АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНО СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С ИЗОЛИРОВАННЫМ ПЕПТИДОМ, ОБРАЗОВАННЫМ ИЗ ВИМЕНТИНА, ИЛИ СВЯЗЫВАЮЩИЙСЯ С ЭТИМ ПЕПТИДОМ ФРАГМЕНТ Российский патент 2019 года по МПК A61K39/00 C07K16/18 A61K39/395 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ПРИНАДЛЕЖИТ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к антителу, специфично связывающемуся с пептидом с SEQ ID NO: 1, и, в частности, к антителу, специфично связывающемуся с изолированным пептидом с SEQ ID NO: 1, или к связывающемуся с указанным пептидом фрагменту, к полинуклеотиду, кодирующему антитело или связывающийся с указанным пептидом фрагмент, к вектору, содержащему этот полинуклеотид, к клетке, в которую введен этот вектор, к способу получения антитела или связывающегося с указанным пептидом фрагмента с использованием этой клетки, к рекомбинантному антителу или связывающемуся с указанным пептидом фрагменту, полученному этим способом, к противовирусной композиции, содержащей антитело или связывающийся с указанным пептидом фрагмент, к композиции для предотвращения или лечения воспалительных заболеваний, и к способу лечения инфекционных вирусных заболеваний или воспалительных заболеваний с применением этой композиции.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В отличие от бактериальных заболеваний, вирусные заболевания трудно лечить, поскольку антибиотики, в частности, неэффективны против вирусов, и вирусные заболевания, соответственно, становятся одной из основных причин заболеваний и смертности у людей. Кроме того, инфекционные вирусные заболевания вызывают воспаление, вследствие чего являются причиной различных воспалительных заболеваний.

Терапевтические средства, разработанные для лечения таких инфекционных вирусных заболеваний, можно отнести к категориям химических веществ и веществ биологического происхождения, и большинство разработанных химических веществ эффективно лишь против конкретных вирусных заболеваний, характеризуется различными нежелательными явлениями, и их недостатки заключаются в частом возникновении резистентных вирусов.

Между тем, хорошо известные примеры веществ биологического происхождения могут включать в себя цитокины, такие как интерферон (IFN). Из них интерферон был впервые открыт среди цитокинов, которые вырабатываются в инфицированных вирусом клетках, и известен как цитокин, обладающий наилучшей противовирусной активностью. Сообщали, что интерферон можно применять для лечения различных заболеваний, таких как хронический гепатит В или С, гемобластоз, рассеянный склероз и т.д. Недавно сообщали о действии IFN на пациентов с вирусом иммунодефицита человека (HIV). Все усилия по разработке противовирусных средств и иммуномодуляторов в течение последних нескольких лет с продолжающимися исследованиями методами генной инженерии и биоинженерии по существу направлены на массовую продукцию интерферона, и с недавнего времени ведутся активные исследования по поиску соединений из природных или синтетических материалов, которые могут индуцировать экспрессию интерферона (Alcaro S et al., Bioorg Med Chem. 2005, 13 (10), 3371-3378). В результате компанией 3М Pharmaceuticals был разработан сильнодействующий индуктор интерферона, названный Имиквимод, но его разработка прекращена в связи с различными нежелательными явлениями, наблюдаемыми в ходе клинических исследований.

Хотя показано, что интерферон является сильнодействующим противовирусным средством, недостаток интерферона состоит в том, что его нельзя применять в течение более 6 месяцев, поскольку он вызывает воспалительные ответы, такие как инфильтрация иммунных клеток и т.д..; почти все клетки во все моменты времени экспрессируют рецепторы интерферона, в результате чего проявляются различные нежелательные явления, такие как противоклеточное действие, и для разработки интерферона в клинических исследованиях требуются его большие количества.

Соответственно, существует необходимость в разработке терапевтического средства, которое может вероятнее оказывать избирательное действие на инфицированные вирусом клетки, чем на нормальные клетки; которое применимо в небольших количествах и вероятнее действует на различные типы вирусов, чем на конкретные типы вирусов; и которое одновременно обладает как противовирусной, так и противовоспалительной активностью за счет подавления инфильтрации иммунных клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

Авторами настоящего изобретения предпринята разработка терапевтического средства, которое может специфично действовать на инфицированные вирусом клетки и обладает противовирусной и противовоспалительной активностью, способной к ингибированию воспаления за счет подавления инфильтрации иммунных клеток. В результате авторы настоящего изобретения подтвердили, что гуманизированный вирус-подавляющий фактор (hzVSF), представляющий собой новое гуманизированное антитело, не только обладает способностью к специфичному действию на различные типы вирусов, но также ингибиторной активностью против инфильтрации иммунных клеток и наилучшей противовирусной активностью, но, кроме того, поскольку является гуманизированным антителом, обладающим сниженной иммуногенностью, представляет собой безопасное средство, не вызывающее каких-либо нежелательных явлений при введении людям, таким образом, было осуществлено настоящее изобретение.

Техническое решение

Объектом настоящего изобретения является разработка нового антитела, специфично связывающегося с пептидом с SEQ ID NO: 1 или связывающегося с указанным пептидом фрагмента.

Другим объектом настоящего изобретения является разработка полинуклеотида, кодирующего антитело или связывающийся с указанным пептидом фрагмент, вектора, содержащего этот полинуклеотид, клетки, в которую введен этот вектор, способа получения антитела или связывающегося с указанным пептидом фрагмента с использованием этой клетки и антитела или связывающегося с указанным пептидом фрагмента, полученных этим способом.

Еще одним объектом настоящего изобретения является разработка противовирусной композиции, содержащей антитело или связывающийся с указанным пептидом фрагмент.

Еще одним объектом настоящего изобретения является разработка способа предотвращения или лечения инфекционных вирусных заболеваний с применением этой противовирусной композиции.

Еще одним объектом настоящего изобретения является разработка композиции для предотвращения или лечения инфекционных вирусных заболеваний, содержащей антитело или связывающийся с указанным пептидом фрагмент.

Еще одним объектом настоящего изобретения является разработка способа лечения воспалительных заболеваний с применением композиции для предотвращения или лечения инфекционных вирусных заболеваний.

Полезные эффекты изобретения

Антитело, специфично связывающееся с пептидом с SEQ ID NO: 1, или фрагмент, связывающийся с указанным пептидом, могут быть разработаны в качестве нового терапевтического средства, представляющего собой гуманизированное антитело, обладающего превосходной противовирусной и противовоспалительной активностью, обусловленной его способностью к избирательному действию на инфицированные вирусом клетки, в результате чего на момент лечения требуется лишь небольшое его количество, не вызывающего каких-либо нежелательных явлений и способного также ингибировать воспаление или подавлять инфильтрацию иммунных клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 представлена схематическая диаграмма вектора для получения химерного вирус-подавляющего фактора (virus suppressing factor, VSF).

На ФИГ. 2 представлена схематическая диаграмма химерного VSF.

На ФИГ. 3 представлены результаты, подтверждающие экспрессию химерного VSF.

На ФИГ. 4 представлен результат, иллюстрирующий последовательность ДНК одноцепочечного Fv (scFv) VSF.

На ФИГ. 5 представлены схематические диаграммы, иллюстрирующие клонирование scFv VSF в векторе.

На ФИГ. 6 представлены результаты, подтверждающие scFv VSF после очистки.

На ФИГ. 7 представлены результаты, подтверждающие противовирусную активность VSF, scFv и антител к вирусу EMC-D на основании количества клеток, сохранивших жизнеспособность после вирусной инфекции.

На ФИГ. 8 представлен результат, подтверждающий противовирусную активность химерного VSF.

На ФИГ. 9 представлена схематическая диаграмма вектора для получения hzVSF, представляющего собой гуманизированное антитело.

На ФИГ. 10 представлена схематическая диаграмма hzVSF, представляющего собой гуманизированное антитело по настоящему изобретению.

На ФИГ. 11 представлены результаты, подтверждающие экспрессию hzVSF, представляющего собой гуманизированное антитело.

На ФИГ. 12 представлены результаты, подтверждающие противовирусную активность hzVSF, представляющего собой гуманизированное антитело.

На ФИГ. 13 представлены результаты восстанавливающего и невосстанавливающего электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), подтверждающие физические свойства hzVSF_var13, представляющего собой гуманизированное антитело.

На ФИГ. 14 представлены результаты жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC/MS), подтверждающие физические свойства hzVSF_var13, представляющего собой гуманизированное антитело.

На ФИГ. 15 представлены результаты эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SEC-HPLC), подтверждающие физические свойства hzVSF_var13, представляющего собой гуманизированное антитело.

На ФИГ. 16 представлены результаты изоэлектрического фокусирования (IEF), подтверждающие физические свойства hzVSF_var13, представляющего собой гуманизированное антитело.

На ФИГ. 17 представлены результаты, иллюстрирующие количество доноров с пролиферацией Т-клеток в ответ на KLH, hzVSF_var12 и hzVSF_var13 из 51 доноров крови.

На ФИГ. 18 представлены результаты, иллюстрирующие степень пролиферации Т-клеток от 51 донора в ответ на hzVSF_var12 и hzVSF_var13, представляющих собой репрезентативные варианты гуманизированного антитела hzVSF.

На ФИГ. 19 представлены результаты, иллюстрирующие индуцированную KLH, hzVSF_var12 и hzVSF_var13 пролиферацию Т-клеток в виде среднего арифметического индекса стимуляции (SI).

На ФИГ. 20 представлены результаты электрофореза в SDS-PAGE hzVSF_var12 и hzVSF_var13, представляющих собой репрезентативные варианты гуманизированного антитела hzVSF.

На ФИГ. 21 представлены результаты HPLC, подтверждающие физические свойства hzVSF_var12 и hzVSF_var13, представляющих собой репрезентативные варианты гуманизированного антитела hzVSF.

На ФИГ. 22 представлены результаты фармакодинамики hzVSF_var13, представляющего собой репрезентативный вариант гуманизированного антитела hzVSF.

На ФИГ. 23 представлен результат, подтверждающий противовирусную активность hzVSF и hzVSF_var12 и hzVSF_var13, представляющих собой репрезентативные варианты гуманизированного антитела hzVSF.

На ФИГ. 24 представлены результаты, подтверждающие жизнеспособность клеток hzVSF_var13, представляющего собой гуманизированное антитело, и IFN-α человека (hIFN-α) в клетках человека.

На ФИГ. 25 представлены изображения, подтверждающие ингибиторную активность hzVSF, представляющего собой гуманизированное антитело, против инфильтрации воспалительных клеток при вирусном диабете.

На ФИГ. 26 представлен результат, подтверждающий действие mVSF против вируса гепатита В (HBV).

На ФИГ. 27 представлены изображения, подтверждающие возможность экспрессии рецепторов VSF в инфицированной HBV ткани печени человека.

На ФИГ. 28 представлены изображения, подтверждающие возможность экспрессии рецепторов VSF в инфицированной вирусом гепатита С (HCV) ткани печени человека.

На ФИГ. 29 представлены изображения, подтверждающие экспрессию рецепторов VSF в клетках, инфицированных вирусом гриппа.

На ФИГ. 30 представлены изображения, подтверждающие экспрессию рецепторов VSF в клетках, инфицированных вирусом EMC-D.

На ФИГ. 31 представлены результаты, подтверждающие противовирусное действие hzVSF_var13 против вируса гепатита В, представленное в виде количества ковалентно-непрерывной кольцевой ДНК (кзкДНК), определенного с помощью количественной полимеразной цепной реакции (PCR) в реальном времени.

На ФИГ. 32 представлены результаты, подтверждающие противовирусное действие hzVSF_var13 против вируса гепатита В, представленное в виде количества внеклеточной ДНК HBV, определенного с помощью количественной PCR в реальном времени.

На ФИГ. 33 представлены результаты, подтверждающие противовирусное действие hzVSF_var13 против вируса гепатита В, представленное в виде количества внутриклеточной ДНК HBV, определенного с помощью количественной PCR в реальном времени.

На ФИГ. 34 представлены результаты, подтверждающие противовирусное действие hzVSF против вируса гепатита С с использованием сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS).

На ФИГ. 35 представлены результаты, подтверждающие противовирусное действие hzVSF против вируса гепатита С с использованием количественной PCR в реальном времени.

На ФИГ. 36 представлены результаты, подтверждающие противовирусное действие hzVSF_var13 против вируса гепатита С генотипа 1а с использованием количественной PCR в реальном времени и вестерн-блоттинга.

На ФИГ. 37 представлены результаты, подтверждающие долговременное противовирусное действие hzVSF_var13 против вируса гепатита С генотипа 1а с использованием количественной PCR в реальном времени.

На ФИГ. 38 представлены результаты, подтверждающие противовирусное действие hzVSF_var13 против вируса гепатита С генотипа 1b с использованием количественной PCR в реальном времени и вестерн-блоттинга.

На ФИГ. 39 представлены результаты, подтверждающие противовирусное действие hzVSF_var13 против вируса гепатита С генотипа 2а с использованием количественной PCR в реальном времени и вестерн-блоттинга.

На ФИГ. 40 представлены результаты, подтверждающие долговременное противовирусное действие hzVSF_var13 против вируса гепатита С генотипа 2а с использованием количественной PCR в реальном времени.

На ФИГ. 41 показано ингибиторное действие hzVSF_var13, представляющего собой гуманизированное антитело, против пролиферации вируса гриппа (H1N1), подтвержденное у мышей.

На ФИГ. 42 представлены результаты, подтверждающие терапевтическое действие hzVSF_var13, представляющего собой репрезентативный вариант hzVSF, на ткань легкого мышей, инфицированных вирусом гриппа.

На ФИГ. 43 представлены результаты, подтверждающие защитное действие hzVSF_var13, представляющего собой репрезентативный вариант hzVSF, на эпителиальные клетки слизистой оболочки и реснички мышей, инфицированных вирусом гриппа.

На ФИГ. 44 представлены результаты, подтверждающие ингибиторное действие hzVSF_var13, представляющего собой репрезентативный вариант hzVSF, против пневмонии у мышей, инфицированных вирусом гриппа, в соответствии со временем введения и дозой.

На ФИГ. 45 показано ингибиторное действие hzVSF_var13, представляющего собой репрезентативный вариант hzVSF, направленное против инфильтрации иммунных клеток CD4, после введения мышам, инфицированным вирусом гриппа (100000 бляшкообразующих единиц (БОЕ)).

На ФИГ. 46 показано ингибиторное действие hzVSF_var13, представляющего собой репрезентативный вариант hzVSF, против инфильтрации иммунных клеток CD4 после введения мышам, инфицированным вирусом гриппа (10000000 БОЕ).

На ФИГ. 47 показано ингибиторное действие hzVSF_var13, представляющего собой репрезентативный вариант hzVSF, против инфильтрации макрофагов после введения мышам, инфицированным вирусом гриппа (100000 БОЕ).

На ФИГ. 48 показано ингибиторное действие hzVSF_var13, представляющего собой репрезентативный вариант hzVSF, против инфильтрации макрофагов после введения мышам, инфицированным вирусом гриппа (10000000 БОЕ).

На ФИГ. 49 представлены результаты, иллюстрирующие ингибиторное действие hzVSF против секреции воспалительных цитокинов после вирусной инфекции у мышей.

На ФИГ. 50 представлены результаты, иллюстрирующие противовирусную активность hzVSF_v13, подтвержденную анализом MVIT, после инфекции вирусом клеток MCF-7, не экспрессирующих рецепторы VSF, после гиперэкспрессии в этих клетках VR дикого типа и VR мутантного типа.

На ФИГ. 51 представлены результаты, иллюстрирующие противовирусную активность hzVSF_v13, подтвержденную анализом WST, после инфекции вирусом клеток MCF-7, не экспрессирующих рецепторы VSF, после гиперэкспрессии в этих клетках VR дикого типа и VR мутантного типа.

На ФИГ. 52 представлены результаты, иллюстрирующие противовирусную активность hzVSF_v13, подтвержденную анализом MVIT, после инфекции вирусом клеток MCF-7, не экспрессирующих рецепторы VSF, после гиперэкспрессии в этих клетках VR дикого типа и VR мутантного типа.

На ФИГ. 53 показаны изображения связывания между рецепторами VSF и hzVSF_v13, подтвержденного иммунофлуоресцентным окрашиванием после инфекции вирусом клеток MCF-7, не экспрессирующих рецепторы VSF, после гиперэкспрессии в этих клетках VR дикого типа и VR мутантного типа.

На ФИГ. 54 показаны изображения связывания между hzVSF_v13 и рецепторами VSF дикого типа и мутантного типа (виментином), очищенными после гиперэкспрессии в Е. coli, подтвержденного анализом с «опусканием».

На ФИГ. 55 показаны изображения связывания между hzVSF_v13 и рецепторами VSF дикого типа и мутантного типа (виментином), очищенными после гиперэкспрессии в клетках HEK293T, подтвержденного иммунопреципитацией.

На ФИГ. 56 представлена схематическая диаграмма моделирования связывающего участка между виментином и VSF.

На ФИГ. 57 представлены схематические диаграммы моделирования связывания между виментином и VSF.

На ФИГ. 58 представлены схематические диаграммы моделирования связывающего участка между виментином и hzVSF_v13.

Лучший способ осуществления изобретения

Для достижения описанных выше целей в одном аспекте в настоящем изобретении предложено антитело, специфично связывающееся с изолированным пептидом с SEQ ID NO: 1, или связывающийся с указанным пептидом фрагмент.

Примеры антитела могут включать без ограничений мышиные антитела, химерные антитела или гуманизированные антитела.

Гуманизированное антитело или фрагмент, связывающиеся с пептидом по настоящему изобретению, обладает превосходством в ингибировании реакции человеческого антимышиного антитела (human anti-mouse antibody, НАМА) в организме человека при сохранении исходной аффинности и специфичности мышиного антитела в результате пересадки определяющего комплементарность участка (CDR) вариабельной области мышиного моноклона или моноклонального антитела, связывающегося непосредственно с антигеном, на остов человеческого антитела. Кроме того, гуманизированные антитела по настоящему изобретению обладают сниженной иммуногенностью в результате деиммунизации и, следовательно, их можно применять в качестве безопасного средства при введении людям за счет значимого снижения иммуногенности. Таким образом, гуманизированные антитела по настоящему изобретению могут более эффективно воздействовать на клетки-мишени посредством лучшего взаимодействия с иммунной системой человека, при этом реагируя и влияя на клетки, в которых пептидный участок SEQ ID NO: 1 обращен к поверхности клеточной мембраны, например, предотвращая комплементзависимую цитотоксичность (CDC) или антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) при ответе на инфицированные вирусом клетки. Кроме того, преимущество гуманизированных антител по настоящему изобретению состоит в том, что, благодаря их сниженной иммуногенности, иммунная система человека не распознает гуманизированные антитела как белки чужеродного происхождения.

Кроме того, преимущество гуманизированных антител по настоящему изобретению состоит в том, что периоды полувыведения гуманизированных антител в системе кровообращения человека подобны таковым для природных антител даже при введении лекарственного средства в меньшей дозе или реже.

В настоящем изобретении мышиные антитела, специфично связывающиеся с пептидом с SEQ ID NO: 1, могут быть в совокупности обозначены как «мышиный вирус-подавляющий фактор (mVSF)», химерные антитела - как «химерный вирус-подавляющий фактор (chVSF)», а гуманизированные антитела - как «гуманизированный вирус-подавляющий фактор (hVSF)». Используемые в настоящем документе термины «гуманизированное антитело hzVSF» или «его варианты» могут использоваться взаимозаменяемо, и hzVSF может использоваться взаимозаменяемо с hzVSF дикого типа (hzVSF_wt) и вариантом hzVSF (например, указанным как hzVSF_var1, hzVSF_v1, hzVSF_1 и т.д.).

В настоящем изобретении изолированный пептид SEQ ID NO: 1 соответствует аминокислотной последовательности виментина в положениях аминокислот 142-294, и этот пептид может включать в себя не только указанные выше аминокислотные последовательности, но также любые аминокислотные последовательности, обладающие гомологией указанной выше последовательности 80% или выше, предпочтительно 90% или выше, более предпочтительно 95% или выше и еще более предпочтительно 97% или выше, при условии, что антитело по настоящему изобретению или его пептид-связывающий фрагмент могут связываться с ними. Изолированный пептид SEQ ID NO: 1 представляет собой антигенный участок, включающий в себя эпитоп, и может представлять собой аминокислотную последовательность виментина в положениях аминокислот 142-211 или в положениях аминокислот 211-294, при условии, что этот пептид может проявлять функцию, подобную функции пептида по настоящему изобретению, посредством связывания с антителом или пептид-связывающим фрагментом. Кроме того, очевидно, что любые аминокислотные последовательности, обладающие любыми из описанных выше гомологий, могут входить в объем настоящего изобретения, несмотря на то, что эта последовательность может иметь делецию, модификацию, замену или добавление в части последовательности. Виментин, который представляет собой белок, кодируемый геном VIM, поддерживает и закрепляет на месте внутриклеточные органеллы, и известно, что он, в основном, вовлечен в поддержание формы клетки, транспорт белков и сигнальную систему клетки. Также известно, что виментин используют в качестве маркера рака; однако неизвестно, могут ли антитела, связывающиеся с виментином, проявлять противовирусную активность.

Антитело, специфично связывающееся с изолированным пептидом с SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, или связывающийся с указанным пептидом фрагмент специфично отвечает на инфицированные вирусом клетки, и как антитело, так и связывающий фрагмент, связываются с рецепторами вирус-подавляющего фактора (VSF), которые обращены к клеточной поверхности в инфицированных вирусом клетках. Антитело или связывающийся с пептидом фрагмент по настоящему изобретению проявляют противовирусную и противовоспалительную активность посредством специфичного связывания с инфицированными вирусом клетками и, следовательно, их можно эффективно использовать в качестве противовирусной композиции и в области предотвращения или лечения инфекционных вирусных заболеваний и воспалительных заболеваний.

Конкретно, антитело или связывающийся с пептидом фрагмент могут специфично связываться с остатком аминокислоты в 9^ом, 45^ом, 54^ом, 76^ом, 94^ом или 129^ом положении цепи с SEQ ID NO: 1 и, более конкретно, специфично связываться с остатком аминокислоты в 9^ом, 45^ом, 54^ом, 76^ом, 94^ом и 129^ом положениях цепи с SEQ ID NO: 1, но не ограничиваясь этими положениями, при условии, что они могут специфично связываться с изолированным пептидом с SEQ ID NO: 1.

Используемый в настоящем документе термин «антитело» в области иммунологии относится к молекуле белка, выполняющей роль лиганда, специфично распознающего антиген, включая молекулу иммуноглобулина, обладающую реакционной способностью к специфичному антигену, и может включать все из поликлонального антитела, моноклонального антитела, полного антитела и фрагмента антитела. Кроме того, термин «антитело» может включать в себя химерное антитело (например, гуманизированное мышиное антитело) и бивалентную или биспецифическую молекулу (например, биспецифическое антитело), диатело, триатело и тетратело. Кроме того, термин «антитело» может включать в себя одноцепочечное антитело, обладающее FcRn-связывающей аффинностью, scAb, производное константной области антитела и искусственное антитело на основе белкового каркаса. Полное антитело имеет структуру, состоящую из двух полноразмерных легких цепей и двух полноразмерных тяжелых цепей, где каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью дисульфидной связью. Полное антитело включает в себя IgA, IgD, IgE, IgM и IgG, и подтипы IgG включают в себя IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Используемые в настоящем документе термины «фрагмент», «связывающийся с пептидом фрагмент» и «фрагмент антитела» относятся к любому фрагменту антител или к связывающему пептид фрагменту по настоящему изобретению, обладающему антигенсвязывающей активностью, и данные термины можно использовать взаимозаменяемо. В иллюстративном воплощении изобретения фрагмент антитела может включать в себя, без ограничений, одноцепочечное антитело, Fd, Fab, Fab', F(ab')₂, dsFv или scFv.

Fd относится к участку тяжелой цепи, включенному в Fab-фрагмент. Fab имеет структуру, состоящую из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, константных областей легкой цепи и первой константной области тяжелой цепи (домена СН1), и имеет единственный антигенсвязывающий сайт.Fab' отличается от Fab тем, что Fab' имеет шарнирную область, содержащую по меньшей мере один остаток цистеина на С-конце домена СН1 тяжелой цепи. Антитело F(ab')₂ получают при образовании дисульфидной связи остатком цистеина в шарнирной области Fab'. Используемый в настоящем документе термин «вариабельный фрагмент (Fv)» относится к минимальному фрагменту антитела, имеющему только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Стабилизированный дисульфидной связью фрагмент Fv (dsFv) характеризуется тем, что вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны дисульфидной связью, а одноцепочечный фрагмент Fv (scFv) характеризуется тем, что вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи обычно связаны ковалентной связью посредством линкера. Эти фрагменты антител могут быть получены с использованием протеазы (например, в результате рестрикционного расщепления полного антитела папаином можно получить фрагмент Fab, тогда как в результате расщепления полного антитела пепсином можно получить фрагмент F(ab')₂) и предпочтительно могут быть получены с помощью генетической рекомбинантной технологии.

Используемый в настоящем документе термин «моноклональное антитело» относится к молекуле антитела, состоящей из единственной молекулы, полученной из по существу одной и той же группы антител, и моноклональное антитело проявляет единую связывающую специфичность и аффинность к конкретному эпитопу.

Обычно иммуноглобулины имеют тяжелые цепи и легкие цепи, и каждая из тяжелых цепей и легких цепей включает в себя константную область и вариабельную область (также известные как домены). Вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи включают в себя три высоко вариабельных участка, которые называют определяющими комплементарность участками (далее в настоящем документе CDR), и четыре каркасных участка (далее в настоящем документе FR). Ролью CDR является главным образом связывание с эпитопом антигена. CDR в каждой цепи называют CDR1, CDR2 и CDR3, обычно начиная с N-конца в этом порядке, и они идентифицируются по цепи, в которой локализован конкретный CDR.

Кроме того, когда антитело по настоящему изобретению содержит константную область, она может включать в себя константную область, имеющую происхождение от IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, или константную область, полученную в результате их комбинирования или гибридизации.

Используемый в настоящем документе термин «комбинирование» относится к образованию связи между полипептидом, кодирующим константную область одноцепочечного иммуноглобулина того же происхождения, и одноцепочечным полипептидом другого происхождения при образовании димера или мультимера. Например, димер или мультимер может быть образован из двух или более константных областей, выбранных из группы, состоящей из константных областей IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.

Используемый в настоящем документе термин «гибрид» относится к присутствию последовательностей, соответствующих двум или более константным областям тяжелой цепи иммуноглобулина в пределах константной области тяжелой цепи одноцепочечного иммуноглобулина, и, например, возможен гибрид, состоящий из доменов в количестве от одного до четырех, выбранных из группы, состоящей из СН1, СН2, СН3 и СН4 из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.

Гуманизированное антитело по настоящему изобретению может быть гуманизировано на основе иммуноглобулина γ4 человека, хотя гуманизация не ограничена им, и его преимущество может состоять в том, то оно не вызывает CDC в связи с отсутствием активации комплемента.

Гуманизированное антитело или связывающийся с пептидом фрагмент может включать в себя:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2; CDR2 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 14 (в которой 9-я аминокислота SEQ ID NO: 3 треонин заменена аспарагиновой кислотой); и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 15 (в которой 4-я аминокислота SEQ ID NO: 4 треонин заменена аспарагином); и

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи с SEQ ID NO: 5; CDR2 легкой цепи с SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16 (в которой 3-я аминокислота SEQ ID NO: 6 треонин заменена аспарагиновой кислотой), SEQ ID NO: 17 (в которой 3-я аминокислота SEQ ID NO: 6 треонин заменена аспарагиновой кислотой) и 6-я аминокислота SEQ ID NO: 6 аланин заменена глицином) или SEQ ID NO: 18 (в которой 3-я аминокислота SEQ ID NO: 6 треонин заменена аспарагиновой кислотой; 5-я аминокислота SEQ ID NO: 6 лейцин заменена аргинином и 6-я аминокислота SEQ ID NO: 6 аланин заменена глицином); и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 19 (в которой 6-я аминокислота SEQ ID NO: 7 серии заменена треонином).

Кроме того, гуманизированное антитело или связывающийся с пептидом фрагмент, включающие в себя каркасный участок (FR) человека, могут представлять собой иммуноглобулин гамма человека SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31, или вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя каркасный участок 1 (FR1) тяжелой цепи с SEQ ID NO: 20; FR2 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 21; FR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 28 (в которой 8^ая аминокислота SEQ ID NO: 22 лизин заменена треонином) и 10^ая аминокислота SEQ ID NO: 22 изолейцин заменена аланином); и FR4 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, включающую в себя каркасный участок 1 (FR1) легкой цепи с SEQ ID NO: 24, FR2 легкой цепи с SEQ ID NO: 25, FR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 26 и FR4 легкой цепи с SEQ ID NO: 27, но не ограничены ими.

В частности, гуманизированное антитело или связывающийся с пептидом фрагмент может включать в себя:

(а) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно;

(б) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 7, соответственно;

(в) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 7, соответственно;

(г) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 7, соответственно;

(д) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, соответственно;

(е) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно;

(ж) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; FR1, FR2, FR3 и FR4 тяжелых цепей SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно; и FR1, FR2, FR3 и FR4 легких цепей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(з) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 4, соответственно; FR1, FR2, FR3 и FR4 тяжелых цепей SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно; и FR1, FR2, FR3 и FR4 легких цепей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(и) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; FR1, FR2, FR3 и FR4 тяжелых цепей SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно; и FR1, FR2, FR3 и FR4 легких цепей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(к) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 4, соответственно; FR1, FR2, FR3 и FR4 тяжелых цепей SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 7, соответственно; и FR1, FR2, FR3 и FR4 легких цепей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(л) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; FR1, FR2, FR3 и FR4 тяжелых цепей SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 7, соответственно; и FR1, FR2, FR3 и FR4 легких цепей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(м) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 4, соответственно; FR1, FR2, FR3 и FR4 тяжелых цепей SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, соответственно; и FR1, FR2, FR3 и FR4 легких цепей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(н) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; FR1, FR2, FR3 и FR4 тяжелых цепей SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, соответственно; и FR1, FR2, FR3 и FR4 легких цепей SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно; и

(о) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 7, соответственно.

Антитело (а) может включать hzVSF_WT, антитело (б) может включать hzVSF_var1, антитело (в) может включать hzVSF_var2, антитело (г) может включать hzVSF_var3, антитело (д) может включать hzVSF_var4, антитело (е) может включать hzVSF_var5, антитело (ж) может включать hzVSF_var6, антитело (з) может включать hzVSF_var7, антитело (и) может включать hzVSF_var8, антитело (к) может включать hzVSF_var9, антитело (л) может включать hzVSF_var10, антитело (м) может включать hzVSF_var11, антитело (н) может включать hzVSF_var12 и антитело (о) может включать hzVSF_var13.

Гуманизированное антитело или связывающийся с пептидом фрагмент может включать в себя вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 76 и SEQ ID NO: 78; или SEQ ID NO: 80 и SEQ ID NO: 82, соответственно, но не ограничиваясь ими.

Конкретно, мышиное антитело может включать в себя вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 137; CDR2 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 138; и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 139; и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи с SEQ ID NO: 134; CDR2 легкой цепи с SEQ ID NO: 135; и CDR3 легкой цепи с SEQ ID NO: 136; и, более конкретно, включает в себя вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 9; и вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 8, но не ограничиваясь ими.

Конкретно, химерное антитело может включать в себя вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 141 или SEQ ID NO: 142; и вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 140; и более конкретно тяжелую цепь с SEQ ID NO: 146 или SEQ ID NO: 148 и легкую цепь с SEQ ID NO: 144, но не ограничиваясь ими.

scFv могут также включать, без ограничений, scFv, полученный в целях безопасности mVSF и, например, scFv может быть получен на основе последовательности, представленной на ФИГ. 4. Кроме того, scFv может иметь форму, где вариабельная область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 131 и вариабельная область легкой цепи с SEQ ID NO: 133 связаны посредством линкера. Кроме того, scFv может иметь форму, где кодирующая вариабельную область тяжелой цепи нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 130; и кодирующая вариабельную область легкой цепи нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 132 связаны посредством линкера. Эти scFv можно клонировать в экспрессионном векторе Е. colic SEQ ID NO: 150.

В иллюстративном воплощении изобретения авторы настоящего изобретения получили гуманизированные антитела (т.е., hzVSF_wt, три его альтернативных формы и 13 вариантов) и подтвердили их противовирусную активность (пример 6). Кроме того, в результате сравнения антигенности гуманизированных антител с терапевтическими антителами, которые получили утверждение в Управлении по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) и имеются в продаже, подтвердили, что антигенность гуманизированных антител была сходной с антигенностью препарата Humira, обладающего самой низкой антигенностью среди указанных выше коммерческих терапевтических антител (таблица 7), что, таким образом, подтверждает, что гуманизированные антитела можно применять в качестве безопасных противовирусных средств или лекарственных препаратов, не вызывающих каких-либо нежелательных явлений, которые могут развиваться при их применении в качестве противовирусных средств или противовоспалительных средств. Кроме того, с помощью Т-клеточного анализа с использованием вариантов hzVSF_var было подтверждено, что описанные выше гуманизированные антитела не оказывают значимого влияния на пролиферацию Т-клеток (таблица 8), и, таким образом, подтвердили, что они обладают низким риском нежелательных реакций за счет их действия в качестве антигенов при их использовании в клинических исследованиях. Кроме того, фармакокинетическим анализом было подтверждено, что гуманизированные антитела обладают достаточно большой продолжительностью периодов полувыведения in vivo для их применения в клинических исследованиях (пример 8). Кроме того, в результате сравнения цитотоксичности гуманизированных антител с интерфероном они не проявляли какой-либо цитотоксичности при концентрации 4 нМ или выше, что, таким образом, подтверждает, что гуманизированные антитела вызывают нежелательные явления в меньшей степени, чем интерферон (пример 11). Кроме того, было подтверждено, что антитела hzVSF (как дикого типа, так и варианты) по настоящему изобретению обладают противовирусным действием против инфекции вируса EMC-D и ингибиторным действием на инфильтрацию иммунных клеток у мышей, и, таким образом, антитела hzVSF могут значимо ингибировать разрушение островков Лангерганса и лечить диабет, вызванный вирусной инфекцией (пример 12). Кроме того, было подтверждено, что антитела hzVSF могут также значимо ингибировать вирус гепатита (примеры 13-16). Кроме того, было подтверждено, что антитела hzVSF также обладают противовирусными и противовоспалительными действиями против вируса гриппа без инфильтрации иммунных клеток (пример 17) и обладают противовирусными действиями против различных вирусов (таблица 15), и, таким образом, было подтверждено, что антитела hzVSF можно применять в качестве универсальных противовирусных средств. Кроме того, было подтверждено, что антитела hzVSF могут ингибировать секрецию провоспалительных цитокинов в модели инфицированных вирусом мышей (пример 19), и, таким образом, было подтверждено, что антитела hzVSF можно применять в качестве терапевтического средства для лечения различных видов воспалительных заболеваний.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий антитело или связывающийся с пептидом фрагмент, вектор, содержащий этот полинуклеотид, клетка, в которую введен этот вектор, способ получения антитела или связывающегося с пептидом фрагмента с использованием этой клетки и антитело или связывающийся с пептидом фрагмент, полученные этим способом.

Антитело и связывающийся с пептидом фрагмент являются такими, как описано выше.

Вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий антитело, предложенный в настоящем изобретении, может представлять собой вектор, который может реплицироваться и/или экспрессировать полинуклеотид в эукариотических клетках или прокариотических клетках, включающих клетки млекопитающих (например, клетки людей, обезьян, кроликов, крыс, хомяков, мышей и т.д.), клетки растений, клетки дрожжей, клетки насекомых или бактериальные клетки (например, Е. coli), и предпочтительно вектор, который может быть функционально связан с приемлемым промотором в клетке-хозяине для экспрессии нуклеотида и который имеет по меньшей мере один селективный маркер, но конкретно не ограничен ими. Например, вектор может иметь форму, в которой полинуклеотид был введен в фаг, плазмиду, космиду, минихромосому, вирус или ретровирусный вектор и т.д.

Вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий антитело, может представлять собой экспрессионный вектор, включающий в себя полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела, или полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела, соответственно, или экспрессионный вектор, включающий в себя оба полинуклеотида, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь антитела.

Примеры клеток, в которые введен экспрессионный вектор (трансформантов/трансфектантов), предложенный в настоящем изобретении, могут включать клетку или бактерию, такую как E. coli, Streptomyces и Salmonella typimurium; клетку дрожжей, клетку грибов, таких как Pichia pastoris; клетку насекомых, таких как Drosophila и Spodoptera Sf9; клетку животных, такую как клетка яичника китайского хомячка (СНО), SP2/0 (миелома мыши), лимфобластоид человека, COS, NSO (миелома мыши), 293Т, меланомы, НТ-1080, почек новорожденного хомяка (BHK), эмбриональных почек человека (HEK) и PERC.6 (сетчатки человека); или клетку растений, в которую введен экспрессионный вектор, и трансформированную, но конкретно не ограничены ими.

Используемый в настоящем документе термин «включение» относится к способу доставки вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий описанное выше антитело, в клетку-хозяина. Включение можно осуществлять различными способами, известными в данной области техники, такими как копреципитация фосфата кальция с ДНК, опосредованная DEAE-декстраном трансфекция, опосредованная полибреном трансфекция, электропорация, микроинъекция, слияние липосомы, липофектаминовая трансфекция и слияние протопластов. Кроме того, трансдукция относится к доставке целевого материала в клетку посредством инфекции с использованием вирусной частицы. Кроме того, вектор может быть введен в клетку-хозяина способами, такими как бомбардировка генами, и т.д. В настоящем изобретении термин «включение» можно использовать взаимозаменяемо с трансформацией.

Еще в одном другом аспекте в настоящем изобретении предложена противовирусная композиция, содержащая антитело или связывающийся с пептидом фрагмент.

Антитело и связывающийся с пептидом фрагмент являются такими, как объяснено выше.

Используемый в настоящем документе термин «противовирусный» относится к действию, ослабляющему, ингибирующему или предотвращающему вирусную инфекцию посредством ингибирования пролиферации или репликации патогенного вируса, но не ограничен ими. «Патогенный вирус», пролиферация или репликация которого ингибируется противовирусной активностью, характеризуется тем, что в результате вирусной инфекции участок виментина в клетке-хозяине обращен к поверхности мембраны клетки-хозяина, но не ограничен этим. Примеры патогенного вируса, который вызывает заболевание у животных или людей, может включать без ограничений вирус семейства Orthomyxoviridae, вирус семейства Picornaviridae, вирус семейства Retroviridae, вирус семейства Herpesviridae, вирус семейства Filoviridae, вирус семейства Coronaviridae, вирус семейства Hepadnaviridae, вирус семейства Flaviviridae, вирус семейства Bunyaviridae и т.д. Примеры патогенного вируса могут включать вирус гриппа, вирус гепатита В и С, вирус энцефаломиокардита, менговирус, вирус Эбола, коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS), реовирус, вирус иммунодефицита человека (HIV), цитомегаловирус человека (HCMV) или вирус Хантаан. В частности, hzVSF в соответствии с настоящим изобретением, проявляющий противовирусную активность не только в отношении менговируса семейства Picornaviridae, но также в отношении вируса гриппа семейства Orthomyxoviridae, имеющего структуру генома и жизненный цикл, значимо отличающийся от таковых вируса ЕМС семейства Picornaviridae, и дополнительно hzVSF проявляет универсальную противовирусную активность, включающую эффективное ингибирование пролиферации HIV (принадлежащего к семейству Retroviridae) (таблица 15).

Композиция может быть в форме фармацевтической композиции, парафармацевтической композиции и композиции функциональной пищевой добавки для применения человеком.

Фармацевтическая композиция может дополнительно включать в себя фармацевтически приемлемый носитель.

Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к носителю или разбавителю, который не ингибирует биологическую активность или свойства соединения для введения в организм, не вызывая раздражение организма. Примерами фармацевтически приемлемого носителя, используемого в композиции для включения в жидкий раствор, поскольку они пригодны для стерилизации и применению in vivo, являются раствор хлорида натрия, стерильная вода, раствор Рингера, забуференный раствор хлорида натрия, инъекционный раствор альбумина, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этанол и смесь по меньшей мере одного их компонента, а также другие традиционные добавки, такие как антиоксидант, буферный раствор и, кроме того, при необходимости можно также добавлять бактериостатический агент. Кроме того, композицию можно включать в инъекционные препараты (например, в водный раствор, суспензию, эмульсию и т.д.), пилюли, капсулы, гранулы или таблетки путем дополнительного добавления разбавителя, диспергирующего средства, поверхностно-активного вещества, связующего вещества, смызвающего вещества и т.д.

Фармацевтическую композицию можно готовить в различных лекарственных формах для перорального или парентерального введения. Для приготовления этих лекарственных форм фармацевтическую композицию можно включать в препарат в комбинации с разбавителем или эксципиентом, таким как наполнитель, объемообразующий агент, связующее вещество, модификатор влажности, разрыхлитель, поверхностно-активное вещество и т.д. Твердые лекарственные формы для перорального введения могут включать таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и т.д., и эти твердые лекарственные формы можно готовить путем добавления по меньшей мере одного эксципиента, например крахмала, карбоната кальция, сахарозы или лактозы, желатина и т.д. Кроме простого эксципиента, можно использовать смазывающее вещество, такое как стеарат магния, тальк и т.д. Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут включать суспензии, растворы для приема внутрь, эмульсии, сиропы и т.д., и, кроме простого эксципиента, такого как вода или жидкий парафин, в жидких препаратах могут содержаться разнообразные эксципиенты, такие как модификаторы влажности, подсластители, ароматические вещества, консерванты и т.д. Лекарственные формы для парентерального введения могут включать стерильные водные растворы, неводные растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизированные лекарственные формы, суппозитории. Примеры неводных растворителей и суспензий могут включать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, инъекционный сложный эфир, такой как этилолеат, и т.д. Примеры суппозиторных основ могут включать Witepsol, макрогол, Твин 61, масло какао, лаурин, глицерожелатин и т.д.

Фармацевтическая композиция может иметь любой тип лекарственной формы, выбранный из группы, состоящей из таблеток, пилюль, порошков, гранул, капсул, суспензий, растворов для приема внутрь, эмульсий, сиропов, стерильных водных растворов, неводных растворов, суспензий, лиофилизированных лекарственных форм и суппозиториев.

Композицию по настоящему изобретению вводят в фармацевтически эффективной дозе.

Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически эффективная доза» относится к количеству, достаточному для лечения заболеваний при обоснованном соотношении пользы и риска, применимом к медикаментозному лечению, и уровень эффективной дозы можно определить на основании факторов, включающих тип пациента, тяжесть заболевания, возраст, пол, вид заболевания (-й), активность лекарственного средства, чувствительность лекарственного средства, время введения, путь введения и скорость растворения, продолжительность лечения, факторов, включающих лекарственное (-ые) средство (-а) для одновременного применения в комбинации, и других факторов, хорошо известных в области медицины. Композицию по настоящему изобретению можно вводить в виде отдельного терапевтического средства, в комбинации с другим (-и) терапевтическим (-и) средством (-ами) и последовательно или одновременно с традиционным (-и) терапевтическим (-и) средством (-ами), и можно вводить в однократной дозе или в многократных дозах. Важно вводить такое количество, чтобы получить максимальный эффект, при этом количество должно быть минимальным, чтобы не вызывать нежелательных явлений, с учетом описанных выше факторов, которые могут быть легко определены обычным специалистом в данной области техники. Другое терапевтическое средство может представлять собой интерферон, но не ограничивается им.

Композиция может представлять собой композицию, приводящую к предотвращению или лечению инфекционных вирусных заболеваний за счет ее противовирусных действий.

В настоящем изобретении инфекционные вирусные заболевания могут включать заболевания, в результате которых участок виментина в клетке-хозяине становится обращенным к мембране клетки-хозяина, и могут, например, включать не только гепатит, СПИД, пневмонию и диабет, но также все заболевания, которые могут развиваться в результате инфекции вируса семейства Orthomyxoviridae, вируса семейства Picornaviridae, вируса семейства Retroviridae, вируса семейства Filoviridae, вируса семейства Coronaviridae, вируса семейства Hepadnaviridae, вируса семейства Flaviviridae, вируса семейства Bunyaviridae и вируса семейства Herpesviridae.

Используемый в настоящем документе термин «предотвращение» может относиться к любому действию, приводящему в результате к подавлению или задержке возникновения заболевания путем введения композиции, а термин «лечение» может относиться к любым видам действий, связанных с улучшением или благоприятными изменениями симптомов заболевания путем введения композиции.

Композиция может представлять собой композицию, которая оказывает специфичное действие на инфицированные вирусом клетки.

Композиция может представлять собой композицию, которая подавляет инфильтрации иммунных клеток или может ингибировать инфильтрацию иммунных клеток или может представлять собой композицию, которая ингибирует воспалительные реакции (ФИГ. 45-48). Было подтверждено, что композиция по настоящему изобретению статистически значимо ингибирует провоспалительные цитокины, такие как IL-6, TNF-α, IFN-γ и CCL2 (МСР-1) (ФИГ. 49).

Еще в одном аспекте в настоящем изобретении предложен способ лечения инфекционных вирусных заболеваний, включающий введение противовирусной композиции нуждающемуся в этом субъекту.

Противовирусная композиция и инфекционные вирусные заболевания являются такими, как описано выше.

Способ лечения инфекционных вирусных заболеваний может представлять собой способ, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей антитело или дополнительный фармацевтически приемлемый носитель, субъекту, имеющему инфекционное вирусное заболевание или подозрение на его наличие. Фармацевтически приемлемый носитель является таким, как определено выше. Предпочтительно способ лечения инфекционных вирусных заболеваний может представлять собой способ лечения инфекционных вирусных заболеваний, включающий введение содержащей антитело композиции субъекту, зараженному инфекционным вирусным заболеванием.

Субъект может включать млекопитающих, птиц и т.д., таких как крупный рогатый скот, свиньи, овцы, куры, собаки и люди, и может включать, без ограничений, любого субъекта, у которого инфекционные вирусные заболевания можно лечить путем введения композиции по настоящему изобретению.

В частности, композицию можно вводить в фармацевтически приемлемой дозе с однократным или многократным введением. Композицию можно вводить в форме жидкостей, порошков, аэрозолей, капсул, таблеток, капсул с энтеросолюбильным покрытием или суппозиториев. Примеры путей введения могут включать, без ограничений, интраперитонеальный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, эндотелиальный, пероральный, местный, интраназальный, внутрилегочный или интраректальный путь введения и т.д. Однако, поскольку пептиды расщепляются при пероральном введении, пероральная композиция должна быть включена в такую лекарственную форму, чтобы активный ингредиент мог быть покрыт или защищен от распада в желудке. Кроме того, фармацевтическую композицию можно вводить с использованием любого устройства, которое может транспортировать активный ингредиент в клетку-мишень.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для предотвращения или лечения воспалительных заболеваний, содержащая антитело или связывающийся с пептидом фрагмент.

Композиция для предотвращения или лечения воспалительных заболеваний может быть в форме фармацевтической композиции, парафармацевтической композиции и композиции функциональной оздоровительной пищевой добавки.

Воспалительные заболевания могут быть вызваны вирусной инфекцией.

Еще в одном другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ лечения воспалительных заболеваний, включающий введение композиции для предотвращения или лечения воспалительных заболеваний нуждающемуся в этом субъекту.

Еще в одном аспекте в настоящем изобретении предложено противовирусное применение антитела или связывающийся с пептидом фрагмент.

Способы осуществления изобретения

Настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на сопроводительные примеры, приведенные в настоящем документе ниже. Однако примеры, раскрытые в настоящем документе, предназначены только для иллюстративных целей, и их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1: Получение нового гуманизированного антитела VSF

Пример 1-1: Получение химерного VSF (chVSF)

На основании предположения, что основная функциональная часть мышиного VSF (mVSF) представляет собой моноклональное антитело, методами генной инженерии было сконструировано химерное антитело мышь/человек (chAb) с использованием mVSF и иммуноглобулина человека.

В частности, для получения химерного антитела константные области легкой и тяжелой цепей mVSF были заменены константными областями антитела иммуноглобулина человека (κ, γ2 или γ4). Для chVSF экспрессионный вектор был получен с использованием вектора pCAGGS в качестве матрицы (ФИГ. 1). Вариабельную область тяжелой цепи mVSF (mVH) (SEQ ID NO:9) амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (PCR) с включением сайтов для ферментов рестрикции Sad и KpnI. Вариабельную область легкой цепи (mVL) (SEQ ID NO: 8) амплифицировали методом PCR с включением сайтов ферментов рестрикции ClaI и Xhol. Праймеры, используемые в PCR, описаны в таблице 1, и PCR проводили в течение в общей сложности 35 циклов (94°С в течение 45 с, 60°С в течение 45 с и 72°С в течение 45 с) и при 72°С в течение 10 мин.

Тяжелую цепь человека (SEQ ID NO: 11) клонировали с использованием сайтов для ферментов рестрикции KpnI и SphI, а легкую цепь (SEQ ID NO: 13) клонировали с использованием сайтов для ферментов рестрикции XhoI и BglI. Для одновременной экспрессии как тяжелой, так и легкой, цепей между легкой цепью и тяжелой цепью клонировали участок внутренней посадки рибосомы (internal ribosome entry site, IRES), используя сайты для ферментов рестрикции SpnI и ClaI. Селективный маркер встраивали в сайт для фермента рестрикции SalI. Сам chVSF был получен, как показано на схематической диаграмме на ФИГ. 2.

Пример 1-2: Экспрессия chVSF с использованием двухвекторной экспрессионной системы

Для изучения уровней трансфекции и экспрессии 15 мкг pCAGGS-GFP трансфицировали в клетки HEK 293Т с использованием 1 мг/мл полиэтиленимина (PEI). chVSF, полученный в примере 1-1, трансфицировали в клетки HEK 293Т таким же способом, и через 6 часов среду заменяли средой, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Супернатант культуры клеток собирали каждые 3 дня, и содержащиеся в нем примеси удаляли с помощью фильтра (0,45 мкм). chVSF очищали с помощью сефарозных гранул с белком A (nProtein A Sepharose)^®. chVSF элюировали 0,2 М буферным раствором глицин/HCl (рН 2,5) и использовали 1 М буферный раствор Трис-Cl (рН 9,0) в качестве буферного раствора для нейтрализации. Конкретно, супернатант культуры VSF пропускали через колонку, используя гомогенизированную смолу с 10-кратным объемом 1 М буферного раствора Трис-Cl (рН 8,0) относительно объема смолы. Полученное в результате вещество промывали путем пропускания через него по меньшей мере 5-кратного объема 0,1 М буферного раствора Трис-Cl (рН 8,0) относительно объема колонки. Полученное в результате вещество элюировали путем пропускания через него по меньшей мере 5-кратного объема 0,2 М буферного раствора глицин/HCl (рН 2,5) относительно объема смолы, в результате чего получали очищенные VSF в пробирке, в которую был заранее добавлен буферный раствор для нейтрализации. Очищенный VSF подтверждали электрофорезом в SDS-PAGE.

В результате, как проиллюстрировано на ФИГ. 3, подтвердили, что chVSF имеет структуру, состоящую из тяжелой цепи (50 кДа) и легкой цепи (25 кДа), и обладает характеристиками иммуноглобулина.

Пример 2: Получение одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) и подтверждение его противовирусного действия

Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) был получен с использованием вариабельных областей VSF. scFv имеет последовательность ДНК SEQ ID NO: 150, и scFv был получен путем клонирования ДНК в экспрессионном векторе рЕТ-22b (+) Е. coli (ФИГ. 4 и 5).

Конкретно, scFV был получен путем связывания VH и VL mVSF посредством линкера, встроенного в бактериальный экспрессионный вектор рЕТ-22b (+), обработки IPTG (bзопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) для индукции его экспрессии и очистки на колонке Ni-NTA (ФИГ. 6).

Противовирусная активность scFV была подтверждена с использованием очищенного scFv. В частности, клетки L929, которые были инфицированы вирусом EMC-D, инкубировали с scFv, VSF или антителами к вирусу EMC-D при 37°С в течение 30 часов. Затем супернатант отделяли, обрабатывали водным раствором CellTiter96 AQueous One Solution и измеряли оптическую плотность при OD450. В результате подтвердили, что во всех группах, обработанных VSF (от 5 нг до 500 нг), scFv (от 5 мкг до 10 мкг) и антителами к вирусу EMC-D (разведение 1:20), проявлялись противовирусные эффекты (ФИГ. 7).

Пример 3: Подтверждение противовирусной активности chVSF

Для подтверждения противовирусной активности chVSF, полученного в примере 1, проводили анализ MVIT.

В частности, клетки L929, представляющих собой мышиные фибробласты, высевали в лунки 96-луночного планшета в количестве 2×10⁴ клеток, инфицировали вирусом EMC-D (100 БОЕ) в течение одного часа, используя среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащую 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), а затем обрабатывали VSF (4 мкг/мл) в 2-кратных разведениях. Через 48 часов клетки фиксировали 10% формалином в течение 10 минут и окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым в течение 10 минут. Окрашенные клетки промывали PBS (фосфатно-солевым буфером) и определяли жизнеспособность клеток на основании степени окрашивания. При ингибировании пролиферации вируса все клетки становились жизнеспособными и формировали однородный слой, который также окрашивался кристаллическим фиолетовым. Напротив, при лизисе клеток в результате вирусной инфекции клетки откреплялись и, таким образом, окрашенный слой почти отсутствовал.

В результате, как проиллюстрировано на ФИГ. 8, chVSF по настоящему изобретению проявлял противовирусную активность против вируса EMC-D. Эти результаты подтверждают, что не только существующие мышиные VSF, но и chVSF по настоящему изобретению, который был получен путем химеризации существующего мышиного VSF с константной областью антитела, представляющего собой иммуноглобулин человека, на основании предположения, что mVSF представляет собой моноклональное антитело, можно также использовать в качестве противовирусного средства.

Пример 4: Получение гуманизированного антитела VSF

Гуманизированное антитело hzVSF получали с использованием chVSF на основе примеров 1 и 3.

В частности, для экспрессии двух различных видов рекомбинантных белков с применением эукариотической клетки был использован вектор pdCMV-dhfr, т.е. экспрессионная система, соответствующая вектору для экспрессии двух генов (ФИГ. 9). Вектор состоит из двух различных транскрипционных единиц генов двух различных видов в одном векторе и, таким образом, экспрессирует два различных гена, используя промотор и полиА сигнал в каждой транскрипционной единице, и представляет собой векторную систему, использующую промотор цитомегаловируса (CMV), представляющий собой сильный промотор млекопитающих. hzVSF был получен с использованием промотора, как проиллюстрировано на ФИГ. 10.

В этой связи аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи hzVSF была обозначена как SEQ ID NO: 10, области тяжелой цепи - как SEQ ID NO: 11, тогда как аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи была обозначена как SEQ ID NO: 12, а области легкой цепи - как SEQ ID NO: 13.

Для изучения уровней трансфекции и экспрессии 15 мкг pCAGGS-GFP трансфицировали в клетки HEK 293Т с использованием 1 мг/мл полиэтиленимина (PEI). chVSF и hzVSF трансфицировали в клетки HEK 293Т таким же путем, и через 6 часов среду заменяли средой, содержащей 2% FBS.

Супернатант культуры клеток собирали один раз в 3 дня, и содержащиеся в нем примеси удаляли с помощью фильтра (0,45 мкм). chVSF и hzVSF очищали с помощью гранул сефарозы с белком A (nProtein A Sepharose)^®. chVSF и hzVSF элюировали 0,2 М буферным раствором глицин/HCl (рН 2,5), и в качестве буферного раствора нейтрализации использовали 1 М буферный раствор Трис-Cl (рН 9,0). В частности, культуры VSF пропускали через колонку, используя гомогенизированную смолу с 10-кратным объемом 1 М буферного раствора Трис-Cl (рН 8,0) относительно объема смолы. Полученное в результате вещество промывали путем пропускания через него по меньшей мере 5-кратного объема 0,1 М буферного раствора Трис-Cl (рН 8,0) относительно объема колонки. Полученное в результате вещество элюировали путем пропускания через него по меньшей мере 5-кратного объема 0,2 М буферного раствора глицин/HCl (рН 2,5) относительно объема смолы, в результате чего получили очищенные VSF в пробирке, в которую был заранее добавлен буферный раствор для нейтрализации. Очистку VSF подтверждали электрофорезом в SDS-PAGE, и их активность подтверждали анализом MVIT. Используемые в эксперименте VSF приведены в таблице 2 ниже.

*rmVSF: рекомбинантныи мышиный VSF

В результате, как видно на ФИГ. 11, подтвердили, что chVSFγ2 и chVSFγ4, а также hzVSFγ2 и hzVSFγ4, состоят из тяжелой цепи (50 кДа) и легкой цепи (25 кДа), соответственно и обладают характеристиками иммуноглобулина.

Кроме того, как видно на ФИГ. 12, подтвердили, что hzVSF также обладает противовирусным действием. Эти результаты свидетельствуют о том, что hzVSF в качестве гуманизированного антитела обладает противовирусным действием, аналогичным действию VSF.

Пример 5: Подтверждение физических свойств гуманизированного антитела VSF

Физические свойства hzVSF, полученного в примере 4, были подтверждены, как описано ниже.

Пример 5-1: Подтверждение основных паттернов молекулярной массы и чистоты

Паттерны молекулярной массы и чистоту подтверждали электрофорезом в SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. В частности, hzVSF_v13 окрашивали Кумасси в SDS-PAGE в соответствии с молекулярной массой, и, таким образом, подтверждали молекулярную массу и чистоту.

В результате, как проиллюстрировано на ФИГ. 13, на дорожке 1, представляющей собой невосстанавливающий гель, основную полосу наблюдали в положении, где ожидалось антитело IgG (150 кДа); а на дорожке 2, представляющей собой восстанавливающий гель, наблюдали полосы, соответствующие положению тяжелой цепи (около 50 кДа) и легкой цепи (около 25 кДа) антитела иммуноглобулина G (IgG), что, таким образом, подтверждает, что hzVSF_v13 проявляет общий паттерн антитела IgG.

Пример 5-2: Подтверждение молекулярной массы, паттерна гликозилирования, изменения по размеру и т.д.

Для подтверждения молекулярной массы, паттерна гликозилирования, изменения по размеру и т.д. hzVSF_v13 проводили жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию. Небольшое количество hzVSF_v13 вводили в систему HPLC и наблюдали пики.

В результате подтвердили, что hzVSF_v13 проявляет характеристики IgG (ФИГ. 14). При интактной массе наблюдали общую молекулярную массу (около 140 кДа) hzVSF_v13, а наблюдаемые паттерны пиков соответствовали характерному гликозилированию IgG (например, G0/G0, G0F/G1, G1/G1 и т.д.). Кроме того, после дегликозилирования наблюдали тяжелую цепь (около 49 кДа) и легкую цепь (около 23 кДа). При суммировании молекулярных масс тяжелой цепи, где гликан был удален обработкой PNGase F, и тяжелой цепи, не обработанной PNGase F, можно было подтвердить характерный паттерн гликозилирования для IgG (G0F, G1F и G2F).

Пример 5-3: Подтверждение чистоты и агрегации

Для подтверждения чистоты и агрегации hzVSF_v13 проводили SEC-HPLC.

Условия SEC-HPLC были следующими:

- Система HPLC: Dionex Ultimate 3000

- Колонка: Tosoh TSKgel G3000 SWxl

- Подвижная фаза: фосфатный буфер, 0,5 мл/мин

- Объем ввода пробы: 10 мкл

В результате 92,44% основного пика наблюдали в положении, соответствующем мономерам типичного антитела IgG (при времени удерживания около 16 минут), и около 6,84% пиков наблюдали в положении, соответствующем димерам типичного антитела IgG (при времени удерживания около 13 минут) (ФИГ. 15).

Пример 5-4: Подтверждение pi и гетерогенности заряда Для подтверждения изоэлектрической точки hzVSF_v13 электрофорез проводили с использованием геля, характеризующегося градиентом от рН 3 до рН 10.

В результате, как проиллюстрировано на ФИГ. 16, было показано, что hzVS_v13F имеет pI 7,7, и в дополнение к основным полосам также наблюдали кислые/основные изоформы. Они соответствуют изомерам, обычно наблюдаемым в антителах IgG (например, в результате дезаминирования в С-концевом участке).

Описанные выше результаты подтверждают, что гуманизированные антитела по настоящему изобретению, hzVSF_v13, обладают физическими свойствами, подобными свойствам антител IgG.

Пример 6: Получение вариантов hzVSF. представляющих собой гуманизированные антитела со сниженной иммуногенностью. при этом обладающие сохраненной или усиленной активностью ингибирования вируса

Пример 6-1: Получение альтернативных вариантов hzVSF

На основе hzVSF было получено три альтернативных варианта hzVSF, полученного в примере 4. Активность каждого альтернативного варианта была аналогична активности дикого типа (0,5≤≤1 Ед. <1 мг/мл) или ниже (таблицы 3 и 4). Аминокислотные последовательности CDR 1-CDR 3 для каждого из альтернативных вариантов представлены в таблице 3, а аминокислотные последовательности FR1-FR4 каждого из вариантов представлены в таблице 4.

Пример 6-2: Получение вариантов hzVSF

На основе hzVSF, полученного в примере 4, были получены варианты hzVSF для фактического применения in vivo посредством снижения иммуногенности и созревания аффинности. В результате было получено в общей сложности 13 вариантов (таблицы 5 и 6). Аминокислотные последовательности CDR 1-CDR 3 для каждого из вариантов представлены в таблице 5, а аминокислотные последовательности FR1-FR4 каждого из вариантов представлены в таблице 6.

Было подтверждено, что все полученные выше 13 вариантов обладают сниженной иммуногенностью, при этом обладая противовирусной активностью и противовоспалительной активностью, сохраненной и усиленной по сравнению с активностями дикого типа.

hzVSF_var12, обладающий самой низкой иммуногенностью из описанных выше вариантов, показал такую противовирусную активность, что 1 единица проявляла противовирусную активность при 500 нг/Ед., аналогичную активности варианта hzVSF дикого типа. Напротив, hzVSF_var13, обладающий относительно низкой иммуногенностью, но относительно высокой противовирусной активностью, показал противовирусную активность при 250 нг/Ед.

Пример 6-3: Подтверждение числа эпитопов hzVSF дикого типа и его вариантов

Проводили сравнение числа эпитопов hzVSF дикого типа; hzVSF_var12 и hzVSF_var13, представляющих собой репрезентативные варианты среди вариантов со сниженной иммуногенностью дикого типа; и четырех видов лекарственных препаратов на основе антител, являющихся в настоящее время лидерами продаж на фармацевтическом рынке. В результате была подтверждена возможность относительной иммуногенности в каждом главном комплексе гистосовместимости человека (HLA) класса II, как показано в таблице 7.

В таблице 7 более высокое общее значение означает наличие более высокой вероятности нежелательных явлений, связанных с HLA класса II. На основании описанных выше результатов было подтверждено, что число эпитопов hzVSF_var12 и hzVSF_var13 со сниженной иммуногенностью по настоящему изобретению было сходным с числом эпитопов антитела Humira, имеющего наименьшее число эпитопов из этих четырех видов фармацевтических препаратов. Эти результаты свидетельствуют о том, что гуманизированные антитела по настоящему изобретению будут обладать очень низким уровнем серьезных побочных эффектов, которые могут возникать при их применении в качестве противовирусных средств, и, следовательно, подтверждают безопасность гуманизированных антител по настоящему изобретению в качестве безопасных противовирусных или противовоспалительных лекарственных средств.

Кроме того, биологическая активность каждого из вариантов (с var1 по var12) была сходной с активностью дикого типа (0,5 мг/Ед.), но показано, что активность var13 выше по сравнению с активностью дикого типа.

Пример 6-4: Подтверждение вариантов hzVSF анализом Т клеток

С целью оценки иммуногенности hzVSF_var12 и hzVSF_var13 с использованием образцов крови от 51 здорового донора подтвердили, что материал, исследуемый в анализе Т клеток in vitro по Lonza, может действовать на пролиферацию Т клеток.

Суммарные мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) от каждого донора обрабатывали hzVSF_var12 и hzVSF_var13 или гемоцианином лимфы улитки (Keyhole limpet hemocyanin, KLH) и культивировали в течение 7 дней. KLH представляет собой металлопротеин-переносчик кислорода, который можно использовать в качестве белка-носителя при продуцировании антител, и его использовали в качестве положительного контроля на способность эффективно вызывать иммунные ответы. Затем измеряли долю Т клеток, окрашенных CD3⁺CD4⁺Edu⁺. В результате KLH приводил к пролиферации Т клеток у 45 здоровых доноров (частота ответа 88%), при этом hzVSF_var12 и hzVSF_var13 индуцировали пролиферацию Т клеток только у 3 субъектов (частота ответа 5,8%) в ответ на материал (ФИГ. 17).

При этом рассчитывали индекс стимуляции (SI) пролиферации Т клеток, индуцированной KLH, hzVSF_v12 или hzVSF_v13, используя в качестве контроля РВМС, культивируемые в течение 7 дней. При SI более 2 ожидается высокий уровень иммуногенности при применении у людей. Напротив, при значении SI менее 0,5 ожидается ингибирование пролиферации Т клеток. В результате было подтверждено, что hzVSF_v12 и hzVSF_v13 проявляют низкие значения SI 1,12 и 1,03, соответственно, а также проявляют значения SI в диапазоне значений от равного или большего 0,6 до равного или меньшего 2. Напротив, KLH, используемый в качестве положительного контроля, проявлял высокое значение SI, равное 3,91 (ФИГ. 18 и 19; и таблица 8).

На основании вышеописанных результатов ожидают, что hzVSF_v12 и hzVSF_v13 будут обладать меньшей иммуногенностью при введении инфицированным вирусом пациентам и, следовательно, вызывать меньше побочных эффектов.

Пример 7: Подтверждение связывающих эпитопов hzVSF и его вариантов

Была предпринята попытка идентификации пептидов, с которыми связывается hzVSF и его варианты, полученные в описанных выше примерах.

В результате подтвердили, что hzVSF и его варианты, полученные в описанных выше примерах, связываются с изолированным пептидом с SEQ ID NO: 1, соответствующей аминокислотной последовательности виментина, в положениях аминокислот 142-294 (ФИГ. 54-58).

Пример 8: Подтверждение Физических свойств и Фармакокинетики вариантов hzVSF

Для подтверждения физических свойств и фармакокинетики вариантов hzVSF, полученных в примере 6, проводили эксперименты с репрезентативными вариантами hzVSF_var12 и hzVSF_var13.

Пример 8-1: Подтверждение паттернов молекулярной массы и чистоты вариантов hzVSF

Паттерн молекулярной массы и чистоту hzVSF_var12 и hzVSF_var13 подтверждали электрофорезом в SDS-PAGE. Образец для электрофореза в восстанавливающих условиях готовили путем смешивания 4-кратного буферного раствора для нанесения образца на гель (NuPage, 4Х LDS) (Invitrogen, NP0007) и 10-кратного восстанавливающего агента NuPage (Invitrogen, NP0009) для нанесения образца на гель с hzVSF_var12 и hzVSF_var13,, соответственно, с последующим нагреванием при 70°С в течение 10 минут. Образец для электрофореза в невосстанавливающих условиях готовили, пропуская стадии добавления восстанавливающего агента и нагревания. 10 мкл каждого из контрольных антител, hzVSF_var12 и hzVSF_var13, в концентрации 1 мг/мл, соответственно, подвергали электрофорезу в 4%-12% SDS-PAGE, гель окрашивали InstantBlue (TripleRed, ISB01L) и подтверждали чистоту hzVSF_var12 и hzVSF_var13.

В результате, как проиллюстрировано на ФИГ. 20, подтвердили, что на дорожках 2 и 4 (образцы для электрофореза в невосстанавливающих условиях) основные полосы наблюдали в положении ожидаемого размера антитела IgG (около 150 кДа); а на дорожках 3 и 5 (образцы для электрофореза в восстанавливающих условиях) наблюдали полосы, соответствующие положению тяжелой цепи (около 50 кДа) и легкой цепи (около 25 кДа) антитела иммуноглобулина G (IgG), что, таким образом, подтверждает, что варианты hzVSF также проявляют общий паттерн антитела IgG, как и в случае hzVSF. Кроме того, при использовании IgG4 в качестве контроля наблюдаемый паттерн был аналогичен паттерну, наблюдаемому на дорожке 6 (образец для электрофореза в невосстанавливающих условиях) и на дорожке 7 (образец для электрофореза в восстанавливающих условиях). Кроме того, подтвердили, что оба варианта hzVSF_var12 и hzVSF_var13 характеризуются высокой чистотой.

Кроме того, с целью подтверждения чистоты и агрегации hzVSF_var12 и hzVSF_var13 их анализировали методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SEC-HPLC), используя колонку HPLC параллельно с колонкой Zorbax GF-250 мкм, внутренний диаметр (ID) 9,2 мм × 25 см (Agilent, серия 1200). Перед вводом пробы на колонку HPLC образец в концентрации 1 мг/мл очищали пропусканием через фильтр 0,2 мкм для удаления примесей. Каждый из образцов (100 мкл) вводили на колонку и проводили HPLC при скорости тока 1 мл/мин в течение 15 минут. Анализ проводили с помощью программного обеспечения Chemstation.

В результате основной пик наблюдали в положении, соответствующем мономерам типичного антитела IgG (при времени удерживания примерно 8,65 минут), и подтвердили, что чистота hzVSF_var12 и hzVSF_var13 составляет 95% или выше (ФИГ. 21). Примерно 3,72% и 4,43% пиков наблюдали в положении, соответствующем димерам типичного антитела IgG (при времени удерживания от около 7,89 до 7,93 минуты), что, таким образом, подтверждает, что форма пика идентична таковой для антитела IgG; этот результат согласуется с результатом, полученным в электрофорезе в SDS-PAGE.

Пример 8-2: Анализ фармакокинетики вариантов hzVSF

В целях получения объективных показателей для стандарта в клинических испытаниях был проведен описанный ниже эксперимент по определению приемлемой дозировки in vivo, интервалов введения и лекарственных форм для введения hzVSF_var13 посредством количественного прогнозирования характеристик hzVSF_var13 in vivo после его введения мышам, т.е. концентрации в крови, периода полувыведения, корости метаболизма и т.д.

В качестве контроля использовали 6,25 мкг (0,31 мг/кг) IgG человека (поликлонального), при этом экспериментальным группам вводили 6,25 мкг (25 Ед.; 0,31 мг/кг), 62,5 мкг (250 Ед.; 3,10 мг/кг) и 625 мкг (2500 Ед.; 31,0 мг/кг) hzVSF_var13 путем инъекции в хвостовую вену мыши. После инъекции у мышей брали образцы крови в дни 1, 2, 4, 8, 14, 21, 28 и 35, и сыворотку крови отделяли и использовали для определения концентрации hzVSF_var13 в крови методом твердофазного иммуносорбентного ферментного анализа (ELISA).

Для анализа ELISA античеловеческий IgG (γ-специфичный) фиксировали в лунках планшета при 37°С в течение 2 часов или при 4°С в течение ночи, а затем инкубировали с 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA) при 37°С в течение 2 часов для блокирования несвязанных участков. Его подвергали взаимодействию с сыворотками, полученными из крови, собранной у мышей, при 37°С в течение 1 часа и подвергали взаимодействию с античеловеческим IgG (κ-специфичным), конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), при 37°С в течение 30 минут. Полученную в результате смесь инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 9,5 минут, используя раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ) в качестве субстрата, и определяли количество hzVSF_var13 крови в соответствии с его значением OD при 450 нм. FK (фармакокинетические) параметры при введении однократной дозы hzVSF_var13 в каждой концентрации указаны в таблице 9 и на графиках на ФИГ. 22.

В результате при введении hzVSF_var13 в однократной дозе 25 Ед. наблюдали такую же тенденцию к снижению концентрации hzVSF в крови, как для контроля-пустышки (IgG), введенного в такой же дозе. Максимальная концентрация (C_max) и площадь под кривой концентрации (AUC) возрастали параллельно возрастанию вводимой дозы, и, таким образом, была подтверждена их дозозависимость. Период полувыведения in vivo (t_1/2) hzVSF_var13 (25 Ед.) составлял 10 дней для самцов и 13 дней для самок, что незначительно меньше, чем для контроля-пустышки (16 дней для самцов и 20 дней для самок), и было показано, что период полувыведения незначительно уменьшается с увеличением вводимой дозы. Было показано, что все значения C_max, AUC, период полувыведения in vivo (t_1/2), системный клиренс in vivo и значение клиренса (CLt) выше у самок при каждой концентрации для введения, чем у самцов. Через 35 дней после введения всех мышей вскрывали и проводили измерение массы органов, патогистологическое исследование, тест на иммунотоксичность и на способность к нейтрализации, чтобы выявить наличие токсичности in vivo, вызванной hzVSF_var13, но нежелательных явлений не наблюдали.

Описанные выше результаты подтверждают, что hzVSF и его варианты в соответствии с настоящим изобретением характеризуются периодами полувыведения, сходными с периодами полувыведения других гуманизированных антител, и что проблемы для клинических применений отсутствуют.

Пример 9: Подтверждение ингибирующей вирусы активности hzVSF и его вариантов

Клетки мышей L929 инфицировали вирусом EMC-D, обрабатывали hzVSF дикого типа и hzVSF_var12 и hzVSF_var13, представляющими собой репрезентативные варианты из вариантов hzVSF, и их противовирусное действие было подтверждено в анализе MVIT примера 2.

В результате, как проиллюстрировано на ФИГ. 23, для hzVSF показано 100% противовирусное действие при концентрации 0,5 мкг/мл; a hzVSF_var12 и hzVSF_var13 показано 100% противовирусное действие при концентрациях 0,2 мкг/мл и 0,1 мкг/мл, соответственно.

Соответственно, минимальное количество, содержащееся в 1 мл VSF, проявляющее 100% противовирусное действие при инфицировании клеток L929 вирусом EMC-D и одновременной обработке VSF, было определено как 1 единица биологической активности.

В соответствии с этим биологическая активность каждого из VSF показана в таблице 10 ниже.

Эти результаты свидетельствуют о том, что варианты hzVSF, которые были вновь получены путем проведения гуманизации моноклонального антитела, снижения иммуногенности и «созревания аффинности», могут проявлять превосходные противовирусные и противовоспалительные действия при почти отсутствующих нежелательных явлениях по сравнению с hzVSF_wt, несмотря на то, что вновь полученные варианты hzVSF также характеризовались более низким титром, чем mVSF.

Пример 10: Подтверждение аффинности hzVSF

Аффинность к рецепторам hzVSF количественно определяли описанным ниже способом.

Клетки L929 высевали в количестве 6×10⁵ и инфицировали 2 MOI (множественность инфекции) вируса EMC-D в течение 0, 2, 6 и 10 часов, соответственно. К ним добавляли четыре единицы лигандов (mVSF, hzVSF_wt и hzVSF v13) и культивировали в течение 1 часа, и супернатанты культуры клеток собирали и определяли их значения константы аффинности Ka. Разность между количеством каждого добавленного лиганда и количеством собранного лиганда после взаимодействия представляет собой количество лиганда, связавшегося с рецептором, и на основании этого результата рассчитывали константу аффинности (Ka) и константу диссоциации (Kd) (таблица 11).

В результате было подтверждено, что hzVSF характеризуется константой аффинности (Ka) 1×10⁹ или выше, что соответствует потенциальным биологическим препаратам, и, таким образом, было подтверждено, что как hzVSF, так и его варианты, в качестве биологических препаратов также обладают высокой аффинностью связывания с рецепторами.

Пример 11: Подтверждение противоклеточной активности hIFN-α и hzVSF wt в клетках человека

Фибробласты человека, клетки WI-38, инфицировали EMC-D и обрабатывали интерфероном человека и hzVSF_wt в различных концентрациях, и противовирусное действие и жизнеспособность каждой клетки количественно определяли методом MTS.

Подробно, клетки высевали в лунки 96-луночного планшета и культивировали до прикрепления ко дну в течение 24 часов. Клетки инфицировали вирусом EMC-D (100 БОЕ) и обрабатывали интерфероном или hzVSF. После культивирования в течение 48 часов клетки обрабатывали 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-5-[3-карбоксиметоксифенил]-2-[4-сульфофенил]-2Н-тетразолиумом] (MTS). Клетки дополнительно инкубировали в течение 2 или 3 часов, и их жизнеспособность подтверждали путем измерения оптической плотности при 490 нм. Как проиллюстрировано на ФИГ. 24, клетки, обработанные интерфероном человека, проявляли жизнеспособность около 90% даже при меньшем количестве, чем клетки, обработанные hzVSF_wt; однако при обработке клеток интерфероном человека в высокой концентрации (4 нМ или выше) клетки демонстрировали цитотоксичность. Напротив, при обработке клеток hzVSF_wt клетки демонстрировали жизнеспособность около 100% при концентрации около 4 нМ, и какой-либо цитотоксичности для клеток не выявлено при концентрации 4 нМ или выше.

На основании описанных выше результатов ожидают, что hzVSF будет вызывать меньше неблагоприятных явлений в отличие от интерферона человека.

Пример 12: Подтверждение ингибиторной активности hzVSF wt против инфильтрации иммунных клеток и воспалительного ответа при вирусном

диабете

В целях изучения эффективности действия hzVSF на диабет у мышей в зависимости от концентрации hzVSF самцов мышей 5-недельного возраста DBA/2N инфицировали вирусом EMC-D (100 БОЕ) путем интраперитонеальной инъекции. Затем им вводили hzVSF_wt в концентрациях 2, 4 и 16 единиц, соответственно, путем инъекции в хвостовую вену и исследовали уровни глюкозы в крови и моче, начиная с 3-го дня после инфекции. Кроме того, мышей умерщвляли на 3-й и 7-й дни после инфекции, извлекали хирургическим путем их поджелудочные железы и подвергали биопсии с последующим гистологическим исследованием.

В результате, как проиллюстрировано на ФИГ. 25, если в поджелудочных железах, извлеченных у мышей после их инфицирования вирусом EMC-D и окрашивания гематоксилином-эозином, в группе, только инфицированной вирусом (контроль вируса), выявлена инфильтрация иммунных клеток и уменьшение размеров островков Лангерганса вследствие разрушения этих островков, в то время как в группе, которой вводили по меньшей мере 4 единицы hzVSF_wt (вирус + hzVSF), инфильтрация иммунных клеток не была выявлена, и островки Лангерганса также оставались нормальными. Соответственно, предположили, что hzVSF_wt ингибирует пролиферацию EMC-D и подавляет инфильтрацию иммунных клеток, таким образом, защищая островки Лангерганса от разрушения.

Кроме того, в результате определения уровней глюкозы в крови показано, что в группе, которой вводили по меньшей мере 4 единицы hzVSF_wt, диабет не развивался, и уровни глюкозы в крови были ниже 200 мг/дл, что соответствует диапазону у нормальных мышей. Что касается мочи, в группе, которой вводили по меньшей мере 8 единиц hzVSF_wt, глюкоза в моче не обнаружена (таблицы 12-14).

При вирусном диабете частота развития диабета в зависимости от концентрации hzVSF_wt показана в таблице 12, уровни глюкозы в крови в зависимости от концентрации hzVSF_wt показаны в таблице 13, и уровни глюкозы в моче в зависимости от концентрации hzVSF_wt показаны в таблице 14.

*При наличии у мыши уровня глюкозы в крови 300 мг/дл или выше и уровня глюкозы в моче «+» или выше считали, что у мыши развился диабет.

При наличии у мыши уровня глюкозы в крови 300 мг/дл или выше считали, что у мыши развился диабет.

Описанные выше результаты подтвердили, что hzVSF и его различные варианты по настоящему изобретению, благодаря их противовирусному действию на вирус EMC-D и ингибиторной активности против инфильтрации иммунных клеток, значимо ингибировали разрушение островков Лангерганса, и было подтверждено, что они способны к значительному воздействию на диабет, вызванный вирусной инфекцией. Таким образом, описанные выше результаты свидетельствуют о том, что hzVSF и его различные варианты по настоящему изобретению не только проявляют противовирусное действие, не вызывая инфильтрацию иммунных клеток, но также обладают способностью к лечению вирусного диабета, и их можно, таким образом, применять в качестве средства лечения различных видов воспалительных заболеваний.

Пример 13: Подтверждение противовирусного действия mVSF на вирус гепатита В (HBV)

Для подтверждения противовирусного действия mVSF на вирус гепатита В человека (HBV) использовали клетки HepG2.2.15, представляющие собой клетки гепатокарциномы человека, экспрессирующие HBV.

Клетки HepG2.2.15 высевали в лунки планшета и обрабатывали mVSF, и количественное определение поверхностных антигенов HBV (HBsAg), пролиферирующих в клетках и высвобождаемых в культуру, проводили каждые 3 дня с использованием ELISA. Результат преобразовывали в количество вируса на клетку. Одновременно подсчитывали количество клеток и определяли относительное количество вируса на клетку.

В результате было подтверждено, что обработка mVSF приводила к отчетливому уменьшению количества HBsAg, что позволяет предположить противовирусное действие mVSF на HBV (ФИГ. 26). Эти результаты подтверждают тот факт, что hzVSF и различные его варианты по настоящему изобретению могут эффективно ингибировать вирусы гепатита, такие как HBV, и, таким образом, обладают противовирусным действием на различные вирусы. Кроме того, было показано, что обработка mVSF в течение 9 дней приводит к ингибированию репликации вируса в каждой клетке на 80% или более, и ожидают дополнительное ингибирование у человека, что, таким образом, позволяет предположить его особую эффективность при лечении клинических симптомов.

Пример 14: Подтверждение паттернов экспрессии рецепторов VSF в инфицированных вирусом клетках

Во-первых, с целью подтверждения того, что рецепторы VSF могут экспрессироваться в инфицированных вирусом клетках, ткань печени человека от пациента с гепатитом В (участок ткани печени, не пораженный раком, хотя вследствие гепатита В в печени прогрессировало развитие рака) и ткань печени человека от пациента с гепатитом С (участок ткани печени, не пораженный раком, хотя вследствие гепатита С в печени прогрессировало развитие рака) окрашивали антителами mVSF. В качестве контроля использовали ткань печени человека, не инфицированную вирусом (не пораженную раком). В результате было показано, что рецепторы VSF экспрессируются в тканях печени, полученных от пациентов, инфицированных HBV или HCV, но рецепторы VSF не экспрессировались в контрольной ткани, что позволяет предположить, что рецепторы VSF специфичным образом экспрессируются при вирусной инфекции. Эти результаты были показаны при такой же схеме, когда эксперимент повторно проводили с использованием тканей печени человека, полученных от других пациентов (ФИГ. 27 и 28).

Впоследствии, с целью подтверждения периода экспрессии рецепторов VSF в зависимости от вирусной инфекции вирусом гриппа H1N1 инфицировали линию клеток MDCK, и репликацию вируса и экспрессию рецепторов VSF наблюдали методом флуоресцентного окрашивания. В результате подтвердили, что репликация вируса происходит в зависимости от времени после инфекции вирусом гриппа, а экспрессия VSF после инфекции возрастает (ФИГ. 29). На основании этих результатов подтвердили, что рецепторы VSF индуцируются вирусной инфекцией.

Кроме того, фибробласты человека WI-38 инфицировали вирусом ЕМС-D, а затем исследовали экспрессию рецепторов VSF и противовирусное действие VSF (ФИГ. 30). Изображения слева на ФИГ. 30 показывают экспрессию рецепторов VSF в результате инфекции EMC-D, а изображения справа показывают противовирусное действие на вирус EMC-D и экспрессию рецепторов VSF в результате воздействия hzVSF_wt. На основании описанных выше результатов в отношении инфекции вирусом EMC-D подтвердили, что VSF может оказывать противовирусное действие, и его рецепторы также специфично экспрессируются при инфекции.

В заключение подтвердили, что инфицированные вирусом клетки могут экспрессировать рецепторы VSF, хотя в зависимости от клеток время экспрессии может варьировать, а также, что воздействие VSF может индуцировать противовирусное действие, хотя не влияет на экспрессию рецепторов.

Пример 15: Подтверждение противовирусного действия hzVSF на вирус гепатита В

В целях исследования действия hzVSF на вирус гепатита В человека (HBV) проводили эксперименты с использованием hzVSF_var13, репрезентативного варианта hzVSF, как описано ниже.

Пример 15-1: Анализ ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (кзкДНК)

Инфицированную HBV линию клеток HepG2.2.15 обрабатывали hzVSF_var13 и лекарственным средством против HBV (ламивудин; Lami) в соответствии с каждой дозировкой, количество клеток подсчитывали каждую неделю и собирали одинаковое количество клеток.

Для получения кзкДНК HBV из описанных выше клеток клетки HepG2.2.15 после их выделения ресуспендировали в буферном растворе для лизиса (25 мМ EDTA, 10 мМ Трис-HCl; рН 7,5, 100 мМ NaCl, 1% SDS, 0,1 мг/мл протеиназы K) и подвергали взаимодействию при 55°С в течение 1 часа. После очистки суммарной ДНК HBV с использованием набора реагентов MEGA «Квик-Спин» (быстрого осаждения) для очистки фрагментов суммарной ДНК (Intron) полученную в результате смесь подвергали взаимодействию при 37°С с безопасной для плазмиды АТФ-зависимой ДНКазой в течение 1 часа, и фермент инактивировали при 70°С в течение 30 минут. Затем удаляли релаксированную кольцевую ДНК HBV (ркДНК) и выделяли только кзкДНК HBV.

Впоследствии проводили количественный анализ кзкДНК HBV методом количественной полимеразной цепной реакции (qPCR), используя основную смесь набора реагентов Accupower 2х Greenstar (компания Bioneer, Корея).

Праймеры, используемые для PCR, представляли собой прямой праймер 5'-TGAATCCYGCGGACGACC-3' (SEQ ID NO: 153) и обратный праймер 5'-CAGCTTGGAGGCTTGAACAG-3' (SEQ ID NO: 154) (нуклеотиды 1862-1881) (Y=С/T).

В результате подтвердили, что содержание кзкДНК инфицированных HBV клеток уменьшалось зависимым от концентрации образом при обработке hzVSF_var13 и, в частности, содержание кзкДНК почти отсутствовало после обработки 10 мкг/мл hzVSF_var13 (ФИГ. 31).

Соответственно, подтвердили, что введение hzVSF может привести к значимому уменьшению количества внутриклеточной кзкДНК и, следовательно, обладает превосходным эффектом в качестве средства для лечения HBV.

Пример 15-2: Подтверждение ингибирования ДНК HBV

Инфицированную HBV линию клеток HepG2.2.15 обрабатывали hzVSF_var13 и лекарственным средством против HBV (ламивудин; Lami) в соответствии с каждой дозировкой, количество клеток подсчитывали каждую неделю и собирали одинаковое количество клеток.

Внутриклеточную ДНК HBV очищали, как описано ниже. Полученные, как описано выше, клетки HepG2.2.15 ресуспендировали в буферном растворе для лизиса (25 мМ EDTA, 10 мМ Трис-HCl; рН 7,5, 100 мМ NaCl, 1% SDS, 0,1 мг/мл протеиназы K) и подвергали взаимодействию при 55°С в течение 1 часа. Внутриклеточную ДНК HBV очищали, используя набор реагентов MEGA «Квик-Спин» для очистки фрагментов суммарной ДНК (Intron).

Для получения внеклеточной ДНК HBV получали определенное количество супернатанта культуры клеток, обрабатывали буферным раствором для лизиса и экстрагировали. Затем проводили количественный анализ суммарной ДНК HBV методом qPCR, используя основную смесь набора реагентов Accupower 2х Greenstar (компания Bioneer, Корея).

Праймеры, используемые для PCR, представляли собой прямой праймер 5'-CCTCTTCATCCTGCTGCT-3' (SEQ ID NO: 155) и обратный праймер 5'-AACTGAAAGCCAAACAGTG-3' (SEQ ID NO: 156).

В результате в случае внеклеточной ДНК HBV количество ДНК HBV значимо уменьшалось при обработке hzVSF_var13 в очень низкой концентрации (0,1 мкг/мл) по сравнению с контролем, который обрабатывали ламивудином (ФИГ. 32). В случае внутриклеточной ДНК HBV hzVSF_var13 ингибировал ДНК HBV дозозависимым образом, и в результате обработки hzVSF_var13 показана значительно улучшенная эффективность по сравнению с контролем, который обрабатывали ламивудином (ФИГ. 33).

В заключение, было подтверждено, что введение hzVSF может привести к значимому уменьшению количества как внутриклеточной, так и внеклеточной ДНК HBV, и, следовательно, hzVSF обладает превосходной активностью в качестве терапевтического средства для лечения HBV.

Пример 16: Подтверждение противовирусного действия hzVSF на вирус гепатита С

Пример 16-1: Подтверждение противовирусного действия hzVSF_wt на вирус гепатита С

В целях исследования действия hzVSF_wt на вирус гепатита С человека (HCV) проводили эксперименты, как описано ниже.

Штаммом вируса гепатита С JFH-1 инфицировали клетки печени человека Huh7.5 в концентрации 0,1 множественности инфекции (MOI) и обрабатывали интерфероном-β (3 нг/мл) и hzVSF_wt (500, 1000 и 2000 единиц) на 3^й день после инфекции, и супернатанты культуры клеток и клетки собирали на 4^й день. Клетки измеряли, используя окрашивание NS5A HCV антителом к HCV NS5A, методом анализа сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS), и в супернатантах культуры клеток измеряли относительные титры РНК HCV с помощью количественной PCR в реальном времени.

В анализе FACS показано противовирусное действие в отношении HCV в результате обработки hzVSF_wt (1000 Ед./мл), подобное действию интерферона-В (ФИГ. 34). Кроме того, при измерении титра вируса методом количественной PCR в реальном времени для hzVSF_wt показано около 50% противовирусного действия в отношении HCV при 1000 Ед./мл, но это действие оказалось слабее по сравнению с интерфероном-β (ФИГ. 35).

Однако, если интерферон действительно вызывает нежелательные явления in vivo, hzVSF не вызывает каких-либо нежелательных явлений, а также ожидают, что он будет лечить симптомы, вызванные воспалением, следовательно, в реальных условиях hzVSF будет проявлять заметное превосходство. Таким образом, на ранних стадиях вирусной инфекции комбинация химического средства и интерферона необходима для ингибирования роста вируса; а с момента средней стадии вирусной инфекции или возникновения симптомов комбинация химического средства и интерферона необходима для ингибирования не только иммунопатологических явлений, но также роста вируса. Таким образом, описанные выше результаты свидетельствуют о том возможность комбинированной терапии химическим лекарственным средством, обладающим превосходным ингибиторным действием на рост вируса (или интерфероном), и hzVSF_wt и его различными вариантами по настоящему изобретению, обладающими превосходным ингибиторным действием против иммунопатологических явлений. Однако эти результаты также предполагают отдельное применение hzVSF_wt и его различных вариантов по настоящему изобретению в качестве противовирусного средства, не вызывающего нежелательных явлений.

Пример 16-2: Подтверждение противовирусного действия вариантов hzVSF на вирус гепатита С (HCV 1а)

Затем для исследования действия вариантов hzVSF на вирус гепатита С человека (HCV) проводили эксперименты с использованием hzVSF_var13, репрезентативного варианта hzVSF, как описано ниже.

Во-первых, для подтверждения ингибиторного действия варианта hzVSF на репликацию HCV 1а клетки Huh7.5, инфицированные HCV TN из культуры клеток (TNcc) (генотип 1а), обрабатывали hzVSF_var13 в соответствии с каждой дозировкой, и клетки собирали в день 3, день 6, день 9 и день 12. Затем после сбора HCV-инфицированных клеток суммарную РНК экстрагировали реагентом Тризол. Впоследствии синтезировали кДНК методом обратной транскрипции, и РНК HCV и гена глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (GAPDH) (гена домашнего хозяйства) для нормализации подвергали количественному анализу методом qPCR с использованием основной смеси набора реагентов Accupower 2х Greenstar для qPCR (Bioneer, Корея).

Праймеры, используемые для PCR, нацеленные на HCV, представляли собой прямой праймер 5'-GGGCTATAAGGTGCTAGTGC-3' (SEQ ID NO: 157) и обратный праймер 5'-GGCTGCCAGTGGTAATTGTT-3' (SEQ ID NO: а праймеры, используемые для PCR GAPDH, представляли собой прямой праймер 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3' (SEQ ID NO: 159) и обратный праймер 5'-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3' (SEQ ID NO: 160).

В результате было подтверждено, что содержание РНК HCV 1а уменьшалось со временем после обработки hzVSF_var13 в концентрации 0,1 Ед./мл или выше, а также, что ингибиторное действие hzVSF_var13 на репликацию HCV 1а осуществляется дозозависимым образом (ФИГ. 36А).

Кроме того, при обработке hzVSF_var13 содержание корового белка HCV подтверждали анализом методом вестерн-блоттинга, и в результате было подтверждено, что содержание белка уменьшается дозозависимым образом (ФИГ. 36В).

Затем исследовали действие hzVSF_var13 по сравнению с действием лекарственных средств против HCV. Клетки Huh7.5, инфицированные HCV TNcc (генотип 1а), обрабатывали hzVSF_var13 и лекарственными средствами против HCV (софосбувиром и симепревиром) в соответствии с дозировкой, и HCV-инфицированные клетки выделяли раз в неделю и экстрагировали суммарную РНК реагентом Тризол. Затем синтезировали кДНК методом обратной транскрипции, и суммарную РНК HCV (использовали праймеры SEQ ID NO: 157 и 158) и GAPDH (гена домашнего хозяйства) для нормализации подвергали количественному анализу методом qPCR с использованием основной смеси набора реагентов Accupower 2х Greenstar для qPCR (Bioneer, Корея).

В результате было подтверждено, что при обработке hzVSF_var13 в концентрации 1 мкг/мл доля ингибирования репликации HCV 1а была значимо выше по сравнению с контрольными лекарственными средствами (ФИГ. 37).

Соответственно, введение варианта hzVSF в клетки, инфицированные HCV TNcc (генотип 1а), приводило к уменьшению количества гена HCV (РНК) и корового белка HCV, и, таким образом, подтвердили, что варианты hzVSF обладают противовирусным действием в отношении HCV.

Пример 16-3: Подтверждение противовирусного действия вариантов hzVSF на вирус гепатита С (HCV 1b)

Затем для подтверждения ингибиторного действия вариантов hzVSF на репликацию HCV 1b клетки Huh7, экспрессирующие субгеномный репликон генотипа HCV 1b, обрабатывали hzVSF_var13 и лекарственными средствами против HCV (софосбувиром и симепревиром) в соответствии с дозировкой, HCV-инфицированные клетки выделяли раз в неделю, и суммарную РНК экстрагировали реагентом Тризол. Затем синтезировали кДНК методом обратной транскрипции, и суммарную РНК HCV и гена GAPDH (гена домашнего хозяйства) для нормализации подвергали количественному анализу методом qPCR с использованием основной смеси набора реагентов Accupower 2х Greenstar для qPCR (Bioneer, Корея).

Праймеры, используемые для PCR, нацеленные на HCV, представляли собой прямой праймер 5'-ATGCAGCCCAAGGGTATAAG-3' (SEQ ID NO: 161) и обратный праймер 5'-GGTTCTGATGTTAGGGTCGATAC-3' (SEQ ID NO: 162, a праймеры, используемые для PCR GAPDH, представляли собой праймеры SEQ ID NO: 159 и 160.

В результате было подтверждено, что обработка hzVSF_var13 приводит к ингибированию репликации HCV 1b дозозависимым образом, и, в частности, при обработке hzVSF_var13 в концентрации 1 мкг/мл ингибирование было эффективным на уровне, сходном с уровнем ингибирования контрольными лекарственными средствами (софосбувиром и симепревиром) (ФИГ. 38В). Кроме того, при определении уровня NS5A HCV методом вестерн-блоттинга было подтверждено, что количество NS5A HCV снижается дозозависимым образом в соответствии с концентрацией hzVSF_var13 при обработке клеток (ФИГ. 38А).

Соответственно, введение hzVSF_var13 в клетки, экспрессирующие репликон HCV (генотип 1b), приводило к уменьшению количества гена HCV (РНК) и белка NS5A HCV, и, таким образом, подтвердили, что hzVSF_var13 обладает противовирусным действием в отношении HCV.

Пример 16-4: Подтверждение противовирусного действия вариантов hzVSF на вирус гепатита С (HCV 2а)

Затем для подтверждения ингибиторного действия вариантов hzVSF на репликацию HCV 2а клетки JFH-1, инфицированные HCV генотипа 2а, обрабатывали hzVSF_var13 и лекарственными средствами против HCV (софосбувиром и симепревиром) в соответствии с дозировкой, HCV-инфицированные клетки выделяли раз в неделю, и суммарную РНК экстрагировали реагентом Тризол. Затем синтезировали кДНК методом обратной транскрипции, и впоследствии суммарную РНК HCV и гена GAPDH (гена домашнего хозяйства) для нормализации подвергали количественному анализу методом qPCR с использованием основной смеси набора реагентов Accupower 2х Greenstar для qPCR (Bioneer, Корея). Праймеры, нацеленные на HCV, используемые для PCR, представляли собой праймеры с SEQ ID NO: 157 и 158, а праймеры, используемые для PCR GAPDH, представляли собой праймеры с SEQ ID NO: 159 и 160.

В результате было подтверждено, что при обработке hzVSF_var13 ингибирование репликации HCV 2а было сходным с ингибированием контрольными лекарственными средствами при значимом различии в концентрации обработки в момент времени через 7 недель (ФИГ. 39В). Кроме того, при исследовании описанного выше результата на долгосрочной основе, т.е. вплоть до 21-й недели, было подтверждено, что при обработке hzVSF_var13 в концентрации 1 мкг/мл ингибиторное действие на репликацию HCV 2а сохранялось на уровне, сходном с уровнем при обработке софосбувиром и симепревиром (ФИГ. 40).

Обобщая описанные выше результаты, подтвердили, что введение hzVSF_var13 в клетки JFH-1, инфицированные HCV (генотип 2а), приводило к уменьшению количества гена HCV (РНК) и корового белка HCV (ФИГ. 39А), и, следовательно, hzVSF_var13 обладает противовирусной активностью против HCV.

Пример 17: Подтверждение терапевтического эффекта hzVSF в отношении инфекции вируса гриппа

С целью подтверждения противовирусных и противовоспалительных действий hzVSF_var13, репрезентативного варианта hzVSF, против вируса гриппа были проведены эксперименты на мышах, как описано ниже.

Самок мышей Balb/c четырехнедельного возраста инфицировали вирусом гриппа А H1N1/Пуэрто-Рико/8/34 (1×10⁵ БОЕ) в полости носа и вводили 25, 100 и 400 единиц hzVSF_var13 в хвостовую вену в день 2, 4 или 6 после инфекции. На 7-й день и на 9-й день после вирусной инфекции мышей умерщвляли. Затем определяли массу легкого и массу тела, исследовали эпителиальные клетки слизистой оболочки методом окрашивания гематоксилином и эозином (ГЭ), и инфильтрацию иммунных клеток исследовали методом иммуногистохимического окрашивания.

В результате в группе, которой вводили 500 Ед. hzVSF_var13, показано по меньшей мере 100-кратное снижение титра вируса гриппа по сравнению с контрольной группой (ФИГ. 41).

Кроме того, в группе, инфицированной вирусом гриппа H1N1, показана инфильтрация иммунных клеток в альвеолярные мешочки, тогда как в группах, которым вводили 100 Ед. и 400 Ед. hzVSF_var13, показано восстановление от симптомов, вызванных вирусом гриппа, сходное с легочной тканью неинфицированной группы (здоровым легким) независимо от периода введения. Было показано, что даже введение 25 Ед. hzVSF_var13 подавляет инфильтрацию иммунных клеток, хотя наблюдалось различие в зависимости от периода введения, и, следовательно, было показано, что введение 25 Ед. hzVSF_var13 обладает терапевтическим эффектом (ФИГ. 42).

Кроме того, при наблюдении ресничек в клетках дыхательного эпителия легких мышей в клетках неинфицированной группы и группы, получавшей hzVSF_var13 (400 Ед.), было показано наличие эпителиальных клеток с ресничками на трахее и в легких, тогда как в легких, инфицированных вирусом, эпителиальный слой был разрушен из-за вирусной инфекции (ФИГ. 43).

Кроме того, при количественном определении отношения массы легких к массе тела мышей в группе, инфицированной вирусом, показано увеличение отношения массы легкого к массе тела из-за симптомов пневмонии в легких, заполненных жидкостью, тогда как в группе, получавшей hzVSF_var13, показано уменьшение отношения массы легкого к массе тела пропорционально концентрации hzVSF_var13 до такой же степени, как у здоровых мышей (ФИГ. 44).

Наконец, ингибиторное действие hzVSF_var13, направленное против инфильтрации иммунных клеток, было подтверждено методом иммуногистохимического окрашивания с использованием маркеров Т-клеток CD4 (ФИГ. 45 и 46) и макрофагов (ФИГ. 47 и 48) (в частности, инфекция 10⁷ БОЕ на ФИГ. 46 и 48). При окрашивании легких мышей на 7^й день после инфекции вируса гриппа H1N1 (10⁷ БОЕ) наблюдали инфильтрацию Т клеток CD4 и макрофагов, тогда как в группе, получавшей hzVSF_var13, показано значимое уменьшение инфильтрации Т клеток CD4 и макрофагов (ФИГ. 45-48).

Эти результаты подтвердили, что hzVSF и его различные варианты по настоящему изобретению не только обладают превосходным противовирусным действием против вируса гриппа, но также обладают противовоспалительным действием, способным подавлять инфильтрацию иммунных клеток, что, таким образом, позволяет предположить, что их можно применять в качестве противовирусных и противовоспалительных средств, не вызывающих нежелательных явлений.

Пример 18: Подтверждение противовирусного действия hzVSF на различные вирусы

Чтобы подтвердить, обладают ли hzVSF_wt и его варианты по настоящему изобретению противовирусным действием на различные вирусы, изучали действия hzVSF_wt и hzVSF_var13, являющихся репрезентативными вариантами hzVSF_wt, in vitro и in vivo. Эксперименты in vitro относятся к противовирусному действию, а эксперименты in vivo относятся к противовирусному и противовоспалительному действиям.

Результаты представлены в таблице 15.

*НТ: не тестировали

В результате было показано, что hzVSF обладает превосходными противовирусными и противовоспалительными действиями против вируса энцефаломиокардита (EMCV), как in vitro, так и in vivo. Показано превосходное противовирусное действие hzVSF против менговируса in vitro. Также показано противовирусное действие hzVSF против реовируса in vitro. Также показано противовирусное действие hzVSF против HIV in vitro. Также показаны противовирусное и противовоспалительное действия hzVSF против HCMV. Также показаны действия hzVSF против вируса Хантаан in vitro и показано противовирусное действие против вируса гепатита В и С in vitro. Также показаны противовирусное и противовоспалительное действия hzVSF против вируса гепатита мыши (MHV), который вызывает гепатит у мышей по механизму, сходному с гепатитом человека, в особенности, in vivo. Также показаны противовирусное и противовоспалительное действия hzVSF против вируса гриппа, как in vitro, так и in vivo, и эти действия были более примечательными in vivo.

Пример 19: Подтверждение ингибиторного действия введения mVSF против секреции воспалительных цитокинов в модели мыши С целью подтверждения действия mVSF на образование воспалительных цитокинов мышей инфицировали вирусом EMC-D и вводили вместе с mVSF, и через 3 дня определяли количество воспалительных цитокинов в сыворотке крови методом ELISA. Как проиллюстрировано в таблице 16, уровни воспалительных цитокинов, таких как интерлейкин (IL)-6, фактор некроза опухоли (TNF)-α, интерферон (IFN)-γ и моноцитарный хемотактический белок (МСР)-1, повышались после вирусной инфекции; тем не менее, введение mVSF приводило к ингибированию экспрессии этих воспалительных цитокинов.

*HO: не определяли

На основании описанных выше результатов было подтверждено, что mVSF обладает противовоспалительным действием, которое ингибирует воспаление, вызванное вирусной инфекцией.

Кроме того, с целью подтверждения действия mVSF на образование воспалительных цитокинов у мыши с острым гепатитом мышей инфицировали вирусом гепатита мыши и вводили им VSF, и через 1 или 3 дня после инфекции определяли количество воспалительных цитокинов в сыворотке крови методом ELISA. Как проиллюстрировано в таблице 17, уровни воспалительных цитокинов, таких как IL-6, TNF-α, IFN-γ и МСР-1, повышались после вирусной инфекции; тем не менее, введение VSF приводило к ингибированию экспрессии этих воспалительных цитокинов. Кроме того, было показано, что однократное комбинированное введение IFN-α оказывает более значимое синергическое действие.

На основании описанных выше результатов было подтверждено, что VSF также обладает противовоспалительным действием, способным к ингибированию воспаления, вызванного вирусной инфекцией.

Пример 20: Подтверждение ингибиторного действия введения hzVSF против секреции воспалительных цитокинов в модели мыши

С целью подтверждения, что hzVSF по настоящему изобретению может ингибировать секрецию воспалительных цитокинов для лечения воспалительных заболеваний, были проведены описанные ниже эксперименты.

Собирали легкие мышей, инфицированных вирусом гриппа H1N1 (вирус гриппа A/PR8) (1×10⁵ БОЕ), и легкие мышей, которым вводили hzVSF_var13 (500 единиц) через день после инфицирования вирусом. Легкие гомогенизировали в буферном растворе Greenberger для лизиса (GLB), и полученный в результате гомогенат помещали на лед на 30 минут и центрифугировали при 3470×g при 4°С в течение 7 минут. После сбора супернатанта его центрифугировали при 420×g при 4°С в течение 10 минут, супернатант образцов ткани легких смешивали с иммобилизующими гранулами и РЕ-реганетом для детектирования в количестве 50 мкл каждого в соотношении 1:1:1 и подвергали взаимодействию при комнатной температуре в течение 2 часов в защищенном от света месте. По окончании реакции гранулы ресуспендировали в буферном растворе для отмывки, проводили измерение образцов с использованием устройства FACS canto II и регистрировали данные.

В результате было подтверждено, что количество IL-6, TNF-α, IFN-γ и CCL2 (МСР-1), относящихся к провоспалительным цитокинам, присутствующим в легких мышей, значительно увеличивалось на 7-й день после инфекции вирусом гриппа. Тем не менее, было подтверждено, что введение hzVSF_var13 по настоящему изобретению приводило к значимому ингибированию образования цитокинов в легких мышей (ФИГ. 49).

Таким образом, предположили, что hzVSF_var13 по настоящему изобретению может ингибировать различные виды воспалительных цитокинов, и, следовательно, его можно применять в качестве средства для лечения различных воспалительных заболеваний, вызванных вирусной инфекцией.

Пример 21: Подтверждение действия hzVSF после инфекции EMC-D в линии клеток с гиперэкспрессией виментина (стабильная линия клеток)

Клетки MCF-7, не экспрессирующие виментин, трансфицировали виментином (wt) или виментином (mt), в котором hzVSF-связывающий домен был мутирован, с получением линии клеток с гиперэкспрессией виментина (wt) или виментина (mt). Затем на отобранных клетках со сходным уровнем экспрессии виментина проводили анализ MVIT.

Конкретно, клетки высевали в количестве 2×10⁴ на лунку и инфицировали вирусом EMC-D (2 MOI), и через 2 часа после этого добавляли hzVSF_var13 в концентрациях от 256 Ед. с последующим 4-кратным серийным разведением и культивировали в течение 2 дней. Затем культивируемые клетки фиксировали метанолом, окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетовым и высушивали на воздухе для наблюдения.

В результате было подтверждено, что действие hzVSF против инфекции вируса EMC-D не наблюдается в родительских клетках MCF-7, в ложно трансфицированных клетках и в клетках, экспрессирующих виментин (mt), тогда как клетки MCF-7, способные экспрессировать виментин (wt), были индуцированы вирусной инфекцией, в результате чего произошли структурные изменения виментина до рецепторов VSF (VR), что, таким образом, подтверждает противовирусное действие hzVSF (ФИГ. 50 и 51).

Затем дополнительно был проведен анализ WST для подтверждения цитотоксичности вследствие инфекции EMC-D.

Клетки, экспрессирующие виментин (wt), и клетки, экспрессирующие виментин (mt), культивировали в течение трех дней в тех же условиях, как для анализа MVIT, обрабатывали тетразолиевой солью (WST-1), дополнительно культивировали в течение 4 часов и измеряли оптическую плотность при 450 нм. После измерения супернатант удаляли, и клетки фиксировали метанолом, окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетовым в течение 20 минут, а затем высушивали на воздухе. Окрашенные клетки растворяли в метаноле и измеряли оптическую плотность при 540 нм.

В результате было подтверждено, что действие hzVSF против инфекции вируса EMC-D не наблюдается в родительских клетках MCF-7, в ложно трансфицированных клетках и в клетках, экспрессирующих виментин (mt), тогда как клетки MCF-7, способные экспрессировать виментин (wt), были индуцированы вирусной инфекцией, в результате чего произошли структурные изменения виментина до рецепторов VSF (VR), что, таким образом, подтверждает противовирусное действие hzVSF (ФИГ. 52).

Затем экспрессионный признак рецепторов VSF (VR) после инфекции EMC-D изучали в линии клеток с гиперэкспрессией виментина (стабильная линия клеток). В этом аспекте каждую из стабильных линий клеток MCF-7, т.е. клеток, экспрессирующих виментин (wt) и виментин (mt), инфицировали EMC-D (5 MOI) в течение 9 часов, а затем клетки подвергали иммунологическому окрашиванию hzVSF_var13. Затем клетки фиксировали и пермеабилизировали, и hzVSF_var13, разведенный в соотношении 1:250, подвергали взаимодействию с клетками. Затем клетки подвергали взаимодействию с конъюгированным с флуоресцеинтиоцианатом (FITC) козьим антителом против IgG человека и исследовали экспрессию рецепторов VSF (VR) к hzVSF в клетках подфлуоресцентным микроскопом (500 × увеличение).

В результате, как проиллюстрировано на ФИГ. 55, было подтверждено, что hzVSF_var13 не связывался с экспрессирующими виментин клетками, ложно трансфицированными клетками и клетками, в которых hzVSF-связывающие домены были мутированы, но в результате вирусной инфекции VR экспрессировался в клетках, экспрессирующих виментин дикого типа (ФИГ. 53).

Пример 22: Подтверждение связывания VSF с VR WT и VR МТ, очищенными в Е. coli

Рекомбинантные белки виментина (5 мг), очищенные с помощью системы Ni-NTA, и hzVSF_var13 смешивали в молярном отношении 2:1, доводили объем фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) до конечного объема 700 мл и инкубировали в орбитальном встряхивателе при 4°С в течение 3 часов. Затем к этом смеси добавляли гранулы с белком А (50% суспензию), инкубировали при 4°С в течение 1 часа, и комплекс белок A-hzVSF-VR центрифугировали при 3000×g при 4°С в течение 3 минут. Затем супернатант удаляли, и гранулы промывали PBS и снова центрифугировали при 3000×g при 4°С в течение 3 минут, и процесс повторяли 3 раза. Впоследствии к ним добавляли 2-кратный буферный раствор для нанесения образца на гель с SDS и кипятили в течение 5 минут для проведения анализов в электрофорезе с SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.

В результате подтвердили, что связывание белков, в которых 6 аминокислотных остатков виментина, Y150, R186, Q195, R217, K235 и R270, подверглись мутации в виде замены пар оснований на F, К, N, К, R и К, соответственно, с hzVSF отчетливо уменьшалось (ФИГ. 54). Соответственно, подтвердили, что hzVSF может связываться с Y150, R186, Q195, R217, K235 и R270 виментина.

Пример 23: Подтверждение связывания между VR, который претерпевал гиперэкспрессию в клетках HEK293T, и VSF

Клетки HEK293T трансфицировали виментином WT или виментином МТ для исследования их связывания с hzVSF_v13.

В частности, клетки HEK293T (2×10⁶), трансфицированные ДНК виментина WT (дикого типа) или виментина МТ (мутантного типа), высевали в культуральные чашки Петри диаметром 100 мм (вектор: pcDNA3.1mycHisC) и инкубировали в течение 48 часов. Затем клетки собирали, обрабатывали 1% лизирующим буферным раствором CHAPS (1 мл) и помещали на лед на 20 минут для лизиса клеток. Лизированные клетки центрифугировали при 13000 об/мин при 4°С в течение 15 минут, а затем супернатант переносили в новую пробирку.

Белок из супернатанта (700 мг) обрабатывали гранулами с белком А в 50% суспензии и оставляли для предварительной очистки при 4°С на 1 час. Затем полученную в результате смесь центрифугировали при 3000 об/мин при 4°С в течение 3 минут, и супернатант переносили в новую пробирку. Полученную в результате смесь обрабатывали hzVSF_var13 в соотношении 1:100 и инкубировали при 4°С в течение ночи для связывания между VSF и VR. Затем к смеси добавляли гранулы с белком А до 50% суспензии и подвергали взаимодействию при 4°С в течение 1 часа. В результате получили комплекс белок A-VSF-VR, и для отмывания от гранул его центрифугировали при 3000×g при 4°С в течение 3 минут, и супернатант удаляли. Впоследствии осажденный комплекс промывали 3 раза добавлением 1% лизирующего буфера CHAPS. Полученную в результате смесь обрабатывали 2-кратным буферным раствором для нанесения образца на гель для проведения электрофореза в SDS-PAGE и анализов методом иммуноблоттинга.

В результате подтвердили, что связывание белков, в которых 6 аминокислотных остатков виментина, Y150, R186, Q195, R217, K235 и R270, подверглись мутации в виде замены пар оснований на F, К, N, К, R и К, соответственно, с hzVSF отчетливо уменьшалось (ФИГ. 55). Соответственно, подтвердили, что hzVSF может связываться с Y150, R186, Q195, R217, K235 и R270 виментина.

Слабое связывание VSF в линии клеток, в которой 6 аминокислотных остатков были заменены вследствие мутации, предположительно обусловлено димеризацией и тетрамеризацией виментина дикого типа, который является эндогенным для клеток HEK293T, с гиперэкспрессируемым мутантным виментином.

В дополнение к описанным выше результатам была изучена модель связывания виментина с VSF с помощью компьютерных программ (ФИГ. 56-58). Конкретные программы, используемые для этого анализа, приведены ниже.

Моделирование димера VR: Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0 (компонент программного обеспечения для выявления матрицы: HHpred 1.51)

Прогнозирование вторичной структуры: Psi-pred 2.5

Прогнозирование дезорганизации: Disopred 2.4

Прогнозирование трансмембранных свойств: Memsat_SVM

Многоматричное моделирование и ab initio: Poing 1.0

Переориентация структур для удобства визуализации: OVOP

Моделирование комплекса VR_димер и VSF: Pymol

Моделирование комплекса VR_димер и химического вещества: autodock vina

Структура, в которой VR и hzVSF связаны вместе, была выведена на основании моделирования димера VR, и в заключение было подтверждено, что hzVSF связывается с остатками Y150, R186, Q195, R217, K235 и R270.

Описанные выше результаты свидетельствуют о том, что антитело по настоящему изобретению, специфично связывающееся с пептидом с SEQ ID NO: 1, или связывающийся с пептидом фрагмент при специфичном связывании с пептидом могут проявлять противовирусные и противовоспалительные действия против широкого ряда вирусных заболеваний. В отличие от существующих противовирусных средств, таких как интерферон или химиотерапевтические средства, они могут оказывать избирательное действие на инфицированные вирусом клетки без каких-либо нежелательных явлений, требуют небольшого количества для лечения и обладают противовоспалительной активностью за счет подавления инфильтрации иммунных клеток, таким образом, предположительно их можно применять в качестве средств для лечения различных вирусных заболеваний.

На основании вышеизложенного, специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, способен понять, что настоящее изобретение может быть осуществлено в других конкретных формах без изменения технических концепций или неотъемлемых характеристик настоящего изобретения. В связи с этим иллюстративные воплощения, раскрытые в настоящем документе, предназначены только для иллюстративных целей, и их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, подразумевают, что настоящее изобретение охватывает не только эти иллюстративные воплощения, но также их различные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в сущность и объем настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая гуманизированное, мышиное и химерное антитела или их фрагменты, специфично связывающиеся с пептидом с SEQ ID NO: 1, где указанный пептид обращен к клеточной поверхности в инфицированных вирусом клетках, полинуклеотид, кодирующий вышеуказанные антитела, экспрессионный вектор, клетка-хозяин для экспрессирования вышеуказанных антител, способ получения вышеуказанных антител, противовирусная композиция и композиция для предотвращения или лечения воспалительных заболеваний, вызванных вирусной инфекцией, содержащие вышеуказанные антитела, способ лечения инфекционных вирусных заболеваний и способ лечения воспалительных заболеваний, вызванных вирусной инфекцией. Изобретение расширяет арсенал средств для связывания с пептидом с SEQ ID NO: 1, где указанный пептид обращен к клеточной поверхности в инфицированных вирусом клетках. 12 н. и 18 з.п. ф-лы, 58 ил., 17 табл., 23 пр.

1. Гуманизированное антитело или его фрагмент, специфично связывающиеся с пептидом с SEQ ID NO: 1, где указанный пептид обращен к клеточной поверхности в инфицированных вирусом клетках, где указанное гуманизированное антитело содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR (определяющий комплементарность участок) 1 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2; CDR2 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 14 и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 15; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи c SEQ ID NO: 5; CDR2 легкой цепи c SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18 и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 19.

2. Гуманизированное антитело или его связывающийся с пептидом фрагмент по п. 1, где указанный связывающийся с пептидом фрагмент представляет собой Fab, Fab′, F(ab′)2, scFv, dsFv, ds-scFv, их димер, минитела, диатела, мультимер или фрагмент биспецифического антитела.

3. Гуманизированное антитело или его связывающийся с пептидом фрагмент по п. 1, где гуманизированное антитело или связывающийся с пептидом фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую каркасный участок 1 (FR1) тяжелой цепи c SEQ ID NO: 20; FR2 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 21; FR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 28 и FR4 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 23; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую FR1 легкой цепи c SEQ ID NO: 24; FR2 легкой цепи c SEQ ID NO: 25; FR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 26 и FR4 легкой цепи c SEQ ID NO: 27.

4. Гуманизированное антитело или его связывающийся с пептидом фрагмент по п. 1, где гуманизированное антитело или связывающийся с пептидом фрагмент содержит:

(а) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно;

(б) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 7, соответственно;

(в) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 7, соответственно;

(г) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 7, соответственно;

(д) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, соответственно;

(е) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно;

(ж) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно; FR1 тяжелой цепи, FR2 тяжелой цепи, FR3 тяжелой цепи и FR4 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно; и FR1 легкой цепи, FR2 легкой цепи, FR3 легкой цепи и FR4 легкой цепи c SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(з) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 4, соответственно; FR1 тяжелой цепи, FR2 тяжелой цепи, FR3 тяжелой цепи и FR4 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно; и FR1 легкой цепи, FR2 легкой цепи, FR3 легкой цепи и FR4 легкой цепи c SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(и) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; FR1 тяжелой цепи, FR2 тяжелой цепи, FR3 тяжелой цепи и FR4 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно; и FR1 легкой цепи, FR2 легкой цепи, FR3 легкой цепи и FR4 легкой цепи c SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(к) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 4, соответственно; FR1 тяжелой цепи, FR2 тяжелой цепи, FR3 тяжелой цепи и FR4 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 7, соответственно; и FR1 легкой цепи, FR2 легкой цепи, FR3 легкой цепи и FR4 легкой цепи c SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(л) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; FR1 тяжелой цепи, FR2 тяжелой цепи, FR3 тяжелой цепи и FR4 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 7, соответственно; и FR1 легкой цепи, FR2 легкой цепи, FR3 легкой цепи и FR4 легкой цепи c SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(м) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 4, соответственно; FR1 тяжелой цепи, FR2 тяжелой цепи, FR3 тяжелой цепи и FR4 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, соответственно; и FR1 легкой цепи, FR2 легкой цепи, FR3 легкой цепи и FR4 легкой цепи c SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно;

(н) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; FR1 тяжелой цепи, FR2 тяжелой цепи, FR3 тяжелой цепи и FR4 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 23, соответственно; CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19, соответственно; и FR1 легкой цепи, FR2 легкой цепи, FR3 легкой цепи и FR4 легкой цепи c SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно; или

(о) CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 4, соответственно; и CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 7, соответственно.

5. Гуманизированное антитело или его связывающийся с пептидом фрагмент по п. 1, где гуманизированное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи c SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 76 и SEQ ID NO: 78 или SEQ ID NO: 80 и SEQ ID NO: 82, соответственно.

6. Мышиное антитело или его фрагмент, специфично связывающиеся с пептидом с SEQ ID NO: 1, где указанный пептид обращен к клеточной поверхности в инфицированных вирусом клетках, где указанное мышиное антитело содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 137; CDR2 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 138 и CDR3 тяжелой цепи c SEQ ID NO: 139; и

вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи c SEQ ID NO: 134; CDR2 легкой цепи c SEQ ID NO: 135 и CDR3 легкой цепи c SEQ ID NO: 136.

7. Мышиное антитело или его связывающийся с пептидом фрагмент по п. 6, где мышиное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи c SEQ ID NO: 9 и вариабельную область легкой цепи c SEQ ID NO: 8.

8. Мышиное антитело или его связывающийся с пептидом фрагмент по п. 6, где указанный связывающийся с пептидом фрагмент представляет собой Fab, Fab′, F(ab′)2, scFv, dsFv, ds-scFv, их димер, минитела, диатела, мультимер или фрагмент биспецифического антитела.

9. Химерное антитело или его фрагмент, специфично связывающиеся с пептидом с SEQ ID NO: 1, где указанный пептид обращен к клеточной поверхности в инфицированных вирусом клетках, где указанное химерное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи c SEQ ID NO: 141 или SEQ ID NO: 142 и вариабельную область легкой цепи c SEQ ID NO: 140.

10. Химерное антитело или его связывающийся с пептидом фрагмент по п. 9, где химерное антитело содержит тяжелую цепь с SEQ ID NO: 146 или SEQ ID NO: 148 и легкую цепь с SEQ ID NO: 144.

11. Химерное антитело или его фрагмент по п. 9, где указанный фрагмент представляет собой Fab, Fab′, F(ab′)2, scFv, dsFv, ds-scFv, их димер, минитела, диатела, мультимер или фрагмент биспецифического антитела.

12. Антитело или его связывающийся с пептидом фрагмент по пп. 2, 8 и 11, где scFv состоит из вариабельной области тяжелой цепи c SEQ ID NO: 131 и вариабельной области легкой цепи c SEQ ID NO: 133, которые связаны посредством линкера.

13. Антитело или его связывающийся с пептидом фрагмент по пп. 2, 8 и 11, где scFv состоит из вариабельной области тяжелой цепи, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 130, и вариабельной области легкой цепи, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 132, которые связаны посредством линкера.

14. Антитело или его связывающийся с пептидом фрагмент по пп. 1, 6 и 9, где указанные антитело или связывающийся с пептидом фрагмент специфично связываются с 9-м, 45-м, 54-м, 76-м, 94-м или 129-м аминокислотным остатком пептида SEQ ID NO: 1.

15. Полинуклеотид, кодирующий антитело или связывающийся с пептидом фрагмент по любому из пп. 1-14, где указанный пептид обращен к клеточной поверхности в инфицированных вирусом клетках.

16. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 15.

17. Клетка-хозяин, в которую включен вектор по п. 16, для экспрессирования указанного антитела или его фрагмента.

18. Способ получения антитела или связывающегося с пептидом фрагмента, где используют клетку по п. 17.

19. Антитело или связывающийся с пептидом фрагмент, полученные способом получения по п. 18.

20. Противовирусная композиция, содержащая эффективное количество антитела или его связывающегося с пептидом фрагмента по любому из пп. 1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.

21. Противовирусная композиция по п. 20, которая предназначена для предотвращения или лечения инфекционных вирусных заболеваний посредством противовирусного действия.

22. Противовирусная композиция по п. 20, которая специфично действует на инфицированные вирусом клетки.

23. Противовирусная композиция по п. 20, которая подавляет инфильтрацию иммунных клеток.

24. Противовирусная композиция по п. 20, которая ингибирует воспалительные ответы.

25. Противовирусная композиция по п. 20, где вирус характеризуется обращением части виментина к поверхности мембраны клетки-хозяина в результате вирусной инфекции в клетке-хозяине.

26. Противовирусная композиция по п. 20, где вирус выбран из группы, состоящей из семейства Orthomyxoviridae, семейства Picornaviridae, семейства Retroviridae, семейства Herpesviridae, семейства Filoviridae, семейства Coronaviridae, семейства Hepadnaviridae, семейства Flaviviridae и семейства Bunyaviridae.

27. Противовирусная композиция по п. 20, где вирус выбран из группы, состоящей из вируса гриппа, вируса гепатита, вируса энцефаломиокардита, менговируса, реовируса, вируса иммунодефицита человека (HIV), вируса Эбола, коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), коронавируса средневосточного респираторного синдрома (MERS), цитомегаловируса человека (HCMV) и вируса Хантаан.

28. Композиция для предотвращения или лечения воспалительных заболеваний, вызванных вирусной инфекцией, содержащая эффективное количество антитела или его связывающегося с пептидом фрагмента по любому из пп. 1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.

29. Способ лечения инфекционных вирусных заболеваний, включающий введение композиции по п. 20 инфицированному вирусом субъекту, за исключением человека.

30. Способ лечения воспалительных заболеваний, вызванных вирусной инфекцией, включающий введение композиции по п. 28 инфицированному вирусом субъекту с воспалительным заболеванием, за исключением человека.