Питательная среда для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa - модифицированная Среда Блеск Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/385 

Изобретение относится к санитарной микробиологии и может быть использовано для обнаружения и количественного учета бактерий рода Pseudomonas при исследовании воды и объектов окружающей среды в лабораториях гигиенического и эпидемиологического профиля.

Псевдомонады широко распространены в природе, являются активными протеолитами, обеспечивают процессы разложения органических веществ, гниения.

По данным ВОЗ, P. aeruginosa может вызывать ряд заболеваний, особенно у людей при снижении иммунного статуса организма. Инфицирование происходит при контакте чувствительных и поврежденных участков кожных покровов, слизистых, дыхательных путей с контаминированной водой. Попадая в организм человека, P. aeruginosa может вызывать различные заболевания: менингит, уроинфекции, прогрессирующую легочную инфекцию, а также заболевания кожных покровов, глаз, слизистых. [Иванова Л.В., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Загайнова А.В., Максимкина Т.Н., Красняк А.В., Корнейчук С.С. Обоснование значимости показателя Pseudomonas aeruginosa при оценке качества питьевой воды. Гигиена и санитария, 2013:(4):29-32].

Степень обсемененности P. aeruginosa характеризует санитарное состояние и уровень эпидемической опасности объекта: воды источников водоснабжения, питьевой воды централизованного водоснабжения, рекреационных вод прибрежных пляжей, акваторий, плавательных бассейнов, сточных жидкостей при оценке качества биологической очистки и обеззараживания.

В соответствии с Методическими указаниями [Методические рекомендации обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)] обнаружение P. aeruginosa в объектах окружающей среды сигнализирует одновременно о санитарном (как индикатор биологического загрязнения) и эпидемическом (как патоген) неблагополучии.

Представленные данные об опасности возникновений заболеваний при контакте с водой, контаминированной P. aeruginosa подтверждают актуальность проблемы, поэтому необходимо своевременное обнаружение патогена.

В отечественной практике существуют подходы к определению P. aeruginosa в воде. Методика в соответствии с МР № 96/225-1997 предусматривает использование прямого посева пробы на среду Эндо или Блеск. Действующие в настоящее время ГОСТ Р 70152-2022, ГОСТ 34786-2021, МУ 2.1.4.1184-03, МУК 4.2.2959-11, МУК 4.2.3963-23 и методические рекомендации «Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)» регламентируют накопление микроба в среде Бонде, а обнаружение и идентификацию - с использованием питательной среды Блеск благодаря уникальному металлическому блеску колоний P.aeruginosa, обнаруживаемому, как правило, только у этого микроба.

При предположении массивного обсеменения объекта P. aeruginosa (сточные жидкости, белковые пищевые продукты после просроченного срока годности и органолептически недоброкачественные) исследование может быть начато непосредственно со второго этапа, т.е. с посева исследуемого объекта на среду Блеск как при качественном, так и при количественном исследовании. При последнем материал распределяется шпателем по поверхности среды Блеск.

В настоящее время отечественными производителями не выпускаются среды Бонде и Блеск, поэтому существует необходимость разработки и внедрения в производство сухой питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa (среды Блеск). В соответствии с действующими нормативными документами, рекомендован состав среды Блеск лабораторного приготовления, для этого в 100 мл 2% - ного расплавленного стерильного мясопептонного агара (МПА) добавляют: 10 мл снятого (обезжиренного) молока, 8,0 мл 10% водного раствора трифенилтетразолия хлорида (ТТХ) и 0,3 г L-аргинина.

Недостатком среды Блеск лабораторного приготовления являются:

- не стандартизованный состав среды Блеск не обеспечивает исключительную видоспецифичность в отношении P. aeruginosa и дифференцирующие свойства среды;

- низкая чувствительность, не позволяющая определять наличие P. aeruginosa в незначительных концентрациях (около 10 КОЕ/мл);

- возможен рост ТТХ-резистентных штаммов клебсиелл, серраций, энтеробактерий, которые могут развиваться на среде Блеск в виде темно-красных разного размера, лишенных блеска, или выпуклых блестящих ярко-красных колоний, что приводит к дополнительным исследованиям по идетификации.

Технической задачей является создание отечественной питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированной (Среда Блеск).

Техническим результатом является получение модифицированной Среды Блеск, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью не только в отношении P. aeruginosa образующих пигменты феназинового ряда, но и беспигментных штаммов, а также значительной селективностью.

Технический результат достигается тем, что предложена двухкомпонентная питательная среда, состоящая из сухой основы: панкреатический гидролизат казеина с Твином, пептон ферментативный, натрий хлористый, L-аргинин, агар микробиологический и водного раствора ТТХ и снятого молока.

Питательная среда для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированная (Среда Блеск), содержащая белковую основу, натрий хлористый, L-аргинин, причем в качестве белковой основы она содержит сухой панкреатический гидролизат казеина высушенный с Твином (ПГК-ТВ мод) и пептон ферментативный, а так же агар микробиологический при следующем соотношении сухих компонентов. г/л:

Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный сухой (ПГК -ТВ мод) 8,1-12,1 Пептон ферментативный 8,0-12,0 Натрий хлористый 3,0-5,0 L-аргинин 1,0-2,0 Агар бактериологический 8,0-12,0 10% водный раствор ТТХ 80,0 мл Снятое молоко 100,0 мл

Способ получения двухкомпонентной питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированной (Среда Блеск) предусматривает смешивание сухих компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный сухой (ПГК -ТВ мод) 8,1-12,1 Пептон ферментативный 8,0-12,0 Натрий хлористый 3,0-5,0 L-аргинин 1,0-2,0 Агар бактериологический 8,0-12,0

Затем для приготовления готовой к применению питательной среды Блеск, навеску сухих компонентов растворяют в 1,0 л дистиллированной воды, стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин, затем в охлажденную до (40-50)°С добавляют жидкие компоненты: 100 мл/л стерильного снятого молока; 80 мл/л 10% водного раствора трифенилтетразолия хлорида (ТТХ самостерилизуется после хранения при комнатной температуре в течение 2-3 дней).

Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный (ПГК -ТВ мод) и пептон ферментативный являются источниками азотистого питания, а также витаминов, минеральных солей и аминокислот, необходимых для роста микроорганизмов. ТТХ обеспечивает элективность среды. P. aeruginosa восстанавливает ТТХ до трифенилформазана вследствие чего колонии псевдомонад окрашиваются в темно-красный цвет. Твин - компонент обогащения питательной среды, поддерживающий жизнеспособность микроорганизмов. Твин, как детергент, способствует нейтрализации дезинфектантов в питательной среде. Наличие твина и аргинина способствует высокой интенсивности образования золотистого блеска колоний псевдомонад. Натрий хлористый поддерживает осмотический баланс.

Отличием предлагаемой среды от прототипа лабораторного приготовления является: использование в качестве сухой белковой основы пептона ферментативного и панкреатического гидролизата казеина, высушенного с Твином, модифицированного (ПГК -ТВмод), который получают путем внесения в осветленный изоэлектрических зонах жидкий панкреатический гидролизат казеина расчетное количество Твина (на каждые 10 г сухого ПГК - 0,1 мл) и высушивания гидролизата на сушильной установке в виброкипящем слое А1-ФМУ, однако возможно использование любой сушильной установки, обычно используемой на практике, поэтому сушильную установку А1-ФМУ не следует использовать как основание для ограничения объема исспрашиваемых прав по настоящей заявке.

Расчетное количество Твина вычисляют по следующим формулам:

1. Определение общего содержания сухих веществ () в заданном объеме жидкого панкреатического гидролизата казеина:

;

- общее содержание сухих веществ, г;

V - объем жидкого гидролизата рыбной муки, л;

СО - содержание сухих веществ в ПГК в %, определенное рефрактометрическим методом. (Рефрактометрический метод основан на измерении показателя преломления анализируемого раствора при температуре (20±0,5)°С на рефрактометре. Массовую долю растворимых сухих веществ определяют прямым считыванием по шкале рефрактометра).

2. Определение объема Твина необходимого для внесения в заданный объем (V л) жидкого панкреатического гидролизата казеина:

; где

для внесения в заданный объем гидролизата;

- общее содержание сухих веществ в заданном объеме гидролизата;

- количество Твина для расчета на каждые 10 г сухого панкреатического гидролизата казеина;

- количество сухого панкреатического гидролизата казеина для расчета общего расхода Твина.

Пример 1. Для приготовления питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированной (Среда Блеск) берут навески сухих компонентов в г/л:

Панкреатический гидролизат казеина с твином, модифицированный (ПГК-ТВмод) 8,1 Пептон ферментативный 8,0 Натрий хлористый 3,0 L-аргинин 1,0 Агар бактериологический 8,0

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин, стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. После охлаждения до температуры 40-45°C в асептических условиях вносят жидкие компоненты: стерильное снятое молоко и 10% - ный раствор ТТХ.

Используемые для контроля питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированной (Среда Блеск) тест-штаммы микроорганизмов получали из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ.

Контроль качества проводили с использованием 6 целевых тест-штаммов: P. aeruginosa АТСС 10145, P. aeruginosa АТСС 27853, P. aeruginosa 14010, P.aeruginosa 453, P. aeruginosa АТСС 27/99, P. aeruginosa 9027. В качестве микробов-ассоциантов для определения ингибирующих свойств среды использовали Staphylococcus aureus FDA 209-P ATCC 6538-P, Proteus mirabilis 3177, Bacillus cereus ATCC 10702, Escherichia coli ATTC 25922, Klebsiella pneumoniae 418, Serratia marcescens АТСС 13880.

Готовили стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9 % раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур псевдомонад десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до разведения 10^-7, для ассоциантов до - 10^-4.

Для определения ростовых свойств засев производили по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма псевдомонад из разведений 10^-7 (для определения ингибирующих свойств тест-штаммы S. aureus FDA 209-P ATCC 6538-P, P. mirabilis 3177, B. cereus ATCC 10702, E.coli ATTC 25922 из разведений 10^-4) соответственно на две чашки Петри с предлагаемой питательной средой Блеск и стерильным шпателем распределяли взвесь по поверхности среды. Через 48 ч инкубации посевов при температуре (37±1)°С визуально учитывали наличие и характер роста тест-штаммов.

В качестве контрольной среды использовали Среду Блеск лабораторного приготовления следующего состава: - мясо-пептонный агар (МПА) 100 мл с добавлением: 8,0 мл 10 %-ного раствора ТТХ, 0,3 г L-аргинина и 10 мл стерильного снятого (обезжиренного) молока в соответствии с прописью, указанной в ГОСТ 34786-2021.

Результаты биологического контроля предлагаемой питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированной (Среда Блеск) в сравнении со средой Блеск лабораторного приготовления на наборе тест-штаммов представлены в таблице 1.

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1. Берут навески сухой компоненты в следующем количественном соотношении г/л:

Панкреатический гидролизат казеина с твином, модифицированный (ПГК-ТВмод) 10,1 Пептон ферментативный 10,0 Натрий хлористый 4,0 L-аргинин 1,5 Агар бактериологический 10,0

Результаты биологического контроля, представленные в таблице 1, аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1. Берут навески сухой компоненты в следующем количественном соотношении г/л:

Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный (ПГК-ТВ мод) 12,1 Пептон ферментативный 12,0 Натрий хлористый 5,0 L-аргинин 2,0 Агар бактериологический 12,0 Вода дистиллированная 1,0 л

Результаты биологического контроля, представленным в таблице 1, аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный (ПГК-ТВ мод) 6,1 Пептон ферментативный 6,0 Натрий хлористый 2,0 L-аргинин 0,5 Агар бактериологический 6,0 Вода дистиллированная 1,0 л

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в примере 4 ведет к ухудшению специфической активности, проявляющейся в отсутствии золотистого блеска, являющегося диагностическим признаком на этой среде.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 1.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный (ПГК-ТВ мод) 14,1 Пептон ферментативный 14,0 Натрий хлористый 6,0 L-аргинин 2,5 Агар бактериологический 14,0 Вода дистиллированная 1,0 л

Результаты биологического контроля представлены в таблице 1.

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в большую сторону на примере 5 увеличивает селективность среды, что также негативно сказывается на специфической активности, проявляющейся в формировании колоний неспецифической морфологии (плотные, мелкие с отсутствием золотистого блеска колоний некоторых штаммах).

Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированная (Среда Блеск) в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает хорошими ростовыми свойствами, эффективна для выявления псевдомонад и подавляет рост ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Учет результатов по окончании срока инкубации посевов и их идентификации по способности образовывать на среде Блеск колонии темно-красного цвета с золотистым блеском показал высокую чувствительность и дифференциацию пигментообразующих и не образующих пигмента микроорганизмов P. aeruginosa.

Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.

Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4, 5 наблюдается снижение специфической активности и изменение ингибирующей способности среды:

- при концентрации компонентов ниже минимальных пределов наблюдалось отсутствие золотистого блеска;

- при концентрации компонентов выше максимальных пределов значительно повышаются ингибирующие свойства среды, вследствие чего ухудшается морфология псевдомонад.

Таким образом, разработана отечественная питательная среда для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированная (Среда Блеск)

Преимуществом предлагаемой среды, является:

- Оптимизированный состав среды Блеск благодаря разработанному ПГК с Твином с заданными параметрами;

- Высокая чувствительность: (обеспечивает рост псевдомонад из разведения 10^-7)

- Дифференцирующие свойства среды (феназин-отрицательные клоны P. aeruginosa образуют на среде колонии без золотистого блеска);

- Высокие ингибирующие свойства разработанной среды подтверждаются отсутствием роста клебсиелл, серраций, энтеробактерий и других ТТХ-резистентных штаммов.

- Нет необходимости ex tempore вносить L-аргинин

- Уменьшенное количество вносимого L-аргинина позволяет снизить стоимость предлагаемой питательной среды.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена питательная среда для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa - модифицированная Среда Блеск, содержащая сухой панкреатический гидролизат казеина с Твином и пептон ферментативный, а также агар бактериологический, L-аргинин, натрий хлористый, снятое молоко и водный раствор трифенилтетразолия хлорида при заданном количественном содержании исходных компонентов. Изобретение обеспечивает расширения арсенала питательных сред для обнаружения и количественного учета бактерий рода Pseudomonas, образующих пигменты феназинового ряда, и беспигментных штаммов, при исследовании воды и объектов окружающей среды в лабораториях гигиенического и эпидемиологического профиля. 1 ил., 5 пр.

Питательная среда для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa - модифицированная Среда Блеск, содержащая сухой панкреатический гидролизат казеина с Твином (ПГК-ТВ мод) и пептон ферментативный, а также агар бактериологический, L-аргинин, натрий хлористый, снятое молоко и водный раствор трифенилтетразолия хлорида при следующем количественном содержании исходных компонентов:

Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный сухой (ПГК-ТВ мод)8,1-12,1 )8,1-12,1 г Пептон ферментативный 8,0-12,0 г Натрий хлористый 3,0-5,0 г L-аргинин 1,0-2,0 г Агар бактериологический 8,0-12,0 г Вода дистиллированная 1,0 л 10% водный раствор трифенилтетразолия хлорида 80,0 мл Снятое молоко 100,0 мл