Способ определения микросателлитной нестабильности Российский патент 2020 года по МПК G01N33/50 C12Q1/686 C12Q1/6886 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к методам генетического анализа, в частности к методам молекулярной диагностики в онкологии.

Уровень техники

Известны методы определения микросателлитной нестабильности на основе аналища полиморфизма длин коротких тандемных повторов. Эти методы основаны на ПЦР-амплификации панели целевых локусов с последующим определением длин фрагментов с помощью гель-электрофореза или капиллярного электрофореза.

Аналоги отличаются преимущественно только выбором панели локусов и количеством анализируемых повторов. Наиболее распространенной является 5-маркерная панель Bethesda, включающая повторы ВАТ-25, ВАТ-26, MONO-27, NR-21 и NR-24. При этом наличие нестабильности требует сравнения аллельных вариантов повторов в онормальной ткани/крови и в опухоли. Если для каждого локуса (повтора) присутствуют идентичные аллели и в нормальной ткани и в опухоли, то считается что образей демонстрирует микросателлитную стабильность (MSS) При обнаружении 1-2 нестабильных повторов делается вывод о низкой микросателлитной нестабильности, если нестаблильных локусов 3-5 - образец считается микросатллитно-нестабильным (MSI-H)

Использование высокопроизводительного секвенирования является наиболее перспективным подходом для определения микросателлитной нестабильности так как позволяет одновременно исследовать широкий спектр микросателлитных маркеров и другие типы клинически значимых генетических изменений (в т.ч. соматические мутации, изменение числа копий генов и др.).

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является выявление микросателлитной нестабильности в образцах опухоли и циркулирующей ДНК крови. Отличительной чертой изобретения является использование для выявления MSI метода NGS и возможность определения MSI без контрольного образца нормальной ткани.

Это достигается тем, что в отличие от известных технических решений используется расширенная панель микросателлитных повторов (18 локусов). Выбранные локусы характеризуются тем, что могут быть одновременно наработаны в одной реакционной смеси методом мультиплексной ПЦР. Высокая полиморфность локусов позволяет исследовать их без необходимости проводить сравнение с профилем микросателлитов в нормальной ткани. Кроме того, подобранные повторы составлены не длинными гомо-полимерными, что повышает точность секвенирования и снижает вероятность ошибки «проскальзывания» ошибочного определения дины фрагмента.

Осуществление изобретения

Изобретение является методом, включающим:

1) Выделение ДНК из образца биоматериала, например ткани опухоли, архивного парафинизированного блока или плазмы крови (выделение циркулирующей ДНК).

2) таргетное обогащение целевыми участками тандемных повторов из нижеперечисленных

chr4:55598212-55598236

chr2:47641560-47641586

chr2:39564894-39564921

chr14:23652347-23652367

chr2:95 849362-95849384

chr1:201754411-201754427

chr2:62063094-62063110

chr2:108479623-108479640

chr5:172421761-172421775

chr6:142691951-142691967

chr7:1787520-1787536

chr7:74608741-74608753

chr11:106695515-106695526

chr15:45897772-45897785

chr16:18882660-18882674

chr17:19314918-19314935

chr13:31722621-31722637

chr22:29696469-29696484.

3) Высокопроизводительное секвенирование полученного образца «ДНК-библиотеки», после введения универсальных олигонуклеотидных адаптеров.

4) Анализ результатов секвенирования и поиск генетических вариантов с покрытием не менее 10 прочтений и долей мутантного аллеля не менее 0,1%.

5) Интерпретация обнаруженных генетических вариантов путем установления длин фрагментов: если для не менее 2 и не более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как низкая микросателлитная нестабильность - MSI-L, если для более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как высокая микросателлитная нестабильность.

Обнаруженные генетические варианты соответствуют генотипу исследуемого образца биоматериала (опухоли) и могут быть использованы для принятия решений о постановке диагноза синдром Линча или выборе лекарственного лечения.

Устройство работает следующим образом.

За счет подобранных олигонуклеотидных праймеров выполняется мультиплексная ПЦР для получения библиотеки фрагментов, содержащих микросателлитные локусы. После добавления реакционной смеси к анализируемым пробам ДНК выполняют термоциклирование включащее стандратные стадии плавления ДНК, отжига и элонгации. После 21 цикла ПЦР продукт амплификации готов для дальнейшего процессинга. Если ДНК в анализируемой пробе менее 1 нг, может быть выполнено дополнительное термоциклирование: до 3-5 дополнительных циклов ПЦР в зависимости от доступного количества ДНК.

Введение адаптеров может осуществляться разными способами, в том числе: использование олигонуклеотидных праймеров содержащих адаптерную последовательность на 5'-конце или дполнительное лигирование двуцепочечных адаптеров на следующем шаге после мультиплексной ПЦР и «тупления» концов ПЦР-продуктов. PGM/S5 или другие. Результаты анализируют стандартным программным обеспечением.

Секвенирвоание готовой библиотеки ДНК может выполняться на одной из платформ: Illumina или Torrent, в зависимости от использованных адаптеров. Для одновременного секвенирования более одного образца требуется введение уникального олигонуклеотидного индекса в каждый ПЦР-продукт библиотеки от данного образца.

После завершения цикла секвенирования полученные ВАМ файлы используют для определения длин фрагментов целевых локусов.

Вывод о наличие наличии микросателлитной нестабильности делают следующим образом: если для не менее 2 и не более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как низакая микросателлитная нестабильность - MSI-L, если для более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как высокая микросателлитная нестабильность.

Выбор микросателлитных локусов может быть изменен в сторону сокращения количества анализируемых участков, однако их количество не должно быть менее 10. Полный перечень приведен ниже в Таблице 1.

Результаты анализа MSI методом ПЦР и NGS можно представить следующим образом, как показано на Фиг. 1.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения микросателлитной нестабильности. Осуществляют таргетное обогащение целевых участков методом мультиплексной ПЦР, высокопроизводительное секвенирование полученного образца ДНК-библиотеки, анализ результатов секвенирования и поиск генетических вариантов с покрытием не менее 10 прочтений и долей мутантного аллеля не менее 0,1%. Интерпретацию обнаруженных генетических вариантов проводят путем установления длин фрагментов. Если для не менее 2 и не более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как низкая микросателлитная нестабильность - MSI-L. Если для более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как высокая микросателлитная нестабильность. Изобретение обеспечивает повышение точности секвенирования и снижает вероятность ошибочного определения дины фрагмента. 1 ил., 1 табл.

Способ определения микросателлитной нестабильности, в котором для получения результатов после выделения ДНК из образца ткани опухоли или плазмы крови выполняются последовательно следующие шаги:

- таргетное обогащение методом мультиплексной ПЦР по нижеперечисленным целевым участкам: chr4:55598212-55598236, chr2:47641560-47641586, chr2:39564894-39564921, chr14:23652347-23652367, chr2:95849362-95849384, chr1:201754411-201754427, chr2:62063094-62063110, chr2:108479623-108479640, chr5:172421761-172421775, chr6:142691951-142691967, chr7:1787520-1787536, chr7:74608741-74608753, chr11:106695515-106695526, chr15:45897772-45897785, chr16:18882660-18882674, chr17:19314918-19314935, chr13:31722621-31722637, chr22:29696469-29696484;

- высокопроизводительное секвенирование полученного образца ДНК-библиотеки, после введения универсальных олигонуклеотидных адаптеров;

- анализ результатов секвенирования и поиск генетических вариантов с покрытием не менее 10 прочтений и долей мутантного аллеля не менее 0,1%;

- интерпретация обнаруженных генетических вариантов путем установления длин фрагментов, причем:

если для не менее 2 и не более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как низкая микросателлитная нестабильность - MSI-L,

если для более 5 локусов присутствуют более 2 вариантов длин, результат интерпретируется как высокая микросателлитная нестабильность.