Питательная среда для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированная (среда Бонде) Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к санитарной микробиологии и может быть использовано в качестве среды обогащения при санитарно-бактериологических исследованиях питьевой воды, сточных вод и объектов окружающей среды в лабораториях гигиенического и эпидемиологического профиля с целью обнаружения и количественного учета бактерий рода Pseudomonas.

Псевдомонады широко распространены в природе, являются активными протеолитами, обеспечивают процессы разложения органических веществ, гниения.

Обнаружение P.aeruginosa в объектах окружающей среды сигнализирует одновременно об эпидемическом (как патоген) и санитарном (как индикатор биологического загрязнения) неблагополучии. Известны острые кишечные инфекции псевдомонадной этиологии водного происхождения и различные формы заболеваний (отиты, поражения кожного покрова) у купающихся в бассейнах, септические заболевания грудных детей с летальным исходом в результате купания в питьевой воде централизованного водоснабжения, содержавшей P.aeruginosa. Попадая в организм человека, P. aeruginosa может вызывать различные заболевания: менингит, уроинфекции, прогрессирующую легочную инфекцию, а также заболевания кожных покровов, глаз, слизистых. [Иванова Л.В., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Загайнова А.В., Максимкина Т.Н., Красняк А.В., Корнейчук С.С. Обоснование значимости показателя Pseudomonas aeruginosa при оценке качества питьевой воды. Гигиена и санитария, 2013:(4):29-32]

Описаны вспышки пищевых токсикоинфекций псевдомонадной этиологии и обнаружение P.aeruginosa в пищевых продуктах, особенно богатых белками (мясо, рыба), что характеризует последние как возможный источник пищевой токсикоинфекции. [Методические рекомендации. Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях].

В отечественной практике существуют подходы к определению P. aeruginosa в воде на основе действующих в настоящее время ГОСТ Р 70152-2022, ГОСТ 34786-2021, МУ 2.1.4.1184-03, МУК 4.2.2959-11, МУК 4.2.3963-23 и методических рекомендаций «Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)» регламентирующих накопление микроба в среде Бонде, а обнаружение и идентификацию - с использованием питательной среды Блеск.

В соответствии с действующими нормативными документами, рекомендован состав Минеральной среды Бонде лабораторного приготовления, состоящей из компонентов - Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 0,28 г, натрий-аммоний фосфорнокислый - 0,15 г, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,1 г, магний сернокислый - 0,02 г, дистилированная вода до 100,0 мл. Среда стерилизуется автоклавированием при 1 атм. 20 мин. Непосредственно перед посевом прибавить - 2,0 мл 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового.

Недостатками среды Бонде лабораторного приготовления являются:

• трудоемкость процесса приготовления среды;

• необходимость внесения водного раствора кристаллического фиолетового ex tempore.

• заниженные ростовые свойствами в отношении псевдомонад;

• невысокая эффективность накопления P. aeruginosa при исследовании объектов с

низким уровнем контаминации;

Отечественными производителями не выпускается среда Бонде, поэтому существует необходимость разработки и внедрения в производство сухой питательной среды для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированной (Среда Бонде)

Технической задачей является создание отечественной питательной среды для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированной (Среда Бонде)

Техническим результатом является получение модифицированной Среды Бонде, обладающей хорошими ростовыми свойствами и высокой эффективностью накопления P. aeruginosa в исследуемых образцах.

Технический результат достигается тем, что предложена минеральная питательная среда, содержащая магний сернокислый, однозамещенный фосфат калия, кристаллический фиолетовый, натрий лимоннокислый и дополнительно содержащая натрий хлористый, аммоний хлористый и натрий фосфорнокислый двузамещенный при следующем соотношении сухих компонентов, г/л:

Натрий хлористый 4,0±0,5 Магний сернокислый 0,2±0,05 Натрий лимоннокислый 4,0±0,5 Аммоний хлористый 1,0±0,2 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0±0,2 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,85±0,05 Кристаллический фиолетовый 0,002±0,0005 Вода дистиллированная 1000 мл

Способ получения Питательной среды для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированной (Среда Бонде) предусматривает смешение сухих компонентов, г/л:

Натрий хлористый 4,0 Магний сернокислый 0,2 Натрий лимоннокислый 4,0 Аммоний хлористый 1,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,85 Кристаллический фиолетовый 0,002

Затем для приготовления готовой к применению питательной среды Бонде, навеску сухих компонентов растворяют в 1,0 л дистиллированной воды, доводят до кипения и кипятят 2 мин до полного растворения компонентов, разливают в ёмкости и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин.

Отличием предлагаемой среды от прототипа лабораторного приготовления является: использование аммония хлористого в качестве источника азотистого питания для роста микроорганизмов, натрия фосфорнокислого двузамещенного, который обеспечивает буферность среды, а натрий хлористый с магнием сернокислым поддерживает осмотический баланс среды и оказывают положительное влияние на динамику роста псевдомонад, кристаллический фиолетовый обеспечивает селективность среды.

Пример 1. Для приготовления Питательной среды для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированной (Среда Бонде) берут навески сухой компоненты, г/л:

Натрий хлористый 3,5 Магний сернокислый 0,15 Натрий лимоннокислый 3,5 Аммоний хлористый 0,8 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,8 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,8 Кристаллический фиолетовый 0,0015 Вода дистиллированная до 1000 мл

Навески растворяют в 1,0 л дистиллированной воды, доводят до кипения и кипятят 2 мин до полного растворения компонентов, разливают в ёмкости и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин.

Интегральная оценка эффективности накопления псевдомонад проводилась путем параллельного исследования предлагаемой среды Бонде и среды лабораторного приготовления следующего состава: - Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 0,28 г, натрий-аммоний фосфорнокислый - 0,15 г, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,1 г, магний сернокислый - 0,02 г, дистилированная вода до 100,0 мл. Среда стерилизуется автоклавированием при 1 атм. 20 мин. Непосредственно перед посевом прибавляли - 2,0 мл 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового.

Для этого одинаковые низкоуровневые посевные дозы монокультур эталонных микроорганизмов или их смесей вносили в подготовленные среды Бонде

Контроль эффективности проводили с использованием 6 целевых тест-штаммов: P. aeruginosa АТСС 10145, P.aeruginosa 453, P. aeruginosa 27/99. В качестве микробов-ассоциантов для определения ингибирующих свойств среды использовали Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р (209-P), Bacillus cereus ATCC 10702, Escherichia coli ATTC 25922.

Используемые для контроля Питательной среды для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированной (Среда Бонде) тест-штаммы микроорганизмов получали из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ.

Готовили стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9 % раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до разведения 10^-6, для ассоциантов до - 10^-5.

Ростовые свойства сред Бонде для целевых и нецелевых микроорганизмов оценивали по методике, изложенной в МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» путем определения показателя «эффективность» для штаммов псевдомонад и ингибирующие свойства для микробов-ассоциантов. Порядок обогащения каждой из сред рассчитывали, как соотношение концентраций жизнеспособных бактерий эталонного штамма до и после обогащения в соответствующей питательной среде после 24 час инокуляции в 9,0 мл среды 1 мл суспензии псевдомонад с концентрацией 100 КОЕ/мл, для ассоциантов - с концентрацией 10000 КОЕ/мл. среды

Учет результатов проводили визуально после инкубации посевов при температуре (37±1)°С в течение 24 ч по наличию и характеру роста. При обнаружении во флаконах помутнения среды и наличия на поверхности нежной пленки, как правило поднимающейся по стенке флакона, не перемешивая, делают посев этой пленки петлей на плотные подтверждающие среды (среда Блеск или Цетримидный агар) путем укола в толщу среды и растирания посева вокруг укола.

Оценку качества среды по показателю эффективности, т.е. прирост числа микроорганизмов в накопительной среде определяли по формуле:

, где

Э - показатель эффективности;

n1 - среднее число колоний на чашках после инкубации культуры в накопительной среде;

n2 - среднее число колоний при нулевом посеве;

К - степень разведения

Результаты биологического контроля предлагаемой Питательной среды для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированной (Среда Бонде) в сравнении со средой Бонде лабораторного приготовления на наборе тест-штаммов представлены в таблице 1.

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1. Берут навески сухой компоненты в следующем количественном соотношении, г/л:

Натрий хлористый 4,0 Магний сернокислый 0,2 Натрий лимоннокислый 4,0 Аммоний хлористый 1,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,85 Кристаллический фиолетовый 0,002 Вода дистиллированная до 1000 мл

Результаты биологического контроля, представленные в таблице 1, аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1. Берут навески сухой компоненты в следующем количественном соотношении, г/л:

Натрий хлористый 4,5 Магний сернокислый 0,25 Натрий лимоннокислый 4,5 Аммоний хлористый 1,2 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,2 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,9 Кристаллический фиолетовый 0,0025 Вода дистиллированная до 1000 мл

Результаты биологического контроля, представленным в таблице 1, аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Натрий хлористый 3,0 Магний сернокислый 0,10 Натрий лимоннокислый 3,0 Аммоний хлористый 0,6 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,6 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,75 Кристаллический фиолетовый 0,0010 Вода дистиллированная до 1000 мл

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в примере 4 ведет к ухудшению специфической активности Питательной среды для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированная (Среда Бонде). Так при визуальном контроле наблюдалось слабое диффузное помутнение и отсутствие на поверхности среды тонкой нежной пленки.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 1.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Натрий хлористый 5,0 Магний сернокислый 0,3 Натрий лимоннокислый 5,0 Аммоний хлористый 1,4 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,4 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,95 Кристаллический фиолетовый 0,003 Вода дистиллированная до 1000 мл

Результаты биологического контроля представлены в таблице 1.

Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в большую сторону на примере 5 увеличивает селективность среды, что также негативно сказывается на специфической активности, проявляющейся в снижении эффективности накопления псевдомонад и повышает ингибирующие свойства среды Бонде.

Из таблицы видно, что предлагаемая Питательной среды для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированная (Среда Бонде) в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает хорошими ростовыми свойствами и превосходит среду Бонде лабораторного приготовления по показателю эффективности накопления псевдомонад, кроме того, обладает высокими ингибирующими свойствами в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов полностью подавляя рост S. aureus АТСС 6538-Р (209-P), B. cereus ATCC 10702, E. coli ATTC 25922 из разведения 10^-4.

Среда Бонде лабораторного приготовления по результатам проведенных исследований значительно уступает предлагаемой питательной среде по показателю эффективности накопления псевдомонад.

Таким образом, разработана отечественная Питательной среды для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированная (Среда Бонде).

Преимуществом предлагаемой среды, является:

• высокая эффективность накопления псевдомонад, превышающая по показателю эффективности среду Бонде лабораторного приготовления, для: P.aeruginosa 453 - не менее чем в 1,5 раза, а для P. aeruginosa 27/99 и P. aeruginosa АТСС 10145 - не менее чем в 4,5 раза. То есть, усредненный показатель эффективности предлагаемой Среды Бонде выше в 1,5 - 4 раза контрольной. Высокие ингибирующие свойства предлагаемой среды подтверждаются отсутствием роста S. aureus АТСС 6538-Р (209-P), B. cereus ATCC 10702, E. coli ATTC 25922 после инкубации посевов.

• снижение трудозатрат и простота приготовления готовой к применению среды Бонде.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой питательную среду для накопления Pseudomonas aeruginosa модифицированную (среда Бонде), содержащую магний сернокислый, однозамещенный фосфат калия, кристаллический фиолетовый, дополнительно содержит натрий хлористый, аммоний хлористый и натрий фосфорнокислый двузамещенный, при следующем соотношении сухих компонентов, г/л: натрий хлористый 4,0±0,5, магний сернокислый 0,2±0,05, натрий лимоннокислый 4,0±0,5, аммоний хлористый 1,0±0,2, натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0±0,2, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,85±0,05, кристаллический фиолетовый 0,002±0,0005, вода дистиллированная 1000. Заявленное изобретение обладает хорошими ростовыми свойствами и высокой эффективностью накопления P. aeruginosa в исследуемых образцах. 1 табл.

Питательная среда для накопления Pseudomonas aeruginosa – модифицированная среда Бонде, содержащая магний сернокислый, однозамещенный фосфат калия, кристаллический фиолетовый, натрий лимоннокислый, отличающаяся тем, что дополнительно содержит натрий хлористый, аммоний хлористый и натрий фосфорнокислый двузамещенный при следующем содержании сухих компонентов, г/л:

Натрий хлористый 4,0±0,5 Магний сернокислый 0,2±0,05 Натрий лимоннокислый 4,0±0,5 Аммоний хлористый 1,0±0,2 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0±0,2 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,85±0,05 Кристаллический фиолетовый 0,002±0,0005 Вода дистиллированная 1000