Способ определения атерогенной активности пищевых продуктов Российский патент 2019 года по МПК G01N33/00 G01N33/48 C12N5/786 C12Q1/60 

Изобретение относится к профилактической медицине, оценке безопасности пищевых продуктов (ПП), гигиене питания, экологии человека и может быть использовано для определения атерогенности ПП, содержащих компоненты, инициирующие развитие такого заболевания, как атеросклероз.

Атеросклероз является сложным хроническим воспалительным процессом повреждения сосудов, развивающимся на фоне нарушений холестеринового обмена, который приводит к структурной модификации сосудистого эндотелия и разрастанию соединительной ткани, обуславливая формирование атеросклеротической бляшки.

Атеросклероз и его осложнения - ишемическая болезнь сердца, инсульт, поражение сосудов нижних конечностей продолжают оставаться наиболее частой причиной инвалидизации и смертности населения в экономически развитых странах Европы, США и особенно России. Одна из причин развития атеросклероза - употребление потенциально опасной пищи. Известно, что компоненты состава ПП могут играть существенную роль в атерогенезе, индуцируя накопление холестерина в сосудистой стенке, что ведет, в конечном счете, к развитию атеросклеротических бляшек [1-4]. Тем не менее, значимость различных факторов питания в развитии такой патологии, как атеросклероз, изучена недостаточно, а результатом многочисленных научных исследований являются только общие рекомендации о полезности тех или иных ПП.

В то же время, помимо рутинно тестируемых показателей состава ПП (холестерин, насыщенные жирные кислоты, транс-жиры и т.п.), существует несколько десятков пищевых дополнительных факторов, которые также вносят вклад в развитие атеросклероза [5].

Признавая важность питания в развитии атеросклероза и его последствий, следует учесть, что объектами потребления населения становятся многочисленные новые ПП, особенности химического состава которых могут существенно повлиять на протекание разных патологических процессов в организме, включая атерогенез.

В настоящее время в лабораторной практике отсутствуют доступные экспресс-методы определения атерогенности как традиционных, так и новых пищевых продуктов.

Известен способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем [6], используемый для доклинической оценки токсичности биологически активных веществ, а также для контроля качества сырья и пищевых ингредиентов. Способ включает три этапа: подготовку исследуемого объекта, подготовку тест-системы и определение безопасности объекта для тест-системы. Безопасность пищевых ингредиентов оценивают на основании определения жизнеспособности культуры клеток с использованием камеры Горяева и цитопатической активности изучаемых объектов.

Главным недостатком этого изобретения является возможность только общей, суммарной оценки гигиенической безопасности ПП, без конкретизации вероятного развития патологии, в частности, атеросклероза.

Таким образом, остается актуальной разработка относительно простых, доступных способов определения атерогенности ПП в целом и/или их ингредиентов. Техническим результатом предлагаемого способа является устранение вышеуказанного недостатка изобретения-аналога, расширение арсенала способов определения способности компонентов состава ПП вызывать сердечно-сосудистые заболевания.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа определения атерогенности ПП, содержащих компоненты, инициирующие развитие атеросклероза, пригодного для рутинных исследований с высокой точностью и относительно небольшой затратой времени.

Эта задача решается тем, что для количественной оценки эффекта ПП на атерогенез используется биологическая модель, представляющая собой клеточную культуру, которой являются макрофаги, полученные из моноцитов крови здоровых людей. Особенность этих клеток - сохранение в культуре in vitro характеристик, присущих им в состоянии in vivo: Собственно, атерогенность как искомый показатель оценивается как способность сыворотки крови человека индуцировать накопление холестерина в клеточной культуре.

Этот результат достигается тем, что определение атерогенности ПП проводят в клеточной модели ex vivo, применение которой заключается в следующем. Испытуемые-добровольцы потребляют изучаемый ПП, после чего тестируется сыворотка их крови на способность вызывать накопление холестерина в клеточной модели. Таким образом, поведение клеточной модели отражает биологическую активность компонентов ПП, претерпевших следующие стадии: попадание в организм человека, распределение в нем и последующая биотрасформация.

Способ определения атерогенности ПП включает следующие три стадии.

1. Подготовка клеточной модели моноцитов-макрофагов для оценки накопления холестерина. Методика выделения и культивирования моноцитов-макрофагов крови человека является общеизвестной и описана как градиентное центрифугирование [7], так и магнитная сепарация [8].

2. Взятие крови у добровольцев, не имеющих признаков клинических проявлений атеросклероза или системных воспалительных заболеваний, для получения сыворотки как непосредственно перед приемом исследуемого ПП (контроль), так и через соответствующие интервалы времени после его приема внутрь (обычно через 2, 4 и 6 часов при скрининговых исследованиях и при оценке краткосрочного действия, а также через 4, 8, 12 и 24 часа при оценке длительности эффекта).

3. Анализ накопления холестерина в моноцитах и/или макрофагах in vitro. Эффект (накопление холестерина или атерогенность исследуемых ПП в модели ex vivo) определяется как их способность статистически достоверно повышать содержание холестерина в культивируемых клетках.

Данная модель максимально приближена к ситуации в организме, что позволяет легко интерпретировать результаты, полученные на этой модели. Поскольку в сыворотке содержатся все компоненты, которые могут влиять на накопление холестерина, получаемые данные следует рассматривать как интегральный показатель, отражающий конечный результат влияния всех возможных эффекторов на накопление холестерина.

Примеры проведения анализа, иллюстрирующие использование модели ex vivo для оценки влияния ПП на атерогенность сыворотки крови добровольцев, потребляющих исследуемые ПП.

Пример 1. Изучалась атерогенность сливочного масла. В день эксперимента питательную среду макрофагов заменяли на свежую среду и к ней добавляли исследуемую сыворотку в концентрации 10%. Контрольные клетки инкубировали в среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки инкубировали в течение 24 часов, после чего трижды отмывали буферным раствором. По окончании эксперимента клетки фиксировали смесью гексана и изопропанола в соотношении 3:2. В полученном экстракте определяли содержание холестерина ферментативным методом и нормировали на количество клеточного белка.

Примечание: * - достоверное повышение атерогенности сыворотки крови, р<0,05.

Выводы. Продукт атерогенный. Возможные носители атерогенности -насыщенные жирные кислоты (лауриновая, миристиновая, пальмитиновая, стеариновая).

Пример 2. Проведение опыта - по аналогии с примером 1.

Примечание: * - достоверное повышение атерогенности сыворотки крови, р<0,05.

Выводы. Продукт атерогенный. Возможные носители атерогенности - транс-жиры.

Пример 3. Проведение опыта - по аналогии с примером 1.

Примечание: * - достоверное снижение атерогенности сыворотки крови, р<0,05.

Выводы. Продукт (БАД) антиатерогенный. Возможные носители антиатерогенного действия - серусодержащие кислоты аллицин и аджоен.

Пример 4. Средние показатели снижения атерогенности сыворотки крови при однократном приеме рыбьего жира (производитель Omega-3 Fish Oil, Solgar, США)

Примечание: * - достоверное снижение уровня внутриклеточного холестерина, р<0,05.

Выводы. Продукт антиатерогенный. Возможные носители антиатерогенного действия - полиненасыщенные жирные кислоты.

Основное преимущество предлагаемого способа - интегральная оценка атерогенности ПП на клеточной культуре моноцитов/макрофагов человека с учетом возможной биотрансформации компонентов ПП в организме, что позволяет получить предварительное заключение о влиянии на организм продукта в целом, до идентификации конкретных соединений-носителей этой атерогенности.

Литература

1. Самсонов М.А. Концепция сбалансированного питания и ее значение в изучении механизмов лечебного действия пищи // Вопросы питания. - 2011. - №5. - С. 3-9.

2. Volek J.S., Fernandez M.L., Feinman R.D. Dietary carbohydrate restriction induces a unique metabolic state positively affecting atherogenic dyslipidemia, fatty acid partitioning, and metabolic syndrome // Progress in Lipid Research. - 2008. - 6. - P. 1-12.

3. Harris W.S. The Omega-3 Index: A new risk factor for sudden cardiac death? / W.S. Harris, C. von Schacky // Prev. Med. Med. - 2004. - Vol. 39. - P. 212-220.

4. Г.И. Симонова, B.A. Тутельян, A.B. Погожева. Питание и атеросклероз. Сибирский научный медицинский журнал, 2006, т. 3, с. 80-85.

5. Mustad V.A. Beyond Cholesterol lowering: Deciphering the Benefits of Dietary Intervention on Cardiovascular Diseases / V.A. Mustad, P.M. Kris-Etherton // Current Atherosclerosis report. - 2000. - №2. - P. 461-466.

6. «Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем». Патент на изобретение №: 2604802. Дата публикации: Декабрь 10, 2016.

7. Adams D.O. 1979. Macrophages. Methods Enzymol. 58: 494-505.

8. Грачев A.H., Карагодин В.П., Мясоедова В.А., Кириченко Т.В., Рудимов Е.Н., Орехова Е.А., Хренов М.О., Авхачева Н.В., Мубаракшина Э.К., Кжышковская Ю.Г., Орехов А.Н. Выделение моноцитов из крови человека для изучения влияния факторов внешней среды на иммунитет. Бюллетень Московского общества испытателей природы, 2009, 114(3):291-296.

Изобретение относится к области профилактической медицины, а именно к способу определения атерогенной активности пищевых продуктов, предусматривающему использование клеточной модели моноцитов-макрофагов, выделенных из крови здорового человека, для введения в нее сыворотки крови, взятой у добровольцев, получавших исследуемый пищевой продукт в течение определенного времени, с последующим измерением накопления холестерина в моноцитах-макрофагах модели под действием сыворотки крови и определением ее способности статистически достоверно повышать содержание холестерина в культивируемых клетках. Настоящее изобретение обеспечивает разработку относительно простых, доступных способов определения атерогенности пищевых продуктов в целом и/или их ингредиентов, расширение арсенала способов определения способности компонентов состава пищевых продуктов вызывать сердечно-сосудистые заболевания. 4 табл., 4 пр.

Способ определения атерогенной активности пищевых продуктов, предусматривающий использование клеточной модели моноцитов-макрофагов, выделенных из крови здорового человека, для введения в нее сыворотки крови, взятой у добровольцев, получавших исследуемый пищевой продукт в течение определенного времени, с последующим измерением накопления холестерина в моноцитах-макрофагах модели под действием сыворотки крови и определением ее способности статистически достоверно повышать содержание холестерина в культивируемых клетках.