Способ получения декстраназы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/46 C12N1/14 C12N9/46 C12R1/66 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения декстраназы из микромицетов.

Целью изобретения является повышение активности декстраназы, увеличение выхода конечного продукта и упрощение процесса.

Сущность изобретения заключается в использовании штамма Aspergillus insuetus ВКПМ F-342, который выращивают на питательной среде с полиглюкином и автолиза- том дрожжевым или ферментолизатом биомассы микроорганизмов. Низкомолекулярный декстран полиглюкин, а отличие от высокомолекулярного нативного декстрана, выпускается отечественной промышленностью (МРТУ 42 Г 3548-67). Ом яаяяетея единственно доступным в СССР полимером декстрановой природы. Штамм Asp.

Insuetus ВКПМ F-342 является вариантом штамма Asp. Insuetus Г-116. Депонирован э коллекции микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Получение штамма.

Суспензию спор гриба Asp. insuetus Г- 116 рассевали на чашки Петри с агаризован- ной средой Чапека-Докса, содержащей в качестве источника углерода голубой декстран. Добивались получения отдельных колоний. После 4 сут выращивания отбирали наиболее крупные колонии с широкой зоной просветлений среды вокруг них. Наличие таких зон свидетельствует о щвдюш- зе содержащегося © ер@д@ даекетрама выделенным в питательную среду фермем- том декстранаэой. Каждую отобраммую колонию пересевали на скошенный карто- фельно-декстрозный агар, выращивали при 2б°С в течение 2-х недель, затем проверяли декстраназную активность, культивируя штамм на качалке, в жидкой питательной среде двух вариантов:

1- питательная среда с 0,5% полиглю- кина;

2- питательная среда с 0.5% полиглю- кина и 0,5% эвтолиззта дрожжевого или ферментолйзата биомассы микроорганизмов.

Таким образом, был отобран штамм, накапливающий большое количество декстра- назы (до 100 ед/мл) при культивировании в течение 96 ч на питательной среде 2.

Штамм Asp insuetus ВКПМ F-342 характеризуется следующими культурно- морфологическими и биохимическими признаками:

Морфологические признаки.

На среде Чапекз-Докса мицелий белый, септировэнный. Конидиеносцы прямостоящие, толщиной 3,0-4,0 мкм, несептирован- ные. Конидиальная голов а овальная, образована вершинным вздутием конидие- носца. Размеры головки (8-9) (7-8) мкм, стеригмы 14,0 - 7,0 мкм расположены одним слоем, бесцветные, конидии окуглые, гладкие, диаметром около 5,0 мкм.

Культуральные признаки.

Агар Чапека-Докса с сахарозой. Пяти- суточнэя колония диаметром 2,8-3,0 см. Колония круглая, пушистая, выпуклая, воздушный мицелий белый. На 6-е сутки роста при 28°С колония достигает диаметра 3,2- 3,4 см, в центре появляется зона спороно- шения сероватого цвета.

Картофельно-декстрозный агар. На 5-е сутки при 28°С колония имеет диаметр 2,5- 2,7 см, профиль колонии выпуклый, края ровные, рост концентрический, воздушный мицелий серо-коричневого цвета, по краю колонии белый, к 6-и суткам центр колонии более светлый, диаметр 2,8-3,0 см.

Агар Чапека-Докса с декстраном. Че- тырехсуточная колония круглая, белая, пушистая, выпуклого профиля, с ровными краями, диаметр колонии 3,2-3,5 см, вокруг колонии зона просветления декстрана шириной до 8,0 мм. В центре колонии на 5-6-е сутки появляется конидиеносная зона диаметром до 1,5см.

Физиолого-биохимические признаки.

Asperglllus insuetus ВКПМ F-342 гидро- лизует крахмал, молоко свертывает на 6-е сутки, желатину разжижает воронкообразно. Использует аммонийную, нитратную и белковую формы азота. Нитраты восстанавливает. Активно ассимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, маннит и глицерин.

Условия хранения штамма,

Штамм поддерживают на картофельнодекстрозном агаре или агаре Чапека-Докса при 26°С.

Штамм Asp. Insuetus ВКПМ F-342 не токсичен, так как получен из исходного нетоксичного штамма Asp, insuetus Г-116 без

применения мутагенных факторов.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что продуцент Asp. insuetus ВКПМ F-342 культивируют в колбах в течение 93-96 ч или в ферментерах в

течение 60-70 ч на питательной среде следующего состава, %: лолиглюкин 0,4- 0,6; NaNOa 0,3; КН2РСм 0,1; KCI 0,05; MgSCM 7Н20 0,05; автолизат дрожжевой или ферментолизат биомассы микроорганизмов 0,2-0,5.

Декстраназную активность выражают в глюкозных единицах. Единица активности соответствует количеству освободившихся при действии фермента на субстрат восстанавливающих групп при 37°С за 1 мин, эквивалентному одному микромолю глюкозы. Пример 1 (контроль). Культивирование штамма Asp. insuetus Г-116 в оптимальных условиях,

Гриб выращивают на качалке при 200 об/мин в течение 120 ч при 29°С в колбах емкостью 100 мл с 25 мл питательной среды следующего состава, %: нативный де- кстран 1,0;№МОзО,3;КН2Р040,1; KCI 0,05;

MgSCM 7Н20 0,05, рН 5,0. Культурзльную жидкость (КЖ) с активностью декстраназы 80 ед/мл отделяют фильтрованием. Конечный продукт осаждают этиловым спиртом известным способом, при этом выход препарата составляет 1 г/л КЖ.

Пример 2. Культивирование штамма Asp. insuetus ВКПМ F-342 в оптимальных условиях.

Гриб выращивают на качалке при 2000

об/мин в течение 96 ч при 29°С в колбах емкостью 250 мл со 100 мл питательной среды следующего состава, %: полиглю- кин 0,5; NaNOa 0.3; КН2РСм 0,1; КС 0,05 ; MgS04 7Н2СГО,05; автолизат дрожжевой

0,3, рН 5,0. Получают КЖ с активностью декстраназы 98 ед/мл, выход препарата после осаждения спиртом составляет 1,55 г с 1 л КЖ.

Исследования показали, что для обоих

продуцентов в качестве индуктора синтеза декстраназы можно использовать лолиглюкин взамен нативного декстрана. При внесении в питательную среду в количестве 1 % они дают практически одинаковые результаты. Однако особенностью предлагаемого штамма Asp. Insuetus ВКПМ F-342 является то, что максимум накопления фермента достигается уже на 4-е сутки культивирования, т е происходит сокращение срока культивирования на 24 ч по сравнению с Asp. insuetus Г-116. Кроме того, предлагаемый штамм, в отличие от исходного, обладает способностью к повышенному синтезу де- ксфаназы при культивироаании на питательных средах, содержащих композицию полиглюкина и автолизата дрожжевого или ферментолизата биомассы микроорганизмов. Введение в питательную среду этих недефицитных веществ позволяет в 2 раза снизить концентрацию индуктора при использовании предлагаемого штамма. На питательных средах с 0,4-0,6% полиглюкина и 0,2-0,5% автолизата дрожжевого или фер- ментолизага биомассы микроорганизмов уровень активности декстраназы в КЖ Asp. insuetus ВКПМ F-342 достигает своего максимального значения (96-100 ед/мл). При этом выход конечного продукта увеличивается в среднем на 30%, срок культивирования сокращается на 24 ч. При концентрации полиглюкина менее 0,4% и автолизата дрожжевого или ферментолизата биомассы микроорганизмов менее 0,2% снижается как активность декстраназы, так и выход конечного продукта. Увеличение концентрации полиглюкина выше 0,6% и автолизата дрожжевого или ферментолизата биомассы микроорганизмов выше 0,5% также приводит к снижению активности декстраназы.

При культивировании продуцента Asp. Insuetus ВКПМ F-342 менее 96 ч активность

о культуральной жидкости не достигает своего максимального значения.

При культивировании Asp. Insuetus ВКПМ F-342 в ферменте на питательной среде с 0,5% иолиглюкина и 0,4% автолизата дрожжевого за 60-70 ч роста достигается максимальный уровень активности декстра назы в культуральной жидкости 60-80 ед/мл, при выходе конечного продукта 1,41,6 г/л, в то время как максимум активности декстрэназы Asp. Insuetus Г-116 при выращивании в аналогичных условиях достигается к 75-80 ч и составляет 40-45 ед/мл.

Преимуществом изобретения являются:

увеличение декстраназной активности на 20%, сокращение сроков культивирования на 20-22%, снижение концентрации индуктора в питательной среде в 2 раза и увеличение выхода конечного продукт а в среднем

на 30%.

Формула изобретения Способ получения декстраназы, предусматривающий глубинное культивирование продуцента Aspergillus insuetus в

аэробных условиях на питательной среде, содержащей индуктор декстраназы, источники азота, фосфора, минеральные соли до максимального накопления активности, о т- личающийся тем, что, с целью повышения активности декстраназы, увеличения выхода конечного продукта и упрощения процесса, в качестве продуцента декстраназы используют штамм Aspergillus Insuetus ВКПМ F-342, в качестве индуктора - 0,4-0,6

мас.% полиглюкина, а в качестве источника азота в питательную среду вводят 0,2-0.5% дрожжевого автолизата или ферментолизата биомассы микроорганизмов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения декстра- назы из микромицетов. С целью повышения активности декстраназы, увеличения выхода конечного продукта и упрощения процесса, в качестве продуцента используют штамм-продуцент Aspergillus tnsuetus ВКПМ F-342, являющийся вариантом штамма Aspergillus tnsuetus F-11 б. который выращивают на питательной среде, содержащей в качестве индуктора низкомолекулярный декстран полиглюкин в количестве 0,4- 0,6%, а также автолизат дрожжевого или фементолиза биомассы микроорганизмов в количестве 0,2-0,5%. Преимуществом предложенного способа является увеличение декстраназной активности на 20%. уве- личение выхода конечного продукта в среднем на 30%, снижение концентрации индуктора в питательной среде в 2 раза и сокращение сроков культивирования на 20-22%.