Применение водорастворимых производных фуллерена в качестве лекарственных препаратов нейропротекторного и противоопухолевого действия Российский патент 2019 года по МПК C01B32/152 A61P25/28 

Изобретение относится к химической и фармацевтической отраслям промышленности и касается нейропротекторныхсредств и композиций на основе водорастворимых производных фуллерена C₆₀. Изобретение может найти применение в биомедицинских исследованиях и производстве новых лекарственных препаратов, предназначенных для лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний.

Благодаря своим уникальным структуре и физико-химическим свойствам фуллерены нашли применение в различных областях материаловедения, энергетики и медицины. Для медицины фуллерены и их производные ценны своей антибактериальной, противовирусной, нейропротекторной, противоопухолевой активностями.

Биологическая активность производных фуллеренов находится в строгой зависимости от их строения и типа солюбилизирующих аддендов. Согласно компьютерным расчетам, немодифицированный фуллерен C₆₀, проникая в клеточную мембрану, равномерно распределяется по билипидному слою. Внедрение фуллерена в клеточную мембрану приводит к ее деформации и может привести к нарушению ее функций. Напротив, водорастворимые поликарбоксильные производные фуллерена C₆₀-аддукты малоновой кислоты (стереоизомеры C₃ и D₃)- адсорбируются на заряженной гидрофильной поверхности бислоя и не склонны проникать в подповерхностный слой, образуя контакт с гидрофобными хвостами фосфолипидов [1 - M.E.Bozdaganyan and ets., Comparative Computational Study of Interaction of C₆₀ - Fullerene and Tris-Malonyl-C₆₀-Fullerene Isomers with Lipid Bilayer: Relation to Their Antioxidant Effect, PLoS ONE, 2014, 9, e102487].

Нейропротекторное действие фуллеренов и их производных широко известно и связано с их антиоксидантной активностью, способностью «захватывать» свободные радикалы, а также с антиамилоидными свойствами. Накопление амилоидных бляшек (β-амилоидов) является одной из ключевых особенностей протекания болезни Альцгеймера. Олигомеризация β-амилоидов, вызванная повышенной продукцией активных форм кислорода, признается важным фактором в дисфункции нейронов и запуске программируемой клеточной гибели (апоптоза). Установлено, что фуллерены также могут приводить к расщеплению β-амилоидов, снижая разрушительное действие таких пептидов [2 - С.-М. Lee and ets., C₆₀ fullerene-pentoxifylline dyad nanoparticles enhance autophagy to avoid cytotoxic effects caused by the β-amyloidpeptide, Nanomedicine., 2011, 7(1), 107-114].

На основании вышеизложенного можно сделать вывод о том, что производные фуллеренов являются перспективными объектами для использования в медицине. Однако их практическому внедрению препятствует фактически нулевая растворимость немодифицированных фуллеренов в воде. Исторически первыми попытками солюбилизации фуллеренов в водных средах были работы по получению их коллоидных суспензий в воде, а также растворов с использованием супрамолекулярных взаимодействий фуллеренов и каликсаренов, циклодекстринов или других солюбилизирующих агентов [3 - A.W. Jensen, S.R. Wilson and D.I. Schuster, Biological Applications of Fullerenes, Bioorg. Med. Chem., 1996, 4, 767-779]. Концентрация фуллерена в полученных таким образом коллоидных растворах низка и остается опасность присутствия токсичных органических растворителей. Кроме того, такие формы фуллерена неизбежно накапливаются в мембранах клеток, плохо выводятся из организма и приводят к токсическим эффектам. Напротив, ковалентное присоединение полярных солюбилизирующих групп является наиболее эффективным подходом к получению водорастворимых производных. Были синтезированы водорастворимые метанофуллерены, пирролидинофуллерены, фуллеренолы и дендрофуллерен [4 - Т. Da Ros and М. Prato, Medicinal chemistry with fullerenes and fullerene derivatives. Chem. Commun., 1999, 663-669]. Однако методы синтеза этих аддуктов отличаются малыми выходами целевых продуктов и низкой селективностью, а полученные препараты -низкой растворимостью в воде.

Альтернативный и более простой метод получения водорастворимых производных фуллерена основан на реакциях хлорфуллерена C₆₀Cl₆ с С-, S-, Р- и N-нуклеофилами [5 - O.A.Troshina et al., Chlorofullerene C₆₀Cl₆: a precursor for straight forward preparation of highly water-soluble polycarboxylic fullerene derivatives active against HIV, Org. Biomol. Chem., 2007, 2783-2791; 6 - A.B. Kornev et al., Facile preparation of amine and amino acid adducts of [60]fullerene using chlorofullerene C₆₀Cl₆ as a precursor, Chem. Commun., 2012, 48 (2012), 5461-5463; 7 - E.A. Khakina et al., Highly selective reactions of C₆₀Cl₆ with thiols for the synthesis of functionalized [60]fullerene derivatives, Chem. Commun., 2012, 48, 7158-7160; 8 - A.A. Yurkova et al., Arbuzov chemistry with chlorofullerene C₆₀Cl₆: a powerful method for selective synthesis of highly functionalized [60]fullerene derivatives, Chem. Commun., 2012, 8916-8918]. Солюбилизирующие адденды в образующихся соединениях расположены вокруг одного циклопентадиенильного фрагмента на фуллереновом каркасе, тогда как его большая часть остается свободной для связывания с биологическими мишенями. Данный подход позволяет синтезировать аддукты с высоким выходом, с четко установленным составом и строением, низкой себестоимостью и легкой масштабируемостью, что открывает путь к их промышленному применению.

Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является разработка соединений фуллерена C₆₀ и композиций на их основе, обладающих выраженной нейропротекторной активностью.

В настоящем изобретении эта задача решается применением производных фуллерена общей формулой I:

где в общей формуле I заместитель X имеет следующие значения:

- атом хлора (-Cl), присоединенный к углеродному каркасу (соединения 1-3);

- атом водорода (-Н), присоединенный к углеродному каркасу (соединения 4-9);

где в общей формуле I заместитель R имеет следующие значения:

- фрагмент арилкарбоновой кислоты общей формулы Ia

где n - число метиленовых звеньев в составе адденда (n=1÷3);

Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

- фрагмент фосфоновой кислоты -Р(O)(OY)₂,

где Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

- фрагмент с общей формулой -S-(CH₂)_nSO₃Y, где n=3, a Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

- остаток каптоприла с общей формулой Ib, присоединенный к фуллереновому каркасу по атому серы:

где Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

- фрагмент с общей формулой -NH-(CH₂)_nCOOY, где n=2, a Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

- фрагмент на основе природных аминокислот общей формулы -NHCH(R¹)COOY, присоединенный атомом азота к фуллереновому каркасу, где заместитель R¹ может представлять собой -СН₂ОН (в случае серина) и -CH₂Ph (в случае фенилаланина) в форме любого из оптических изомеров, их смеси или рацемата. При этом Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда.

Структуры соединений общей формулы I и методы их получения были описаны нами ранее [5 - O.A.Troshina et al., Chlorofullerene C₆₀Cl₆: a precursor for straightforward preparation of highly water-soluble polycarboxylic fullerene derivatives active against HIV, Org. Biomol. Chem., 2007, 2783-2791; 6 - A.B. Kornev et al., Facile preparation of amine and amino acid adducts of [60]fullerene using chlorofullerene C₆₀Cl₆ as a precursor, Chem. Commun., 2012, 48 (2012), 5461-5463; 7 - E.A. Khakina et al., Highly selective reactions of C₆₀Cl₆ with thiols for the synthesis of functionalized [60]fullerene derivatives, Chem. Commun., 2012, 48, 7158-7160; 8 - A.A. Yurkova et al., Arbuzov chemistry with chlorofullerene C₆₀Cl₆: a powerful method for selective synthesis of highly functionalized [60]fullerene derivatives, Chem. Commun., 2012, 8916-8918; 9 - F.-Y. Hsieh and ets., Water-soluble fullerene derivatives as brain medicine: surface chemistry determines if they are neuroprotective and antitumor, ACS App. Mater. Interfaces, 2017, 9(13), 11482-11492].

В отличие от всех других описанных в литературе соединений фуллеренов, проявляющих нейропротекторные свойства, производные фуллерена, соответствующие общей формуле 1, имеют ряд отличительных особенностей:

- отличаются простотой получения и низкой стоимостью, и поэтому могут быть легко синтезированы в больших количествах с целью практического использования,

- соединения с общей формулой I имеют четко установленный состав и строение. Полярные адденды располагаются вокруг одного циклопентадиенильного фрагмента. Большая часть фуллереновой сферы свободна и доступна для связывания с биологическими мишенями,

- особенности строения соединений придают им амфифильные свойства, так как соединения имеют в своей структуре гидрофобные и гидрофильные фрагменты, что обеспечивает легкость их проникновения через клеточные мембраны. Это является важным преимуществом указанных производных по сравнению с ранее описанными соединениями, в которых каркас фуллерена равномерно покрыт заряженными группами,

- в зависимости от типа присоединенных заместителей R соединения способны регулировать активность митохондрий и проявлять цитопротекторное (антиоксидантное) действие на разных типах клеток;

- соединения общей формулы I могут преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

Учитывая особенности строения и обнаруженный мощный антиоксидантный эффект производных фуллеренов общей формулы I, выражающийся в их способности регулировать активность митохондрий у различных типов клеток, а также способность преодолевать ГЭБ, можно заключить, что изобретение найдет применение в биомедицинских исследованиях и производстве новых лекарственных препаратов нейропротекторного действия.

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Нейропротекторное действие водорастворимых производных фуллеренов на примере пролиферационной и дифференцирующей активности в отношении нейральных стволовых клеток (ИСК).

Для иллюстрации нейропротекторного действия заявляемого изобретения были выбраны соответствующие общей формуле I производные фуллеренов 1-9 (Фиг. 1).

В данном примере было исследовано влияние производных фуллеренов 1-9 на выживаемость, рост (пролиферацию) и дифференциацию нейральных стволовых клеток (ИСК).

Биологическая активность определялась на НСК, выделенных из гиппокампа мозга взрослой мыши. Соединения 1-9 добавляли в культуру клеток и инкубировали в течение 24 часов. Выживаемость клеток определялась фотометрическим методом измерения числа живых клеток, при добавлении в среду тетразолиевого красителя МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид). Процент клеток, обработанных производными фуллеренов относительно необработанных клеток (контроля) служил характеристикой выживаемости и роста клеток. Результаты определения выживаемости клеток представлены на Фиг. 2.

Выживаемость ИСК, обработанных функционализированными производными фуллерена, заметно возрастает до 120-130%.

Параллельно изучалосьвлияние производных фуллерена C₆₀ 1-6 на дифференциацию ИСК с помощью анализа активности нейрон-связанных генов, кодирующих нестин, β-тубулин и МАР2, методом ПЦР в реальном времени в течение 24 часов. Полученные результаты показаны на Фиг. 3.

Активность гена, кодирующего нестин (маркер прогениторных клеток -недифференциированные клетки-предшественники), существенно (~5 и ~3,5 раз) возрастает для НСК, обработанных производными 3 и 4 соответственно. Но понижается для производных 1 и 2 по сравнению с контролем. НСК, обработанные производными 1-6, экспрессируют больше β-тубулина(маркер клеток-предшественников нервной ткани) и МАР2 (маркер созревших нейронов). Среди всех изученных производных фуллерена C₆₀ соединение 4 вызывало наибольшую экспрессию генов, кодирующих β-тубулин и МАР2.

На данном примере проиллюстрировано, что пролиферационная активность НСК, обработанных функционализированными производными фуллерена соответствующего строения и состава согласно заявленной формуле I, возрастает на 120-130%; исследование нейрон-связанных генов показало, что производные фуллерена соответствующего строения и состава согласно заявленной формуле I могут промотировать дифференциацию НСК в нейроны. Более того, отдельные производные (3-6) поддерживают постоянное обновление клеток-предшественников нейронов (нейропрогениторов).

Пример 2. Регуляция деятельности ЦНС на примере восстановления двигательной активности у взрослых рыбок Данио (Daniorerio).

Производные фуллерена соответствующего строения и состава согласно заявленной формуле I способны восстанавливать различные функции поврежденных участков ЦНС.

В данном примере была исследована способность функционализированных производных фуллеренов 3 и 4 восстанавливать деятельность ЦНС у взрослых рыбок Данио (Danio rerio).

Взрослым рыбкам Данио иглой повреждали мозжечок. Рыбки с таким повреждением ЦНС были обездвижены или демонстрировали не сбалансированное передвижение. Всех рыбок, отобранных для исследования, разделили на группы (по 15 особей в каждой), часть из которых обработали производными 3 или 4. Результаты восстановления двигательной активности после повреждения мозжечка представлены на Фиг. 4.

Рыбки, обработанные производным 4, демонстрировали восстановление двигательных функций на 34, 57 и 72% на 2, 4 и 6 дни соответственно. В тоже время, рыбки, обработанные производным 3, восстановились на 24, 41 и 63% соответственно. Для сравнения, рыбки, не подвергавшиеся действию препаратов, не демонстрировали каких-либо значимых показателей восстановления двигательных функций спустя 6 дней.

Изобретение относится к медицине и предназначено для лечения заболеваний нервной системы. Раскрыто использование водорастворимых производных фуллерена С60 в производстве лекарственных препаратов нейропротекторного действия. Используют производные фуллеренов формулы I, содержащие 5 гидрофильных групп на одной полусфере фуллеренового каркаса, тогда как другая половина остается нефункционализированной. Соединения имеют в своей структуре гидрофобные и гидрофильные фрагменты, что обеспечивает легкость их проникновения через клеточные мембраны. Изобретение позволяет регулировать активность митохондрий и обеспечивает цитопротекторное (антиоксидантное) действие на разных типах клеток. 6 ил., 2 пр.

Применение производных фуллерена C₆₀ общей формулы I

,

где в общей формуле I заместитель X имеет следующие значения:

- атом хлора (-Cl), присоединенный к углеродному каркасу (соединения 1-3);

- атом водорода (-Н), присоединенный к углеродному каркасу (соединения 4-9);

где в общей формуле I заместитель R имеет следующие значения:

- фрагмент арилкарбоновой кислоты общей формулы Ia

,

где n - число метиленовых звеньев в составе адденда (n=1÷3);

Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

- фрагмент фосфоновой кислоты -Р(O)(OY)₂, где Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

- фрагмент с общей формулой -S-(CH₂)₃SO₃Y, a Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

- остаток каптоприла с общей формулой Ib, присоединенный к фуллереновому каркасу по атому серы

,

где Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

- фрагмент бета-аланина с общей формулой -NH-(CH₂)₂COOY, присоединенный к фуллереновому каркасу по атому азота, где Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

- фрагмент на основе природных аминокислот общей формулы -NHCH(R^])COOY, присоединенный атомом азота к фуллереновому каркасу, где заместитель R¹ может представлять собой -СН₂ОН (в случае серина) и -CH₂Ph (в случае фенилаланина) в форме любого из оптических изомеров, их смеси или рацемата, при этом Y - атом водорода, или ион металла, или органический катион аммониевого ряда;

в качестве основы для создания препаратов нейропротекторного действия.