ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM ЕЕ-105 ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ЭНДОГЛЮКАНАЗ И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ В ЗЕРНОВЫХ КОРМАХ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/15 C12N9/42 C12N15/56 C12R1/80 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, а именно, к созданию и производству комплексных высокоэффективных ферментных препаратов (ФП), содержащих высокоактивные термостабильные ферменты. Изобретение может быть использовано в кормовой отрасли в качестве добавки к кормам сельскохозяйственных животных и птицы, например, свиней или кур-бройлеров, ведущей к уменьшению негативного воздействия некрахмальных полисахаридов (НПС) на переваривание зерновых кормов.

Зерновые корма характеризуются наличием НПС, таких как целлюлоза, β-глюканы и ксиланы – их содержание варьирует от 7-10 % в пшенице до 17 % в ячмене. НПС не перевариваются в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) моногастричных животных и птицы, в связи с тем, что животные не вырабатывают соответствующие ферменты. НПС ухудшают переваривание основных питательных веществ, поскольку повышают вязкость химуса, замедляют транзит корма в пищеварительном тракте и снижают всасывание продуктов пищеварения [Jacob J.P., Pescatore A.J. // Annals of Translational Medicine, 2014, Vol.2, No.2. doi: 10.3978/j.issn.2305-5839.2014.01.02.]. Кроме того, непереваренные остатки корма, перемещаясь в нижний отдел кишечника, обеспечивают размножение патогенной и условно патогенной микрофлоры, ухудшая состояние животного или птицы и, соответственно, продуктивность.

Основным способом уменьшения негативного влияния НПС кормов является использование ферментов, которые будучи включёнными в состав корма дополняют ферментную систему птицы, обеспечивают переваривание НПС и в результате способствуют улучшению использования питательных веществ рациона, а также улучшают здоровье сельскохозяйственных животных и птицы. Экономические преимущества использования ФП в качестве кормовых добавок заключается в увеличении доступности питательных веществ корма, что приводит к снижению его расхода на производство единицы продукции. Другая позитивная сторона применения кормовых ФП заключается в возможности использования более дешевых видов растительного сырья в качестве основы корма.

Эффективность действия кормовых ФП определяется уровнем их биокаталитической активности, соотношением компонентов в составе ферментных комплексов, а также специфичностью и свойствами индивидуальных ферментов. Определяющим фактором среди свойств индивидуальных ферментов является устойчивость к действию высокой температуры. На сегодняшний день практически на всех кормопроизводствах существует стадия краткосрочной высокотемпературной обработки кормов (80-90°С, при гранулировании кормов), которая частично или полностью способна инактивировать ферменты. Поэтому создание новых кормовых ФП, сохраняющих активность в условиях краткосрочного термического воздействия («термошока»), является важной прикладной задачей.

Одними из ключевых ферментов, используемых в качестве кормовой добавки для расщепления НПС, являются β-глюканазы. В качестве промышленно важных продуцентов данных ферментов используются грибы родов Trichoderma и Penicillium. Эндо1,4-β-глюканазы этих продуцентов обладают высокой удельной активностью по отношению к НПС (β-глюкану), что делает их востребованными при кормопроизводстве.

Мицелиальный гриб Penicillium verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) обладает гидролитическим комплексом внеклеточных ферментов, способным к эффективной биоконверсии растительной биомассы, в том числе антипитательной составляющей кормов. В этот комплекс входят целлобиогидролазы, эндоглюканазы и β-глюкозидаза. На основе реципиентного штамма P.verruculosum 537 (∆niaD) создана экспрессионная система [Патент RU 2378372 С2, опубликовано 10.01.2010, Бюл. №1], что позволяет использовать данный гриб как основу для получения рекомбинантных штаммов – продуцентов ферментов для практического применения в различных областях промышленности и сельского хозяйства [Skomarovsky, A.A., Gusakov, A.V., Okunev, O.N., Solov’eva, I.V., Bubnova, T.V., Kondrat’eva, E.G., Synitsyn, A.P. // Applied Biochemistry and Microbiology. 2005. Vol. 41. P. 182–184; Martins, L.F., Kolling, D., Camassola, M., Dillon, A.J., Ramos, L.P. // Bioresource Technology. 2008. Vol. 99. P. 1417–1424; Gusakov A.V., Sinitsyn A.P. // Biofuels. 2012. Vol. 3(4). P.463-477.].

Ферменты P.verruculosum обладают высокой активностью по отношению к полисахаридным субстратам. В состав ферментного комплекса P.verruculosum входит высокоэффективная эндо-1,4-β-глюканаза II, относящаяся к 5-ой семье гликозид-гидролаз. Эндо-1,4-β-глюканаза II имеет высокую активность и обладает устойчивостью к воздействию высоких температур [Проскурина О.В. с соавт. // Катализ в промышленности. 2013. №5. С.65-73, Мерзлов Д.А. с соавт// Свойства ферментных препаратов и гомогенных ферментов эндоглюканазы EG2 Penicillium verruculosum и эндоглюканазы LAM Myceliophtora thermophile. Биохимия, 2015, том 20, вып.4, С.556-567, Синицын А.П. с соавт //Оптимизация состава целлюлазного ферментного комплекса Penicillium verruculosum: увеличение гидролитической способности с помощью методов генетической инженерии. Кат в пром. 2015, Т. 15, №6, С.78-83].

В комплекс ферментов гриба Trichoderma reesei входит эндо-1,4-β-глюканаза I. Фермент имеет массу 50 кДа и относится в 7-ой семье гликозид-гидролаз (КФ 3.2.1.4). Фермент обладает высокой удельной активностью как по отношению к β-глюкану, так и по отношению к ксилоглюкану, что позволяет расширить спектр зерновых субстратов в основе корма животных.

Таким образом, наличие в составе нового ФП высокоэффективных эндоглюканаз позволит значительно уменьшить степень полимеризации и вязкость НПС, что приведет к улучшению усвояемости животными питательных веществ корма. Также следует отметить, что увеличение экспрессии эндоглюканаз в новом рекомбинантном штамме приведет к снижению вязкости ферментационной среды за счёт деструкции полисахаридов, входящих в её состав, что позволит сделать процесс культивирования штамма более технологичным.

Кроме того, создание нового рекомбинантного штамма P.verruculosum с высоким уровнем экспрессии гомологичной эндо-β-1,4-глюканазы II и гетерологичной эндо-β-1,4-глюканазы I T.reesei увеличит выход целевых ферментов, снизив тем самым стоимость конечного продукта.

Таким образом, разработка новых высокоактивных и стабильных при повышенных температурах ФП для кормопроизводства, которые будут эффективны при кормлении сельскохозяйственных животных и птицы является важной и актуальной задачей современного агропромышленного сектора.

Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в получении комплексного ФП на основе нового рекомбинантного штамма P.verruculosum ЕЕ-105, являющегося продуцентом гомологичной эндо-β-1,4-глюканазы II, относящаяся к 5 семье гликозид-гидролаз (КФ 3.2.1.4, мол. масса 39 кДа,) и гетерологичной эндо-β-1,4-глюканазы I T.reesei (КФ 3.2.1.4, мол. масса 50 кДа), относящаяся к 7 семье гликозид-гидролаз для применения в кормопроизводстве в качестве кормовой добавки для улучшения усвояемости питательных веществ и облегчения переваривания за счет снижения вязкости кормов, содержащих зерновые, в частности, рожь и ячмень.

Технический результат от предлагаемого изобретения состоит в снижении вязкости корма, содержащего НПС злаков и повышении кормовой ценности рационов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы при обработке корма новым комплексным ФП, содержащим высокоактивные эндо-β-1,4-глюканазу I T.reesei, эндо-β-1,4-глюканазы II P.verruculosum и комплекс сопутствующих карбогидраз.

Сущность изобретения заключается в получении нового штамма-продуцента:

- P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D), который при выращивании на ферментационной среде на основе микрокристаллической целлюлозы (МКЦ), обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего высокоактивные гомологичную эндо-β-1,4-глюканазу II и гетерологичную эндо-β-1,4-глюканазу I T.reesei, и комплекс сопутствующих карбогидраз P.verruculosum. Общая активность культуральной жидкости (КЖ) по окончании ферментации в лабораторных ферментаторах составляет 1800-2000 ед/мл по Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ, рН 5,0, 50°С). Комплекс сопутствующих карбогидраз представлен целлобиогидролазой I, целлобиогидролазой II и β-глюкозидазой.

Способ получения ФП предусматривает глубинное культивирование штамма – продуцента P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) на среде, содержащей МКЦ, пшеничные отруби и дрожжевой экстракт с последующей распылительной сушкой КЖ и доведении ферментативной активности препарата до 3200 ед/г по КМЦ путем добавления кукурузной муки. Изобретение позволяет получать ФП с высокой активностью целевых эндо-β-1,4-глюканаз. Полученный ФП характеризуется высокой термостабильностью, эффективностью при обработке кормовых смесей, содержащих ячмень и/или рожь по сравнению с коммерческими ФП. Применение нового комплексного ФП позволит повысить кормовую ценность рационов на основе зерновых культур.

Изобретение реализуется следующим образом.

Штамм P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) получен из исходного штамма P.verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) путем котрансформации плазмидами pCBHI-EGII_B1 и pCBHI-EGI_Tr с последующей селекцией на агаризованной среде с 10 мМ NaNO₃.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D):

Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, сусло-агар) при t 26-30°С в течение 7-10 суток, рН 4.5-5.0.

На среде Чапека с дрожжевым экстрактом при культивировании гриба при 25°С на 7 сутки колонии достигают 24-30 мм в диаметре, складчатые, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1.5-2.0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии – палево-оранжевая. При температуре 37°С колонии диаметром 5 мм, мицелий светлый, конидиообразования нет. При температуре 5°С роста нет.

При росте на Мальц-агаре диаметр колонии 23-24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, шириной 1,5-2,0 мм. Мицелий белый, шерстистый, прижатый, конидиогенез очень слабый, практически отсутствует. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая.

При микроскопировании штамм имеет конидиеносцы двухярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2-3мкм. Метулы расходящиеся размером 10-13 х2,5-3,0 мкм, фиалиды ампуллиформные размером 7-8 х 2,8-3,0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3,0-3,5 мкм.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,35 ч^–1, в конце культивирования 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма:

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.

Резистентность к нистатину хорошая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен быстро ассимилировать глюкозу, глицерин, галактозу, D-маннозу, D-маннит, трегалозу, сорбозу и сорбит, медленнее - D-ксилозу, L- и D-арабинозу, L-рамнозу и рибозу. Слабо ассимилирует: D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу и 5-тио-D-глюкозу.

Использует неорганический и органический азот, хорошо ассимилирует нитратную и аммонийную формы азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, β-глюкане.

Штамм P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) отличается от исходного повышенной продукцией высокоактивных гомологичной эндо-β-1,4-глюканазы II и гетерологичной эндо-β-1,4-глюканазы I T.reesei, в связи с этим увеличением общей активности по КМЦ в 5 раз и значительным снижением вязкости биомассы во время ферментации – в 6 раз по сравнению с исходным штаммом.

В предлагаемом изобретении метод определения β-глюканазной, КМЦ-азной и ксиланазной активностей основан на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом Шомоди-Нельсона при гидролизе полисахаридных субстратов (β-глюкана ячменя, КМЦ и ксилана из древесины березы, соответственно). За единицу активности принимается такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в минуту при рН 5,0 и 50ºC [Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.А. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. – М.: МГУ, 1995. – 144 с]. β-Глюкозидазную активность определяли по скорости образования п-нитрофенола при гидролизе пНФГ, за единицу активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкмоль п-нитрофенола в течение 1 минуты при рН 5,0 и 40°C [Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. // Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. – М.: ВИНИТИ, 1993. Т. 25, С. 30-37].

Новый комплексный ФП обладает улучшенными эксплуатационными характеристиками, включая высокую эндо-β-1,4-глюканазную активность, увеличенную термостабильность эндо-β-1,4-глюканаз. Это является преимуществом данного ФП в сравнении с имеющимися на рынке коммерческими аналогами. Кроме того, штамм-продуцент P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) имеет улучшенные эксплуатационные характеристики за счет снижения вязкости ферментационной среды при его культивировании.

Комплексный ФП высокоактивных гомологичной эндо-β-1,4-глюканазы II и гетерологичной эндо-β-1,4-глюканазы I будет иметь высокую рентабельность его применения в кормопроизводстве за счет обеспечения высоких целевых активностей, и устойчивости ферментной системы к действию повышенных температур, необходимых условий при подготовке кормов к скармливанию и обеспечению условий для гидролиза НПС зерновой составляющей рациона корма с/х животных и птиц.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Получение рекомбинантного штамма P.verruculosum EE-105 (ВКМ F-4812D).

Плазмида pCBHI-EGII, полученная ранее в [Патент РФ 2532840 С2, 10.01.2010, Бюл. №31] и плазмида pCBHI-EGI_Tr, полученная ранее в [Осипов Д.О., Получение и характеристика мультиферментных комплексов карбогидраз и исследование их эффективности при осахаривании различных видов целлюлозосодержащих материалов. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2011, 147 c.] были одновременно трансформированы в реципиентный штамм P.verruculosum 537 (ΔniaD) совместно с трансформирующей плазмидой pSTA10 в соотношении 3:3:1 (мкг каждой ДНК) по стандартной методике [Sambrook, J., and Russell, D.W. (2001) Molecular cloning:a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; A.Y. Aleksenko, N.A. Makarova, I.V. Nikolaev, A.J. Clutterbuck, Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. 28 (1995) 474-478]. В результате трансформации было получено более 150 рекомбинантных штаммов серии P.verruculosum EЕ, из которых в результате первичного скрининга при культивировании в качалочных колбах на стандартной среде культивирования были отобраны 10 клонов, общие ферментативные активности которых представлены в Таблице 1. Стандартная среда культивирования имела следующий состав (г/л): KH₂PO₄- 15, (NH₄)₂SO₄- 5, MgSO₄×7H₂O- 0,3, CaCl₂×2H₂O- 0,3, дрожжевой экстракт- 10, МКЦ- 40, пшеничные отруби-10.

Анализ общих активностей в КЖ 10-ти рекомбинантных штаммов серии ЕЕ показал наличие клонов с различными комбинациями активностей, что позволило отобрать один штамм для дальнейших прикладных испытаний – P.verruculosum EЕ-105, который отличался наибольшей КМЦ-азной активностью по сравнению с исходным штаммом и другими рекомбинантными штаммами.

Пример 2. Культивирование штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D).

Культивирование штамма P.verruculosum ЕЕ-105 проводили в ферментере объемом 3 л, оснащенном барботером для подачи воздуха в аппарат и турбинной мешалкой на среде 1 следующего состава:

Среда 1 (г/л):

Глюкоза – 40 МКЦ – 40 Дрожжевой экстракт – 10 Пшеничные отруби – 10 KH₂PO₄ – 15 (NH₄)₂SO₄ – 5 CaCl₂ – 0,3 MgSO₄*7H₂O – 0,3

Культивирование проводили 144 ч, при рН не ниже 4,5 и 32^оС. Образцы КЖ отбирали каждые сутки, начиная с 72 ч культивирования, центрифугировали и измеряли КМЦ-азную активность.

С началом биосинтеза эндоглюканаз (чему соответствует увеличение КМЦ-азной активности в КЖ) значительно снижается вязкость ферментационной среды (фиг.1). Это означает, что присутствующие в среде полисахаридные субстраты разрушаются под действием эндоглюканаз, тем самым снижая степень полимеризации субстрата и, как следствие, уменьшая вязкость среды. Это облегчает процесс перемешивания биомассы при культивировании рекомбинантного штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D), снижая при этом энергозатраты.

По окончании ферментации грибную биомассу удаляют путём центрифугирования (4000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге Avanti JXN-26, «Beckman coulter», США), свободную от клеток КЖ концентрируют с помощью ультрафильтрации (с пределом отсечения 10 кДа), ультраконцентрат сушат на распылительной сушилке (Buchi MiniSpray Dryer B-290, условия: Т_вх=135^оС, Т_вых=55-65^оС, степень аспирации- 70%, скорость потока 0,5 л КЖ в час ) с получением сухого ФП, который представляет собой желто-коричневый легко растворимый в водной среде порошок.

Таким образом, получают сухой ФП EЕ-105 c ферментативными активностями по КМЦ – 46000 ед/г, по МКЦ – 90 ед/г, по ксилану березы- 5600 ед/г ФП и по п-НФ-β-глюкопиранозиду – 300 ед/г.

Компонентный состав ФП ЕЕ-105 определялся денситометрическим методом по интенсивности полос с помощью программы LabWork 4.6 (Media Cybernetic Links, CША). Результаты определения находятся в Таблице 2. Данные из Табл.2 свидетельствуют о значительном увеличении содержания эндоглюканаз в ФП ЕЕ-105 по сравнению с содержанием аналогичных ферментов в ФП из исходного штамма.

Далее, сухой препарат ФП ЕЕ-105 был разбавлен кукурузной мукой до 3400 Ед/ по КМЦ –и 400 Ед/г по ксилану. Разбавленная форма сухого ФП ЕЕ-105 являлась конечной формой.

Пример 3. Исследовали термостабильность ФП на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) в условиях «термошока» при 80ºС (фиг.2). Проводили сравнение термостабильности нового ФП ЕЕ-105 на основе штамма по отношению к ФП на основе исходного штамма P.verruculosum 537 и к коммерческому ФП Ронозим VP – продуценту эндоглюканаз. Для этого аликвоту раствора препарата добавляли в пробирку с предварительно разогретым до 80ºС 0,1 М ацетатным буфером (рН 5,0), тщательно перемешивали. Через определенные промежутки времени отбирали пробы для измерения КМЦ-азной активности.

Новый ФП ЕЕ-105 сохранял более 80% КМЦ-азной активности в течение трех минут инкубации при 80⁰С, контрольный ФП на основе исходного штамма сохранял около 40% КМЦ-азной активности, а Ронозим VP – 55%. Более 50% КМЦ-азной активности сохранял новый ФП ЕЕ-105 в течение 10 минут инкубации при 80⁰С. Это на 30% больше по сравнению с коммерческим ФП Ронозим VP и на более, чем 40% – по сравнению с ФП на основе исходного штамма, соответственно.

Пример 4. Определение эффективности ФП, полученного на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) при откорме поросят.

Определение эффективности использования нового ФП ЕЕ-105 проводили в условиях вивария на помесных поросятах мясных пород, боровках (♂ датский йоркшир ×♀ датский ландрас) с живой массой 12-13 кг. Были сформированы три группы свиней по 10 голов в возрасте 45-47 суток с начальной живой массой – 15-16 кг. Эксперимент был разделен на этапы: доращивания до достижения живой массы поросят до 24-25 кг и выращивания до 47-50 кг каждому, из которых соответствовали разные по составу и питательной ценности комбикорма. Кормление свиней проводили 2 раза в сутки (9.00 и 16.00) на протяжении всего опыта с повышением на 5% от нормы «Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. 2003». Доступ животных к воде свободный.

Поросята контрольной группы получали полнорационные комбикорма (ОР) в рассыпчатом виде. В состав премиксов ФП не вводили (Табл. 3).

Поросятам второй опытной группы дополнительно к (ОР) вводили ФП ЕЕ-105, полученный Примеру 2, в количестве 75 г/т корма, и третьей группе – в количестве 100 г на тонну корма.

ФП в рационы опытных групп вносили следующим образом. Комбикорма (в рассыпной форме) взвешивали в количестве 100 кг, отбирали из него 5 кг корма, помешивали в ёмкости на 10-15 литров и добавляли ФП в соответствии с их дозировкой, используемой в опыте, далее добавляли еще 5 кг корма и их снова перемешивали. В последующем полученную смесь добавляли к корму и перемешивали на смесителе минизавод «Прок» в течение 5-6 мин.

Во время опыта ежедневно проводили учет потребления комбикормов, расход на единицу прироста и его химический состав. В целях характеристики интенсивности роста и развития подопытных животных проводили взвешивание поросят в начале опыта, до достижения живой массы 24-25 кг, в возрасте 70 суток (перед началом балансового опыта) и в конце периода дорашивания.

Для определения переваримости питательных веществ корма и эффективности его использования свиньями провели два балансовых опыта в возрасте 70-76 и 76-81 суточного возраста по 3 животных с аналогичной живой массой из каждой группы. Поросята контрольной и опытных групп получали 1,5 кг комбикорма. Животные в период балансовых опытов находились в индивидуальных клетках, оборудованных кормушками для корма и воды, а также приспособлениями для сбора мочи и кала.

В ходе опыта проведен анализ кормов и кала на содержание сухого вещества, сырого протеина, жира, сырой клетчатки, сырой золы, БЭВ расчетным методом, крахмала, НПС, кальция и фосфора по общепринятым методам, азота по Къельдалю на приборе Къельтек. Валовую энергию в корме, кале и моче определяли в калориметрической бомбе.

В конце периода доращивания провели убой по 3 головы с характерной живой массой в опыте из каждой группы. При оценке качества туш и мяса были определены следующие показатели: убойный выход, морфологический состав, площадь «мышечного глазка», толщина шпика на уровне 6-7 позвонка спины данных животных.

Результаты экспериментов были обработаны методом регрессионного и корреляционного анализа и вариационной статистики (Плохинский Н.А., 1980). Для выявления статистически значимых различий использован критерий Стьюдента-Фишера по Н.А. Плохинскому (1980).

Показатели эффективности роста поросят при содержании их на рационах с экспериментальным ФП свидетельствуют о том, что добавка его в состав комбикорма оказывала положительное влияние на приросты живой массы, эффективность использования и усвоение питательных веществ корма и на конверсию корма.

Отмечено, что скармливание комбикорма с дополнительным включением ФП на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) в дозе 100 г на тонну корма оказалось более эффективным по сравнению с вводом 75 г на тонну. Установлено, что у животных третьей опытной группы среднесуточные приросты живой массы, в первый период выращивания, были выше на 20% и расход корма на единицу продукцию меньше на 6,1% по сравнению с аналогами контрольной группы табл.3.

За весь период доращивания у животных третьей опытной группы живая масса составляла 50,05±2,75 кг, а в контрольной – 47,80±1,59 кг (это на 7,7% выше по сравнению с контролем). Среднесуточные приросты у поросят третьей опытной и контрольной группы были на уровне 513±31 и 477±17г, или на 7,5% выше (Р<0,05). При этом затраты корма на 1 кг прироста у поросят этих групп были на 5,0% ниже по сравнению с контрольной группой. Поросята этой группы меньше затрачивали сырого протеина и обменной энергии на приросты живой массы на 7,8 и 8,7% по сравнению контрольной. Поросята этой группы потребляли на 2,3 кг больше по сравнению с контрольной группой.

Исследования показали, что при вводе в комбикорма свиней ФП на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) в количестве 100 г на тонну произошло улучшение переваримости питательных веществ. Так, поросята третьей группы, лучше переваривали сухое вещество – на 1,31 абс. %, органическое вещество – на 1,3, сырой протеин – на 5,43, сырой жир – на 2,08, клетчатку – на 4,73, БЭВ – на 1,44, валовую энергию – на 1,63, крахмал – на 1,11, некрахмалистые полисахариды – на 2,55 абс. % по сравнению с контрольными животными. Добавка этого ферментного препарата в рационы поросят способствует лучшему усвоению кальция и фосфора.

Таким образом, включение в состав комбикормов для растущих свиней ферментного на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) активностью целлюлазы 3400 Ед/г и ксиланазы 400 Ед/г в количестве 100 г на тонну, способствует повышению среднесуточных приростов, снижает расход корма на единицу прироста, улучшает переваримость и усвояемость питательных веществ корма по сравнению с поросятами, получавшими стандартные комбикорма, что говорит о потенциальной эффективности применения нового ферментного препарата в рационах кормления с/х животных.

Таблица 1- Ферментативная активность по отношению к различным субстратам и концентрация белка в КЖ полученных рекомбинантных штаммов по сравнению с контрольным образцом при культивировании в колбах (нетрансформированный штамм, Контроль).

№ штамма Концентрация белка в колбах, мг/мл Активность по КМЦ, ед/мл,
рН 5,0, 50^оС Активность по ксилану березы, ед/мл,
рН 5,0, 50^оС Активность по п-НФ-β-глюкопиранозиду, ед/мл
рН 5,0, 50^оС 8 6,6±0,2 282±8 223±7 66±2,0 49 6,2±0,19 393±12 268±8 33±1,0 66 6,4±0,19 202±6 232±7 39±1,2 84 5,9±0,18 194±6 230±7 38±1,1 105 5,7±0,17 480±14 260±8 52±1,6 112 4,7±0,14 221±7 220±7 33±1,0 129 4,5±0,14 216±6 216±7 62±1,9 138 6,6±0,2 199±6 225±7 59±1,8 140 6,2±0,19 215±6 227±7 62±1,9 144 4,9±0,15 223±7 190±6 36±1,1 Контроль 6,2±0,19 105±5 225±7 51±1,5

Таблица 2- Компонентный состав ФП ЕЕ-105 и ФП исходного штамма P.verruculosum 537 (ФП_исх), % от общего секретируемого комплекса ферментов

Фермент Cостав ФП ЕЕ-105 Состав ФП_исх Целлобиогидролаза I и II, 63 и 55 кДа 23 34 Эндоглюканаза I, 57 кДа 45,6 нет Эндоглюканаза II, 39 кДа 23,3 6 β-глюкозидаза, 108 кДа 0,6 1 Другие (в том числе ксиланазы) 7,5 76

Таблица 3- Состав и питательность комбикорма для свиней, %

Компоненты До 25 кг Период выращивания Ячмень 33,65 46,9 Пшеница 20,0 20,0 Кукуруза 20,0 10,0 Соя полножирная экструд. 8,0 - Шрот соевый 8,5 12,0 Шрот подсолнечный 2,0 6,0 Рыбная мука 3,5 - Масло подсолнечное 1,5 1,7 Поваренная соль 0,45 0,4 Монокальцийфосфат 0,5 0,8 Мука известковая 0,9 1,2 Премикс КС-3 1,0 КС- 4 1,0 В 1 кг содержится: ЭКЕ 1,36 1,33 Обменной энергии, МДж 13,61 13,28 Сырого протеина, г 170,2 155,6 Переваримого протеина, г 140 123,0 Лизина, г 1,26 11,20 Метионина+цистина, г 7,7 7,15 Треонина, г 8,8 7,90 Триптофан, г 2,1 2,1 Сырой жир, г 52,6 37,2 Сырой клетчатки, г 38,6 46,4 Соль поваренная, г 4,5 4,0 Кальция, г 7,50 7,94 Фосфор, г 5,8 6,69

Таблица 4- Продуктивность подопытных свиней при использовании в рационах ФП на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) (n=10, M±m).

Показатели Группа 1-я 2-я 3-я Первый период выращивания Живая масса в начале периода, кг 15,8±0,44 15,65±0.65 15.65±0.67 Живая масса в конце периода, кг 24,15±0,65 24,45±0,71 25,70±0,89 Прирост живой массы, кг 8,35± 0,45 8,80±0,17 10,05±0,32* Среднесуточный прирост, г 363±22 382±7 437±14* Потреблено корма на 1 гол., кг 24,6 25,0 27,3 Затрачено на 1 кг прироста: корма, кг 2,95 2,84 2,77 Второй период выращивания Живая масса в начале периода, кг 24,15±0,65 24,45±0,71 25,70±0,89 Живая масса в конце периода, кг 47,80±1,59 48,45±2,24 51,05±1,75* Прирост живой массы, кг 23,65±1,16 24,0±1,55 25,35±1,51 Среднесуточный прирост, г 537±31 545±35 579±36* Потреблено корма на 1 гол., кг 78,0 78,2 79,6 Затрачено на 1 кг прироста: корма, кг 3,30 3,26 3,14 За весь период выращивания Живая масса в начале периода, кг 15,8±0,44 15,65±0.65 15.65±0.67 Живая масса в конце периода, кг 47,80±1,59 48,45±2,24 51,05±1,75* Прирост живой массы, кг 32,0±1,18 32,8±2,65 35,4±1,68 Среднесуточный прирост, г 477±17 489±40 528±21* Потреблено корма на 1 гол., кг 102,6 103,2 104,9 Затрачено на 1 кг прироста: корма, кг 3,21 3,14 2,96 сырого протеина, г 522 500 481 обменной энергии, МДж 42,84 42,01 39,1

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum EЕ-105, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4812D, продуцент эндо1,4-β-глюканазы II Penicillium verruculosum и эндо1,4-β-глюканазы I Trichoderma reesei. Предложен способ получения кормового ферментного препарата с повышенным содержанием эндо1,4-β-глюканазы II Penicillium verruculosum и эндо1,4-β-глюканазы I Trichoderma reesei с использованием указанного штамма. Группа изобретений позволяет получать комплексный ферментный препарат, который может быть использован в кормопроизводстве в качестве кормовой добавки для улучшения усвояемости питательных веществ и облегчения переваривания за счет снижения вязкости кормов, содержащих зерновые, а также повысить кормовую ценность рационов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 4 пр.

1. Рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum EЕ-105, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4812D, продуцент эндо1,4-β-глюканазы II Penicillium verruculosum и эндо1,4-β-глюканазы I Trichoderma reesei.

2. Способ получения кормового ферментного препарата с повышенным содержанием эндо1,4-β-глюканазы II Penicillium verruculosum и эндо1,4-β-глюканазы I Trichoderma reesei путём глубинного культивирования штамма мицелиального гриба Penicillium verruculosum EE-105 по п.1, на питательной среде в ферментёрах с последующим отделением биомассы гриба, ультрафильтрацией культуральной жидкости и последующего высушивания с помощью распылительной сушилки.