯ АКТИВНОСТЬ (Е)-1-(3',4'-ДИМЕТОКСИФЕНИЛ)БУТАДИЕНА Российский патент 2019 года по МПК A61K36/16 A61P35/00 

Перекрестная ссылка на родственную патентную заявку

Настоящий документ представляет собой международную заявку РСТ, испрашивающую приоритет относительно предварительной заявки на патент США №62275847, поданной 07 января 2016 года.

Предпосылки создания изобретения

[001] Область изобретения

[002] Изобретение в целом относится к лечению рака. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способности (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиена [DMPBD] проявлять противоопухолевую и антиметастатическую активность.

[003] Описание предшествующего уровня техники

[004] Известно, что хроническое воспаление увеличивает риск развития рака и устранение воспаления снижает риск развития рака. Следовательно, противовоспалительные средства рекомендуется использовать в тандеме (в качестве адъювантов) с химиотерапевтическими средствами, причем эти противовоспалительные средства проявляют активность при помощи снижения токсичности, связанной с химиотерапией, при помощи изменения фармакокинетики химиотерапии, что приводит к лучшей эффективности и должной ликвидации, а также при помощи сенсибилизации раковых клеток к самой химиотерапии (Elizabeth R. Rayburn et al,"Anti-inflammatory agents for cancer chemotherapy", Mol Cell Pharmacol. 2009; 1 (1): 29-43). Из предшествующего уровня техники известно также, что противовоспалительные вещества также могут оказывать противораковый эффект. Например, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAIDS) индуцируют апоптоз в различных раковых клетках. Несмотря на многие предлагаемые механизмы противоракового эффекта NSAIDS, включая ингибирование циклооксигеназы, ингибирование активных форм кислорода и опосредованное NF-кВ ингибирование сигнала, остается неопределенным, как они индуцируют остановку клеточного цикла и апоптоз в раковых клетках. Другими словами, существует мало информации о селективности противоракового эффекта, опосредованного противовоспалительным средством, хотя эта информация очень важна для успешной противораковой терапии и будущих лечебных достижений в области лечения рака (М. Adachi et al, "Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and oxidative stress in cancer cells", Histol Histopathol (2007) 22: 437-442). Таким образом, предсказание прямого эффекта таких противовоспалительных молекул при росте или метастазировании рака затруднено (Laurie Е Walker, "NSAIDS as anticancer drugs", в кратком врачебном обзоре) и нуждается в значительной научной оценке. Противовоспалительные свойства (Е)-1-(3,4-диметоксифенил)бутадиена (DMPBD) хорошо известны из предшествующего уровня техники (Jeenapongsa et al, "Antiinflammatory activity of (E)-1-(3,4-dimethoxyphenyl) butadiene from Zingiber cassumunar Roxb.", J Ethnopharmacol. 2003 Aug;87(2-3):143-8). Кроме того, эффективность трансдимера DMPBD, а именно (+/-) транс-3-(3',4'-диметоксифенил)-4-[(Е)-3''',4'''-диметокси-стирил]циклогекс-1-ена обсуждается в терминах его антипролиферативного эффекта при раке легких (Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2015; 4 (1): 01-06).

[005] Авторы настоящего изобретения впервые демонстрируют зависимость концентрации (Е)-1-(3,4-диметоксифенил)бутадиена с противоопухолевой активностью in vitro от линий раковых клеток PANC-1 (карцинома поджелудочной железы), DU-145 (карцинома предстательной железы) и SKOV3 (карцинома яичника) с помощью анализов пролиферации клеток. Кроме того, уникальная способность DMPBD приводить к существенному уменьшению фолдинга при экспрессии молекул клеточной адгезии (Р-селектин, Е-селектин и L-селектин), которые оцениваются с помощью исследований проточной цитометрии клеток на карциноме поджелудочной железы, указывает на специфическую функцию молекулы как антиметастатического средства. Важные документы предшествующего уровня техники, подчеркивающие роль селектинов при метастазировании опухолей, включают

a. Н. Laubli et al, "Selectins promote tumor metastasis", Semin Cancer Biol. 2010 Jun; 20 (3): 169-77;

b. Hariri. G et al, "Radiation guided P-selectin antibody targeted to lung cancer", Ann Biomed Eng. 2008 May; 36 (5): 821-830;

c. Chen M et al, "P-selectin mediates adhesion of leucocytes, platelets and cancer cells in inflammation, thrombosis, cancer growth and metastasis", Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2006 Mar-Apr; 54 (2): 75-84; и

d. Okegawa T et al, "The role of cell adhesion molecule in cancer progression and its application in cancer therapy", Acta Biochim Pol. 2004; 51 (2): 445-57.

[006] Эти научные разработки являются важными, учитывая, что цель лечения рака зависит от

1. специфичности химиотерапевтического средства к конкретному типу рака; и

2. двойной эффективности указанного средства в предотвращении чрезмерной клеточной пролиферации, а также метастазирования опухолей.

[007] Предложенные в настоящем изобретении признаки настоящего изобретения, как выявлено выше, явно выполняют вышеуказанные цели, демонстрируя противоканцерогенную специфичность DMPBD для карциномы поджелудочной железы, яичников и предстательной железы, а также способность DMPBD предотвращать распространение или метастазирование этих или других карцином при помощи ингибирования молекул клеточной адгезии Р-селектина, Е-селектина и L-селектина, тем самым предоставляя новую и неочевидную техническую информацию, полезную для химиотерапии рака поджелудочной железы, яичников и предстательной железы и предотвращения метастазирования.

Краткое описание изобретения

[008] Настоящее изобретение относится к противоопухолевым и антиметастатическим свойствам (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиена [DMPBD]. В частности, изобретение описывает противоопухолевые свойства DMPBD против карциномы поджелудочной железы, карциномы предстательной железы и карциномы яичников. Кроме того, в изобретении также описывается способность DMPBD вызывать значительное снижение фолдинга в экспрессии молекул клеточной адгезии (Р-селектин, Е-селектин и L-селектин), которое оценивается с помощью исследований клеток карциномы поджелудочной железы с проточной цитометрией. В последних исследованиях описана антиметастатическая способность DMPBD.

[009] Преимущества настоящего изобретения включают описание противоопухолевой специфичности DMPBD для карциномы поджелудочной железы, яичников и предстательной железы, а также способности DMPBD предотвращать распространение или метастазирование при помощи ингибирования молекул клеточной адгезии Р-селектина, Е-селектина и L-селектина.

[010] Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего более подробного описания, взятого в сочетании с сопроводительными изображениями, которые иллюстрируют, в качестве примера, принцип изобретения.

Краткое описание чертежей

[0011] На Фиг. 1 показан эффект DMPBD на снижение экспрессии адгезионной молекулы Е-селектина (CD 62Е).

[0012] На Фиг. 2 показан эффект DMPBD на снижение экспрессии адгезионной молекулы Р-селектина (CD 62Р).

[0013] На Фиг. 3 показан эффект DMPBD на снижение экспрессии адгезионной молекулы L-селектина (CD 62L).

Описание наиболее предпочтительных вариантов осуществления

(Фиг. 1, Фиг. 2 и Фиг. 3)

[0014] В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индуцирования противоопухолевого эффекта на раковые клетки человека, причем указанный способ включает стадию обработки указанных раковых клеток эффективным количеством (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиена. В предпочтительных вариантах осуществления указанные раковые клетки человека выбраны из группы, состоящей из клеток карциномы предстательной железы, клеток карциномы яичника и клеток карциномы поджелудочной железы.

[0015] В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования развития и метастазирования раковых клеток человека, причем указанный способ включает стадию обработки указанных раковых клеток эффективным количеством (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиена для обеспечения эффекта значительного уменьшения экспрессии молекулы клеточной адгезии, тем самым препятствуя развитию и метастазированию рака. В предпочтительных вариантах осуществлении молекулы клеточной адгезии выбирают из группы, состоящей из Р-селектина, Е-селектина и L-селектина.

[0016] В других наиболее предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к:

1. (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиену для применения в способе лечения панкреатической карциномы.

2. (Е)-1-(3',4'-Диметоксифенил)бутадиену для применения в способе лечения карциномы яичников.

3. (Е)-1-(3',4'-Диметоксифенил)бутадиену для применения в способе лечения рака предстательной железы.

4. (Е)-1-(3',4'-Диметоксифенил)бутадиену для применения в лечении метастазирования рака, где (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиен останавливает метастазирование при помощи ингибирования экспрессии молекул клеточной адгезии, выбранных из группы, состоящей из Р-селектина, Е-селектина и L-селектина.

5. Композиции, содержащие (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиен в эффективных количествах для использования в способе лечения карциномы поджелудочной железы.

6. Композициям, содержащим (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиен в эффективных количествах для применения в способе лечения карциномы яичников.

7. Композициям, содержащим (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиен в эффективных количествах для применения в способе лечения рака предстательной железы.

8. Композициям, содержащим (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиен в эффективных количествах для применения в способе остановки метастазирования рака при помощи ингибирования экспрессии молекул клеточной адгезии, выбранных из группы, состоящей из Р-селектина, Е-селектина и L-селектина.

9. Использованию (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиен в эффективных количествах для изготовления лекарственного средства для использования в лечении карциномы поджелудочной железы.

10. Использованию (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиен в эффективных количествах для изготовления лекарственного средства для использования в лечении карциномы яичников.

11. Использованию (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиен в эффективных количествах для изготовления лекарственного средства для использования при лечении рака предстательной железы.

12. Использованию (Е)-1-(3',4'-Диметоксифенил)бутадиен в эффективных количествах для изготовления лекарственного средства для использования для остановке метастазирования рака при помощи ингибирования экспрессии молекул клеточной адгезии, выбранных из группы, состоящей из Р- селектина, Е-селектина и L-селектина.

[0017] Конкретные иллюстративные примеры, излагающие наиболее предпочтительные варианты осуществления, включены ниже.

[0018] Пример 1: Противоопухолевый эффект DMPBD на клеточные линии рака человека in vitro

[0019] Клеточная линия рака поджелудочной железы человека PANC-1 (клетки карциномы поджелудочной железы), клеточная линия рака предстательной железы человека DU145 (карцинома предстательной железы) и клеточная линия рака яичника SKOV3 (карцинома яичника) выращивали и культивировали с использованием стандартных протоколов, известных в данной области. Линии раковых клеток обрабатывали DMPBD в различных концентрациях для измерения цитотоксичности. Оценку анализа жизнеспособности клеток проводили методом колориметрического анализа МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида). Анализ МТТ измеряет скорость пролиферации клеток и, наоборот, когда метаболические события приводят к апоптозу или некрозу, снижение жизнеспособности клеток. Данные анализируют при помощи наложения числа клеток в зависимости от абсорбции, что позволяет количественно определять изменения в пролиферации клеток. Скорость восстановления тетразолия пропорциональна скорости пролиферации клеток.

[0020] Расчет:

[0021] Цитотоксичность образца выражается как значение IC₅₀, концентрация, которая ингибирует рост клеток на 50%.

% Цитотоксичности=(Е - Т / Е) X 100

где,

Е=жизнеспособность клеток в отсутствие образца

Т=жизнеспособность клеток в присутствии образца

[0022] Анализ МТТ, который выполняли, был адаптирован по (1) Tim Mosmann. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Immunological Methods, 65 (1983) 55-63; (2) A.A. van de Loosdrecht, R.H.J. Beelen, G.J. Ossenkoppele, M.G. Broekhoven, M.M.A.C. Langenhuijsen. A tetrazolium-based colorimetric MTT assay to quantitate human monocyte mediated cytotoxicity against leukemic cells from cell lines and patients with acute myeloid leukemia. Journal of Immunological Methods 174 (1994) 311-320 и Denis Gerlier и Nicole Thomasset. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Journal of Immunological Methods, 94 (1986) 57-63.

[0023] РЕЗУЛЬТАТЫ

[0024] Пример 2. Эффект DMPBD на экспрессию адгезионных молекул Е-селектина, Р-селектина и L-селектина (антиметастатическое действие DMPBD). Иллюстративный пример на клетках карциномы поджелудочной железы (Фиг. 1, Фиг. 2 и Фиг. 3).

[0025] Клетки карциномы поджелудочной железы сеяли на чашках Петри. Сливаемые культуры собирали трипсинизацией и увеличивали из количество в течение еще двух пассажей перед использованием в экспериментах. Среду и другие компоненты культуры возобновляли через 48 - 72 ч. Все культуры клеток поддерживали при 37°С в 95%-ном воздухе и 5% CO2 в CO2-инкубаторе. 10 нг/мл рекомбинантного TNF-альфа и IL-1бета человека добавляли к культуре клеток. DMPBD добавляли при градуированной концентрации. Через 72 часа клетки инкубировали с конкретными антителами РЕ меченными CD 62Е; FITC меченными CD 62Р и РЕ меченными CD 62L в разных наборах в течение 5 часов. Затем клетки трипсинизировали и получали на проточном цитометре для анализа эффекта DMPBD. Анализ методом проточной цитометрии адаптировали по (1) Curvers J, de Wildt-Eggen J, Heeremans J, Scharenberg J, de Korte D, van der Meer PF. Flow cytometric measurement of CD62P (P-selectin) expression on platelets: a multicenter optimization and standardization effort. Transfusion. 2008. 48(7): 1439-46, (2) Choi YW. Kim HJ. Park SS. Chung HW. Lee SO. Oh BS. Kim JB. Kim HY. Chung BP. Yu CD. Kim SY. Inhibition of endothelial cell adhension by the new anti-inflammatory agent alpha-iso-cubebene. Vascul Pharmacol. 2009;51:215-224 и (3) Yen YT, Liao F, Hsiao CH, Kao CL, Chen YC, Wu-Hsieh BA. Modeling the early events of severe acute respiratory syndrome coronavirus infection in vitro. J Virol. 2006 Mar;80(6):2684-93.

[0026] DMPBD, используемый в вышеупомянутых экспериментах, был получен из корневищ Zingiber cassumunar при помощи запатентованного способа, стадии которого выделены ниже.

1. Поглощенный материал корневища Z. cassumunar экстрагировали метанолом (4 об. X 4) при постоянном перемешивании при 60 - 70°С. Метанольный экстракт объединяли и концентрировали.

2. Концентрат со стадии 1 затем промывали гексаном (4 об. X 4) при 55 - 60°С и полученный продукт (гексановый экстракт) объединяли и концентрировали.

3. Гексановый экстракт со стадии 2 затем растворяли в метаноле и смешивали с γ-циклодекстрином в соотношении 2:3 с надлежащим кипячением с обратным холодильником и высушивали в вакууме при 55 - 60°С с получением 90% водорастворимого конечного продукта с выходом 7,79% и анализом DMPBD 10,73% и анализом DMPB-1-ена 0,44%.

[0027] Хотя изобретение было описано со ссылкой на предпочтительный вариант осуществления, специалистам в данной области понятно, что изобретение не ограничено описанным. Скорее объем изобретения должен интерпретироваться только в сочетании с прилагаемой формулой изобретения.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и касается применения (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиена в качестве противоракового средства в эксперименте. Для этого осуществляют воздействие указанным соединением на клетки карциномы предстательной железы, карциномы яичника и карциномы поджелудочной железы. Такое воздействие обеспечивает индуцирование противоопухолевого эффекта при всех указанных видах рака, а также предотвращение метастазирования за счет воздействия на адгезивные молекулы селектинов. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 пр., 1 табл., 3 ил.

1. Способ индуцирования противоопухолевого действия на раковые клетки человека, где указанный способ включает стадию обработки указанных раковых клеток эффективным количеством (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиена.

2. Способ по п. 1, где указанные раковые клетки человека выбраны из группы, состоящей из клеток карциномы предстательной железы, клеток карциномы яичника и клеток карциномы поджелудочной железы.

3. Способ ингибирования развития раковых клеток человека, где указанный способ включает стадию обработки указанных раковых клеток эффективным количеством (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиена для обеспечения эффекта значительного снижения экспрессии молекулы клеточной адгезии, ингибируя таким образом развитие и метастазирование рака.

4. Способ по п. 3, где молекула клеточной адгезии выбрана из группы, состоящей из Р-селектина, Е-селектина и L-селектина.

5. Применение (Е)-1-(3',4'-диметоксифенил)бутадиена для ингибирования метастазирования раковых клеток человека.