Способ идентификации и количественного определения содержания олигопептидов в фармацевтической субстанции "Пептофорс" методом спектроскопии ЯМР Российский патент 2019 года по МПК G01N24/08 

Изобретение относится к области контроля качества лекарственных средств и может быть использовано для идентификации олигопептидов, входящих в состав фармацевтической субстанции «Пептофорс», и оценки их количественного содержания.

Субстанция «Пептофорс» относится к нейротропным средствам и обладает противогипоксическим, нейропротекторным, антиамнестическим действиями, что позволяет использовать ее для профилактики и лечения состояний, связанных с нарушением мозгового кровообращения, цереброваскулярных и нейродегеративных заболеваний, сопровождающихся снижением когнитивных функций, а также для повышения жизнеспособности. Субстанция «Пептофорс» представляет собой смесь пяти близких по строению олигопептидов: аланил-аспартил-глутамил-лейцин (ADEL); аспартил-глутамил-аргинин (DER); аспартил-глутамил-глицин (DEG); аспартил-глутамил-пролин (DEP); лизил-аспартил-глутаминовая кислота (KDE). Весовая доля компонентов в пересчете на безводное, свободное от органических растворителей и уксусной кислоты вещество составляет 158,33-175,00 мг/г для ADEL, DER, DEG, DEP и 316,65-349,99 мг/г для KDE.

Известен способ идентификации и количественного определения содержания олигопептидов фармацевтических субстанций на основе метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), включающий сравнение времен удерживания и площадей пиков на хроматограмме испытуемой фармацевтической субстанции со временами удерживания и площадями пиков на хроматограмме соответствующих стандартных образцов (СО) олигопептидов [1].

Недостатком указанного способа применительно к фармацевтической субстанции «Пептофорс» является относительность идентификации и количественного определения, связанная с необходимостью использования СО ADEL, DER, DEG, DEP, KDE для установления времени удерживания и построения градуировочной функции между измеряемой площадью пика на хроматограмме и содержанием олигопептида в субстанции. Кроме того, фармакопейные СО олигопептидов, входящих в состав фармацевтической субстанции «Пептофорс», не производятся.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемому изобретению является способ подтверждения подлинности фармацевтической субстанции индивидуального олигопептида бусерелина ацетата методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [2]. Спектроскопия ЯМР является абсолютным методом определения мольного соотношения компонентов смеси и позволяет определять весовую долю каждого компонента без использования СО и точного взятия навесок и объемов [3]. Идентификация индивидуальных олигопептидов методом спектроскопии ЯМР без использования СО предполагает структурную интерпретацию спектральных данных, то есть соотнесение каждого сигнала в спектрах ¹H и ¹³C с конкретным структурным фрагментом соединения. Структурную интерпретацию одномерных спектров ЯМР индивидуального олигопептида проводят путем комплексного анализа данных двумерных спектров ¹H-¹H gCOSY, ¹H-¹³C gHSQC и ¹H-¹³C gHMBC по определенному алгоритму [2].

К недостаткам прототипа следует отнести то, что для идентификации смеси близких по строению олигопептидов без их предварительного разделения или введения изотопных меток этот алгоритм не применим ввиду сложности структурной интерпретации спектральных данных, связанной с частичным или полным перекрыванием большинства сигналов в спектре ¹H и ряда сигналов в спектрах ¹³C, ¹H-¹H gCOSY, ¹H-¹³C gHSQC и ¹H-¹³C gHMBC.

Техническим результатом изобретения является идентификация и количественное определение содержания олигопептидов в фармацевтической субстанции «Пептофорс» методом спектроскопии ЯМР без использования стандартных образцов.

Достижение технического результата обеспечивается благодаря следующим техническим решениям:

1) Применению алгоритма структурной интерпретации спектров ЯМР индивидуальных олигопептидов к смеси пяти близких по строению олигопептидов фармацевтической субстанции «Пептофорс».

2) Составлению таблицы структурного соответствия сигналов в спектрах ¹H и ¹³C, что позволит без предварительного разделения близких по составу олигопептидов, без использования СО и без изотопных меток провести идентификацию фармацевтической субстанции «Пептофорс» и количественно оценить весовую долю каждого олигопептида (компонента субстанции) путем интегрирования выделенных на ее основе характеристических сигналов.

Сущность заявляемого способа заключается в регистрации ¹H и ¹³C спектров ЯМР с последующим сравнением их с данными Табл. 1 структурного соответствия сигналов смеси олигопептидов фармацевтической субстанции «Пептофорс» (нумерация структурных фрагментов представлена на Фиг. 1-5) и количественном измерении весовых долей олигопептидов ADEL, DER, DEG, DEP, KDE путем интегрирования их характеристических сигналов. В спектре ¹³C интегрируют однотипные сигналы метиленовых фрагментов. Данные Табл. 1 получены путем комплексного анализа данных двумерных спектров ¹H-¹H gCOSY, ¹H-¹³C gHSQC и ¹H-¹³C gHMBC фармацевтической субстанции «Пептофорс» с применением существующего алгоритма структурной интерпретации спектров ЯМР индивидуальных олигопептидов [2]. Обработка двумерных спектров проводилась при комбинированном использовании различных взвешивающих функций, что позволило сузить области перекрывания сигналов и упростить процедуру расшифровки спектров ЯМР смеси пяти олигопептидов.

Характеристическими сигналами являются:

¹H (D₂O), δ, м. д. ADEL: 0,89 (д, J=5,9 Гц, 3H, СН₃), 0,93 (д, J=5,9 Гц, 3H, СН₃), 1,55 (д, J=7,0 Гц, 3H, СН₃), 4,12 (кв, J=7,1 Гц, 1Н, СН); DER: 3,22 (дд, J=6,7; 1,9 Гц, 1Н, СН); DEG: 3,88 (с, 2Н, СН₂); DEP (конформер А): 3,73 (м, 1Н, СН₂), 3,77 (м, 1Н, СН₂); DEP (конформер В): 3,46 (м, 1Н, СН₂), 3,60 (м, 1Н, СН₂); KDE: 1,46 (м, 2Н, СН₂), 2,41 (т, J=7,5 Гц, 2Н, СН₂), 3,02 (т, J=7,6 Гц, 2Н, СН₂), 4,06 (дд, J=8,6, 5,4 Гц, 1Н, СН).

¹³C (D₂O), δ, м. д. ADEL: 31,10; 37,31; 40,51; DER: 25,13; 29,04; 31,30; 37,17; 41,19; DEG: 31,19; 37,09; 42,94; DEP: 26,46; 29,71; 30,74; 36,98; 48,27 (конформер A); 27,80; 30,65; 31,92; 36,98; 47,68 (конформер В); KDE: 21,67; 26,96; 27,48; 30,92; 31,42; 37,45; 39,62.

Регистрацию спектров ¹H и ¹³C проводят при температуре 300 К на спектрометре ЯМР с рабочей частотой по протонам не менее 500 МГц. Калибровку шкалы химических сдвигов ¹H проводят по сигналу метильной группы уксусной кислоты, присутствующей в субстанции (δ=2,08 м.д.), шкалы химических сдвигов ¹³C - по сигналу внутреннего стандарта диоксана (δ=67,19 м.д.). Идентификация олигопептидов ADEL, DER, DEG, DEP, KDE подтверждается на основе совпадения химических сдвигов сигналов спектров ¹H и ¹³C испытуемого образца с химическими сдвигами, приведенными в Табл. 1. Весовую долю (X_{i, масс}, мг/г) каждого из олигопептидов ADEL, DER, DEG, DEP, KDE рассчитывают no формуле (1) [3]:

где

j=1…i…5;

M_i - молекулярная масса i-го олигопептида;

- нормированное значение интегральной интенсивности характеристического сигнала i-го олигопептида;

M_j - молекулярная масса j-го олигопептида;

- нормированное значение интегральной интенсивности характеристического сигнала j-го олигопептида.

Существенными отличительными признаками заявляемого изобретения являются:

1) Возможность идентификации и количественного определения содержания олигопептидов, входящих в состав фармацевтической субстанции «Пептофорс», без их предварительного разделения, без использования СО и изотопных меток.

2) Ликвидация неопределенности измерения, связанной со взятием объемов растворителей, точных навесок испытуемого образца фармацевтической субстанции и СО индивидуальных олигопептидов и с неопределенностью аттестованного значения содержания основного компонента СО, что позволяет повысить точность количественного определения индивидуального олигопептида в смеси методом спектроскопии ЯМР по сравнению с методом ВЭЖХ.

Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1-11):

Фиг. 1. Структурная формула аланил-аспартил-глутамил-лейцина (ADEL).

Фиг. 2. Структурная формула аспартил-глутамил-аргинина (DER).

Фиг. 3. Структурная формула аспартил-глутамил-глицина (DEG).

Фиг. 4. Структурная формула аспартил-глутамил-пролина (DEP).

Фиг. 5. Структурная формула лизил-аспаргил-глутаминовой кислоты (KDE).

Фиг. 6. Спектр ¹H фармацевтической субстанции «Пептофорс».

Фиг. 7. Фрагмент спектра ¹H фармацевтической субстанции «Пептофорс» с интергальными интенсивностями характеристических сигналов.

Фиг. 8. Расчет весовых долей олигопептидов фармацевтической субстанции «Пептофорс» по данным спектра ¹H.

Фиг. 9. Спектр ¹³С фармацевтической субстанции «Пептофорс».

Фиг. 10. Фрагмент спектра ¹³C фармацевтической субстанции «Пептофорс» с интергальными интенсивностями характеристических сигналов.

Фиг. 11. Расчет весовых долей олигопептидов фармацевтической субстанции «Пептофорс» по данным спектра ¹³C.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Идентификация и количественное определение содержания олигопептидов в фармацевтической субстанции «Пептофорс» методом ¹H спектроскопии ЯМР.

20 мг фармацевтической субстанции «Пептофорс» (точная навеска не обязательна) растворяют в 0,5 мл D₂O. Регистрируют спектр ¹H на спектрометре ЯМР Agilent DD2 NMR System 600 при температуре 300 К, параметры эксперимента: угол поворота намагниченности 45°, время релаксации 25 с, число накоплений 64, число точек аналого-цифрового преобразования 64к, экспоненциальное умножение 0,3 Гц, автоматическая коррекция базовой линии спектра, ручная настройка фазы. Сравнением химических сдвигов сигналов спектра ¹H (Фиг. 6) с данными Табл. 1 идентифицируют олигопептиды ADEL, DER, DEG, DEP, KDE. Для расчета весовых долей олигопептидов использовали следующие характеристические сигналы (Фиг. 7): ADEL - 4,12 м.д. (S'=1); DER - 3,21 м.д. (S'=1,06); DEG - 3,88 м.д. (S'=1,375); DEP - 3,76 м.д., 3,71 м.д. (S'=0,98, конформер I), 3,59 м.д., 3,46 м.д. (S'=0,28, конформер II); KDE - 4,06 м.д. (S'=2,26). Весовые доли олигопептидов в фармацевтической субстанции «Пептофорс», рассчитанные по формуле (1), представлены на Фиг. 8.

Пример 2. Идентификация и количественное определение содержания олигопептидов в фармацевтической субстанции «Пептофорс» методом ¹³C спектроскопии ЯМР.

20 мг фармацевтической субстанции «Пептофорс» (точная навеска не обязательна) растворяют в 0,5 мл D₂O. Для калибровки шкалы химических сдвигов спектра ¹³C в раствор испытуемого образца добавляют 10 мкл 1,4-диоксана. Регистрируют спектр ¹³C на спектрометре ЯМР Agilent DD2 NMR System 600 при температуре 300 К, параметры эксперимента: угол поворота намагниченности 45°, время релаксации 1 с, число накоплений 10000, число точек аналого-цифрового преобразования 64к, гауссово умножение 1 Гц, автоматическая коррекция базовой линии спектра, ручная настройка фазы. Сравнением химических сдвигов сигналов спектра ¹³C (Фиг. 8) с данными Табл. 1 идентифицируют олигопептиды ADEL, DER, DEG, DEP, KDE. Для расчета весовых долей олигопептидов использовали следующие характеристические сигналы (Фиг. 9): ADEL - 37,31 м.д. (S'=1); DER - 37,17 м.д. (S'=1,06); DEG - 37,09 м.д. (S'=1,37); DEP - 36,98 м.д. (S'=1,25); KDE - 37,45 м.д. (S'=2,26). Весовые доли олигопептидов в фармацевтической субстанции «Пептофорс», рассчитанные по формуле (1), представлены на Фиг. 11.

Пример 3. Результаты количественного определения содержания олигопептидов в фармацевтической субстанции «Пептофорс» методами ВЭЖХ и спетроскопии ЯМР (Табл. 2).

Данные Табл. 2 свидетельствуют о том, что результаты измерения весовых долей олигопептидов в фармацевтической субстанции «Пептофорс» методами ¹H и ¹³C спектроскопии ЯМР близки к результатам измерения методом ВЭЖХ. Наблюдаемые расхождения полученных значений весовых долей олигопептидов с учетом неопределенности измерения для каждого метода статистически незначимы (метод ВЭЖХ - 2-3% [4], метод спектроскопии ЯМР - 1% [5]).

Приведенные примеры показывают возможность идентификации и количественного определения методами ¹H и ¹³C спектроскопии ЯМР содержания олигопептидов - компонентов фармацевтической субстанции «Пептофорс».

Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации.

Список литературы

1. ОФС 1.2.1.2.0005.15 «Высокоэффективная жидкостная хроматография». Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.

2. Кузьмина Н.Е., Моисеев С.В., Крылов В.И., Яшкир В.А., Меркулов В.А. Разработка методики подтверждения подлинности фармацевтической субстанции «бусерелина ацетат» методом ЯМР спектроскопии без использования фармакопейного стандартного образца. Антибиотики и химиотерапия, 2017. Т. 62 (9-10). С. 40-46.

3. ОФС 1.2.1.1.0007.15 «Спектроскопия ядерного магнитного резонанса». Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.

4. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Основа теории. Методология. Применение в лекарственной химии. Рига: Изд-во Зинатие, 1988. 390 с.

5. Malz F., Jancke Н. Validation of quantitative nuclear magnetic resonance. J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V. 38. P. 813-823.

Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано для идентификации и количественного определения содержания пяти близких по строению олигопептидов (ADEL, DER, DEG, DEP, KDE) в фармацевтической субстанции «Пептофорс». При этом применяют метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) без использования стандартных образцов и изотопных меток. Спектральные данные испытуемого образца сравнивают с данными структурного соответствия сигналов спектров ¹Н и ¹³С олигопептидов фармацевтической субстанции «Пептофорс». Для количественного определения олигопептидов проводят измерение весовых долей ADEL, DER, DEG, DEP, KDE путем интегрирования их характеристических сигналов в ¹Н спектре ЯМР или в ¹³С спектре ЯМР. Изобретение позволяет идентифицировать олигопептидный состав фармацевтической субстанции «Пептофорс» и количественно определить содержание ее компонентов без их предварительного разделения, без использования изотопных меток и фармакопейных и рабочих стандартных образцов. 11 ил., 2 табл., 3 пр.

Способ идентификации и количественного определения содержания пяти близких по строению олигопептидов (ADEL, DER, DEG, DEP, KDE) без их предварительного разделения в фармацевтической субстанции «Пептофорс» методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) без использования стандартных образцов и изотопных меток, характеризующийся тем, что спектральные данные испытуемого образца сравнивают с данными структурного соответствия сигналов спектров ¹Н и ¹³С олигопептидов фармацевтической субстанции «Пептофорс» из таблицы 1, и для количественного определения олигопептидов проводят измерение весовых долей ADEL, DER, DEG, DEP, KDE путем интегрирования их характеристических сигналов в ¹Н спектре ЯМР или в ¹³С спектре ЯМР, где характеристическими сигналами являются:

¹Н (D₂O), δ, м. д. ADEL: 0,89 (д, J=5,9 Гц, 3Н, СН₃), 0,93 (д, J=5,9 Гц, 3Н, СН₃), 1,55 (д, J=7,0 Гц, 3Н, СН₃), 4,12 (кв, J=7,1 Гц, 1Н, СН); DER: 3,22 (дд, J=6,7; 1,9 Гц, 1Н, СН); DEG: 3,88 (с, 2Н, СН₂); DEP (конформер А): 3,73 (м, 1Н, СН₂), 3,77 (м, 1Н, СН₂); DEP (конформер В): 3,46 (м, 1Н, СН₂), 3,60 (м, 1Н, СН₂); KDE: 1,46 (м, 2Н, СН₂), 2,41 (т, J=7,5 Гц, 2Н, СН₂), 3,02 (т, J=7,6 Гц, 2Н, СН₂), 4,06 (дд, J=8,6; 5,4 Гц, 1H, СН); и

¹³С (D₂O), δ, м. д. ADEL: 31,10; 37,31; 40,51; DER: 25,13; 29,04; 31,30; 37,17; 41,19; DEG: 31,19; 37,09; 42,94; DEP: 26,46; 29,71; 30,74; 36,98; 48,27 (конформер A); 27,80; 30,65; 31,92; 36,98; 47,68 (конформер В); KDE: 21,67; 26,96; 27,48; 30,92; 31,42; 37,45; 39,62.