Способ выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/68 

Описание патента на изобретение RU2700478C1

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных.

Известна диагностика на лептоспироз путем исследования мочи методом полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (патент РФ №2540643, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2015 г.).

Также известно использование ПЦР для диагностики лептоспироза у сельскохозяйственных животных для этого проводили две амплификации: первая - с внешней парой праймеров (LepF и LepR), вторая - с внутренней (16LNF и 16LNR). Использовали универсальные праймеры, позволяющие определять участок генома, кодирующий 16S рРНК. Выявление продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Гели анализировали, используя ультрафиолетовый трансиллюминатор .

Исследуемые пробы считали отрицательными, если на электрофоре-граммах не было четких полос или полосы не соответствовали по размеру фрагменту в контрольной пробе (т.е. располагались на другом расстоянии от старта). (Викторова Е.В. Автореферат диссертации по ветеринарии на тему «Полимеразная цепная реакция при диагностике лептоспироза и изучение органотропности лептоспир у сельскохозяйственных животных», Москва, 2006 г.)

Недостатком известного технического решения является не достаточная чувствительность из-за проведения ПЦР в агарозном геле

Наиболее близким аналогом является техническое решение (Инструкция по применению набора реагентов для выявления 16S РНК патогенных геновидов лептоспир в клиническом, аутопсийном и биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс Leptospira-FL», Москва, 2018 г. - прототип) в котором осуществляют выделение нуклеиновой кислоты из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.), а по каналу FAM/Green - накопление сигнала внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) присутствует и результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) отсутствует и результат реакции - отрицательный.

Недостатком является наличие процесса выделения РНК для получения кДНК, что влечет за собой увеличение трудозатрат, времени и использование дополнительных реагентов.

Техническим результатом является уменьшение трудозатрат, времени и расходного материала при проведении ПЦР.

Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных, включающем выделение нуклеиновой кислоты из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.), а по каналу FAM/Green - накопление сигнала внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) присутствует и результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) отсутствует и результат реакции - отрицательный, согласно изобретению выделяют ДНК из биологического материала от инфицированных животных и для внутреннего контрольного образца используют суспен-зию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.Lpts) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

прямой праймер

обратный праймер

зонд

зонд

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для является уменьшение трудозатрат, времени и расходного материала при проведении ПЦР выделяют ДНК из биологического материала от инфицированных животных и используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, так как относится к средствам выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM/Green для тестирования сигнала от внутреннего контрольного образца ВКО; на фиг. 2 канал JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp. Lpts)

Способ выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных осуществляется следующим образом. Выделяют ДНК из биологического материала от инфицированных животных. В качестве биологического материала используют по выбору: цельную кровь (от животных с острой формой инфекции), фрагменты тканей и органов от павших животных (мозг, легкие, почки) и мочу. Для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.Lpts) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

прямой праймер

обратный праймер

зонд

зонд

Осуществляют постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow (фиг. 2) накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.), а по каналу FAM/Green - накопление сигнала внутреннего контрольного образца (фиг. 1), проводят интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) присутствует и результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) отсутствует и результат реакции - отрицательный.

Пример конкретного осуществления способа выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных. Для исследования используют следующий материал:

• Цельная кровь (от животных с острой формой инфекции). Кровь забирается в пробирку с 3-6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.

• Фрагменты тканей и органов от павших животных (мозг, легкие, почки) отбирают в стерильный контейнер.

• Мочу отбирают в количестве 15 - 25 мл в специальный сухой стерильный флакон или контейнер. Если нет возможности исследовать материал в течение суток вносят глицерин до 10% от объема, перемешивают и хранят при температуре не выше 16°С.

Подготовка исследуемого материала: Кровь. Пробирку с кровью аккуратно несколько раз переворачивают для равномерного перемешивания. Затем готовят плазму центрифугированием в течение 6-10 мин при 1000 g. Отбирают плазму в пробирки по 1 мл и центрифугируют на микроцентрифуге при 13 тыс. об/мин в течение 10 мин для концентрирования бактериальных клеток. Удаляют 900 мкл надосадочной плазмы, оставшиеся 100 мкл надосадка используют для экстракции ДНК.

Исследуемые пробы фрагментов тканей и органов от павших животных гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, добавляют десятикратный объем стерильного физиологического раствора или фосфатного буфера и тщательно перемешивают. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 600-1600 g (2000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 2-5 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.

Мочу после сбора отстаивают в течение 1 часа, затем осторожно сливают, оставляя придонную часть - около 10 мл. Центрифугируют остаток при 5000-6000 g 10 мин, удаляют надосадочную жидкость (не полностью), осадок с 100 мкл надосадочной жидкости переносят в пробирку объемом 1,5 мл и используют для экстракции ДНК.

Проведение анализа

Для проведения анализа используют набор «ПЦР-ЛЕПТОСПИРОЗ-ФАКТОР» в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-ЛЕПТОСПИРОЗ-ФАКТОР» для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ТУ 21.10.60-129-51062356-2017, для диагностики in vitro, (http://www. vetfaktor.ru/.).

Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2).

Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.

* Возможна легкая опалесценция

Анализ состоит из трех этапов:

- экстракция нуклеиновой кислоты (НК), на этом этапе дополнительно используют реактивы для экстракции, например набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР»);

- проведение ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;

- учет результатов анализа.

Для экстракции (выделения) НК из биологического материала отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) LEPTO.

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы вносят ОКО (пробирку обозначить как ВК-).

Выделяют НК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.

Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.

Подготовка образцов к проведению ПЦР

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительный контрольный образец (ПКО) LEPTO, ВКО LEPTO и ДНК буфера, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.).

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию ПЦР:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ LEPTO

10 мкл смеси ПЦР БУФЕР LEPTO

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы;

в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) 10 мкл ПКО LEPTO ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией проводят с помощью прибора «Rotor-Gene Q», подготовленные для проведения ПЦР пробирки помещают в его ячейки. Далее программируют прибор согласно инструкции производителя.

Интерпретацию результатов анализа проводят по полученным кривым накопления флуоресцентного сигнала, которые анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца). Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- (на канале JOE(HEX)/Yellow) и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых по каналу FAM/Green (фиг. 1) значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом по каналу JOE(HEX)/Yellow отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.

Образец считается положительным (ДНК бактерий рода Leptospira присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow (фиг 2), при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения ДНК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow более 35), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики. В случае получения значения Ct на канале JOE(HEX)/Yellow менее 35 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.

Эффективность заявляемого технического решения по сравнению с прототипом подтверждается сравнительным анализом по части расходного материала, трудозатрат и времени. В прототипе необходимо использовать набор реагентов в 4 формах комплектации, а в заявляемом же всего 2 формы комплектов. Что касается сокращения трудозатрат и времени, то исключение выделения РНК из биологического материал и проведения реакции обратной транскрипции, уже влечет за собой сокращение трудозатрат и времени.

Похожие патенты RU2700478C1

название год авторы номер документа
Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных 2018
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Василевич Федор Иванович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Самуйленко Анатолий Яковлевич
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Калашникова Татьяна Валерьевна
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Лоретц Ольга Геннадьевна
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Гринь Светлана Анатольевна
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Исаева Альбина Геннадиевна
  • Кулакова Мария Александровна
RU2680094C1
Способ выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных 2018
  • Малышев Денис Владиславович
  • Баннов Василий Александрович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Василевич Федор Иванович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Лоретц Ольга Геннадьевна
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Гулюкин Алексей Михайлович
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Суханова Светлана Фаилевна
  • Мищенко Алексей Владимирович
RU2703400C1
Способ выявления ДНК хламидий у сельскохозяйственных животных и птиц 2018
  • Баннов Василий Александрович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Уша Борис Вениаминович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Гулюкин Михаил Иванович
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Шахов Алексей Гаврилович
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Горковенко Наталья Евгеньевна
RU2700381C1
Способ выявления ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) в биологическом материале животных, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения 2018
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Черных Олег Юрьевич
  • Малышев Денис Владиславович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Шабунин Сергей Викторович
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Уша Борис Вениаминович
  • Василевич Федор Иванович
  • Гулюкин Алексей Михаилович
  • Гринь Светлана Анатольевна
  • Исаева Альбина Геннадиевна
  • Барашкин Михаил Иванович
  • Баннов Василий Александрович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
RU2700476C1
Способ выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени 2021
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Василевич Федор Иванович
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Пономарева Ольга Ивановна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Белоусов Василий Иванович
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Дмитрив Николай Иванович
RU2782427C1
Тест-система для обнаружения генома возбудителя ДНК Bordetella bronchiseptica инфекции у сельскохозяйственных животных 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Макаров Юрий Анатольевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Юлдашбаев Юсупжан Артыкович
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Сисягин Павел Николаевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Неверова Ольга Петровна
  • Чернов Альберт Николаевич
RU2700477C1
Тест-система для выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени 2021
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Малышев Денис Владиславович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Василевич Федор Иванович
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Пономарева Ольга Ивановна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Белоусов Василий Иванович
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Дмитрив Николай Иванович
RU2785381C1
Тест-система для выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных 2018
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Черных Олег Юрьевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Самуйленко Анатолий Яковлевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Дорожкин Василий Иванович
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Лайшев Касим Анверович
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Мищенко Алексей Владимирович
  • Гринь Светлана Анатольевна
  • Вацаев Шахаб Вахидович
  • Калошкина Инна Муратовна
RU2700255C1
Способ обнаружения ДНК генома возбудителя бордетеллеза (Bordetella bronchiseptica) у сельскохозяйственных животных 2018
  • Баннов Василий Александрович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Клименко Александр Иванович
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Стекольников Анатолий Александрович
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Иванов Аркадий Васильевич
  • Исаева Альбина Геннадиевна
  • Хахов Латиф Асланбиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
RU2703405C1
Тест-система для выявления ДНК сальмонелл (Salmonella spp.) в биологическом материале животных, продуктах питания и кормах животного и растительного происхождения 2018
  • Черных Олег Юрьевич
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Донник Ирина Михайловна
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Самуйленко Анатолий Яковлевич
  • Смирнов Анатолий Михайлович
  • Сисягин Павел Николаевич
  • Иванов Аркадий Васильевич
  • Авилов Вячеслав Михайлович
  • Кривоногова Анна Сергеевна
  • Неверова Ольга Петровна
  • Баннов Василий Александрович
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Малышев Денис Владиславович
RU2700247C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 700 478 C1

Реферат патента 2019 года Способ выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных, включающий выделение нуклеиновой кислоты из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение по каналу JOE(HEX)/Yellow, накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.), а по каналу FAM/Green накопление сигнала внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) присутствует и результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) отсутствует и результат реакции отрицательный, где для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.Lpts) и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1. Изобретение позволяет упростить выявление ДНК возбудителя лептоспироза. 2 ил., 4 табл.

Формула изобретения RU 2 700 478 C1

Способ выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных, включающий выделение нуклеиновой кислоты из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измерение по каналу JOE(HEX)/Yellow, накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.), а по каналу FAM/Green накопление сигнала внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) присутствует и результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) отсутствует и результат реакции отрицательный, отличающийся тем, что для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

Lpts F CCCGCGTCCGATTAG прямой праймер

Lpts R TCCATTGTGGCCGRACAC обратный праймер

Lpts Р [R60]CTCACCAAGGCGACGATCGGTAGC[BHQ1]зонд

T4F TACATATAAATCACGCAAAGC

T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG

Т4Р FAM ACATTGGCACTGACCGAGTTC BHQ1зонд.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2019 года RU2700478C1

Устройство для электрической сигнализации 1918
  • Бенаурм В.И.
SU16A1
СПОСОБ ОТБОРА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА У ДИКИХ ЖИВОТНЫХ 2013
  • Неустроев Михаил Петрович
  • Тарабукина Надежда Петровна
  • Романова Ульяна Николаевна
  • Степанова Анна Михайловна
  • Трофимов Игнат Игнатьевич
  • Иванова Лидия Ивановна
RU2540643C1

RU 2 700 478 C1

Авторы

Малышев Денис Владиславович

Баннов Василий Александрович

Черных Олег Юрьевич

Котельникова Александра Андреевна

Джавадов Эдуард Джавадович

Дробин Юрий Дмитриевич

Донник Ирина Михайловна

Калашникова Татьяна Валерьевна

Лысенко Александр Анатолиевич

Лоретц Ольга Геннадьевна

Кривонос Роман Анатольевич

Лайшев Касим Анверович

Шевкопляс Владимир Николаевич

Тюрин Владимир Григорьевич

Кощаев Андрей Георгиевич

Шаравьев Павел Викторович

Кулакова Мария Александровна

Даты

2019-09-17Публикация

2018-10-01Подача