Способ получения ингибитора трипсина из люцерны посевной Российский патент 2019 года по МПК A61K36/48 

Изобретение относится к способу получения ингибитора трипсина из люцерны посевной направленно на сокращение времени проведения процесса получения и увеличения степени очистки ингибитора трипсина из люцерны.

Известен способ получения ингибитора трипсина из люцерны А.С. СССР №1440924, заключающийся в связывании ингибитора трипсина из коричневого сока на аффинном сорбенте. Сорбент представляет собой поливиниловый спирт волокнистой структуры, предварительно активированный n-толуолсульфохлоридом и содержащим 47-60 мг трипсина на 1 г сухого сорбента, с последующей десорбцией целевого продукта.

Недостатком известного способа является длительность проведения процесса получения и недостаточная степень очистки ингибитора трипсина, которая составила 150-159 раз.

Наиболее близким к заявленному является способ получения ингибитора трипсина А.С. СССР №1162081 [Новиков Ю.Ф., Новиков Н.Н., Соколова Е.В., Шаповал И.В., Пройдак Н.И., Любецкая Х.А., Сухинин В.Н., Маслова Н.Ф., Потапов Н.В.]. В соответствии с этим способом сок коричневого цвета, полученный из люцерны посевной, использовали для биоспецифической колоночной хроматографии, в колонке объемом 265 см³ (150×15). Всего использовали 17 порций сока общим объемом 4,2 литра.

Недостатком известного способа является многоэтапность и длительность проведения очистки ингибитора при проведении биоспецифической хроматографии, поскольку она проводилась в колонке с объемом 265 см³. Ограниченный объем колонки приводит к тому, что супернатант, полученный после центрифугирования, необходимо делить на 17 порций. Такое длительное и многоэтапное проведение операции очистки приводит к потерям продукта, снижению степени очистки и снижению активности ингибитора.

Технический результат изобретения - упрощение способа получения целевого продукта. Направленно на сокращение времени проведения процесса получения и увеличения степени очистки ингибитора трипсина из люцерны посевной.

Технический результат достигается тем, что очистку ингибитора трипсина из люцерны посевной проводят в один этап, в емкости с мешалкой с прибавлением сорбента. Сок коричневого цвета помещают в емкость с мешалкой и сюда же вносят сорбент трипсин-сефарозу, содержимое перемешивают в течение 10-15 минут, температуру в емкости поддерживают в диапазоне 36-38°С. Полноту связывания ингибитора трипсина определяют в отдельном опыте по величине активности трипсина. Пигменты и неспецифические связанные белки удаляют промыванием водой и ацетатным буфером с 0,3 М хлоридом натрия, рН раствора 7.

Десорбцию ингибитора осуществляют 0,15 М ацетатным буферным раствором с 0,3 М хлоридом натрия. Тонкую очистку ингибитора проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-75. Ингибитор осаждают сернокислым аммонием до насыщения 70% с последующим центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 15 минут и подвергают диализу через полупроницаемую мембрану против воды с 0,3 М хлоридом натрия. Полученный ингибитор трипсина замораживают и сушат в лиофильной сушилке.

Удельная активность полученного ингибитора трипсина составила 7,41±0,86 мг/мг белка, степень очистки 180-190 раз. Выход целевого продукта составил около 0,012-0,013 г из 1 килограмма исходного сырья.

Осуществление заявленного способа поясняется следующим примером технологического процесса.

Люцерну посевную в стадии бутонизации скашивают, измельчают при помощи измельчителя «Волгарь -5 А», отбирают 5 килограмм, далее из измельченной массы отжимают зеленый сок. В емкости, методом температурной коагуляции, нагревая сок до температуры 85°С, отделяют сопутствующие вещества, образовавшийся осадок осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 минут. Полученный раствор помещают в емкость объемом 8000 см³ для проведения сорбции, в нее вносят сорбент - трипсин-сефарозу, содержимое перемешивают в течение 10-15 минут, температуру раствора поддерживают в диапазоне 36-39°. Полноту связывания ингибитора трипсина определяют в отдельном опыте по активности трипсина. Пигменты и неспецифические связанные белки удаляют промыванием содержимого водой и ацетатным буфером с 0,3 М хлорида натрия, рН равна 7.

Десорбцию ингибитора осуществляют 0,15 М ацетатным буферным раствором с 0,3 М хлорида натрия. Ингибитор трипсина из полученного раствора осаждают сернокислым аммонием до насыщения 70% с последующим центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 15 минут. Тонкую очистку ингибитора проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-75. После очистки ингибитор подвергают диализу через полупроницаемую мембрану против воды с 0,3 М хлорида натрия. Полученный ингибитор трипсина замораживают и сушат в лиофильной сушилке.

Выход целевого продукта составляет около 0,012 г из 1 килограмма исходного сырья, степень очистки 180-190 раз. Удельная активность полученного ингибитора трипсина составила 7,41±0,86 мг/мг белка.

Предлагаемая совокупность отличительных признаков (проведение процесса очистки в один этап в емкости с мешалкой, тонкая очистка ингибитора методом гель-фильтрации на сефадексе G-75, осаждение продукта сернокислым аммонием до насыщения 70% и диализ его через полупроницаемую мембрану) взамен многоэтапного способа получения ингибитора трипсина в колонке с объемом 265 см, включающий биоспецифическую очистку ингибитора трипсина в один этап, тонкую очистку методом гель-фильтрации, осаждение сернокислым аммонием, диализ и лиофильное высушивание готового продукта позволяет:

- упростить способ получения целевого продукта - ингибитора трипсина;

- увеличить степень очистки целевого продукта (степень очистки 180-190 раз) за счет проведения процесса биоспецифической сорбции в один этап и тонкой очистки методом гель-фильтрации с последующим осаждением сернокислым аммонием и лиофильной сушкой.

- получить целевой продукт с более высокой удельной активностью (удельная активность полученного ингибитора трипсина составляла 7,41±0,86 мг/мг белка).

Изобретение относится к способу получения ингибитора трипсина из люцерны посевной. Способ получения ингибитора трипсина из люцерны посевной путем температурной коагуляции сока, полученного из вегетативной массы люцерны, аффинной хроматографии на специфическом сорбенте, при этом очистку ингибитора трипсина из люцерны посевной проводят в один этап, для этого сок коричневого цвета помещают в емкость с мешалкой и сюда же вносят сорбент трипсин-сефарозу, затем содержимое перемешивают, пигменты и неспецифические связанные белки удаляют промыванием водой и ацетатным буфером с 0,3 М хлоридом натрия, десорбцию ингибитора осуществляют 0,15 М ацетатным буферным раствором с 0,3 М хлоридом натрия, тонкую очистку ингибитора проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-75, далее ингибитор осаждают сернокислым аммонием до насыщения 70% с последующим центрифугированием и подвергают диализу через полупроницаемую мембрану против воды с 0,3 М хлоридом натрия, полученный ингибитор трипсина замораживают и сушат в лиофильной сушилке при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет упростить способ получения целевого продукта, сокращает время проведения процесса получения и увеличивает степень очистки ингибитора трипсина из люцерны посевной.

Способ получения ингибитора трипсина из люцерны посевной путем температурной коагуляции сока, полученного из вегетативной массы люцерны, аффинной хроматографии на специфическом сорбенте, отличающийся тем, что очистку ингибитора трипсина из люцерны посевной проводят в один этап, при этом сок коричневого цвета помещают в емкость с мешалкой и сюда же вносят сорбент трипсин-сефарозу, затем содержимое перемешивают в течение 10-15 минут, температуру в емкости поддерживают в диапазоне 36-38°С, пигменты и неспецифические связанные белки удаляют промыванием водой и ацетатным буфером с 0,3 М хлоридом натрия, рН раствора 7, десорбцию ингибитора осуществляют 0,15 М ацетатным буферным раствором с 0,3 М хлоридом натрия, тонкую очистку ингибитора проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-75, далее ингибитор осаждают сернокислым аммонием до насыщения 70% с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 минут и подвергают диализу через полупроницаемую мембрану против воды с 0,3 М хлоридом натрия, полученный ингибитор трипсина замораживают и сушат в лиофильной сушилке.