ПРОИЗВОДНЫЕ АМАТОКСИНА Российский патент 2019 года по МПК C07K7/64 A61K47/55 A61K47/64 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Изобретение относится к лечению опухолей. В одном аспекте настоящее изобретение относится к конъюгатам аматоксина и мишень-связывающего фрагмента, например, антитела, связанных определенными связями, которые являются применимыми в лечении рака и других расстройств и заболеваний. В дополнительном аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим указанные конъюгаты.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Аматоксины представляют собой циклические пептиды, состоящие из 8 аминокислот. Они могут, например, быть выделены из грибов Amanita phalloides или получены синтетически. Аматоксины специфически ингибируют ДНК-зависимую РНК полимеразу II клеток млекопитающих, и посредством этого также транскрипцию и биосинтез белка пораженных клеток. Ингибирование транскрипции в клетках вызывает остановку роста и пролиферации. При отсутствии ковалентной связи комплекс между аманитином и РНК полимеразой II является очень тесным (KД=3 нМ). Диссоциация аманитина из фермента представляет собой очень медленный процесс, таким образом делая восстановление пораженных клеток маловероятным. Когда ингибирование транскрипции продолжается слишком долго, клетки подвергаются программируемой клеточной смерти (апоптозу).

[0003] Применение аматоксинов в качестве цитотоксических фрагментов для лечения опухолей уже изучали в 1981 году путем связывания анти-Thy 1.2 антитела с α-аманитином с использованием линкера, прикрепленного к индоловому циклу Trp (аминокислота 4; смотрите фиг.1) посредством диазотирования (Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388). Davis & Preston идентифицировали участок прикрепления как положение 7'. Morris & Venton также продемонстрировали, что замещение в положении 7' дает производное, которое сохраняет цитотоксическую активность (Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res 1983, 21 419-430).

[0004] В патентной заявке EP 1859811 A1 (опубликованной 28 ноября 2007 г.) описаны конъюгаты, в которых γ C-атом аматоксина аминокислоты 1 β-аманитина был непосредственно связан, т.е. без линкерной структуры, с альбумином или моноклональным антителом HEA125, OKT3 или PA-1. Более того, показан ингибирующий эффект указанных конъюгатов в отношении пролиферации клеток рака молочной железы (MCF-7), клеток лимфомы Беркитта (Raji) и клеток Т лимфомы (Jurkat). Предполагали применение линкеров, включая линкеры, содержащие элементы, такие как амид, сложный эфир, простой эфир, тиоэфир, дисульфид, мочевина, тиомочевина, углеводородный фрагмент и подобные, но такие конструкты реально не были показаны и не было представлено больше подробностей, таких как места прикрепления на аматоксинах.

[0005] В патентных заявках WO 2010/115629 и WO 2010/115630 (обе опубликованные 14 октября 2010 г.) описаны конъюгаты, где антитела, такие как анти-EpCAM антитела, такие как гуманизированные huHEA125, связаны с аматоксинами посредством (i) γ C-атома аминокислоты 1 аматоксина, (ii) 6' C-атома аминокислоты 4 аматоксина, или (iii) посредством аминокислоты 3 δ C-атома аматоксина, в каждом случае или непосредственно или посредством линкера между антителом и аматоксинами. Предполагаемые линкеры включают элементы, такие как сложный эфир, простой эфир, уретан, пептидная связь и подобные. Более того, показаны ингибирующие эффекты таких конъюгатов в отношении пролиферации клеток рака молочной железы (клеточная линия MCF-7), карциномы поджелудочной железы (клеточная линия Colo205) и холангиокарциномы (клеточная линия OZ).

[0006] Взаимоотношения структурной активности аматоксинов обсуждаются у Wieland (T. Wieland, Peptides of Poisonous Amanita Mushrooms, Springer series in molecular biology, Springer Verlag New York, 1986). Гидроксильная группа аминокислоты 2 (гидроксипролин) и γ-гидроксигруппа аминокислоты 3 (дигидроксиизолейцин) расцениваются как необходимые для активности, тогда как функциональные группы на аминокислоте 1 (аспартат или аспарагин), аминокислоте 4 (6-гидрокситриптофан) и δ-гидроксигруппа на аминокислоте 3 более стойки к химической модификации. Это показывает, что последние положения являются предпочтительными сайтами для прикрепления линкеров, тогда как модификации первых необходимо избегать.

[0007] Известно, что аматоксины являются относительно нетоксичными при связывании с крупными биомолекулами носителями, такими как молекулы антител, и что они проявляют свою цитотоксическую активность только после отщепления биомолекулы носителя. В свете токсичности аматоксинов, предпочтительно для клеток печени, наиболее важно то, что конъюгаты аматоксина для целевой терапии опухолей остаются высоко стабильными после введения в плазму, и что высвобождение аматоксина развивается после интернализации в целевые клетки. В указанном контексте минимальные улучшения стабильности конъюгата могут иметь радикальные последствия в отношении терапевтического окна и безопасности конъюгатов аматоксина для терапевтических целей.

ЗАДАЧИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Задачей настоящего изобретения является обеспечение дополнительных конъюгатов мишень-связывающего фрагмента и аматоксина, которые являются стабильными в плазме, так что их вредные побочные эффекты на клетки не-мишени минимизированы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Настоящее изобретение основано на неожиданном наблюдении, что образование цикла посредством двух атомов кислорода, связанных с γ и δ C атомами аминокислоты 3 аматоксина, может улучшать переносимость конъюгатов мишень-связывающих фрагментов и аматоксина, не влияя на взаимодействие таких аматоксинов с их мишенью, ДНК-зависимой РНК полимеразой II клеток млекопитающих. К настоящему времени, наличие гидроксильной группы, связанной с γ C атомом аминокислоты 3 аматоксина, расценивается обязательным для эффекта аматоксинов и конъюгатов аматоксина. Wieland (T. Wieland, Peptides of Poisonous Amanita Mushrooms, Springer Series in Molecular Biology, Springer Verlag New York, 1986; Wieland T, Rempel D, Gebert U, Buku A, Boehringer H. Liber die Inhaltsstoffe des griinen Knollenblatterpilzes. XXXII. Chromatographische Auftrennung der Gesamtgifte und Isolierung der neuen Nebentoxine Amanin und Phallisin sowie des ungiftigen Amanullins. Liebigs Ann Chem. 1967;704:226-236) сообщают о натуральных аматоксинах, как амануллин, которые не имеют γ-гидроксильной группы существенно сниженной токсичности.

[0010] В первом аспекте настоящее изобретение относится к аматоксину формулы I

где:

R¹ выбран из C=O, C=S, C=NR⁶ и CR⁷R⁸;

R² выбран из S=O, SO₂ и S;

R³ выбран из NHR⁵ и OR⁵;

R⁴ выбран из H, OR⁵ и OC_1-6-алкила;

R⁶ выбран из C_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

R⁷ и R⁸ независимо выбраны из H, C_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

где:

(i) каждый R⁵ представляет собой H;

(ii) один из R⁵ представляет собой -L_n-X, где L является линкером, n выбран из 0 и 1, и X представляет собой химический фрагмент, который может быть связан с нацеливающим фрагментом, и где оставшиеся R⁵ представляют собой H; или

(iii) один из R⁵ представляет собой -L_n-X^*-Y, где L является линкером, n выбран из 0 и 1, Y представляет собой нацеливающий фрагмент и X^* представляет собой химический фрагмент, возникающий в результате связывания X с функциональной группой Y, и где оставшиеся R⁵ представляют собой H.

[0011] В другом аспекте настоящее изобретение относится к аматоксину по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного препарата.

[0012] В другом аспекте настоящее изобретение относится к аматоксину по настоящему изобретению для применения в лечении рака у пациента, предпочтительно где рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, желудочно-кишечного рака, например, колоректального рака, рака поджелудочной железы, холангиокарциномы, печеночно-клеточной карциномы, остеосаркомы, рака легких, рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы, рака яичника, карциномы яичка, карциномы мочевого пузыря, рака желудка, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака почки, глиом, рака кожи, например, злокачественной меланомы, рака щитовидной железы, лейкоза и злокачественной лимфомы.

[0013] В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей аматоксин по настоящему изобретению, и дополнительно включающей один или более фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей, вспомогательных веществ, наполнителей, вяжущих веществ, смазывающих веществ, глидантов, дезинтегрирующих веществ, абсорбентов; и/или консервантов.

[0014] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу синтеза аматоксина по настоящему изобретению, включающему взаимодействие аматоксина формулы II

где:

R² выбран из S=O, SO₂ и S;

R³ выбран из NHR⁵ и OR⁵;

R⁴ выбран из H, OR⁵ и OC_1-6-алкила;

R⁶ выбран из C_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

R⁷ и R⁸ независимо выбраны из H, C_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

где один из R⁵ представляет собой -L_n-X, где L является линкером, n выбран из 0 и 1, и X является химическим фрагментом, который может быть связан с нацеливающим фрагментом, и где оставшиеся R⁵ являются H;

с (i) Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом (DSC), (ii) тиокарбонилирующим реагентом, предпочтительно тиофосгеном, 1,1'-тиокарбонилдиимидазолом или 1,1'-тиокарбонилди-2(1H)-пиридоном; (iii) иминокарбонилирующим реагентом, предпочтительно дихлоридом изоцианида или фенилизотиоцианатом; или (iv) альдегидом, кетоном или ациклическим ацеталем.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0015] На фиг.1 показаны структурные формулы различных аматоксинов. Цифры жирным шрифтом (1-8) обозначают стандартную нумерацию восьми аминокислот, образующих аматоксин. Также показаны стандартные обозначения атомов в аминокислотах 1, 3 и 4 (греческие буквы α-γ, греческие буквы α-δ, и числа от 1' до 7', соответственно).

[0016] На фиг.2 показана цитотоксическая активность различных конъюгатов аматоксина-трастузумаба (торговое наименование Герцептин®) на клетках SK-OV-3 (рак яичника) в анализе BrdU после инкубации в течение 72 ч.

[0017] На фиг.3 показана цитотоксическая активность различных конъюгатов аматоксина-трастузумаба на клетках SK-OV-3 (рак яичника) в анализе BrdU после инкубации в течение 72 ч.

[0018] На фиг.4 показана цитотоксическая активность различных конъюгатов аматоксина-трастузумаба на клетках SKBR-3 (рак молочной железы) в анализе BrdU после инкубации в течение 72 ч.

[0019] На фиг.5 показана цитотоксическая активность различных конъюгатов аматоксина-трастузумаба на клетках JIMT-1 (рак молочной железы) в анализе BrdU после инкубации в течение 72 ч.

[0020] На фиг.6 показана эффективность in vivo двух различных конъюгатов аматоксина аматоксин-трастузумаб в модели ксенотрансплантата рака молочной железы JIMT-1.

[0021] На фиг.7 показана переносимость in vivo двух различных конъюгатов аматоксина аматоксин-трастузумаб у самок мышей NMRI nu/nu.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0022] Настоящее изобретение может быть более понятно со ссылками на следующее подробное описание изобретения и примеры, включенные в настоящее описание.

[0023] В первом аспекте настоящее изобретение относится к аматоксину формулы I

где:

R¹ выбран из C=O, C=S, C=NR⁶ и CR⁷R⁸;

R² выбран из S=О, SО₂ и S;

R³ выбран из NHR⁵ и OR⁵;

R⁴ выбран из H, OR⁵ и OС_1-6-алкила;

R⁶ выбран из С_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

R⁷ и R⁸ независимо выбран из H, С_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

где:

(i) каждый R⁵ представляет собой H;

(ii) один из R⁵ представляет собой -L_n-X, где L является линкером, n выбран из 0 и 1, и X представляет собой химический фрагмент, который может быть связан с нацеливающим фрагментом, и где оставшиеся R⁵ являются H; или

(iii) один из R⁵ представляет собой -L_n-X^*-Y, где L является линкером, n выбран из 0 и 1, Y является нацеливающим фрагментом и X* является химическим фрагментом, появляющимся в результате связывания X с функциональной группой Y, и где оставшиеся R⁵ являются H.

[0024] Термин "мишень-связывающий фрагмент", как используется в настоящем описании, относится к любой молекуле или части молекулы, которые могут специфически связываться с целевой молекулой или целевым эпитопом. Предпочтительными мишень-связывающими фрагментами в контексте настоящей заявке являются (i) антитела или их антиген-связывающие фрагменты; (ii) антителоподобные белки; и (iii) аптамеры нуклеиновой кислоты. "Мишень-связывающие фрагменты", подходящие для применения в настоящем описании, обычно имеют молекулярную массу 40000 Дa (40 кДa) или более.

[0025] Как используется в настоящем описании, первое соединение (например, антитело) расценивают как "специфически связывающееся" со вторым соединением (например, антигеном, таким как целевой белок), если он имеет константу диссоциации K_D к указанному второму соединению 100 мкΜ или менее, предпочтительно 50 мкΜ или менее, предпочтительно 30 мкΜ или менее, предпочтительно 20 мкΜ или менее, предпочтительно 10 мкΜ или менее, предпочтительно 5 мкΜ или менее, более предпочтительно 1 мкΜ или менее, более предпочтительно 900 нM или менее, более предпочтительно 800 нM или менее, более предпочтительно 700 нM или менее, более предпочтительно 600 нM или менее, более предпочтительно 500 нM или менее, более предпочтительно 400 нM или менее, более предпочтительно 300 нM или менее, более предпочтительно 200 нM или менее, более предпочтительно 100 нM или менее, более предпочтительно 90 нM или менее, более предпочтительно 80 нM или менее, более предпочтительно 70 нM или менее, еще более предпочтительно 60 нM или менее, еще более предпочтительно 50 нM или менее, еще более предпочтительно 40 нM или менее, еще более предпочтительно 30 нM или менее, еще более предпочтительно 20 нM или менее и еще более предпочтительно 10 нM или менее.

[0026] В контексте настоящей заявки термины "целевая молекула" и "целевой эпитоп", соответственно, относятся к антигену и эпитопу антигена, соответственно, которые специфически связываются мишень-связывающим фрагментом. Предпочтительно нацеливающей молекулой является антиген, ассоциированный с опухолью, в частности, антиген или эпитоп, который присутствует на поверхности одного или более типов опухолевых клеток или клеток, ассоциированных с опухолью в увеличенной концентрации и/или в иной стерической конфигурации по сравнению с поверхностью неопухолевых клеток. Предпочтительно указанный антиген или эпитоп присутствуют на поверхности одного или более типов клеток опухоли или стромы опухоли, но не на поверхности неопухолевых клеток. В определенных вариантах осуществления изобретения мишень-связывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом HER-2/neu или молекулой адгезии эпителиальных клеток (EpCAM). В других вариантах осуществления изобретения указанный антиген или эпитоп предпочтительно экспрессируется на клетках, вовлеченных в аутоиммунные заболевания. В таких определенных вариантах осуществления изобретения мишень-связывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом рецептора IL-6 (IL-6R). В других вариантах осуществления изобретения указанный антиген или эпитоп предпочтительно экспрессируется на клетках, вовлеченных в воспалительные заболевания.

[0027] Термин "антитело или его фрагмент, связывающий антиген", как используется в настоящем описании, относится к молекулам иммуноглобулина и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулина, т.е. молекулам, которые содержат сайт связывания антигена, которые иммуноспецифически связывают антиген. Также включают иммуноглобулиноподобные белки, которые выбирают посредством методик, включающих, например, фаговое отображение для специфического связывания с целевой молекулой, например, целевым белком Her-2/neu или EpCAM. Молекулы иммуноглобулина по изобретению могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина. "Антитела и их антиген-связывающие фрагменты", подходящие для применения в настоящем изобретении, включают, без ограничения, поликлональные, моноклональные, одновалентные, биспецифические, гетероконъюгатные, мультиспецифические, человеческие, гуманизированные (в частности CDR-привитые), деиммунизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела (например, scFv), Fab фрагменты, F(ab')₂ фрагменты, фрагменты, полученные посредством Fab библиотеки экспрессии, диатела или тетратела (Holliger P. et al., 1993), нанотела, анти-идиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела к антителам по изобретению) и эпитоп-связывающие фрагменты любого из вышеперечисленного.

[0028] В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген-связывающими фрагментами являются фрагменты человеческих антиген-связывающих антител по настоящему изобретению и включают, без ограничения, Fab, Fab' и F(ab')₂, Fd, одноцепочечное Fv (scFv), одноцепочечные антитела, дисульфидно-связанные Fv (dsFv) и фрагменты, включающие или VL или VH домен. Антиген-связывающие фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, могут включать вариабельный домен(ы) отдельно или в комбинации с полным или частью следующего: шарнирная область, домены CL, CH1, CH2 и CH3. Также включают в изобретение антиген-связывающие фрагменты, также включающие любую комбинацию вариабельных доменов(а) с шарнирной областью, доменами CL, CH1, CH2 и CH3.

[0029] Антитела, применимые в изобретении, могут иметь любое животное происхождение, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела получают от человека, грызунов (например, мыши, крысы, морской свинки или кролика), цыплят, свиньи, козы, верблюда, коровы, лошади, осла, кошки или собаки. Особенно предпочтительно, чтобы антитела имели человеческое или мышиное происхождение. Как используется в настоящем описании, "человеческие антитела" включают антитела, имеющие последовательность аминокислот человеческого иммуноглобулина, и включают антитела, выделенные из библиотек человеческих иммуноглобулинов и/или от животных, трансгенных для одного или более человеческих иммуноглобулинов и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины, как описано, например, в патенте США № 5939598 Kucherlapati & Jakobovits.

[0030] Термин "антителоподобный белок" относится к белку, который был создан (например, посредством мутагенеза петель) для специфического связывания целевой молекулы. Обычно такие антителоподобные белки включают по меньшей мере одну вариабельную пептидную петлю, прикрепленную к обоим концам белковой складки. Такой двойной структурный конструкт существенно увеличивает аффинность связывания антителоподобного белка до уровня, сравнимого с таковым антитела. Длина вариабельной пептидной петли обычно состоит из 10-20 аминокислот. Каркасным белком может быть любой белок, имеющий хорошие свойства растворимости. Предпочтительно каркасным белком является мелкий глобулярный белок. Антителоподобные белки включают, без ограничения, белки миметики, антикалины и созданные белки повторов анкирина (для описания смотрите Binz et al. 2005). Антителоподобные белки могут быть получены из крупных библиотек мутантов, например, быть получены из крупных библиотек фагового отображения и могут быть выделены по аналогии с обычными антителами. Также антителоподобные связывающие белки могут быть получены путем комбинаторного мутагенеза поверхностно-выставленных остатков в глобулярных белках.

[0031] Термин "аптамер нуклеиновой кислоты" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была создана посредством повторных оборотов селекции in vitro или SELEX (систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения) для связывания с целевой молекулой (для описания смотрите Brody and Gold, 2000). Аптамером нуклеиновой кислоты может быть молекула ДНК или РНК. Аптамеры могут содержать определенные модификации, например, модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-фтор-замещенные пиримидины.

[0032] Как используется в настоящем описании, "конъюгат аптамера" относится к конъюгату токсина и мишень-связывающего фрагмента, в котором мишень-связывающий фрагмент представляет собой аптамер нуклеиновой кислоты в соответствии с вышеуказанной альтернативой (iii).

[0033] "Линкер" в контексте настоящего изобретения относится к молекуле, которая связывает два компонента, каждый прикрепленный к концу линкера, и которая увеличивает расстояние между двумя компонентами и облегчает стерические взаимодействия между указанными компонентами, например, в настоящем случае между мишень-связывающим фрагментом и аматоксином. В отсутствие линкера непосредственная связка аматоксина с мишень-связывающим фрагментом может снижать способность аматоксина взаимодействовать с РНК полимеразой II. В определенных вариантах осуществления изобретения линкер имеет непрерывные цепи между 1 и 30 атомами (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 атомами) в его основе, т.е. длину линкера определяют как самую короткую связь, измеряемую по количеству атомов или связей между фрагментом аматоксина и мишень-связывающим фрагментом, где одна сторона линкерной основы взаимодействует с аматоксином, и другая сторона - с мишень-связывающим фрагментом. В контексте настоящего изобретения линкером предпочтительно является группа C_1-20-алкилен, C_1-20-гетероалкилен, C_2-20-алкенилен, C_2-20-гетероалкенилен, C_2-20-алкинилен, C_2-20-гетероалкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, гетероарилен, аралкилен или гетероаралкилен, необязательно замещенная. Линкер может содержать один или более структурных элементов, таких как карбоксамид, сложный эфир, простой эфир, тиоэфир, дисульфид, мочевина, тиомочевина, углеводородные фрагменты и подобные. Линкер также может содержать комбинации двух или более таких структурных элементов. Каждый из таких структурных элементов может присутствовать в линкере более чем однократно, например, дважды, три раза, четыре раза, пять раз или шесть раз. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер может включать дисульфидную связь. Понимают, что линкер прикрепляется в одной стадии или в двух или более последовательных стадиях к аматоксину и мишень-связывающему фрагменту. Для этого линкер несет две группы, предпочтительно на проксимальном или дистальном конце, которые могут (i) образовывать ковалентную связь с группой, присутствующей в одном из компонентов для связывания, предпочтительно, активированной группой на аматоксине или мишень-связывающем пептиде, или (ii) который является или может быть активирован с образованием ковалентной связи с группой на аматоксине. Соответственно предпочтительно, чтобы химические группы находились на дистальном и проксимальном конце линкера, что является результатом такой реакции связывания, например, сложный эфир, простой эфир, уретан, пептидная связь и др.

[0034] В контексте настоящего изобретения термин "аматоксин" включает все циклические пептиды, состоящие из 8 аминокислот, выделенные из рода Amanita и описанные в Wieland, T. and Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 1978 Dec; 5(3): 185-260), и, более того, включает все их химические производные; дополнительно все их полусинтетические аналоги; дополнительно все их синтетические аналоги, построенные из строительных блоков в соответствии с основной структурой натуральных соединений (циклические, 8 аминокислот), дополнительно все синтетические или полусинтетические аналоги, содержащие негидроксилированные аминокислоты вместо гидроксилированных аминокислот, дополнительно все синтетические или полусинтетические аналоги, в которых тиоэфирсульфоксидный фрагмент заменен сульфидом, сульфоном или атомами, отличными от серы, например, атомом углерода как в карба-аналоге аманитина, в каждом случае, когда любое такое производное или аналог является функционально активным путем ингибирования РНК полимеразы II млекопитающего.

[0035] Как используется в настоящем описании, "химическое производное" (или коротко: "производное") соединения относится к видам, имеющим химическую структуру, которая сходна с соединением, все еще содержащую по меньшей мере одну химическую группу, не присутствующую в соединении, и/или не имеющую по меньшей мере одной химической группы, которая присутствует в соединении. Соединение, с которым сравнивают производное, известно как "исходное" соединение. Обычно "производное" может быть получено из исходного соединения в одной или более стадий химической реакции.

[0036] Как используется в настоящем описании, "аналог" соединения является структурно связанным, но не идентичным соединению и проявляет по меньшей мере один эффект соединения. Соединение, с которым сравнивают аналог, известно как "исходное" соединение. Вышеупомянутые эффекты включают, без ограничения: эффект связывания с другим соединением; ингибирующий эффект, например, эффект ингибирования ферментов; токсические эффекты; эффект активации, например, эффект ферментативной активации. Не требуется, чтобы аналог проявлял указанную активность в той же степени, как исходное соединение. Соединение расценивается как аналог в контексте настоящей заявки, если оно оказывает нужный эффект в степени по меньшей мере 1% (более предпочтительно по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%_; более предпочтительно по меньшей мере 40% и более предпочтительно по меньшей мере 50%) активности исходного соединения. Следовательно, "аналог аматоксина", как используется в настоящем описании, относится к соединению, которое структурно связано с любым из α-аманитина, β-аманитина, γ-аманитина, ε-аманитина, аманина, аманинамида, амануллина и аманулловой кислоты, как показано на фиг.1, и которое проявляет по меньшей мере 1% (более предпочтительно по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40% и более предпочтительно по меньшей мере 50%) ингибирующей активности в отношении РНК полимеразы II млекопитающих по сравнению с по меньшей мере одним из α-аманитина, β-аманитина, γ-аманитина, ε-аманитина, аманина, аманинамида, амануллина и аманулловой кислоты. "Аналог аматоксина", подходящий для применения в настоящем изобретении, может даже проявлять большую ингибирующую активность в отношении РНК полимеразы II млекопитающих, чем любой из α-аманитина, β-аманитина, γ-аманитина, ε-аманитина, аманина, аманинамида, амануллина и аманулловой кислоты. Ингибирующая активность может быть измерена путем определения концентрации, при которой развивается 50% ингибирование (значение IC₅₀). Ингибирующая активность против РНК полимеразы II млекопитающих может быть определена опосредованно при помощи измерения ингибирующей активности в отношении клеточной пролиферации. Подходящий анализ для оценки ингибирования пролиферации клеток описан в примерах.

[0037] "Полусинтетический аналог" относится к аналогу, который был получен химическим синтезом с использованием соединений из натуральных источников (например, растительных материалов, бактериальных культур, грибковых культур или клеточных культур) в качестве исходного материала. Обычно "полусинтетический аналог" по настоящему изобретению синтезируют, начиная с соединения, выделенного из грибов семейства Amanitaceae. Наоборот, "синтетический аналог" относится к аналогу, синтезированному посредством так называемого тотального синтеза из мелких (обычно петрохимических) строительных блоков. Обычно такой тотальный синтез проводят без помощи биологических процессов.

[0038] Функционально аматоксины определяют как пептиды или депсипептиды, которые ингибируют РНК полимеразу II млекопитающих. Предпочтительными аматоксинами являются таковые с функциональной группой (например, карбоксильной группой, аминогруппой, гидроксигруппой, тиоловой группой или тиол-захватывающей группой), которые могут взаимодействовать с линкерными молекулами или мишень-связывающими фрагментами, как определено выше. Аматоксины, которые являются предпочтительно подходящими для конъюгатов по настоящему изобретению, представляют собой α-аманитин, β-аманитин, γ-аманитин, ε-аманитин, аманин, аманинамид, амануллин и аманулловую кислоту, как показано на фиг.1, а также их соли, химические производные, полусинтетические аналоги и синтетические аналоги. Особенно предпочтительными аматоксинами для применения в настоящем изобретении являются α-аманитин, β-аманитин и аманинамид.

[0039] В определенном варианте осуществления настоящего изобретения аматоксин по (iii), где функциональной группой Y аматоксина (iii) является амногруппа.

В таком определенном варианте осуществления изобретения X^* представляет собой фрагмент мочевины.

[0040] В определенном варианте осуществления настоящего изобретения указанный остаток R⁵, представляя собой -L_n-X^*-Y:

(i) присутствует в R¹;

(ii) присутствует в R³;

(iii) присутствует в R⁴; или

(iv) присутствует в R⁵.

[0041] В определенном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аматоксин выбран из α-аманитина, β-аманитина, аманина, аманинамида или из их солей или аналогов.

[0042] В определенных вариантах осуществления изобретения линкер L (ii) или (iii) представляет собой линейную цепь между 1 и 20 атомами, независимо выбираемыми из C, O, N и S, предпочтительно между 2 и 16 атомами, более предпочтительно между 5 и 14 атомами и еще более предпочтительно между 6 и 12 атомами. В определенных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере 60% атомов в линейной цепи являются атомами С. В определенных вариантах осуществления изобретения атомы в линейной цепи связаны простыми связями.

[0043] В определенных вариантах осуществления изобретения линкер (ii) или (iii) имеет длину до 12 атомов, предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 4 до 9 и наиболее предпочтительно от 6 до 8 атомов.

[0044] В определенных вариантах осуществления изобретения линкером L является группа алкилен, гетероалкилен, алкенилен, гетероалкенилен, алкинилен, гетероалкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, гетероарилен, аралкилен, или гетероаралкилен, включающая от 1 до 4 гетероатомов, выбираемых из N, O и S, где указанный линкер является необязательно замещенным.

[0045] Термин "алкилен" относится к двухвалентной насыщенной углеводородной группе с линейной цепью, имеющей от 1 до 20 атомов углерода, включая группы, имеющие от 1 до 10 атомов углерода. В определенных вариантах осуществления изобретения алкиленовыми группами могут быть низшие алкиленовые группы. Термин "низший алкилен" относится к алкиленовым группам, имеющим от 1 до 6 атомов углерода, и в определенных вариантах осуществления изобретения от 1 до 5 или от 1 до 4 атомов углерода. Примеры алкиленовых групп включают, без ограничения, метилен (-CH₂-), этилен (-CH₂-CH₂-), н-пропилен, н-бутилен, н-пентилен и н-гексилен.

[0046] Термин "алкенилен" относится к двухвалентным группам с линейными цепями, имеющими от 2 до 20 атомов углерода, где по меньшей мере одна из связей углерод-углерод является двойной связью, тогда как другие связи могут быть простыми связями или дополнительными двойными связями. Термин "алкинилен" в настоящем описании относится к группам, имеющим от 2 до 20 атомов углерода, где по меньшей мере одна связь углерод-углерод является тройной связью, тогда как другие связи могут быть простыми, двойными или дополнительными тройными связями. Примеры алкениленовых групп включают этенилен (-CH=CH-), 1-пропенилен, 2-пропенилен, 1-бутенилен, 2-бутенилен, 3-бутенилен и подобные. Примеры алкиниленовых групп включают этинилен, 1-пропинилен, 2-пропинилен и так далее.

[0047] Как используется в настоящем описании, "циклоалкилен" относится к двухвалентномму циклу, являющемуся частью любой стабильной одноциклической или полициклической системы, где такой цикл имеет от 3 до 12 атомов углерода, но не имеет гетероатома, и где такой цикл является полностью насыщенным, и термин "циклоалкенилен" относится к двухвалентному циклу, являющемуся частью любой стабильной одноциклической или полициклической системы, где такой цикл имеет от 3 до 12 атомов углерода, но не имеет гетероатома, и где такой цикл является по меньшей мере частично ненасыщенным (за исключением любого ариленового цикла). Примеры циклоалкиленов включают, без ограничения, циклопропилен, циклобутилен, циклопентилен, циклогексилен и циклогептилен. Примеры циклоалкениленов включают, без ограничения циклопентенилен и циклогексенилен.

[0048] Как используется в настоящем описании, термины "гетероциклоалкилен" и "гетероциклоалкенилен" относятся к двухвалентному циклу, являющемуся частью любой стабильной одноциклической или полициклической системы циклов, где такой цикл имеет от 3 до около 12 атомов, и где такой цикл состоит из атомов углерода и по меньшей мере одного гетероатома, предпочтительно по меньшей мере одного гетероатома, независимо выбираемого из группы, состоящей из N, O и S, с гетероциклоалкиленом, относящимся к такому циклу, который является полностью насыщенным, и гетероциклоалкениленом, относящимся к циклу, который является по меньшей мере частично ненасыщенным (за исключением любого ариленового или гетероариленового цикла).

[0049] Термин "арилен" означает двухвалентный цикл или систему циклов, являющихся частью любой стабильной одноциклической или полициклической системы, где такой цикл или система циклов имеет от 3 до 20 атомов углерода, но не имеет гетероатома, такой цикл или система циклов состоит из ароматического фрагмента, как определено по правилу электронов "4n+2", включая фенилен.

[0050] Как используется в настоящем описании, термин "гетероарилен" относится к двухвалентному циклу или системе циклов, являющейся частью любой стабильной одно- или полициклических систем, где такой цикл или система циклов имеет от 3 до 20 атомов, такой цикл или система циклов состоит из ароматического фрагмента, что определено по правилу электронов "4n+2", и содержит атом углерода и один из гетероатомов азота, серы и/или кислорода.

[0051] В контексте настоящего изобретения термин "замещенный" указывает, что один или более атомов водорода, присутствующих в основе линкера, заменены с выбором из указанной групп(ы), с условием, что указанная нормальная валентность атома или таковая соответствующего атома группы, которая является замещенной, не превышается, и что замещение приводит к стабильному соединению. Термин "необязательно замещенный" означает, что линкер является или незамещенным, или замещенным, как определено в настоящем описании, одним или более заместителями, как определено в настоящем описании. Когда заместителем является кето (или оксо, т.е. =O) группа, тио или иминогруппа или подобные, то два водорода на линкерной основе заменены. Примерные заместители включают, например, алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, гетероциклоалкил, арил, гетероарил, аралкил, гетероаралкил, ацил, ароил, гетероароил, карбоксил, алкокси, арилокси, ацилокси, ароилокси, гетероароилокси, алкоксикарбонил, галоген, (тио)эфир, циано, фосфорил, амино, имино, (тио)амидо, сульфгидрил, алкилтио, ацилтио, сульфонил, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, азидо, галоалкил, включая перфторалкил (такой как трифторметил), галоалкокси, алкилсульфанил, алкилсульфинил, алкилсульфонил, алкилсульфониламино, арилсульфоноамино, фосфорил, фосфат, фосфонат, фосфинат, алкилкарбокси, алкилкарбоксиамид, оксо, гидрокси, меркапто, амино (необязательно моно- или дизамещенный, например, алкилом, арилом, или гетероарилом), имино, карбоксамид, карбамоил (необязательно моно- или дизамещенный, например, алкилом, арилом, или гетероарилом), амидино, аминосульфонил, ациламино, ароиламино, (тио)уреидо, арилтио)уреидо, алкил(тио)уреидо, циклоалкил(тио)уреидо, арилокси, аралкокси или -О(CH₂)_n-OH, -O(CH₂)_n-NH₂, -O(CH₂)_nCOOH, -(CH₂)_nCOOH, -C(O)0(CH₂)_nR, -(CH₂)_nN(H)C(O)OR или -N(R)S(O)₂R, где n равно 1-4 и R независимо выбран из водорода, -алкила, -алкенила, -алкинила, -циклоалкила, -циклоалкенила, -(C-связанного-гетероциклоалкила), -(C-связанного-гетероциклоалкенила), -арила, и -гетероарила, с возможностью множественной степени замещения. Специалист в данном области понимает, что заместители, такие как гетероциклоалкил, арил, гетероарил, алкил и др., или функциональная группы, такие как -OH, -NHR и др., могут сами по себе быть замещены, если необходимо. Также специалист в данной области понимает, что замещенные фрагменты сами по себе могут быть также замещены, если требуется.

[0052] В определенных вариантах осуществления изобретения линкер L включает фрагмент, выбираемый из: дисульфида (-S-S-), простого эфира (-O-), тиоэфира (-S-), амина (-NH-), сложного эфира (-O-C(=O)- или -C(=О)-О-), карбоксамида (-NH-C(=O)- или -C(=O)-NH-), уретана (-NH-C(=O)-O- или -0-C(=O)-NH-) и фрагмента мочевины (-NH-C(=О)-NH-).

[0053] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения линкер L (ii) или (iii) включает m групп, выбираемые из: алкилена, алкенилена, алкинилена, циклоалкилена, гетероалкилена, гетероалкенилена, гетероалкинилена, гетероциклоалкилена, арилена, гетероарилена, аралкилена и гетероаралкилена, где каждая группа может независимо быть замещена, линкер дополнительно включает фрагмент n, независимо выбираемый из: дисульфида (-S-S-), простого эфира (-O-), тиоэфира (-S-), амина (-NH-), сложного эфира (-O-C(=O)- или -C(=О)-О-), карбоксамида (-NH-C(=O)- или -C(=O)-NH-), уретана (-NH-C(=O)-O- или -O-C(=O)-NH-) и фрагмента мочевины (-NH-C(=O)-NH-), где m=n+1. В определенных вариантах осуществления изобретения m равно 2 и n равно 1, или m равно 3 и n равно 2. В определенных вариантах осуществления изобретения линкер включает 2 или 3 незамещенных алкиленовых группы и 1 или 2, соответственно, дисульфидных, эфирных, тиоэфирных, аминовых, сложноэфирных, карбоксамидных, уретановых или фрагментов мочевины, связывающих незамещенные алкиленовые группы.

[0054] В определенных вариантах осуществления изобретения атомы C в линейной цепи являются независимо частью необязательно замещенных метиленовых групп (-CH₂-). В таких определенных вариантах осуществления изобретения необязательные заместители независимо выбраны из галогена и C_1-6-алкила, предпочтительно метила.

[0055] В определенных вариантах осуществления изобретения линкер L, предпочтительно линкер L, как показано в разделе [0043], выбран из следующей группы линкеров:

сторона аматоксина: -(CH₂)₂- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₃- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₄- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₅- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₆- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₇- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₈- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₉- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₁₀- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₁₁ сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₁₂- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₁₆- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₃-S-S-(CH₂)₂- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₃- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₃-S-S-(CH₂)₃- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₄-S-S-(CH₂)₄- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₂-CMe₂-S-S-(CH₂)₂- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₂-S-S-CMe₂-(CH₂)₂- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₂-О-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -(CH₂)₂-О-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-О-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -CH₂-C₆H₄-NH-Cit-Val-(CH₂)₆- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -CH₂-C₆H₄-NH-Lys-Phe-(CH₂)₆- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -CH₂-C₆H₄-NH-Val-Val-(CH₂)₆- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -CH₂-C₆H₄-NH-lle-Val-(CH₂)₆- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -CH₂-C₆H₄-NH-His-Val-(CH₂)₆- сторона мишень-связывающего фрагмента;

сторона аматоксина: -CH₂-C₆H₄-NH-Met-Val-(CН₂)₆- сторона мишень-связывающего фрагмента; и

сторона аматоксина: -CH₂-C₆H₄-NH-Asn-Lys-(CH₂)₆- сторона мишень-связывающего фрагмента.

[0056] В определенных вариантах осуществления изобретения мишень-связывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом, который присутствует на опухолевой клетке, предпочтительно где мишень-связывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом рецептора 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2).

[0057] В определенных вариантах осуществления изобретения антителом является трастузумаб или HEA125, или фрагмент антитела, включающий антиген-связывающий фрагмент трастузумаба или HEA125.

[0058] В определенных вариантах осуществления изобретения более чем одна молекула аматоксина связана с одним мишень-связывающим фрагментом. Увеличение количества молекул аматоксина на конъюгат также увеличивает токсичность. Соответственно в определенном варианте осуществления изобретения соотношение мишень-связывающего фрагмента к аматоксину составляет между одним фрагментом, связывающим мишень с между 1 и 15 молекулами аматоксина, предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. Для целей расчета соотношения в случае димеров антител, таких как IgG, димер расценивается как один мишень-связывающий фрагмент.

[0059] В определенных вариантах осуществления изобретения мишень-связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из:

(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента;

(ii) антитело-подобного белка; и

(iii) аптамера нуклеиновой кислоты.

[0060] В определенных вариантах осуществления изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент выбран из диатела, тетратела, нанотела, химерного антитела, деиммунизированного антитела, гуманизированного антитела или человеческого антитела.

[0061] В определенных вариантах осуществления изобретения антиген-связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab')₂, Fd, Fv, одноцепочечного Fv и дисульфидно-связанных Fv (dsFv).

[0062] В другом аспекте настоящее изобретение относится к аматоксину по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного препарата.

[0063] В другом аспекте настоящее изобретение относится к аматоксину по настоящему изобретению для применения в лечении рака у пациента, предпочтительно когда рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, холангиокарциномы, колоректального рака, рака легкого, рака предстательной железы, рака яичника, рака предстательной железы, рака желудка, рака почки, злокачественной меланомы, лейкоза и злокачественной лимфомы.

[0064] Как используется в настоящем описании, "пациент" означает любое млекопитающее или птицу, которые могут получить пользу от лечения конъюгатами токсина с мишень-связывающим фрагментом. Предпочтительно "пациент" выбран из группы, состоящей из лабораторных животных (например, мыши или крысы), домашних животных (включая морских свинок, кролика, кур, свиней, овец, коз, коров, лошадей, ослов, кошек или собак) или приматов, включая человека. Особенно предпочтительно, чтобы "пациентом" был человек.

[0065] Как используется в настоящем описании, "лечить", "лечение" или "терапия" заболевания или расстройства означает одно или более из следующего: (a) уменьшение тяжести расстройства; (b) ограничение или предотвращение развития характерных симптомов расстройств(а), которое лечат; (c) ингибирование ухудшения характерных симптомов расстройств(а), которое лечат; (d) ограничение или предотвращение рецидива расстройств(а) у пациентов, которые ранее имели расстройство(а); и (e) ограничение или предотвращение рецидива симптомов у пациентов, которые ранее имели симптомы расстройств(а).

[0066] Как используется в настоящем описании, лечение может включать введение конъюгата или фармацевтической композиции по настоящему изобретению пациенту, где "введение" включает введение in vivo, а также введение непосредственно в ткани ex vivo, например, в протезы вен.

[0067] В определенных вариантах осуществления изобретения используют терапевтически эффективное количество конъюгата по настоящему изобретению.

[0068] "Терапевтически эффективное количество" представляет собой количество терапевтического средства, достаточное для достижения желаемой цели. Эффективное количество заданного терапевтического средства варьируется в зависимости от факторов, таких как природа средства, путь введения, размер и вид животного, получающего терапевтическое средство и цели введения. Эффективное количество в каждом отдельном случае может быть эмпирически определено специалистом в области техники в соответствии с установленными методами в области техники.

[0069] В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей аматоксин по настоящему изобретению и дополнительно включающей один или более фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей, вспомогательных веществ, наполнителей, вяжущих веществ, глидантов, дезинтегрирующих веществ, адсорбентов и/или консервантов.

[0070] "Фармацевтически приемлемый" означает одобренный регуляторными органами Федерального или государственного правительства или перечисленный в Фармакопее США или другой общепринятой фармакопее для применения у животных и предпочтительно у людей.

[0071] В определенных вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция используется в форме системно вводимого лекарственного препарата. Они включают парентеральные средства, которые включают, среди остальных, инъекции и инфузии. Инъекционные препараты рецептируют или в форме ампул или в виде так называемых готовых к применению инъекционных препаратов, например, готовых к применению шприцев или одноразовых шприцев и, кроме этого, в флаконах с прокалываемой пробкой для многократного использования. Введение инъекционных препаратов может осуществляться в форме подкожного (п/к), внутримышечного (в/м), внутривенного (в/в) или внутрикожного (в/к) применения. В частности возможно получать соответственно подходящие инъекционные препараты в виде суспензии кристаллов, растворов, системы наночастиц или коллоидных диспергированных систем, как, например, гидрозоли.

[0072] Инъекционные композиции могут дополнительно быть получены в виде концентратов, которые могут быть растворены или диспергированы водными изотоничными разбавителями. Инфузия также может быть получена в форме изотонических растворов, жирных эмульсий, композиций липосом и микроэмульсий. Подобно инъекционным препаратам, инфузионные композиции также могут быть получены в форме концентратов для разведения. Инъекционные композиции также могут применяться в форме постоянных инфузий или в стационарной или в амбулаторной терапии, например, в качестве мини-помп.

[0073] Возможно добавлять композиции парентеральных лекарственных средств, например, альбумин, плазму, расширитель, поверхностно-активные вещества, органические разбавители, вещества, влияющие на рН, комплексообразующие вещества или полимерные вещества, в частности, в виде веществ, для воздействия на адсорбцию конъюгатов токсина и мишень-связывающего фрагмента по изобретению белками или полимерами, или они могут быть добавлены с целью снижения адсорбции конъюгатов токсина и мишень-связывающего фрагмента по изобретению к материалам, таким как инъекционные средства или упаковочные материалы, например, пластик или стекло.

[0074] Аматоксины по настоящему изобретению, включающие мишень-связывающий фрагмент, могут быть связаны с микроносителями или наночастицами в парентеральных препаратах, как, например, с мелко диспергированными частицами на основе поли(мет)акрилатов, полилактатов, полигликолатов, полиаминокислот или полиэфируретанов. Парентеральные композиции также могут быть модифицированы как препараты депо, например, на основе "системы доставки на основе множественных частиц", если конъюгаты токсина и мишень-связывающего фрагмента по изобретению вводят в мелко измельченной, диспергированной и суспендированной форме, соответственно, или в виде суспензии кристаллов в лекарственном препарате или на основе "системы доставки на основе одной частицы", если конъюгаты токсина и мишень-связывающего фрагмента по изобретению заключены в композицию, например, в таблетку или стержень, который впоследствии имплантируют. Такие импланты или препараты депо в композициях на основе одной частицы и множества частиц часто состоят из так называемых биоразлагаемых полимеров, как, например, полиэфиры молочной кислоты и гликолевой кислоты, полиэфируретаны, полиаминокислоты, поли(мет)акрилаты или полисахариды.

[0075] Адъювантами и носителями, добавляемыми во время получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению, рецептируемых в виде парентеральных препаратов, предпочтительно являются стерильная вода (вода стерильная), вещества, влияющие на значение рН, как, например, органические или неорганические кислоты или основания, а также их соли, буферные вещества для регуляции значений рН, вещества для изотонизации, как, например, хлорид натрия, гидрокарбонат натрия, глюкоза и фруктоза, тенсиды и поверхностно-активные вещества, как, например, частичные эфиры жирных кислот полиоксиэтиленсорбита (например, Tween®) или, например, сложные эфиры жирной кислоты и полиоксиэтиленов (например, Cremophor®), жирные масла, например, арахисовое масло, соевое масло или касторовое масло, синтетические эфиры жирных кислот, как, например, этилолеат, изопропилмиристат и нейтральное масло (например, Miglyol), а также полимерные добавки, как, например, желатин, декстран, поливинилпирролидон, добавки, которые увеличивают растворимость органических растворителей, как, например, пропиленгликоль, этанол, Ν,Ν-диметилацетамид, пропиленгликоль или комплексообразующие вещества, как, например, цитрат и мочевина, консерванты, как, например, гидроксипропиловый эфир и метиловый эфир бензойной кислоты, бензиловый спирт, антиоксиданты, как, например, сульфит натрия, и стабилизаторы, как, например, EDTA.

[0076] При рецептировании фармацевтических композиций по настоящему изобретению в виде суспензий в предпочтительном варианте осуществления изобретения добавляют загустители для предотвращения оседания конъюгатов токсина и мишень-связывающих фрагментов по изобретению, тенсиды и полиэлектролиты для обеспечения ресуспендирования осадка и/или комплексообразующие добавки, как, например, EDTA. Также возможно получать комплексы активного ингредиента с различными полимерами. Примерами таких полимеров являются полиэтиленгликоль, полистирол, карбоксиметилцеллюлоза, Pluronics® или сложные эфиры жирных кислот и полиэтилен сорбита. Конъюгаты токсина и мишень-связывающих фрагментов по изобретению также могут быть включены в жидкие композиции в форме соединений включения, например, с циклодекстринами. В определенных вариантах осуществления изобретения диспергирующие вещества могут быть добавлены в виде дополнительных добавок. Для получения лиофилизатов могут быть использованы зависающие вещества, как маннит, декстран, сахароза, человеческий альбумин, лактоза, PVP или множество желатинов.

[0077] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения X представляет собой производное карбаминовой кислоты -NH-C(O)-Z, где Z является уходящей группой, которая может быть заменена нуклеофильной группой мишень-связывающего фрагмента, предпочтительно первичным амином мишень-связывающего фрагмента.

[0078] В определенных вариантах осуществления изобретения Z выбран из: -бутилокси, -сукцинимидилокси, -1-O-сукцинимидилокси-3-сульфоната (-сульфо-NHS), -О-(4-нитрофенилокси), -O-(3-нитрофенилокси), -O-(2,4-динитрофенилокси), -O-(2,4-дихлор-6-нитрофенилокси), -пентафторфенилокси, -пентахлорфенилокси, -O-(2,4,5-трихлорфенилокси), -O-(3,4-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин-3-ил), -O-(эндо-1-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимид-1-ил), -1-фталимидоилокси, -1-бензотриазолилокси, -1-(7-азабензотриазолил)окси и -N-имидазолила.

[0079] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу синтеза аматоксина по настоящему изобретению, включающему стадию взаимодействия аматоксина формулы II

где:

R² выбран из S=О, SО₂ и S;

R³ выбран из NHR⁵ и OR⁵;

R⁴ выбран из H, OR⁵ и OC_1-6-алкила;

R⁶ выбран из C_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

R⁷ и R⁸ независимо выбраны из H, C_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

где один из R⁵ представляет собой -L_n-X, где L является линкером, n выбран из 0 и 1, и X представляет собой химический фрагмент, который может быть связан с нацеливающим фрагментом, и где оставшиеся R⁵ являются H;

с (i) Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом (DSC), (ii) тиокарбонилирующим реагентом, предпочтительно тиофосгеном, 1,1'-тиокарбонилдиимидазолом или 1,1'-тиокарбонилди-2(1H)-пиридоном; (iii) иминокарбонилирующим реагентом, предпочтительно дихлоридом изоцианида или фенилизотиоцианатом, или (iv) альдегидом, кетоном или ациклическим ацеталем.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: синтез конъюгированных молекул аматоксина

1.1 Синтез 6'-N-Boc-(6-аминогексил)-α-аманитина HDP 30.0132

[0080] В атмосфере аргона и при комнатной температуре 180 мг (196 мкмоль) высушенного в вакууме α-аманитина растворяли в 5000 мкл сухого диметилсульфоксида (ДМСО). Добавляли N-Boc-аминогексилбромид (439 мг, 8 эквивалентов) и 1 M гидроксид натрия (215,5 мкл, 1,1 экв.). Через 2 ч при комнатной температуре реакционную смесь подкисляли до pH=5 с помощью 100 мкл 1 M раствора уксусной кислоты в ДМСО. Летучие вещества испаряли в вакууме, и остаток растворяли в 500 мкл метанола и добавляли к 40 мл ледяного метил-трет-бутилового эфира (MTBE). Осадок центрифугировали и промывали путем ресуспендирования в 40 мл MTBE. Осадок забирали в 4000 мкл метанола, фильтровали и очищали в порциях по 500 мкл препаративной ВЭЖХ на колонке C18 (250×21,2 мм, Luna RP-18, 10 мкм, 100 Å). Растворитель A: вода, растворитель B: метанол; градиент: 0 мин 5% B; 5 мин 5% B; 20 мин 100% B; 25 мин 100% B; 27 мин 5% B; 35 мин 5% B; ток 30 мл/мин. Фракции с временем удержания 18,4-19,1 мин собирали, и растворители выпаривали до 126 мг (57%) HDP 30,0132 в виде бесцветного твердого вещества.

[0081] МС (ESI+) 1118,5 [M+H]⁺, 1140,5 [M+Na]⁺.

[0082] Путем выпаривания фракций с временем удержания 12,8-13,4 мин могут быть восстановлены 35 мг (19%) α-аманитина.

1.2 Синтез 6'-(6-аминогексил)-α-аманитина HDP 30.0134

[0083] 6^'-NH-boc-6-аминогексил-α-аманитин (HDP 30.0132, 81,82 мг, 73,17 мкмоль) растворяли в 300 мкл трифторуксусной кислоты (TFA). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре. Через 2 мин кислоту удаляли в вакууме при 20°C, и следы TFA удаляли посредством совместного выпаривания с 2×3 мл сухого толуола. Остаток растворяли в 3000 мкл воды/метанола 95:5, содержащих 0,05% TFA, и очищали в порциях 500 мкл препаративной ВЭЖХ на колонке C18 (250×21,2 мм, Luna RP-18, 10 мкл, 100 Å). Растворитель A: вода (содержащая 0,05% TFA), растворитель B: метанол (содержащий 0,05% TFA). Градиент: 0 мин 5% B; 5 мин 5% B; 20 мин 100% B; 25 мин 100% B; 27 мин 5% B; 35 мин 5% B; ток 30 мл/мин. Фракцию с временем удержания 13,4-13,9 мин собирали, и растворители выпаривали для получения 75,52 мг (89%) HDP 30.0134 в виде бесцветного твердого вещества.

[0084] HR-МС (ESI+) 1018,46749 рассчитано 1018,46679 для C₄₅H₆₈N₁₁O₁₄S [M+H]⁺

1.3 Синтез 6'-(6-(сукцинимидилоксикарбонил)-аминогексил-α-аманитина HDP 30.0643

[0085] HDP 30.0134 (160,52 мг, 141,78 мкмоль) растворяли в 1000 мкл сухого диметилформамида (DMF) и 363,19 мг (10 экв.) Ν,Ν'-дисукцинимидил карбоната (DSC) в 4000 мкл сухого DMF добавляли одновременно с последующими 39,3 мкл (2 экв.) триэтиламина, и смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 30 мин реакционную смесь добавляли по каплям в равных частях в две центрифужные пробирки, заполненные 40 мл ледяного MTBE. Полученный осадок центрифугировали и промывали ресуспендированием в 40 мл MTBE каждая. Осадки сушили в вакууме, растворяли и комбинировали в 2400 мкл 95% метанола, содержащего 0,05% TFA, и очищали в порциях 400 мкл препаративной ВЭЖХ на колонке C18 (250×21,2 мм, Luna RP-18, 10 пм, 100 Å). Растворитель A: вода (содержащая 0,05% TFA). Растворитель B: метанол (содержащий 0,05% TFA). Градиент: 0 мин 5% B; 5 мин 5% B; 20 мин 100% B; 25 мин 100% B; 27 мин 5% B; 35 мин 5% B; ток 30 мл/мин. Фракцию с временем удержания 15,4-16,5 мин собирали, и растворители выпаривали, и остаток лиофилизировали из 8 мл трет-бутанола до 151,46 мг (92%) HDP 30.0643 в виде белого порошка.

[0086] МС (ESI+) 1159,1 [M+H], 1181,0 [M+Na]⁺.

1.4 Синтез производного циклического карбоната HDP 30.1165

[0087] 10,23 мг (9,04 мкмоль) HDP 30.0134 растворяли в 500 мкл сухого диметилформамида (DMF) и одновременно добавляли 452 мкл (10 эквивалентов) 0,2 M раствора Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбоната (DSC) в сухом DMF. Добавляли триэтиламин (2,51 мкл, 2 эквивалента), и смесь перемешивали в течение 90 мин при комнатной температуре. Впоследствии летучие вещества удаляли в вакууме при температуре бани 40°C. Остаток растворяли в 500 мкл 95% метанола, содержащего 0,05% TFA, и очищали препаративной ВЭЖХ на колонке C18 (250×21,2 мм, Luna RP-18, 10 пм, 100 Å). Растворитель A: вода (0,05% TFA). Растворитель B: метанол (0,05% TFA). Градиент: 0 мин 5% B; 5 мин 5% B; 20 мин 100% B; 25 мин 100% B; 27 мин 5% B; 35 мин 5% B; ток 30 мл/мин. Фракцию с временем удержания 15,4-16,5 мин собирали и растворители выпаривали, и остаток лиофилизировали из 2 мл трет-бутанола до 9,06 мг (85%) HDP 30.1065 в виде белого порошка.

[0088] МС (ESI+) 1185,10 [M+H]⁺, 1207,07 [M+Na]⁺.

1.5 Синтез 6'-N-Boc-(6-аминогексил)-S-деокси-α-аманитина HDP 30.0741

[0089] К раствору HDP 30.0132 (18,64 мг, 16,67 мкмоль) в 2 мл этанола добавляли молибденгексакарбонил (51 мг, 11,6 эквивалентов), и смесь нагревали в герметичной пробирке до 75°C в течение 25 ч. Впоследствии летучие вещества удаляли в вакууме, и остаток забирали в 2 мл метанола. Нерастворимый материал удаляли центрифугированием, и надосадочную жидкость концентрировали до 500 мкл и очищали препаративной ВЭЖХ на колонке C18 (250×21,2 мм, Luna RP-18, 10 пм, 100 Å). Растворитель A: вода, растворитель B: метанол; градиент: 0 мин 5% B; 5 мин 5% B; 20 мин 100% B; 25 мин 100% B; 27 мин 5% B; 35 мин 5% B; ток 30 мл/мин. Фракцию с временем удержания 17,9-18,6 мин собирали, и растворители выпаривали до 10,95 мг (60%) HDP 30.0741 в виде бесцветного твердого вещества.

[0090] МС (ESI+) 1102,3 [M+H], 1124,5 [M+Na]⁺.

1.6 Синтез 6'-(6-аминогексил)-S-деокси-α-аманитина HDP 30.0743

[0091] HDP 30.0741 (10,95 мг, 9,93 мкмоль) растворяли в 500 мкл TFA и инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре. Затем летучие вещества выпаривали в вакууме, и следы TFA удаляли совместным выпариванием с 2×1 мл сухого толуола. 12,38 мг сырого продукта использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

[0092] МС (ESI+) 1002,4 [M+H]⁺, 1024,3 [M+Na]⁺.

1.7 Синтез 6^'-(6-(сукцинимидилоксикарбонил)-аминогексил-S-дезокси-α-аманитина HDP 30.1033

[0093] HDP 30.0743 (12,38 мг, 10,51 мкмоль) растворяли в 500 мкл сухого диметилформамида (DMF), и сразу добавляли 525 (10 экв.) 0,2 н. раствора Ν,Ν'-дисукцинимидил карбоната (DSC) в сухом DMF с последующими 2,91 мкл (2 экв.) триэтиламина, и смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 30 мин реакционную смесь добавляли по каплям в центрифужные пробирки, заполненные 10 мл ледяного MTBE. Полученный осадок центрифугировали и промывали ресуспендированием в 10 мл MTBE каждый. Осадок сушили в вакууме, растворяли в 500 мкл 95% метанола, содержащего 0,05% TFA, и очищали препаративной ВЭЖХ на колонке C18 (250×21,2 мм, Luna RP-18, 10 пм, 100 Å). Растворитель A: вода (содержащая 0,05% TFA). Растворитель B: метанол (содержащий 0,05% TFA). Градиент: 0 мин 5% B; 5 мин 5%; B 20 мин 100% B; 25 мин 100% B; 27 мин 5% B; 35 мин 5% B; ток 30 мл/мин. Фракцию с временем удержания 16,0-17,2 мин собирали, и растворители выпаривали, и остаток лиофилизировали из 3 мл трет-бутанола до 10,93 мг (91%) HDP 30.1033 в виде белого порошка.

[0094] МС (ESI+) 1143,3 [M+H]⁺.

1.8 Синтез производного циклического карбоната HDP 30.1036

[0095] Сырой HDP 30.0743 (12,38 мг, 9,93 мкмоль) растворяли в 500 мкл сухого диметилформамида (DMF), и сразу добавляли 497 мкл (10 эквивалентов) 0,2 M раствора Ν,Ν'-дисукцинимидил карбоната в сухом DMF. Добавляли триэтиламин (2,75 мкл, 2 эквивалента), и смесь перемешивали в течение 90 мин при комнатной температуре. Впоследствии летучие вещества удаляли в вакууме при температуре бани 40°C. Остаток растворяли в 500 мкл 95% метанола, содержащего 0,05% TFA, и очищали препаративной ВЭЖХ на колонке C18 (250×21,2 мм, Luna RP-18, 10 мкм, 100 Å). Растворитель A: вода (0,05% TFA). Растворитель B: метанол (0,05% TFA). Градиент: 0 мин 5% B; 5 мин 5% B; 20 мин 100% B; 25 мин 100% B; 27 мин 5% B;, 35 мин 5% B; ток 30 мл/мин. Фракцию с временем удержания 15,9-17,2 мин собирали, и растворитель выпаривали, и остаток лиофилизировали из 3 мл трет-бутанола до 10,06 мг (87%) HDP 30.1036 в виде белого порошка.

[0096] МС (ESI+) 1191,08 [M+Na]⁺.

Пример 2: синтез конъюгатов антител аматоксина - конъюгация трастузумаба с пре-активированными аматоксин-NHS-карбаматами

1.1 Трастузумаб-30.0643

[0097] 1,15 мг преактивированного производного аматоксин-линкера HDP 30.0643 растворяли в 230 мкл сухого диметилсульфоксида (ДМСО), и добавляли к 3,33 мл раствора антитела 6 мг/мл в фосфатном буферном растворе (PBS, pH=7,4). Полученный раствор встряхивали при 4°C в течение ночи и разделяли посредством гель-фильтрации Sephadex G-25 (колонка PD-10; GE Healthcare Life Sciences). Колонки PD-10 предварительно промывали 6×5 мл раствора PBS, pH=7,4. Фракции конъюгатов определяли посредством раствора Брэдфорда и комбинировали в один раствор. Раствор затем диализировали в кассете Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0,5-3 мл; 20000 MWCO) против 1 л PBS pH 7,4 в течение ночи при 4°C. Концентрацию белка определяли посредством RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany). Концентрацию ADC повышали в центрифужных фильтрах Amicon Ultra 50Ό00 MWCO (Millipore; центрифугирование при 4000 об/мин) и наконец доводили до 3 мг/мл. Аманитиновую нагрузку трастузумаба определяли посредством УФ поглощения при A=280 нм и A=310 нм.

1.2 Трастузумаб-30.1033

[0098] 2,00 мг преактивированного производного аматоксина-линкера HDP 30.1033 растворяли в 400 мкл сухого диметилсульфоксида (ДМСО), и добавляли к 2,62 мл раствора антитела 10 мг/мл в фосфатном буферном растворе (PBS, pH=7,4). Полученный раствор встряхивали при 4°C в течение ночи и разделяли посредством гель-фильтрации Sephadex G-25 (колонка PD-10; GE Healthcare Life Sciences). Колонки PD-10 предварительно промывали 6×5 мл раствора PBS, pH=7,4. Фракции конъюгатов определяли посредством раствора Брэдфорда и комбинировали в один раствор. Затем раствор диализировали в кассете Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0,5-3 мл; 20000 MWCO) против 1 л PBS pH 7,4 в течение ночи при 4°C. Концентрацию белка определяли посредством RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany). Концентрацию ADC увеличивали в центрифужных фильтрах Amicon Ultra 50000 MWCO (Millipore; центрифугирование при 4000 об/мин) и наконец доводили до 3 мг/мл. Аманитиновую нагрузку трастузумаба определяли посредством определения УФ абсорбции при A=280 нм и A=310 нм.

1.3 Трастузумаб-30.1036

[0099] 2,00 мг преактивированного производного аматоксина-линкера HDP 30.1036 растворяли в 400 мкл сухого диметилсульфоксида (ДМСО), и добавляли к 2,57 мл раствора антитела 10 мг/мл в фосфатном буферном растворе (PBS, pH=7,4). Полученный раствор встряхивали при 4°C в течение ночи и разделяли гель-фильтрацией Sephadex G-25 (колонка PD-10; GE Healthcare Life Sciences). Колонки PD-10 предварительно промывали 6×5 мл PBS растворами, pH=7,4. Фракции конъюгата определяли посредство раствора Брэдфорда и комбинировали в один раствор. Затем раствор диализировали в кассете Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0,5-3 мл; 20000 MWCO) против 1 л PBS pH 7,4 в течение ночи при 4°C. Концентрацию белка определяли посредством RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany). Концентрацию ADC увеличивали в центрифужных фильтрах Amicon Ultra 50Ό00 MWCO (Millipore; центрифугирование при 4000 об/мин) и наконец доводили до 3 мг/мл. Аманитиновую нагрузку трастузумаба определяли посредством УФ абсорбции при A=280 нм и A=310 нм.

1.4 Трастузумаб-30.1165

[0100] 0,90 мг преактивированного производного аматоксина-линкера HDP 30.1165 растворяли в 180 мкл сухого диметилсульфоксида (ДМСО), и добавляли к 2,00 мл раствора антитела 5 мг/мл в фосфатном буфером растворе (PBS, pH=7,4). Полученный раствор встряхивали при 4°C в течение ночи и разделяли посредством гель-фильтрации Sephadex G-25 (колонка PD-10; GE Healthcare Life Sciences). Колонки PD-10 предварительно промывали 6×5 мл PBS растворами, pH=7,4. Фракции конъюгата определяли посредством раствора Брэдфорда и комбинировали в один раствор. Раствор затем диализировали в кассете Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0,05-3 мл; 20000 MWCO) против 1 л PBS pH 7,4 в течение ночи при 4°C. Концентрацию белка определяли посредством RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany). Концентрацию ADC увеличивали в центрифужных фильтрах Amicon Ultra 50Ό00 MWCO (Millipore; центрифугирование при 4000 об/мин) и наконец доводили до 3 мг/мл. Аманитиновую нагрузку трастузумаба определяли путем определения УФ абсорбции при A=280 нм и A=310 нм.

Антитело Производное токсина-линкера Конъюгат Нагрузка Трастузумаб HDP 30.1036 Her-30.1036 4,0 Трастузумаб HDP 30.0643 Her-30.0643 4,4 Трастузумаб HDP 30.1165 Her-30.1165 5,0 Трастузумаб HDP 30.1033 Her-30.1033 3,9

Пример 3: цитотоксичность Her-30.0643 [4,4], Her-30.1033 [3,9], Her-30.1036 [4,0] и Her-30.1165 [5,0] на HER2-позитивных опухолевых клеточных линиях in vitro

[0101] Цитотоксическую активность конъюгатов трастузумаба-аматоксина оценивали in vitro с клеточными линиями HER2-положительных опухолей SK-OV-3 (яичника), SKBR-3 (молочной железы) и JIMT-1 (молочной железы) и анализом включения хемилюминесцента BrdU (Roche Diagnostics). Выживаемость клеток определяли после 72 ч инкубации с различными концентрациями конъюгатов при 37°C и 5% CO₂ посредством измерения фиксированных и проницаемых клеток с помощью анти-BrdU-HRP антитела в счетчике микропланшетов BMG Labtech Optima. Значение EC₅₀ дозозависимой кривой рассчитывали посредством программного обеспечения Graphpad Prism 4.0.

[0102] Значения EC₅₀ конъюгатов трастузумаба-аматоксина в различных Her2 положительных клеточных линиях (смотрите также фиг.2-5):

Конъюгат SKOV-3 SKBR-3 JIMT-1 Her-30.1036 [4,0] 3,8×10^-11 М 3,3×10^-11 М 2,1×10^-9 М Her-30.0643 [4,4] 2,9×10^-11 М 2,0×10^-11 М 1,0×10^-9 М Her-30.1165 [5,0] 1,1×10^-10 М - - Her-30.1033 [3,9] 2,7×10^-11 М 1,3×10^-11 М 7,9×10^-9 М

Пример 4: in vivo эффективность Her-30.0643 [4,4] и Her-30.1036 [4,0] в трастузумаб-резистентной модели ксенотрансплантата JIMT-1

[0103] Покупали интактных самок атимических мышей NMRI nu/nu в возрасте шести недель (Janvier) и случайно делили на три группы по восемь мышей в каждой. 5×10⁶ JIMT-1 клеток вводили п/к в бок каждой мыши. Конъюгаты трастузумаба-аматоксина Her-30.0643 [4,4] и Her-30.1036 [4,0] вводили однократно в/в в дозе 30 мкг/кг и 150 мкг/кг в отношении аманитина в день 14 после инокуляции опухоли, тогда как отрицательному контролю вводили носитель (PBS буфер). Объем опухоли записывали (смотрите фиг.6). Оба конъюгата показали высокую противоопухолевую активность, приводя к полной редукции опухоли при 30 мкг и 150 мкг/кг.

Пример 5: переносимость Her-30.0643 [4,4] и Her-30.1036 [4,0] у мышей

[0104] Покупали семинедельных интактных самок атимичных мышей NMRI nu/nu (Janvier) и случайно делили на три группы по три мыши в каждой группе. Конъюгаты герцептина-аматоксина Her-30.0643 [4,4] и Her-30.1036 [4,0] вводили однократно в/в в дозе 300 мкг/кг, тогда как отрицательному контролю вводили носитель (PBS буфер). Массу мышей записывали (смотрите фиг.7). Все животные, получавшие Her-30.0643 [4,4], умерли в течение девяти дней после применения, тогда как все животные, получавшие Her-30.1036 [4,0], продемонстрировали массу тела, сравнимую с группой отрицательного контроля после дня 14.

Изобретение относится к конъюгатам аматоксина и мишень-связывающего фрагмента, например антитела, связанного определенными связями, которые являются применимыми в лечении рака и других расстройств и заболеваний. В дополнительном аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим такие конъюгаты. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 5 пр.

1. Аматоксин формулы I

,

где:

R¹ выбран из C=O, C=S, C=NR⁶ и CR⁷R⁸;

R² выбран из S=O, SO₂ и S;

R³ выбран из NHR⁵ и OR⁵;

R⁴ выбран из H, OR⁵ и OC_1-6-алкила;

R⁶ выбран из C_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

R⁷ и R⁸ независимо выбраны из H, C_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

где:

(i) каждый R⁵ представляет собой H;

(ii) один из R⁵ представляет собой -L_n-X, где L является линкером, n выбран из 0 и 1 и X представляет собой химический фрагмент, который может быть связан с нацеливающим фрагментом, и где оставшиеся R⁵ являются H; или

(iii) один из R⁵ представляет собой -L_n-X^*-Y, где L является линкером, n выбран из 0 и 1, Y представляет собой нацеливающий фрагмент и X^* является химическим фрагментом, образующимся в результате связывания X с функциональной группой Y, и где оставшиеся R⁵ являются H.

2. Аматоксин по п.1(iii), где указанной функциональной группой Y является аминогруппа.

3. Аматоксин по п.2, где X^* является фрагментом мочевины.

4. Аматоксин по любому из пп.1(iii), 2 и 3, где указанный остаток R⁵, представляя собой -L_n-X^*-Y, является:

(i) присутствующим в R¹;

(ii) присутствующим в R³;

(iii) присутствующим в R⁴ или

(iv) присоединенным к N1’.

5. Аматоксин по любому одному из пп.1, 2 или 3, где n равно 1 и где линкер имеет длину до 12 атомов, предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 4 до 9 и наиболее предпочтительно от 6 до 8 атомов.

6. Аматоксин по любому одному из пп.1, 2 или 3, где линкером L является группа алкилен, гетероалкилен, алкенилен, гетероалкенилен, алкинилен, гетероалкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, гетероарилен, аралкилен или гетероаралкилен, состоящая из 1-4 гетероатомов, выбираемых из N, O и S, где указанный линкер является необязательно замещенным.

7. Аматоксин по любому одному из пп.1, 2 или 3, где линкер L включает фрагмент, выбираемый из: дисульфида, простого эфира, тиоэфира, амина, сложного эфира, карбоксамида, уретана и фрагмента мочевины.

8. Аматоксин по любому одному из пп.1, 2 или 3, где мишень-связывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом, который присутствует на опухолевой клетке, предпочтительно где мишень-связывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом рецептора 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2).

9. Аматоксин по любому одному из пп.1, 2 или 3, где мишень-связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из:

(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента;

(ii) антитело-подобного белка и

(iii) аптамера нуклеиновой кислоты.

10. Аматоксин по п.9, где антитело или его антиген-связывающий фрагмент выбран из диатела, тетратела, нанотела, химерного антитела, деиммунизированного антитела, гуманизированного антитела или человеческого антитела.

11. Аматоксин по п. 9, где антиген-связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab')₂, Fd, Fv, одноцепочечного Fv и дисульфидно-связанного Fv (dsFv).

12. Аматоксин по любому одному из пп.1, 2, 3, 10 или 11 для применения в качестве лекарственного препарата для лечения рака.

13. Аматоксин по любому одному из пп.1, 2, 3, 10 или 11 для применения в лечении рака у пациента, предпочтительно когда рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, холангиокарциномы, колоректального рака, рака легкого, рака предстательной железы, рака яичника, рака желудка, рака почки, злокачественной меланомы, лейкоза и злокачественной лимфомы.

14. Фармацевтическая композиция для лечения рака, включающая терапевтически эффективное количество аматоксина по любому из пп.1(iii)-11 и дополнительно включающая один или более фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей, вспомогательных веществ, наполнителей, вяжущих веществ, смазывающих веществ, глидантов, дезинтегрирующих веществ, адсорбентов и/или консервантов.

15. Аматоксин по п.1(ii), где X представляет собой производное карбамовой кислоты -NH-C(O)-Z, где Z представляет собой уходящую группу, которая может быть заменена нуклеофильной группой мишень-связывающего фрагмента, предпочтительно первичным амином мишень-связывающего фрагмента.

16. Аматоксин по п.15, где Z выбран из: -бутилокси, -сукцинимидилокси, -1-O-сукцинимидилокси-3-сульфоната (-сульфо-NHS), -O-(4-нитрофенилокси), -O-(3-нитрофенилокси), -O-(2,4-динитрофенилокси), -O-(2,4-дихлор-6-нитрофенилокси), -пентафторфенилокси, -пентахлорфенилокси, -О-(2,4,5-трихлорфенилокси), -O-(3,4-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин-3-ил), -O-(эндо-1-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимид-1-ил), -1-фталимидоилокси, -1-бензотриазолилокси, -1-(7-азабензотриазолил)окси и -N-имидазолила.

17. Способ синтеза аматоксина по п.15 или 16, включающий стадию реакции аматоксина формулы II

,

где:

R² выбран из S=O, SO₂ и S;

R³ выбран из NHR⁵ и OR⁵;

R⁴ выбран из H, OR⁵ и OC_1-6-алкила;

R⁶ выбран из C_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

R⁷ и R⁸ независимо выбраны из H, C_1-6-алкилен-R⁵, циклоалкилен-R⁵, гетероциклоалкилен-R⁵, арилен-R⁵ и гетероарилен-R⁵;

где один из R⁵ представляет собой -L_n-X, где L является линкером, n выбран из 0 и 1 и X является химическим фрагментом, который может быть связан с нацеливающим фрагментом, и где оставшиеся R⁵ являются H;

с (i) Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонатом (DSC), (ii) тиокарбонилирующим реагентом, предпочтительно тиофосгеном, 1,1'-тиокарбонилдиимидазолом или 1,1'-тиокарбонилди-2(1H)-пиридоном; (iii) иминокарбонилирующим реагентом, предпочтительно дихлоридом изоцианида или фенилизотиоцианатом; или (iv) альдегидом, кетоном или ациклическим ацеталем.