Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 718 536

(13)

(51)

МПК

C12N5/789(2010-01-01)

(21) (22)

Заявка

2014139904, 2014-10-02

(24)

Дата начала отсчета патента

2008-05-28

(22)

дата подачи заявки

2014-10-02

(45)

опубликовано

2020-04-08

(72)

авторы

Рейд Кристофер Б.

(73)

патентообладатели

Рейд Кристофер Б.

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

TAKAHASHI Ket al"Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors", CellBELTRAMI A.Pet al"Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow)", Blood

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ПОПУЛЯЦИЙ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ И ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК, УСТОЙЧИВЫХ К ЗАБОЛЕВАНИЯМ И СПОСОБНЫХ К ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ Российский патент 2020 года по МПК C12N5/789

Описание патента на изобретение RU2718536C2

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка на национальной фазе в соответствии с §371 закона №35 Кодекса США является продолжением в соответствии с §120 закона №35 Кодекса США международной заявки PCT/US2008/065007, поданной 28 мая 2008 года, и в соответствии с §119 закона №35 Кодекса США заявляет приоритет по отношению к предварительной заявке на патент США 60/932020, поданной 29 мая 2007 года, предварительной заявке на патент США 60/933133, поданной 5 июня 2007 года, предварительной заявке на патент США 60/933670, поданной 8 июня 2007 года, предварительной заявке на патент США 61/006449, поданной 14 января 2008 года, и предварительной заявке на патент США 61/064761, поданной 25 марта 2008 года, полное содержание которых включено в описание в качестве ссылки во всей их полноте.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Важнейшей проблемой для медицины в 21-м веке будет замена поврежденных, изношенных или генетически ослабленных клеток. Транскрипционные факторы, специфично связывающиеся с ДНК, играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов. А именно, набор транскрипционных факторов в отдельной клетке определяет, какие клеточные программы активны, а какие нет. В этом качестве транскрипционные факторы играют решающую роль в определении и поддержании клеточной индивидуальности, а также определении клеточной уязвимости.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Возможность получать пролиферирующую, самообновляющуюся популяцию (популяции) мультипотентных и плюрипотентных клеток из неплюрипотентных, несамообновляющихся клеток может принести значительные положительные результаты во всех сферах, использующих клеточные методы лечения. Данные сферы применения включают в себя трансплантацию костного мозга, трансфузиологию и генную терапию и делают возможным получение индивидуальных для каждого пациента стволовых или других требуемых типов клеток. Аналогично, возможность инициировать дифференцировку клеток в нервные, мышечные и другие различные требуемые популяции клеток также имеет и будет иметь большое значение для медицины и промышленных процессов с участием животных. Соответственно, данное изобретение предлагает способы генетического получения и применения популяций мультипотентных клеток, популяций плюрипотентных клеток, популяций нейронов, популяций мышечных клеток и других требуемых популяций клеток, как, например, популяций клеток, устойчивых к ВИЧ (вирус иммунодефицита человека).

Данным изобретением предполагается, что эффективное введение или сверхэкспрессия определенных транскрипционных факторов, отдельно или в сочетании с другими детерминантами клеточного развития (notch, numb или numblike), делает возможным взаимное преобразование того, что было определено как временные (мультипотентные, плюрипотентные и/или самообновляющиеся) или постоянные (дифференцированные или соматические) клеточные фенотипы. Возможность надежно индуцировать фенотипические преобразования или клеточное перепрограммирование делает возможным получение стволовых клеток, замену клеток, тканей и органов, которые подходят отдельным пациентам. В сочетании с методами генной терапии и методами клеточного культивирования взаимопревращение типов клеток также предусматривает получение устойчивых к заболеваниям и генетически репарированных клеток, пригодных для трансплантации.

Цель данного изобретения - представить различные способы создания популяции (популяций) пролиферирующих, самообновляющихся мультипотентных и/или плюрипотентных клеток, а также других требуемых популяций клеток либо из делящихся, либо из неделящихся клеток без применения онкогенов. Популяции дифференцирующихся клеток включают клетки, экспрессирующие некоторые, но не все маркеры, связанные с принадлежностью к определенному типу клеток. В этом документе раскрывается, что экспрессия соответствующей изоформы Numb в сочетании с другими трансгенами (в особенности транскрипционными факторами) делает возможным получение популяций делящихся плюрипотентных клеток или популяций дифференцирующихся клеток. Более того, генетические векторы данного изобретения можно использовать для получения генетической модификации (например, экспрессии генных продуктов, недостающих у пациента) и для временной или постоянной индукции пролиферации, самообновления или характерного для стволовых клеток/клеток-предшественников поведения у эндогенных клеток in vivo, в частности таких клеток, обнаруживаемых в тканях, которые обычно не демонстрируют или больше не демонстрируют подобное поведение. Наконец, другие генетические векторы данного изобретения могут быть использованы для получения генетической модификации и/или для блокирования пролиферации, самообновления или характерного для стволовых клеток/клеток-предшественников поведения у клеток, аберрантно проявляющих такое поведение (например, у раковых клеток). Кроме того, целью настоящего изобретения является обеспечение терапевтических векторов, а также клеток, способных экспрессировать последовательности искусственных олигонуклеотидов для смягчения патологических процессов. Например, данное изобретение раскрывает применение искусственных олигонуклеотидов для уменьшения экспрессии генов, ключевых для инфицирования, размножения и распространения ВИЧ и других вирусов иммунодефицита.

Данное изобретение можно применять для любых подходящих клеток, включая клетки позвоночных, и включая клетки рыб, млекопитающих, птиц, земноводных и рептилий.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Схематичная карта вектора, соответствующая векторной последовательности из Примера 13.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Все патенты, патентные заявки и публикации, которые цитируются в этой заявке, включены в данный документ по ссылке в их полном объеме.

Обсуждаемая в настоящем документе «ДНК» относится к дезоксирибонуклеиновой кислоте, а «РНК» относится к рибонуклеиновой кислоте. Обсуждаемая в настоящем документе «кДНК» относится к комплементарной ДНК, «иРНК» относится к информационной РНК; «миРНК» относится к малой интерферирующей РНК; «shRNA» относится к малым РНК, образующим шпильки; «микроРНК» относится к микро-РНК, таким как одноцепочечные молекулы РНК, как правило, около 20-30 нуклеотидов в длину, которые могут регулировать экспрессию генов; «ловушка», и «ловушка-РНК», и «РНК-ловушка» относятся к молекуле РНК, которая имитирует природный связывающий домен для лиганда.

Используемое в данном документе выражение «уменьшение интенсивности» включает снижение эффекта, или уменьшение повреждения, или сведение к минимуму эффекта или влияния действия, активности или функционирования, и включает, например, снижение вредных эффектов заболевания или состояния.

Используемое в данном документе выражение «торможение» включает замедление или снижение развития эффекта или действия, и включает, например, замедление развития заболевания, замедление скорости инфицирования, или иные действия, направленные на замедление или уменьшение прогрессирования или развития заболевания или состояния.

Используемое в данном документе выражение «индуцирующее средство» означает средство, которое содействует в качестве вспомогательного средства или само по себе эффективно, чтобы вызвать действие. Например, экзогенное средство, которое влияет на промотор, например, путем инициирования или усиления его активности, и тем самым влияет на экспрессию гена под контролем промотора, можно назвать индуцирующим средством. Например, в качестве индуцирующего средства можно применять тетрациклин; и в качестве индуцирующего средства можно применять доксициклин.

Последовательность нуклеиновой кислоты (например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид) называется «функционально связанной» с другой последовательностью нуклеиновой кислоты (например, с промотором), если первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Используемое в данном документе выражение «находится под управлением» относится к гену или кодирующей последовательности, которая функционально связана с последовательностью промотора, а последовательность промотора влияет на транскрипцию и экспрессию кодирующей последовательности.

Используемое в данном документе выражение «маркер» представляет собой молекулу, которая является поддающейся обнаружению, или кодирует поддающуюся обнаружению молекулу, или воздействует на другие молекулы с тем, чтобы наличие маркера стало поддающимся обнаружению. «Маркерным белком» или «маркерным полипептидом» является белок или полипептид, который поддается обнаружению в лабораторных или клинических условиях и в вариантах осуществления может поддаваться визуальному обнаружению. «Маркерный ген» кодирует маркерный белок или маркерный полипептид.

Используемое в данном документе выражение «ВИЧ» («HIV») означает вирус иммунодефицита человека, и включает его разновидности, такие как, например, ВИЧ-1, ВИЧ-2. Другие вирусы иммунодефицита включают вирус иммунодефицита обезьян (SIV) и вирус иммунодефицита кошек (FIV). Ферменты, которые относятся к ВИЧ, могут называться «ферментами ВИЧ» и включают, например, интегразу, протеазу, обратную транскриптазу и трансактивирующий регуляторный белок (TAT).

Как полагают, инфицирование ВИЧ вовлекает в процесс рецепторы, называемые «рецепторами ВИЧ». Таких рецепторов может быть много, некоторые из них можно назвать «корецепторами ВИЧ». Обсуждаемые в настоящем документе корецепторы ВИЧ включают CXCR4 и CCR5.

В данном документе описывается теоретическая основа для вариантов осуществления данного изобретения, однако, данное обсуждение ни в коем случае не должно рассматриваться как обязательное или ограничивающее для данного изобретения. Специалисты в данной области поймут, что на практике можно осуществить различные варианты осуществления данного изобретения, независимо от модели, используемой для описания теоретических обоснований данного изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления клетки «выбирают» из доступных популяций делящихся или неделящихся клеток с целью получения требуемой а) популяции пролиферирующих, мультипотентных или плюрипотентных клеток, дифференцирующихся б) популяций нервных клеток в) мышечных клеток, г) и/или любой другой требуемой популяции клеток; более того, требуемая популяция клеток может быть способна к дальнейшей дифференцировке in vitro, in vivo, и/или соответствующей для ткани и соответствующей для области дифференцировке in vivo.

Источники клеток, выбранные для применения в данном изобретении:

Выбранные клетки могут включать любую клетку, применимую в данном изобретении. Клетки, выбранные для применения в данном изобретении (в данном документе называемые: «выбранные клетки») могут изначально быть эндогенными клетками пациента, в том числе клетками, полученными из других систем органов; или происходить из экзогенных источников (в том числе клетки, полученные из клеточных линий, криоконсервированных источников, хранящихся в банках источников и доноров). Клетки также могут быть выбраны из клеток, генетически модифицированных искусственными или природными последовательностями нуклеиновых кислот. Используемое в данном документе выражение «выбранные клетки» не включает в себя эмбриональные стволовые клетки человека.

В вариантах осуществления данного изобретения для того, чтобы их можно было выделить без применения инвазивных процедур, выбранные клетки предпочтительно будут легко доступными клетками (например, лейкоциты периферической крови, циркулирующие стволовые кроветворные клетки, эпителиальные клетки (например, клетки буккального эпителия внутренней стороны щеки (например, Michalczyk et al., 2004)), жировая ткань (например, Gimble et al., 2007; Ma et al., 2007), клетки пуповинной крови (например, Zhao, et al., 2006, Tian et al., 2007) и др.). Тем не менее, стволовые клетки костного мозга, сперматогонии (например, Guan et al., 2006, Takahashi et al., 2007), первичные половые клетки (PGC), стволовые клетки, выделенные из околоплодных оболочек (например, Ilancheran et al., 2007.), амниотической жидкости (например, De Coppi et al., 2007), а также клетки, выделенные из кожи (например, Tumbar, 2006; Dunnwald et al., 2001; Szudal'tseva et al., 2007) и др., также охватываются настоящим изобретением. Такие клетки можно выделить из тканей, в которых они располагаются, с помощью средств, известных в данной области техники.

Клетки-сперматогонии можно выделить с помощью двухступенчатого ферментативного расщепления с последующим разделением в перколле. Затем клетки можно ресуспендировать в минимальной необходимой среде (MEM) с добавлением бычьего сывороточного альбумина до достижения конечной концентрации 10⁶/мл. Подробнее: хирургическим путем получают доступ к фрагментам канальца и препарируют при помощи иглы перед обработкой с использованием 1 мг/мл трипсина, гиалуронидазы и коллагеназы, а затем 1 мг/мл гиалуронидазы и коллагеназы, в MEM, содержащей 0,10% бикарбоната натрия, 4 мМ L-глутамин, заменимые аминокислоты, 40 мкг/мл гентамицина, 100 ME на 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина и 15 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота). В дальнейшем клетки-сперматогонии отделяют от фрагментов канальца путем центрифугирования при 30-кратной силе тяжести. После фильтрации через нейлоновые фильтры с порами размером 77 и/или 55 микрон клетки собирают и загружают на ступенчатый градиент плотности перколла. Фракции с чистотой более 40% клеток-предшественников/стволовых клеток/клеток-сперматогоний отмывают и ресуспендируют до концентрации клеток равной 10⁶ клеток-предшественников/стволовых клеток/клеток-сперматогониев на милилитр. Затем клетки культивируют и/или хранят с помощью любой известной в данной области техники методики криоконсервации.

Выбранные клетки могут быть генетически модифицированными клетками, в частности клетками, которые были модифицированы любым известным в данном уровне техники способом с тем, чтобы кодировать терапевтические и используемые в коммерческих целях последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК).

В соответствии с аспектом настоящего изобретения предлагается способ получения требуемой популяции клеток (например, плюрипотентных, нейронов, мышечных клеток и т.д.) из выбранных клеток.

Получение популяций мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток:

Для получения а) популяции пролиферирующих, самообновляющихся плюрипотентных клеток выбранную клетку (клетки) и/или ее (их) потомство трансфицируют нуклеотидной последовательностью (последовательностями), включая последовательности, кодирующие «длинную (длинные)» (PRR insert+) изоформу (изоформы) гена numb млекопитающих. Приблизительно в то же время, выбранные клетки также можно трансфицировать искусственными олигонуклеотидами, нацеленными на короткие изоформы Numb или Numblike, затем культивировать в условиях, которые способствуют росту выбранных клеток с оптимальной скоростью роста. Выбранные клетки поддерживают в таких условиях в течение периода времени, достаточного для достижения требуемого количества клеток.

Клетки выращивают при (оптимальной) скорости роста, которая достигается инкубацией с LIF (фактором, ингибирующим лейкоз), фактором стволовых клеток и/или с равносильными концентрациями IL-6, гипер-IL-6, IL-7, онкостатина-М и/или кардиотрофина-1; или такой скорости роста, которая достигается в присутствии других цитокинов, усиливающих клеточный рост (например, в условиях, описанных для культивирования плюрипотентных клеток, например, Guan et al., 2006). Скорость роста определяют по времени удвоения выбранных клеток в указанной ростовой культуральной среде. Подобным образом, для размножения и наращивания с оптимальной скоростью роста клеток, трансфицированных длинной (PRR+) изоформой (изоформами) Numb, могут быть пригодны условия культивирования, такие как описанные в патентах США 6432711 и 5453357. Другие приемлемые протоколы и стандартные концентрации цитокинов были разработаны Koshimizu et al., 1996; Keller et al, 1996; Piquet-Pellorce, 1994; Rose et al., 1994; Park и Han, 2000; Guan et al., 2006; Dykstra et al., 2006; Zhang et al., 2007. Как бы то ни было, осуществление на практике настоящего изобретения не ограничено деталями этих идей.

В предпочтительном варианте осуществления выбранные клетки культивируют в стандартной ростовой среде (например, в минимальной необходимой среде с добавками (например, глутамином и бета-меркаптоэтанолом) или без них). Среда может включать основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор стволовых клеток, фактор, ингибирующий лейкоз (LIF) и/или факторы с LIF-активностью (например, LIF, LIF-рецептор (LIFR), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), онкостатин М (OSM), OSM-рецептор (OSMR), кардиотрофин, интерлейкины (IL), такие как IL-6, гипер-IL-6, GP130 и др.), а также лошадиную сыворотку. LIF, а также другие факторы с LIF-активностью, предотвращают спонтанную дифференцировку клеток. При таких условиях ожидается, что выбранные клетки, трансфицированные PRR+ изоформой (изоформами) Numb, и их потомство станут мультипотентными, плюрипотентными и/или самообновляющимися.

В предпочтительном варианте осуществления выбранную (выбранные) клетку (клетки) и/или ее (их) потомство трансфицируют нуклеотидной последовательностью (нуклеотидными последовательностями), кодирующей (кодирующими) «длинную (длинные)» (PRR insert+) изоформу (изоформы) Numb, а также последовательностями, кодирующими другие трансгены. Многие из этих трансгенов приведены ниже вместе с их соответствующими идентификационными номерами (номерами доступа) в базе данных последовательностей NCBI.

В другом предпочтительном варианте осуществления выбранную (выбранные) клетку (клетки) и/или ее (их) потомство трансфицируют нуклеотидной последовательностью (нуклеотидными последовательностями), кодирующей (кодирующими) сегмент «длинной (длинных)» (PRR insert+) изоформы (изоформ) Numb, а также последовательностями, кодирующими другие трансгены. Многие из этих трансгенов приведены ниже вместе с их соответствующими идентификационными номерами (номерами доступа) (кодами) в базе данных последовательностей NCBI.

В предпочтительном варианте осуществления выбранные клетки и/или их потомство трансфицируют последовательностями, кодирующими длинную (PRR+) изоформу Numb, а также последовательностями, кодирующими другие трансгены, в том числе LIF.

В предпочтительном варианте осуществления выбранные клетки и/или их потомство трансфицируют последовательностями, кодирующими длинную (длинные) (PRR+) изоформу (изоформы) Numb, а также последовательностями, кодирующими другие трансгены, в том числе LIFR.

В предпочтительном варианте осуществления выбранные клетки и/или их потомство трансфицируют последовательностями, кодирующими другие трансгены, в том числе OCT3/4, и SOX2, и трансген с LIF-активностью.

В дальнейшем могут быть описаны или разработаны другие, отличающиеся от описанных в данном документе, комбинации генов, которые способны вызывать превращение клеток в мультипотентные, плюрипотентные, способные к самообновлению, или которые способны вызывать начало дифференцировки. Однако, настоящая заявка на патент охватывает такое «генетическое перепрограммирование» любой ядросодержащей клетки с помощью электропорации с введением нуклеиновой кислоты или белка (см. Gagne et al., 1991; Saito et al., 2001; Yuan, 2008; Huang et al., 2007; Xia and Zhang, 2007; Cemazar and Sersa 2007; Isaka and Imai, 2007; Luxembourg et al., 2007; Van Tendeloos, 2007; Takahashi, 2007 и др.), липосом, нанокапсул, нанохранилищ и т.д. (см. Goldberg et al., 2007; Li et al., 2007), и/или с помощью другого подхода, который позволяет избежать вирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки, поскольку такие средства повышают безопасность и эффективность.

Из категории случайного изменения, естественно, исключают подходы, включающие способы направленного воздействия на гены и сайтнаправленные способы, разработанные для введения или удаления ДНК в конкретных участках генома.

Также, данная заявка на патент охватывает генетическое перепрограммирование любой ядросодержащей клетки с помощью электропорации с введением нуклеиновой кислоты или белка, липосом, нанокапсул, нанохранилищ и т.д., и/или другого подхода, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки, поскольку такие средства повышают безопасность и эффективность. Такие подходы и способы включают все известные в данной области и применимые в данном изобретении.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие отдельному гену или его сегменту (в частности, упомянутым в данном документе, открытым по описанным в данном документе способам или открытым по другим опубликованным способам; или известным как индуцирующие мультипотентность, плюрипотентность и/или самообновление), - это единственная нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), которые сверхэкспессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые соответствуют отдельному гену или его сегменту (в частности, упомянутым в данном документе, открытым по описанным в данном документе способам или открытым по другим опубликованным способам; или известным как индуцирующие мультипотентность, плюрипотентность и/или самообновление), можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток.

В предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие Nanog, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим Nanog, можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать вирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие Oct4 и Sox2, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать вирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые соответствуют Oct4/Sox2, можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать вирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие длинным (PRR+) изоформам Numb, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать вирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим длинным (PRR+) изоформам Numb, можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток; а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать вирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим Nanog, можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие гену с LIF-активностью, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим гену с LIF-активностью, можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие Oct4, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим Oct4, можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие Sox2, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим Sox2, можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие lin28, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим lin28, можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие c-myc, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим c-myc, можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие Oct4 и Sox2, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим Oct4 и Sox2, используют другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие длинным (PRR+) изоформам Numb, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим длинным (PRR+) изоформам Numb, используют другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие Oct4, Sox2 и Nanog, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим Oct4, Sox2 и Nanog, используют другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления единственной нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для получения мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток из выбранных клеток, являются нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие длинным (PRR+) изоформам Numb, а способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), соответствующим длинным (PRR+) изоформам Numb, используют другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся клеток, а способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

Следует понимать, что любую описанную в настоящем документе комбинацию последовательностей нуклеиновых кислот или белков можно изменять путем исключения таких, которые соответствуют Numb и/или Numblike, до тех пор, пока не будет получена требуемая популяция клеток или достигнуто требуемое поведение.

Аналогично, следует понимать, что описанные в настоящем документе способы инициации дифференцировки применимы к любым индуцированным или неиндуцированным мультипотентным, плюрипотентным или самообновляющимся стволовым клеткам, другим клеткам-предшественикам или другим выбранным клеткам, а не только к клеткам, полученным описанным в данном документе способом.

Следует понимать, что любую описанную в настоящем документе комбинацию последовательностей нуклеиновых кислот или белков можно изменять путем исключения последовательностей нуклеиновых кислот или белков, соответствующих Numb и/или Numblike, до тех пор, пока не будет получена требуемая популяция клеток.

В другом варианте осуществления используют различные комбинации нуклеиновых кислот или белков, описанные в настоящем документе, за исключением нуклеиновых кислот или белков, соответствующих изоформам Numb и/или Numblike.

В предпочтительном варианте осуществления выбранные клетки и/или их потомство - это клетки, которые были предварительно генетически модифицированы.

В предпочтительном варианте осуществления описанные в этом документе этапы трансфекции представляют собой временную трансфекцию.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения такую временную трансфекцию осуществляют с помощью векторов на основе вирусов, которые не встраиваются в геном хозяина.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения такую временную трансфекцию осуществляют с помощью стандартных методик трансфекции (электропорация, химически опосредованная трансфекция, сливающиеся или несливающиеся липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и т.д.).

В дальнейшем могут быть описаны или открыты другие комбинации генов, отличающиеся от описанных в данном документе, которые способны вызывать превращение клеток в мультипотентные, плюрипотентные и/или самообновляющиеся, а также вызывать начало дифференцировки. Однако, настоящая заявка на патент также охватывает генетическое перепрограммирование любой ядросодержащей клетки с помощью электропорации с введением нуклеиновой кислоты или белка (например, способы, описанные Gagne et al., 1991; Saito et al., 2001; Yuan, 2008; Huang et al., 2007; Xia and Zhang, 2007; Cemazar and Sersa 2007; Isaka and Imai, 2007; Luxembourg et al., 2007; Van Tendeloos, 2007; Takahashi, 2007 и др.), липосом, нанокапсул, нанохранилищ и/или с помощью другого подхода, который позволяет избежать вирусной интеграции или другого случайного изменения клеточного генома, поскольку такие средства повышают безопасность и эффективность способа.

В другом предпочтительном варианте осуществления трансфекцию последовательностями, кодирующими длинную (PRR+) изоформу numb (и/или искусственными нуклеотидами, нацеленными на numblike и короткие изоформы numb), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют человеческий LIF (например, Du and Shi, 1996), онкостатин-М, кардиотрофин-1, IL-11, IL-6, IL-6-P, гипер-IL-6, LIFR, gp130, OCT3 (OCT4), Nanog, SOX2 и/или FGF-4.

Одновременную трансфекцию любым подклассом данных определенных трансгенных последовательностей можно выполнить любыми известными в данной области техники способами, включая применение одного генетического вектора, множественных генетических векторов, серийную трансфекцию или отбор, основанный на определенных маркерных белках и/или устойчивостях к антибиотикам.

В другом предпочтительном варианте осуществления клетки, трансфицированные длинной (PRR+) изоформой (изоформами) numb, культивируют в клеточной культуре, способствующей оптимальной скорости роста, такой, как описано выше, и которая включает EGF, bFGF, онкостатин, LIF (например, Du and Shi, 1996), фактор стволовых клеток, IL-11, кардиотрофин-1, IL-6, гипер-IL-6, CNTF и/или растворимый gp130.

Оценка потентности и дифференцировки

Плюрипотентность и мультипотентность можно оценить любыми известными в данной области техники способами, в том числе: 1) трансплантацией, 2) культивированием в условиях, способствующих формированию эмбриоидного тельца, 3) введением клеток в эмбрионы животных (за исключением человека) на стадии бластоцисты с последующим развитием и 4) анализами экспрессии РНК (например, ОТ-ПЦР или анализы на основе микрочипов) на генную экспрессию, связанную с дифференцировкой, мультипотентностью, плюрипотентностью и т.д. (см. Guan et al., 2006), 5) образованием колоний, а также по морфологии, подобной эмбриональным стволовым клеткам. Один раскрываемый в данном документе подход для определения плюрипотентности у выбранных клеток и/или их потомства включает трансфекцию конструктом-репортером, который включает промотор Nanog, функционально связанный с геном флуоресцентного белка. Это позволяет осуществить идентификацию и накопление клеток, экспрессирующих Nanog, с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортинга (FACS) и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления эндогенные клетки (например, клетки, окружающие место ожога или повреждения) трансфицируют in vivo генетическими векторами, кодирующими длинную (длинные) (PRR+) изоформу (изоформы) numb, самими по себе или в сочетании с другими трансгенами, упоминаемыми в настоящем документе, что будет временно способствовать возобновлению пролиферации или повышенной пролиферации клеток. Этот подход также может найти клиническое применение в ситуации с гипопластическими тканями, нарушениями, при которых количество стволовых клеток/клеток-предшественников аномально уменьшено, а также при других нарушениях, при которых подход может быть продемонстрирован как полезный.

Получение популяций дифференцирующихся клеток

Для получения популяций б) нервных, в) мышечных и г) других клеток, способных далее дифференцироваться под влиянием окружающей среды in vivo, выбранную клетку (клетки) и/или ее (их) потомство факультативно трансфицируют последовательностью (последовательностями) длинной (PRR+) изоформы Numb и/или последовательностями искусственных олигонуклеотидов и наращивают посредством выращивания в течение достаточного времени для достижения требуемого количества клеток-потомков in vitro (как описано выше).

После этого факультативного этапа выбранные клетки и/или их потомство отмывают от цитокинов и средств, включая среду для оптимального роста/наращивания, и факультативно трансфицируют нуклеотидной последовательностью (последовательностями), кодирующей ген Numblike и/или «короткую» (PRR-) изоформу (изоформы) Numb, и/или искусственные олигонуклеотиды, которые целенаправленно действуют на длинные (PRR+) изоформы, и т.д. (например, Zaehres et al., 2005), затем культивируют при условиях, которые способствуют дифференцировке выбранных клеток в требуемый тип (типы) клеток.

В большинстве случаев клетки затем культивируют в присутствии 5-10% фетальной бычьей сыворотки и средства (средств), способствующего дифференцировке выбранных клеток и/или их потомства в требуемую популяцию клеток. Присутствие фетальной бычьей сыворотки и средства (средств) обеспечивает рост или пролиферацию со скоростью, которая меньше оптимальной скорости роста или скорости наращивания, а также способствует дифференцировке клеток в требуемую популяцию клеток. Средства или конкретные условия культивирования выбирают в соответствии с требуемой популяцией клеток, как это описано ниже.

Получение популяций нейронов или нервных клеток

Если требуемая популяция клеток - это популяция нервных клеток, то успешно трансфицированные клетки культивируют в условиях, которые способствуют росту при скорости, которая меньше оптимальной скорости, а также в присутствии средства (средств), которое способствует дифференцировке клеток в нервные клетки. Условия, способствующие дифференцировке в нейроны, были описаны в многочисленных публикациях, включая (Benninger et al., 2003; Chung et al. 2005; Harkany et al., 2004; Ikeda et al., 2004; Ikeda et al., 2005; Wernig et al., 2002; и Wernig et al., 2004). Более того, сочетание воздействия ретиноевой кислоты с присутствием дополнительных цитокинов способствует специфической дифференцировке в тип нервных клеток in vitro (например, Soundararajan et al., 2006; Soundararajan et al., 2007; патент США 6432711).

В предпочтительном варианте осуществления дифференцировка нейронов или нервных клеток in vitro происходит в присутствии 50 нг/мл фактора роста нервов (NGF).

В предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией клеток является популяция нейронов, то трансфекцию последовательностями, кодирующими короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют Nurr1, REN, нейрогенин-1, нейрогенин-2, нейрогенин-3, Mash1, Phox2b, Phox2a, dHand, Gata3, Shh, FGF8, Lmx1b, Nkx2.2, Pet1, Lbx1 и/или Rnx.

В другом предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией нейронов является популяция дофаминергических нейронов, то трансфекцию последовательностями, кодирующими короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют Mash1, Ngn2, Nurr1, Lmx1b и/или Ptx-3.

В другом предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией нейронов является популяция серотонинергических нейронов, то трансфекцию последовательностями, кодирующими короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют Mash1, Phox2b, Lmx1b, Nkx2.2, Gata2, Gata3 и/или Pet1.

В другом предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией нейронов является популяция холинергических нейронов, то трансфекцию последовательностями, кодирующими короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют MASH1, Phox2a и/или REST4.

В другом предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией нейронов является популяция ГАМК-эргических нейронов, то трансфекцию последовательностями, кодирующими короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют MASH1, Phox2a и/или REST4, факультативно с последующим культивированием в средах, дополненных LIF, нейротрофином-3 (NT3) и/или фактором роста нервов (NGF).

В другом предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией нейронов является популяция норадренергических нейронов, то трансфекцию последовательностями, кодирующими короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют Mash1, dHand, Phox2a, Phox2b, Gata2 и/или Gata3.

В другом предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией нейронов является популяция ГАМК-эргических нейронов, то трансфекцию последовательностями, кодирующими короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют PITX2, Dlx2, Dlx5, антисмысловую РНК Hes1 и/или другие искусственные олигонуклеотиды, целенаправленно воздействующие на HES1.

В другом предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией является популяция нейронов или популяцией нервных клеток, то клетки, трансфицированные короткими (PPR-) изоформами numb (и/или numblike), культивируют в среде для культивирования клеток, которая способствует дифференцировке, например описанной выше, и которая включает один или несколько из следующих средств: ретиноевая кислота, NT3, NGF, глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и интерферон-гамма (IFN-гамма).

Получение популяций мышечных клеток

Если требуемая популяция клеток - это популяция мышечных клеток, то успешно трансфицированные клетки культивируют в присутствии средства, способствующего дифференцировке клеток в мышечные клетки, и росту при скорости, меньше оптимальной скорости. Условия, которые способствуют дифференцировке в мышечные клетки, также были ранее описаны (Nakamura et al., 2003; Pal and Khanna, 2005; Pipes et al., 2005; Albilez et al., 2006; Pal and Khanna, 2007; Behfar et al., 2007; патент США 6432711). Более того, воздействие на выбранные клетки и/или их потомство гексаметилен-бис-акриламидом или диметилсульфоксидом в присутствии дополнительных цитокинов способствует инициации дифференцировки в клетки мышечного типа in vitro.

В предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией является популяция клеток сердечной мышцы, то клетки, трансфицированные короткими (PRR-) изоформами numb (и/или numblike), культивируют в среде для культивирования клеток, которая способствует дифференцировке в кардиомиоциты (Не et al., 2003; Guan et al., 2007 и др.), или которая включает определенные средства в концентрациях, которые способствуют дифференцировке в кардиомиоциты (например, 0,75%-1% диметилсульфоксид (DMSO), 20% нормальная бычья сыворотка (NBS), 10(-7) мМ ретиноевая кислота (RA) и 20% среда, кондиционированная кардиомиоцитами) (Hua et al., 2006).

В другом предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией является популяция кардиомиоцитов, то клетки также трансфицируют нуклеотидными последовательностями, которые включают последовательности, выбранные из тех последовательностей, которые кодируют Gata4, Gata5 и Gata6.

В предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией клеток является популяция мышечных клеток, то трансфекцию последовательностями, которые кодируют короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют специфический для мышечного типа bHLH, MyoD, миогенин, Myf5, Myf6, Mef2, миокардин, Ifrd1 и/или другие транскрипционные факторы мышечных клеток.

В предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией клеток является популяция гладкомышечных клеток, то трансфекцию последовательностями, которые кодируют короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют нуклеотидную последовательность специфического для клеток мышечного типа миокардина.

В предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией клеток является популяция клеток скелетной мышцы, то трансфекцию последовательностями, которые кодируют короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют нуклеотидные последовательности специфического для клеток мышечного типа MyoD и миогенина.

В предпочтительном варианте осуществления, если требуемой популяцией клеток является популяция олигодендроцитов, то трансфекцию последовательностями, которые кодируют короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют специфические для олигодендроцитов нуклеотидные последовательности OLIG1, OLIG2 и Zfp488.

Одновременную трансфекцию любым подклассом данных определенных трансгенных последовательностей, приведенных выше, можно выполнить любыми известными в данной области техники способами, включая применение множественных генетических векторов, серийную трансфекцию, а также отбор, основанный на определенных маркерных белках и/или устойчивости к антибиотикам.

Если требуемой популяцией клеток является популяция кроветворных клеток, то среда для дифференцировки включает специфические средства в концентрациях, которые способствуют дифференцировке в кроветворные клетки-предшественники (например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), тромбопоэтин и т.д. (например, Ohmizono, 1997; Wang et al., 2005; Srivastava et al., 2007; Gupta et al., 2007) или дифференцированные кроветворные клетки (в соответствии с известными в уровне техники способами получения дифференцированных типов кроветворных клеток из недифференцированных или плюрипотентных клеток).

Если требуемая популяция клеток - это популяция половых клеток, то среда дифференцировки включает специфические средства в концентрациях, которые способствуют дифференцировке в половые клетки (например, Nayernia et al. 2006а, 2006b).

Если требуемая популяция клеток - это популяция клеток эндодермы или инсулярных клеток поджелудочной железы, то среда дифференцировки включает специфические средства в концентрациях, которые способствуют дифференцировке в клетки эндодермы и инсулярные клетки поджелудочной железы (например, Xu et al., 2006; Denner et al., 2007; Shim et al., 2007; Jiang et al., 2007).

В предпочтительном варианте осуществления дифференцировка выбранных клеток и/или их потомства может происходить в среде для дифференцировки без трансфекции numblike, короткими изоформами Numb или другими трансгенами, при этом среда для дифференцировки может оставаться неизменной.

В вариантах осуществления будут использовать один вектор, который контролирует экспрессию нуклеотидной последовательности (последовательностей), кодирующей «длинную» изоформу (изоформы) гена numb млекопитающих (и/или искусственные олигонуклеотиды, целенаправленно воздействующие на numblike или короткие изоформы numb) одним регулируемым промотором (например, тетрациклин-регулируемым промотором), тогда как Numblike и короткие изоформы Numb (и/или искусственные олигонуклеотиды, целенаправленно воздействующие на длинные (PRR+) изоформы) экспрессируются под контролем другого отдельного, но также регулируемого промотора. Следовательно, длинная (PRR+) изоформа (изоформы) numb может экспрессироваться (и/или короткие изоформы репрессироваться), если требуется наращивание выбранных клеток и в питательную среду добавлен индуктор (например, тетрациклин); затем могут экспрессироваться numblike и короткие изоформы (и/или длинная (PRR+) изоформа (изоформы) numb подавляться), если требуется дифференцировка.

Аналогично, белки и пептиды, соответствующие изоформам Numb, Notch, OCT3/4, SOX2 и другим последовательностям ДНК, приведенным в данном документе, можно вводить подобным образом в выбранные клетки и/или их потомство посредством электропорации (например, Koken et al., 1994; Ritchie and Gilroy, 1998), с помощью наночастиц, катионных липидов, сливающихся липосом (например, Yoshikawa et al., 2005; 2007) и т.д., вместо или в сочетании с генетической трансфекцией. В целом, электропорация предусматривает высокоэффективную трансфекцию (и высокий выход требуемых клеток) без геномной интеграции трансгена и, следовательно, связана в повышенной безопасностью.

ДНК или РНК, кодирующие белок (белки) или полипептид (полипептиды), которые способствуют пролиферации, мультипотентности, плюрипотентности или дифференцировке выбранных клеток, можно выделить в соответствии со стандартными методиками генной инженерии (например, путем выделения такой ДНК из библиотеки кДНК конкретной линии клеток) и поместить ее в соответствующий вектор экспрессии, который затем трансфицируют в выбранные клетки.

В другом предпочтительном варианте осуществления требуемой популяцией являются клетки эндодермы или инсулярные клетки поджелудочной железы, а трансфекцию последовательностями, кодирующими короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют Foxa2, Sox17, HLXB9 и/или Pdx1.

В другом предпочтительном варианте осуществления требуемой популяцией являются гепатоциты, а трансфекцию последовательностями, кодирующими короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют печеночный ядерный фактор (hepatic nuclear factor) HNF-1, HNF-3, FTNF-4, FTNF-6 и creb-связывающий белок.

В другом предпочтительном варианте осуществления требуемой популяцией являются кроветворные клетки, а трансфекцию последовательностями, кодирующими короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, выбранные из тех, которые кодируют Runx1/AML1 и NOV(CCN3), и/или культивированием клеток в присутствии колониестимулирующих факторов, специфичных для требуемых популяций клеток. Если требуется приживление трансплантата, то вводят изоформу Runx1/AML1a; если требуется дифференцировка, то вводят изоформу b (Creemers et al., 2006).

В другом предпочтительном варианте осуществления, требуемой популяцией являются хондроциты, а трансфекцию последовательностями, которые кодируют короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая последовательности, которые кодируют Sox9, CREB-связывающий белок, Gata6 и/или Runx2.

В другом предпочтительном варианте осуществления требуемой популяцией являются костные клетки (особенно остеобласты), а трансфекцию последовательностями, которые кодируют короткие изоформы numb (и/или numblike), дополняют или заменяют временной или постоянной трансфекцией другими последовательностями, включая Runx2.

В предпочтительном варианте осуществления генетические векторы, кодирующие длинные изоформы Numb (такие как те, что описаны в настоящем документе), вводят в эндогенные клетки in vivo временно или под контролем регулируемого промотора с тем, чтобы заставить такие клетки временно пролиферировать.

В предпочтительном варианте осуществления эндогенные клетки (например, клетки эпендимальной зоны центральной нервной системы) трансфицируют in vivo генетическими векторами, которые кодируют самую короткую изоформу numb или белок (белки) numblike, отдельно или в сочетании с другими трансгенами, указанными в настоящем документе, с тем, чтобы временно или постоянно способствовать повторному запуску дифференцировки или повышенной дифференцировке (особенно нейрональной дифференцировке) и миграции клеток-предшественников/эпендимальных клеток в центральную нервную систему. Это обновление или повышение измеряют по величине числа клеток, проявляющих впервые возникшую экспрессию маркеров, связанных с дифференцировкой. Этого можно достигнуть путем введения в систему органов генетических векторов с использованием способов, пригодных для данной цели (смотри примеры).

В предпочтительном варианте осуществления эндогенные клетки (например, клетки эпендимальной зоны центральной нервной системы) трансфицируют in vivo генетическими векторами, которые кодируют длинную изоформу (изоформы) numb и/или другие приведенные в настоящем документе трансгены, с тем, чтобы временно способствовать возобновлению пролиферации или повышенной пролиферации стволовых клеток (с последующей дифференцировкой клеток-потомков). Это возобновление или повышение измеряют по величине числа клеток, проявляющих впервые возникшую экспрессию маркеров, связанных с делением предшественников. Этого можно достигнуть путем введения в систему органов генетических векторов с использованием способов, пригодных для данной цели (смотри примеры).

Аналогично, этот подход также является пригодным для индукции повторного запуска дифференцировки или повышенной дифференцировки из популяций прочих стволовых клеток в прочих тканях (таких, как кожа и т.д.). Этот подход можно использовать, например, в клинических условиях в ситуации с пораженией центральной нервной системы, нарушениями других тканей, у которых нормальная дифференцировка или миграция нарушены, диспластическими нарушениями и другими нарушениями, если данный подход является полезным.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), соответствующие одному гену или его сегменту (в частности, упоминаемые в этом документе, открытые по описанным в этом документе способам, открытые по другим опубликованным способам; и/или известные как способные инициировать требуемый вид дифференцировки), - это единственная нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты) или белок (белки), которые сверхэкспрессируются и/или которые вводят для инициации дифференцировки у выбранных клеток.

В отдельном предпочтительном варианте вместе с нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми кислотами) или белком (белками), которые соответствуют отдельному гену или его сегменту (в частности, упоминаемые в этом документе, открытые по описанным в этом документе способам, открытые по другим опубликованным способам; и/или известные как способные инициировать требуемый вид дифференцировки), можно использовать другую нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты) или белок (белки) до тех пор, пока из выбранных клеток не будет получена популяция дифференцирующихся клеток, а используемым способом является электропорация, липосомы, нанокапсулы, нанохранилища и/или другой подход, который позволяет избежать ретровирусной/лентивирусной интеграции или другого случайного изменения генома клетки.

Аналогично, следует понимать, что описанные в настоящем документе (или в любом другом месте) способы инициации дифференцировки применимы к любым индуцированным или неиндуцированным мультипотентным, плюрипотентным или самообновляющимся стволовым клеткам или другим выбранным клеткам, а не только к клеткам, полученным описанным в данном документе способом.

Источники выбранных клеток

Популяция выбранных клеток может происходить от различных стволовых клеток, клеток-предшественников или соматических клеток. Однако, в частности, исключение составляют соматические клетки, не имеющие ядра (например, зрелые эритроциты человека). Выбранные стволовые клетки могут быть получены от существующих линий клеток или выделены из хранящихся, находящихся в банке или криоконсервированных источников. Типичные источники стволовых клеток включают костный мозг, периферическую кровь, плацентарную кровь, амниотическую жидкость (например, De Coppi et al., 2007), пуповинную кровь (например, Zhao, et al., 2006; Tian et al., 2007), жировую ткань (например, Gimble et al., 2007; Ma et al., 2007), эмбрионы животных (за исключением человека) и другие клетки. Подобным образом можно выбрать циркулирующие лейкоциты и другие нестволовые клетки и поместить в такие условия, которые описаны выше, эффективные для приобретения клетками, таким образом, мультипотентности, плюрипотентности и/или способности к самообновлению. Примеры других доступных соматических клеток, которые могут использоваться в этом изобретении, включают лимфоциты и эпителиальные (например, буккального эпителия внутренней стороны щеки) клетки. Выделение и сбор клеток, выбранных для применения в рамках настоящего изобретения, можно проводить любым способом, известным в данной области техники.

В вариантах осуществления на животных столовые клетки, выделенные из предстательной железы, яичек, мозга эмбриона и кишечника, также раскрываются как предпочтительные источники выбранных клеток.

В предпочтительном варианте осуществления выбранные клетки и/или их потомство культивируют в трехмерном формате.

Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение клеток для применения при получении совместимых с пациентом и специфичных для пациента тканей и органов для трансплантации пациентам, признанных нуждающимися в таких органах и тканях. В настоящем документе раскрывается, что плюрипотентные, мультипотентные и/или дифференцирующиеся клетки, полученные по описанным в данном документе способам (или похожим способам), используют в сочетании с методиками, направленными на получение таких органов и/или тканей (например, Boland et al., 2006. Xu et al., 2006; Campbell and Weiss, 2007). Такое использование, в частности, охватывается настоящим изобретением.

Например, плюрипотентные, мультипотентные и/или

дифференцирующиеся клетки, полученные или обработанные по описанным в данном документе способам (или другим опубликованным способам), можно выращивать с использованием двухмерных или трехмерных каркасов, сконструированных так, чтобы они повторяли нормальную структуру ткани и/или органа (например, Yarlagada et al., 2005; Kim et al, 1998; WO/2003/070084; EP1482871; WO03070084; патенты США 2395698; 7297540; 6995013; 6800753; Isenberg et al., 2006).

Аналогично, каркасы, на которые должны заселяться плюрипотентные, мультипотентные и/или дифференцирующиеся клетки, можно получить из трупного органа (органов) или ткани (тканей), после этого трупные органы и ткани (например, кости, сердце, почки, печень, легкие и т.д.) можно обработать таким образом, чтобы удалить иммунные клетки организма, находящихся в этих тканях, а также другие нежелательные или вспомогательные клетки хозяина (например, с помощью ионизирующего облучения, стерилизации (например, Mroz et al., 2006) и/или различных способов удаления клеток (патенты Соединенных Штатов 6734018; 6962814; 6479064; 6376244; патенты США 5032508; 4902508; 4956178; 5281422, 5554389; 6099567; и 6206931; 4361552 и 6576618; 6753181; заявка на патент США с серийным номером 11/162715; WO/2001/048153; WO/2002/024244; WO 003002165; WO/2001/049210; WO/2007/025233; Европейские патенты EP1482871; ЕР1246903; ЕР1244396; ЕР0987998; ЕР1244396; ЕР1333870; Rieder et al., 2004; Ott et al., 2008; Taylor et al., 1998)).

Подобным образом ожидается, что плюрипотентные, мультипотентные и/или дифференцирующиеся клетки настоящего изобретения можно использовать в областях применений с использованием «струйной печати» в целях тканевой инженерии (например, Boland et al., 2006. Xu et al., 2006; Campbell et al., 2007). Следовательно, такое применение клеток, полученных или обработанных в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, является охваченным.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения выбранные клетки и/или их потомство культивируют в висячих каплях.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, выбранные клетки можно предварительно генетически модифицировать.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, выбранные клетки можно модифицировать с помощью ДНК или РНК, кодирующих белок (белки) или полипептид (полипептиды), которые способствуют дифференцировке клетки в требуемую популяцию клеток.

Скрининг популяций клеток

В одном варианте осуществления способы данного изобретения включают скрининг клеток из линий клеток, донорских источников, пуповинной крови и аутологичного или донорского костного мозга, крови, сперматогониев, первичных половых клеток, клеток буккального эпителия внутренней стороны щеки или любых других источников клеток, пригодных в настоящем изобретении. Выбранные клетки можно подвергнуть скринингу для подтверждения успешной трансфекции полезной последовательностью (полезными последовательностями) или терапевтическим вектором (терапевтическими векторами), а также успешной инициации дифференцировки с помощью любого известного в данной области способа (Guan et al., 2006; патент США 6432711). В некоторых вариантах осуществления клетки подвергают скринингу с помощью стандартных способов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот и ПЦР, или с помощью способов быстрого типирования. В предпочтительных вариантах осуществления клетки подвергают скринингу в отношении экспрессии генов-репортеров. В некоторых вариантах осуществления клетки подергают скринингу по экспрессии маркерного гена, кодируемого вектором (векторами), экспрессирующим трансгены, такого как ген устойчивости к антибиотикам или ген флуоресцентного белка (например, GFP).

Скрининг на терапевтические векторы и полезные последовательности

Клетки можно подвергнуть скринингу на присутствие полезной последовательности (полезных последовательностей) и терапевтического вектора (терапевтических векторов) с помощью любого способа (любых способов), известного (известных) в данной области техники для определения специфических последовательностей. Каждый образец клеток можно одновременно подвергать скринингу на ряд последовательностей. Альтернативно, можно одновременно проводить скрининг множества образцов.

Клеточную дифференцировку можно отслеживать несколькими способами: включая (i) морфологическую оценку, (ii) использование полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), нозерн-блоттинг или методики с микрочипами для отслеживания изменений экспрессии генов, (iii) анализ клеточной экспрессии специфических маркеров, таких как бета-тубулин III (для нейронов) и т.д. (Ozawa, et al., 1985). В некоторых вариантах осуществления клетки подвергают скринингу на успешную инициацию дифференцировки с помощью флуоресцентно-активированного сортинга клеток (FACS) на основе экспрессии специфических для данного типа клеток маркеров или трансгенных маркеров (например, экспрессии белка устойчивости к антибиотикам или флуоресцентного белка) под контролем промоторов, специфических для клеток данного типа, таких как миозиновый промотор в мышечных клетках; промотор человеческого сердечного α-актина в кардиомиоцитах; инсулиновый промотор в клетках, продуцирующих инсулин; промотор нейрон-специфической енолазы (NSE) для дифференцировки в нейроны или промоторы, связанные с нейромедиаторами, такие как промотор тирозин-гидроксилазы у дофаминергических нейронов; и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления клетки подвергают скринингу с помощью стандартных способов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот и ПЦР. В частном предпочтительном варианте осуществления клетки подвергают скринингу с помощью способов быстрого типирования.

Скрининг на типы общих антигенов лейкоцитов (HLA)

В определенных вариантах осуществления выбранные клетки отбирают на основании совместимости при HLA-типировании. Генотип HLA можно определить любыми известными специалистам в данной области способами.

Клетки, используемые для скрининга, могут включать клетки, взятые непосредственно от донора, или из линий клеток, созданных из донорных клеток, или других применимых источников клеток. Клетки можно подвергнуть скринингу на полезную последовательность (полезные последовательности) и/или терапевтический вектор (терапевтические векторы), а также HLA-тип одновременно или по отдельности. Те клетки, которые успешно трансфицированы полезной последовательностью и проявляют соответствующий генотип HLA, можно подготовить для трансплантации пациенту.

В определенных вариантах осуществления трансфицированные клетки трансплантируют без HLA-типирования. В других вариантах осуществления клетки подвергают HLA-типированию на предмет совместимости.

Скрининг на средства, способствующие проявлению клеточного фенотипа

Настоящее изобретение также предусматривает способы скрининга белков и средств на их способность индуцировать фенотипические изменения или дифференцировку выбранных клеток и/или их потомства в требуемые популяции клеток. Коротко, векторы, кодирующие комплементарные ДНК (кДНК) из соответствующих библиотек кДНК, трансфицируют в выбранные клетки и/или их потомство. После идентификации специфической кДНК, которая индуцирует дифференцировку или другие фенотипические изменения, такую кДНК можно выделить и клонировать в соответствующий вектор экспрессии для продуцирования белка в соответствующих клетках (например, клетках COS) in vitro. Затем супернатант, содержащий белок, можно вносить в культуры выбранных клеток для определения того, индуцируют ли дифференцировку какие-либо секретируемые белки из таких клеток. С другой стороны, в культуры выбранных клеток можно вносить предполагаемые средства для определения того, индуцируют ли дифференцировку какие-либо секретируемые белки из таких клеток (см. патент США 6432711).

Настоящее изобретение также предусматривает способы скрининга нуклеиновых кислот на их способность индуцировать мультипотентность, плюрипотентность и/или самообновление, или инициировать дифференцировку выбранных клеток и/или их потомства. В этих способах векторы, кодирующие выбранные кДНК (или кДНК из соответствующих библиотек кДНК, или другие последовательности), вводят в выбранные клетки и/или их потомство с использованием электропорации, нанокапсул, нанохранилищ, липосом, ретровирусов, лентивирусов и/или любых других возможных средств трансфекции. После идентификации специфической кДНК, которая индуцирует фенотипические изменения, мультипотентность, плюрипотентность и/или способность к самообновлению, такую кДНК можно выделить и клонировать в соответствующий вектор экспрессии. Анализы определения таких изменений включают описанные в тексте данной заявке.

Также белок, соответствующий идентифицированной кДНК, можно продуцировать в соответствующих клетках (например, клетках COS) in vitro, для определения того, можно ли супернатант, содержащий белок, вносить в культуры выбранных клеток и может ли она индуцировать изменения.

Наконец, белки можно вводить в выбранные клетки и/или их потомства с помощью электропорации, нанокапсул, нанохранилищ, липосом, ретровирусов, лентивирусов и/или других возможных средств трансфекции, а полученные клетки можно оценить, как описано в настоящем документе, на мультипотентность, плюрипотентность, способность к самообновлению или инициацию дифференцировки.

Трансплантация клеток пациентам

После скрининга выбранные клетки и/или их потомство можно подвергнуть криоконсервации, сохранять в виде линий клеток в культуре или ввести пациенту. Выбранные клетки можно подвергнуть криоконсервации или сохранять в культуре с помощью любых средств, известных в данной области техники, и хранить для будущих процедур трансплантации.

Предпочтительно, клетки, которые необходимо подвергать скринингу, получают из доступных источников, позволяющих легкий сбор.

Касательно получения клеток, устойчивых к ВИЧ: целевые соматические и стволовые клетки данного изобретения могут быть клетками любого типа, способными к дифференцировке в клетки, которые могут инфицироваться ВИЧ, которые могут поддерживать транскрипцию и/или репликацию ВИЧ, которые могут изменять иммунный ответ на ВИЧ или которые могут тормозить прогрессирование в СПИД. Такие стволовые клетки включают, но без ограничений, плюрипотентные клетки, полученные из сперматогониев, первичные половые клетки, стволовые кроветворные клетки, клетки периферической крови, клетки плацентарной крови, клетки амниотической жидкости, клетки пуповинной крови, клетки буккального эпителия внутренней стороны щеки, клетки жировой ткани (в том числе стволовые клетки, полученные из этих тканей), перепрограммированные клетки, индуцированные мультипотентные клетки, индуцированные плюрипотентные клетки и т.д., эмбрионы животных (за исключением человека) и/или любой другой тип клеток, которые могут образовывать гемоциты и иммуноциты, клетки-мишени ВИЧ и другие клетки.

Терапевтический вектор (терапевтические векторы) экспрессирует «полезную последовательность (полезные последовательности)», предназначенную для превращения трансфицированных или инфицированных клеток в менее способные к поддержанию репликации и транскрипции ВИЧ. Генетические векторы, экспрессирующие «полезную последовательность (полезные последовательности)», а также любой вирус, полученный из такого генетического вектора, называются в настоящем документе «терапевтический вектор».

После скрининга клетки, трансфицированные требуемым терапевтическим вектором (терапевтическими векторами) и экспрессирующие полезную последовательность (с или без совместимого генотипа HLA), можно наращивать ex vivo (in vivo) посредством стандартных способов культивирования делящихся клеток и поддерживать в виде стабильных линий клеток (патенты США 6432711 и 5453357, включенные в настоящий документ посредством ссылки). С другой стороны, эти клетки можно ввести пациенту и наращивать in vivo.

Выбранные клетки можно подвергнуть криоконсервации с помощью любых средств, известных в данной области техники, и хранить для будущих процедур трансплантации.

Трансплантация требуемых популяций клеток пациентам

В определенных вариантах осуществления популяции клеток перед трансплантацией обогащают стволовыми клетками. В данной области техники хорошо известны различные способы отбора стволовых клеток. Например, образцы клеток можно обогатить с помощью моноклональных антител с флуоресцентными метками, которые распознают маркеры клеточной поверхности недифференцированных кроветворных стволовых клеток (например, CD34, CD59, Thyl, CD38 low, C-kit low, lin-minus) для проведения сортинга посредством флуоресцентно-активированного сортинга клеток (FACS).

В других вариантах осуществления образец выбранных клеток трансплантируют без обогащения.

В некоторых вариантах осуществления перед трансплантацией терапевтических стволовых клеток уменьшают количество или устраняют эндогенные стволовые клетки костного мозга. Терапевтические стволовые клетки определяют как такие стволовые клетки, которые содержат полезную последовательность (полезные последовательности) или терапевтический вектор (терапевтические векторы).

В некоторых вариантах осуществления процесс трансплантации может включать следующие фазы: (1) кондиционирование, (2) инфузия стволовых клеток, (3) нейтропеническая фаза, (4) фаза приживления трансплантата и (5) период после приживления трансплантата.

В некоторых вариантах осуществления перед трансплантацией уменьшают количество или устраняют эндогенные стволовые клетки, которые в норме образуют требуемые клетки (например, стволовые клетки костного мозга). Для обработки костного мозга для надлежащего приживления трансплантата можно применять химиотерапию, облучение и т.д. и/или способы, аналогичные описанным в патенте США 6217867. Наконец, терапевтические стволовые клетки можно трансплантировать пациенту с использованием любого известного в данной области техники способа.

Конструирование векторов, кодирующих Numb, Numblike и другие трансгены

В одном варианте осуществления трансфекцию последовательностью (последовательностями) нуклеиновых кислот, кодирующей изоформу (изоформы) numb/numblike, выполняют посредством вирусной трансфекции. Выражение «вектор (векторы), кодирующий Numb/Numblike» относится к векторам, включающим последовательность (последовательности) нуклеиновых кислот, кодирующей изоформу (изоформы) numb/numblike и/или искусственные олигонуклеотиды, целенаправленно воздействующие на изоформы numb или numblike, а также любые дополнительные последовательности трансгенов, искусственные олигонуклеотиды и т.д. и любой супернатант, связанный с вирусными компонентами, введенными в эти векторные последовательности.

Вектор (векторы), кодирующий Numb/Numblike, может включать вектор экспрессии. Соответствующие векторы экспрессии - это векторы, которые можно использовать для трансфекции ДНК или РНК в эукариотические клетки. К таким векторам относятся, прокариотические векторы, такие как, например, бактериальные векторы; эукариотические векторы, такие как, например, дрожжевые векторы или векторы на основе грибов; а также векторы на основе вирусов, такие как, но без ограничений, векторы на основе аденовирусов, векторы на основе аденоассоциированных вирусов и векторы на основе ретровирусов. Примеры векторов на основе ретровирусов, которые можно использовать, включают, но без ограничений, векторы, полученные на основе вируса лейкоза мышей Молони [Moloney], вируса саркомы мышей [Moloney], вируса саркомы Рауса [Rous], FIV (вирус иммунодефицита кошек), HIV (ВИЧ), SIV (вирус иммунодефицита обезьян, ВИО) и гибридные векторы.

Раскрывается, что вектор (векторы), кодирующий Numb/Numblike, можно применять для трансфекции клеток in vitro и/или in vivo. Трансфекцию можно осуществить с помощью любых известных в данной области техники средств, в частности с помощью вируса, полученного из клеток, пакующих вирусы. Такой вирус может быть заключен в капсид с тем, чтобы оставаться способным инфицировать различные типы клеток. Тем не менее, любая методика на основе заключения в капсид, позволяющая инфицировать выбранные типы клеток и/или их потомство, практически осуществима в контексте данного изобретения.

Конструирование генотерапевтического вектора (генотерапевтических векторов) для вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)

«Терапевтический вектор (терапевтические векторы)» может включать вектор экспрессии. Соответствующие векторы экспрессии - это векторы, которые можно использовать для трансфекции ДНК или РНК в эукариотические клетки. Такие векторы включают прокариотические векторы, такие как, например, бактериальные векторы; эукариотические векторы, такие как, например, дрожжевые векторы или векторы на основе грибов; а также векторы на основе вирусов, такие как, но без ограничений, векторы на основе аденовирусов, векторы на основе аденоассоциированных вирусов и векторы на основе ретровирусов. Примеры векторов на основе ретровирусов, которые можно использовать, включают, но без ограничений, векторы, полученные на основе вируса лейкоза мышей Молони [Moloney], вируса саркомы мышей [Moloney], вируса саркомы Рауса [Rous], FIV (вирус иммунодефицита кошек), HIV (ВИЧ), SIV (вирус иммунодефицита обезьян, ВИО) и гибридные векторы.

В настоящем изобретении раскрывается, что терапевтический вектор (терапевтические векторы) можно использовать для трансфекции клеток-мишеней in vitro и/или in vivo. Трансфекцию можно осуществить с помощью любых известных в данной области техники средств, в частности с помощью вируса, полученного из клеток, пакующих вирусы. Такой вирус может быть заключен в капсид с тем, чтобы оставаться способным инфицировать CD34+ клетки и/или CD4+ клетки. Однако, в некоторых случаях трансфицируют другие типы клеток без участия белков CD4 или CD34. Тем не менее, любая методика заключения в капсид, позволяющая инфицирование таких типов клеток, таким образом, может быть включена в раскрытие настоящего изобретения.

Псевдотипирование различными белками оболочки расширяет перечень клеток-хозяев, подвергающихся трансдукции с помощью векторов на основе вирусов и терапевтических векторов, и позволяет сконцентрировать вирус до высоких титров, в частности при псевдотипировании гликопротеином оболочки вируса везикулярного стоматита (VSV-G) (Li et al., 1998; Reiser et al., 2000).

Векторная конструкция

В данном изобретении используемые векторы на основе вирусов могут быть различных типов, в том числе гибридными векторами. Например, векторами могут быть векторы на основе лентивирусов третьего поколения, которые могут включать лишь малую часть нативного генома (Zufferey et al., 1998). Получение вектора (векторов), кодирующего (кодирующих) трансгены, также может включать самоинактивацию транспортных векторов (Zufferey et al., 1998; Miyoshi et al., 1998), исключая образование полноценной векторной РНК после инфицирования клеток-мишеней.

Можно использовать векторы на основе вирусов, не способные реплицироваться вследствие нарушения экспрессии определенных вирусных белков, необходимых для нормальной репликации. Однако, существует возможность того, что вспомогательный вирус может запустить репликацию терапевтического вируса. Вероятность такого явления можно снизить путем применения самоинактивирующихся векторов.

В предпочтительном варианте осуществления трансгенные последовательности управляются убиквитиновым промотором, промотором U6, промотором EF-1 альфа, промотором CMV, регулируемыми промоторами и/или промоторами, специфическими для требуемого типа клеток.

Вирусный тропизм

В предпочтительном варианте осуществления вирус, полученный на основе вектора (векторов), кодирующего изоформы Numb/Numblike, терапевтического вектора (терапевтических векторов) и/или другого трансгенного вектора (других трансгенных векторов) этого изобретения, псевдотипируют гликопротеином оболочки вируса везикулярного стоматита для концентрирования вируса до высоких титров и облегчения инфицирования CD34+ клеток.

Выбор последовательности

Применение любой последовательности с 70% или большей идентичностью (или комплементарностью) к любой последовательности, имеющей отношение к последовательности NUMB или Numblike (с возможностью поиска с помощью базы данных Entrez-Pubmed), охватывается данным изобретением при условии использования в соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение также частично имеет отношение к генетическому вектору, который включает в себя последовательности, способные значительно уменьшать восприимчивость клеток млекопитающих к инфицированию вирусами ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (оба в данном документе именуются как ВИЧ).

Настоящее изобретение раскрывает новую комбинацию искусственных олигонуклеотидов для уменьшения экспрессии генов, ключевых для ВИЧ/механизма заболевания СПИД.

Целесообразность комбинирования искусственных олигонуклеотидов для осуществления "нок-дауна" корецептора посредством экспрессии последовательностей TAR (трансактивируемые регуляторные элементы)- и RRE (Rev-чувствительные регуляторные элементы)-ловушек вытекает из представленного в данном документе утверждения, что терапевтические подходы на основе комбинирования множества генов, осуществляющие одновременно целевое воздействие на 1) инфицирование ВИЧ, 2) транскрипцию ВИЧ и 3) репликацию ВИЧ у отдельных клеток, вероятно, дадут лучшие терапевтические эффекты, чем любой из этих подходов по отдельности.

Терапевтический вектор (терапевтические векторы) экспрессирует "полезную последовательность (полезные последовательности)", предназначенную для превращения трансфицированных или инфицированных клеток в менее способные к поддержанию репликации и транскрипции ВИЧ. Генетический вектор, экспрессирующий "полезную последовательность (полезные последовательности)", а также любой вирус, полученный от такого генетического вектора, в данном документе обозначается выражением "терапевтический вектор".

Данное изобретение отчасти направлено на генетическую модификацию клеток, восприимчивых к инфицированию ВИЧ или способных размножать ВИЧ. Такие клетки в данном документе обозначаются выражением "клетки-мишени".

Настоящее изобретение предлагает композицию и способ применения терапевтических векторов на основе вирусов с целью уменьшения восприимчивости зрелых или незрелых клеток-мишеней, лейкоцитов, гемоцитов, любых стволовых клеток/клеток-предшественников и/или их потомства к инфицированию ВИЧ.

Из этого следует, что настоящее изобретение также предлагает композицию и способ применения терапевтических векторов на основе вирусов с целью уменьшения восприимчивости перепрограммированных клеток, индуцированных мультипотентных клеток, индуцированных плюрипотентных клеток и/или их потомства к инфицированию ВИЧ.

Дальнейшей целью данного изобретения является уменьшение способности зрелых или незрелых клеток-мишеней, стволовых клеток/клеток-предшественников (включая перепрограммированные клетки, индуцированные мультипотентные клетки, индуцированные плюрипотентные клетки) и/или их потомства к поддержанию репликации и транскрипции вируса иммуннодефицита.

Другой целью данного изобретения является достижение эффективной, долгосрочной экспрессии терапевтических последовательностей в зрелых или незрелых клетках-мишенях, других покоящихся клетках, в стволовых клетках/клетках-предшественниках и/или их потомстве.

В одном аспекте данное изобретение представляет способ предупреждения или лечения ВИЧ-инфекции. Способ включает трансплантацию стволовых клеток, трансфицированных терапевтическим вектором (терапевтическими векторами) или последовательностью (последовательностями), пациентам с ВИЧ-инфекцией.

Полезная последовательность (полезные последовательности) может (могут) быть последовательностями, которые уменьшают способность ВИЧ к инфицированию клетки, транскрибированию вирусной ДНК или репликации в пределах инфицированной клетки, или последовательностью, которая усиливает способность клетки нейтрализовывать ВИЧ-инфекцию.

В определенных вариантах осуществления полезная последовательность (полезные последовательности) представляет (представляют) собой искусственный олигонуклеотид (искусственные олигонуклеотиды), который (которые) препятствует (препятствуют) проникновению ВИЧ, включая миРНК, shRNA, антисмысловую РНК или микроРНК, направленные против любого из корецепторов ВИЧ (включая, но не ограничиваясь CXCR4, CCR5, CCR2b, CCR3 и CCR1).

В предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор (терапевтические векторы) включает (включают) в себя искусственные олигонуклеотиды, целенаправленно воздействующие на один или несколько корецепторов ВИЧ, включая CXCR4, CCR5, CCR1, CCR2, CCR3, CXCR6 и/или BOB.

В другом предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор (терапевтические векторы) включает (включают) в себя искусственные олигонуклеотиды, целенаправленно воздействующие на главные корецепторы ВИЧ - CXCR4 и CCR5

В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор (терапевтические векторы) включает (включают) в себя искусственные олигонуклеотиды, целенаправленно воздействующие на один или несколько ферментов ВИЧ, такие как обратная транскриптаза, интеграза и протеаза ВИЧ.

Подходящими последовательностями для искусственных олигонуклеотидов являются последовательности, 1) прогнозируемые компьютерными алгоритмами как эффективные в уменьшении целевых последовательностей, и 2) способные к успешному уменьшению количества целевого фермента на >70% в стандартных количественных исследованиях РНК и в исследованиях ферментативной активности или до степени, ниже терапевтической.

Фраза "целевая последовательность" указывает на то, что у конкретной последовательности есть последовательность нуклеотидных оснований, обладающая по меньшей мере 70% идентичностью к вирусной геномной нуклеотидной последовательности или ее комплементарной цепи (например, такой же как она сама или комплементарной к такой вирусной геномной последовательности), или соответствующая последовательность РНК. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения данное выражение указывает на то, что последовательность по меньшей мере на 70% идентична вирусной геномной последовательности конкретного вируса, против которого направлен олигонуклеотид, или его комплементарной последовательности.

Любой из многочисленных типов искусственных олигонуклеотидов может быть экпрессирован в результате трансфекции терапевтического вектора, и настоящее изобретение направлено на все возможные комбинации таких олигонуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления последовательности искусственных олигонуклеотидов управляются клеткой-мишенью, специфическим промотором (специфическими промоторами).

В другом предпочтительном варианте осуществления последовательности искусственных олигонуклеотидов управляются промотором (промоторами) U6.

Искусственные олигонуклеотиды подобным же образом могут быть включены в тот же самый терапевтический вектор (терапевтические векторы) с РНК-ловушкой.

РНК-ловушка

РНК-ловушки являются последовательностями РНК, которые эффективны в связывании с определенными белками и ингибировании их функции.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор (терапевтические векторы) включает (включают) в себя множество последовательностей РНК-ловушек.

В дальнейшем варианте осуществления последовательности РНК-ловушек фланкируются последовательностями, обеспечивающими стабильность последовательности ловушки.

В другом предпочтительном варианте осуществления последовательности РНК-ловушек являются последовательностями RRE- и/или TAR-ловушек.

В предпочтительном варианте осуществления последовательности RRE- и TAR-ловушек являются последовательностями TAR и RRE, полученными из ВИЧ-2.

В другом предпочтительном варианте осуществления последовательности ловушек также включают в себя последовательности ловушек-элементов Psi.

В предпочтительном варианте осуществления каждая из последовательностей ловушек находятся под управлением промотора U6.

В другом предпочтительном варианте осуществления последовательности ловушек находятся под управлением специфических для клеток-мишеней промоторов.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор целенаправленно воздействует на множество стадий жизненного цикла ВИЧ, кодируя искусственную нуклеотидную последовательность (искусственные нуклеотидные последовательности) в комбинации с последовательностями TAR- и/или RRE-ловушек ВИЧ-2.

В другом предпочтительном варианте осуществления вектор включает в себя последовательности олигонуклеотидов микроРНК.

В другом предпочтительном варианте осуществления вектор включает в себя последовательности олигонуклеотидов shRNA.

В другом предпочтительном варианте осуществления вектор включает в себя последовательности олигонуклеотидов миРНК.

В другом предпочтительном варианте осуществления вектор включает в себя последовательности олигонуклеотидов для РНК-интерференции.

В другом предпочтительном варианте осуществления вектор включает в себя последовательности рибозимов.

В другом предпочтительном варианте осуществления вектор включает в себя комбинацию классов искусственных олигонуклеотидов.

В дальнейшем варианте осуществления последовательности искусственных нуклеотидов целенаправленно взаимодействуют с корецепторами ВИЧ, такими как CCR5, CXCR4 и т.д.

В дальнейшем варианте осуществления последовательности искусственных нуклеотидов целенаправленно воздействуют на такие ферменты ВИЧ, как интеграза, протеаза, обратная транскриптаза, TAT и т.д.

В дальнейшем варианте осуществления последовательности рибозимов целенаправленно взаимодействуют с такими корецепторами ВИЧ, как CCR5, CXCR4 и т.д. или такими ферментами ВИЧ, как интеграза, протеаза, обратная транскриптаза, TAT и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления вирус создают с помощью терапевтического вектора (терапевтических векторов) и вирус является псевдотипированным.

В предпочтительном варианте осуществления вирус создают с помощью терапевтического вектора (терапевтических векторов), и вирус не является псевдотипированным, и данный вирус демонстрирует изначально присущий ВИЧ-тропизм.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор (терапевтические векторы) является (являются) вектором на основе вируса.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор (терапевтические векторы) является (являются) вектором на основе лентивируса.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор (терапевтические векторы) является (являются) вектором на основе лентивируса третьего поколения.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор (терапевтические векторы) включает (включают) комбинацию классов искусственных олигонуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления экспрессия искусственных нуклеотидных последовательностей находится под управлением промотора EF-1 альфа или других, соответствующих для клеток-мишеней промоторов.

В предпочтительном варианте осуществления экспрессия искусственных нуклеотидных последовательностей находится под управлением промотора U6 или других, соответствующих для клеток-мишеней промоторов.

В предпочтительном варианте осуществления экспрессия искусственных нуклеотидных последовательностей находится под управлением комбинации промотора EF-1 альфа и промотора U6 и/или других, соответствующих для клеток-мишеней промоторов.

В предпочтительном варианте осуществления EF-1 альфа управляет экспрессией микроРНК, в то время как промотор U6 управляет экспрессией РНК-ловушки.

В предпочтительном варианте осуществления EF-1 альфа управляет экспрессией миРНК, в то время как промотор U6 управляет экспрессией РНК-ловушки.

В предпочтительном варианте осуществления EF-1 альфа управляет экспрессией shRNA, в то время как промотор U6 управляет экспрессией РНК-ловушки.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор (терапевтические векторы) включает (включают) в себя множество последовательностей микроРНК, направленных против CXCR4, множество последовательностей микроРНК, направленных против CCR5, последовательность RRE-ловушки ВИЧ-2 и последовательность TAR-ловушки ВИЧ-2, и вектор является вектором на основе вируса.

В предпочтительном варианте осуществления лечение с включением терапевтического вектора (терапевтических векторов) комбинируют с другими методами лечения против ретровирусов, включая фармакотерапии. Фармакотерапии против ретровирусов, подходящие для комбинирования с терапевтическим вектором (терапевтическими векторами), являются такими, которые обладают аддитивными или синергическими эффектами в комбинации с терапевтическим вектором.

Целевые клетки для генной терапии при ВИЧ могут включать, но не обязательно ограничиваться ими, зрелые Т-лимфоциты периферической крови, моноциты, тканевые макрофаги, предшественники Т-клеток, клетки-предшественники макрофагов-моноцитов и/или мультипотентные кроветворные стволовые клетки, такие как клетки, обнаруживаемые в пуповинной крови, периферической крови и занимающие участки костного мозга.

Настоящее изобретение также относится к трансфекции CD4+ Т-клеток, макрофагов, предшественников Т-клеток, предшественников макрофагов-моноцитов, CD34+ стволовых клеток/клеток-предшественников и/или любой другой покоящейся клетки, делящейся клетки, стволовой клетки или клетки-предшественника, способных к дифференцировке in vitro или in vivo в клетки-мишени для ВИЧ, CD4+ Т-клетки, макрофаги, предшественники Т-клеток, предшественники макрофагов-моноцитов и/или CD34+ стволовые клетки/клетки-предшественники. Трансфицированные клетки, таким образом, могут быть эндогенными клетками in situ или экзогенными клетками, полученными из других частей организма или даже от других индивидуумов-доноров. Клетки, выбранные с этой целью, в данном тексте обозначаются выражением "выбранные клетки".

Подобным же образом самообновляющиеся, мультипотентные и/или плюрипотентные стволовые клетки (включая перепрограммированные и индуцированные плюрипотентные клетки) представляют другую логичную цель для генной терапии ВИЧ, и данное изобретение, в частности, охватывает их применение.

В одном варианте осуществления этого процесса выбранные клетки (например, кроветворные стволовые клетки, стволовые клетки кожи, клетки пуповины, первичные половые клетки (PGC), сперматогонии, любая доступная соматическая клетка и т.д.) 1) размножают в культуре с использованием одного или нескольких цитокинов, таких как фактор стволовых клеток, фактор, ингибирующий лейкоз (LIF), кардиотропин-1, IL-11, IL-6, IL-6 R, GP-130, CNTF, IGF-I, bFGF и/или онкостатин-М, и 2) трансфицируют терапевтическим вектором (терапевтическими векторами) или полезной последовательностью (полезными последовательностями) до дифференцировки с использованием любых известных в данной области техники способов, таких как способы, описываемые в патенте США 5677139, который включен в данный документ по ссылке, или посредством способов, аналогичных описываемым в патенте США 5677139 касательно других клеток-мишеней.

В отдельных вариантах осуществления перед трансфекцией может потребоваться осуществление различных этапов.

В отдельных вариантах осуществления с целью создания популяций плюрипотентных стволовых клеток может потребоваться выполнение только этапов инкубирования, указанных выше.

Соответствующие концентрации LIF и фактора стволовых клеток для размножения/пролиферации стволовых клеток/клеток-предшественников, а также другие условия культивирования клеток были описаны ранее (например, патенты США 6432711 и 5453357, включенные в данный документ по ссылке). Другие соответствующие протоколы и стандартные концентрации цитокинов были изложены Koshimizu et al., 1996; Keller et al., 1996; Piquet-Pellorce, 1994; Rose et al., 1994; Park and Han, 2000; Guan et al., 2006; Dykstra et al., 2006).

Популяция клеток-мишеней может включать соматические клетки, стволовые клетки и клетки-предшественники. Стволовые клетки могут быть получены из существующих линий клеток или выделены из сохраненных, находящихся в банке или криоконсервированных источников. Типичные источники стволовых клеток включают костный мозг, периферическую кровь, плацентарную кровь, амниотическую жидкость, пуповинную кровь, жировую ткань, эмбрионы животных (за исключением человека) и т.д.

Соматические клетки, в частности циркулирующие лейкоциты и другие клетки, не являющиеся клетками-предшественниками/стволовыми клетками, можно также поместить в те же самые условия культивирования, как описано выше для стволовых клеток/клеток-предшественников, эффективные для того, чтобы в результате они приобрели свойства стволовых клеток/клеток-предшественников.

Изобретение также раскрывает получение (например, заявка на патент США 20030099621) клеток-мишеней из стволовых клеток/клеток-предшественников, которые можно сделать относительно устойчивыми к инфицированию ВИЧ и/или репликации ВИЧ.

Тем не менее, подразумевается, что любой способ дифференцировки ранее размноженных стволовых клеток/клеток-предшественников/лейкоцитов в требуемые клетки-мишени можно использовать в рамках объема данного изобретения до тех пор, пока не будут получены функциональные клетки-мишени, относительно устойчивые к инфицированию ВИЧ, и/или репликации ВИЧ, и/или транскрипции ВИЧ.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор на основе вируса упаковывается одним или несколькими белками оболочки нативных вирусов ВИЧ, придающих терапевтическому вирусу способность инфицировать любую клетку, которую способны инфицировать нативные штаммы ВИЧ.

Клетки, выбранные для применения в данном изобретении, в некоторых случаях будут доступны (например, стволовые клетки пуповины, стволовые клетки костного мозга, сперматогонии и первичные половые клетки яичка, стволовые клетки, выделенные от амниотической жидкости, стволовые клетки, выделенные из кожи, и т.д.). Такие клетки можно выделить из тканей, в которых они находятся, любыми известными в данной области техники средствами.

Другие выбранные клетки могут включать перепрограммированные клетки, индуцированные мультипотентные клетки, индуцированные плюрипотентные клетки и т.д.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения приводится способ получения требуемой линии клеток, типа клеток или класса клеток из выбранных клеток. В целом, способ включает культивирование выбранных клеток и/или их потомства в условиях, стимулирующих рост выбранных клеток с оптимальной скоростью роста. Получаемую в результате популяцию клеток затем культивируют в условиях, стимулирующих клеточный рост при скорости, которая обычно меньше оптимальной скорости, и в присутствии средства, стимулирующего дифференцировку клеток в требуемую линию клеток, тип клеток или класс клеток (например, CD4+ Т-клетки).

Настоящее изобретение также раскрывает размножение выбранных клеток и/или их потомства в культуре до или после трансфекции терапевтическим вектором любыми известными в данной области техники средствами (например, заявка на патент США 20060099177). Такие способы также включают инкубацию с LIF, фактором стволовых клеток, IL-6, IL-7, онкостатином-М и/или кардиотропином-1 и другими цитокинами, усиливающими рост, и т.д.

Настоящее изобретение далее раскрывает направленную дифференцировку клеток, трансфицированных терапевтическим вектором (терапевтическими векторами), в требуемые типы клеток посредством дальнейшей инкубации в средах, содержащих соответствующие цитокины и факторы роста, такие как колониестимулирующие факторы, такие как M-CSF (CSF-1), GM-CSF, IL-7, любой цитокин, стимулирующий дифференцировку CD4+ Т-клеток, и т.д.

Трансфекция

Генетическая модификация выбранных клеток и клеток-мишеней, будь то экзогенные клетки или эндогенные клетки, может быть выполнена согласно любому опубликованному или неопубликованному способу, известному в данной области техники (например, патенты США №№6432711, 05593875, 05783566, 5928944, 05910488, 05824547 и т.д.), или другими общепринятыми средствами. Подходящие способы трансформации клеток-хозяев можно найти в руководстве Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) и других лабораторных пособиях.

Успешно трансфицированные клетки можно идентифицировать с помощью протоколов отбора с вовлечением маркеров, таких как гены устойчивости к антибиотиком, в дополнение к исследованиям экспрессии РНК и морфологическим анализам. Клоны от успешно трансфицированных клеток, экспрессирующие соответствующую экзогенную ДНК на соответствующих уровнях, можно сохранить как линии клеток посредством криоконсервации (с использованием любого соответствующего способа криоконсервации, известного в данной области).

Селектируемые маркеры (например, гены устойчивости к антибиотикам) могут включать маркеры, придающие устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин, ампициллин и бластицидин и т.д. Клетки, содержащие представляющий интерес ген, можно идентифицировать посредством отбора с помощью лекарственного средства, где клетки, в которые был включен селектируемый маркерный ген, выживают, а другие погибают.

В данном документе описывается теоретическое обоснование для вариантов осуществления данного изобретения, однако это обсуждение ни в коем случае нельзя рассматривать как имеющее обязательную силу или ограничивающее настоящее изобретение. Специалисты в данной области техники поймут, что на практике можно осуществить различные варианты осуществления данного изобретения, независимо от модели, используемой для описания теоретического обоснования данного изобретения.

Далее данное изобретение будет описано и проиллюстрировано на основе приведенных ниже примеров; однако, объем настоящего изобретения не следует ограничивать ими.

Пример 1: Построение трансгенных векторов, подходящих для применения в настоящем изобретении.

Подходящие векторы на основе лентивирусов EGFP-Numb и EGFP-Numblike и EGFP-X (где X является любым трансгеном, описанным в настоящем изобретении) можно получить посредством клонирования в соответствующий вектор на основе вирусов (например, двухгенный вектор HIV-EGFP-HSA (Reiser et al., 2000)). Для ПЦР-амплификации кДНК изоформ Numb и Numblike и клонирования в генетический вектор можно выбрать праймеры-адаптеры. При подготовке к клонированию генный вектор расщепляют ферментами. Затем кДНК каждого трансгена вставляют в кодирующий участок nef, ранее занимаемый кДНК ЧСА. УЗФБ (EGFP - усиленный зеленый флуоресцентный белок) и промотор, соответствующий для популяции клеток (например, CMV-ie или EF-1 альфа), были ранее вставлены в вирусный кодирующий участок. Генетические конструкты могут включать основную часть вектора и трансактиватор, который регулирует промотор, функционально связанный с гетерологичными последовательностями нуклеиновой кислоты.

Примеры векторов на основе ретровирусов, которые можно использовать, включают векторы, полученные на основе вируса лейкоза мышей Молони, вируса саркомы мышей Молони, вируса саркомы Рауса, FIV и ВИЧ, но не ограничиваются ими. Соответствующие векторы экспрессии - это такие векторы, которые можно использовать для трансфекции ДНК или РНК в эукариотические клетки. Такие векторы включают, но не ограничиваются ими, прокариотические векторы, например, бактериальные векторы; эукариотические векторы, например, дрожжевые векторы и векторы на основе грибов; и векторы на основе вирусов, такие как, но без ограничений, векторы на основе лентивирусов, векторы на основе аденовирусов, векторы на основе аденоассоциированных вирусов и векторы на основе ретровирусов.

Неспособный к репликации вектор pcDNA 6.2/EmGFP-Bsd/V5-DEST является примером подходящего вектора экспрессии (Invitrogen) и позволяет экспрессировать искусственные олигонуклеотиды (например, микроРНК), перемещенные из вектора pcDNA 6.2 GW/miR, имеющего способность расщеплять целевые последовательности. Эти векторы включают фланкирующие последовательности и петельные последовательности из эндогенной микроРНК, управляющие вырезанием сконструированной микроРНК из более длинного транскрипта Pol II (пре-микроРНК).

Сочетание множества последовательностей микроРНК, направленных против специфических эндогенных разновидностей РНК, увеличивает вероятность успеха в ослаблении экспрессии последовательности-мишени. Последовательности микроРНК могут быть функционально связаны с регулируемыми или тканеспецифическими промоторами.

При использовании векторов на основе лентивирусов для экспрессии генов полученный (полученные) в результате вектор (векторы), кодирующий (кодирующие) Numb/Numblike, и/или другой трансгенный вектор (другие трансгенные векторы) этого изобретения становятся способными устойчиво трандуцировать как делящиеся, так и неделящиеся типы клеток.

В предпочтительном варианте осуществления полученный (полученные) в результате вектор (векторы), кодирующий (кодирующие) Numb/Numblike, и/или другой трансгенный вектор (другие трансгенные векторы) этого изобретения содержат множество последовательностей искусственных олигонуклеотидов, находящиеся под управлением одного или нескольких промоторов, для снижения экспрессии определенных изоформ numb и/или numblike.

Пример 2: Другой пример подходящего вектора - вектор на основе ретровируса. Ретровирусы - это РНК-вирусы, которые содержат РНК-геном. Гены gag, pol и env фланкируются последовательностями длинных терминальных повторов (LTR-последовательностями). 5' и 3' LTR-последовательности способствуют транскрипции и полиаденилированию иРНК.

Вектор на основе ретровируса может обеспечить регулируемый трансактивирующий элемент, участок внутренней посадки рибосомы (IRES), маркер отбора и целевой гетерологичный ген, управляемый регулируемым промотором.

В качестве альтернативы, под контролем множества промоторов могут экспрессироваться множество последовательностей. Наконец, вектор на основе ретровируса может содержать действующие в цис-положении последовательности, необходимые для обратной транскрипции и интеграции. При инфицировании происходит обратная транскрипция РНК в ДНК, которая эффективно интегрируется в геном хозяина. Рекомбинантный ретровирус данного изобретения генетически модифицирован таким образом, чтобы некоторые из ретровирусных, инфекционных генов природного вируса были удалены и в некоторых случаях заменены целевой последовательностью нуклеиновой кислоты для генетической модификации клетки. Последовательности могут быть экзогенной ДНК или РНК, в ее естественной или измененной форме.

Пример 3: Служащие в качестве примера способы создания вектора (векторов), кодирующего (кодирующих) Numb/Numblike, и/или другого трансгенного вектора (других трансгенных векторов) данного изобретения.

Способы создания получаемого (получаемых) в результате вектора (векторов), кодирующего (кодирующих) Numb/Numblike, и/или другого трансгенного вектора (других трансгенных векторов) данного изобретения включают способы, указанные в Viral Power Lentiviral Expression Systems Manual от Invitrogen, 2007. Вкратце, кассету EmGFP-bsd клонируют как фрагмент PmlI-BlpI в вектор pLenti6/R4R2/V5-DEST, в то время как кассеты miR-длинная (PRR+) изоформа numb или miR-короткая изоформа numb/numblike одновременно переносят BP-реакцией в pDONR221. Затем кассеты с регулируемым промотором (регулируемыми промоторами) и miR-изоформами скрещивают посредством Multisite LR реакции, в модифицированный вектор pLenti6/EmGFP-bsd/R4R2-DEST.

Таким образом можно создать множество векторов, включающих различные сочетания искусственных олигонуклеотидов и трансгенных кассет.

Последовательность вектора pLenti6/R4R2/V5-DEST (SEQ ID NO: 1):

Пример 4: Дополнительные способы создания терапевтического вектора (терапевтических векторов).

"Пакующие линии клеток", происходящие от линий фибробластов человека и/или животных, получают в результате трансфекции или инфицирования линий нормальных клеток вирусными структурными генами gag, pol и env. С другой стороны, пакующие линии клеток продуцируют РНК, лишенную psi-последовательности, таким образом вирусные частицы, полученные от пакующей клетки, не содержат генов gag, pol или env. Как только ДНК терапевтического вектора, содержащая psi-последовательность (наряду с терапевтическим геном), будет введена в пакующую клетку посредством трансфекции или инфицирования, пакующая клетка сможет производить вирионы, способные к переносу терапевтической РНК в конечную клетку-мишень (например, CD4+ клетку).

"Диапазон инфективности" терапевтического вектора (терапевтических векторов) определяется пакующей линией клеток. Доступен ряд пакующих линий клеток для получения вируса, подходящего для инфицирования широкого диапазона типов клеток человека. При этом, эти пакующие линии клеток способны заключать в капсид векторы на основе вирусов, происходящие от вирусов, которые в природе обычно инфицируют различные виды животных. Например, векторы, происходящие от SIV или MMLV, могут быть упакованы заключающими в капсид линиями клеток GP120.

Далее приведен служащий в качестве примера протокол получения супернатанта с компонентами терапевтического вируса:

1. Двадцать микрограммов вектора на основе ретровируса смешивают с 2-3 микрограммами вирусной ДНК, содержащей селектируемый маркерный ген (например, ген устойчивости к антибиотикам) легким постукиванием в 0,8-1 миллилитре забуференного солевого раствора Hepes (pH=7,05) в пластмассовой пробирке объемом 1,5 мл.

2. Семьдесят микролитров 2М CaCl₂. добавляют к смеси повторным легким постукиванием.

3. Когда в пробирке начинает появляться синий осадок, продукт следует осторожно нанести на 30% конфлюэнтный слой пакующих клеток (от любого из ряда коммерческих продавцов). Смесь ДНК следует наносить только после того, как из пакующих клеток будет удалена среда.

4. Пакующие клетки ставят на инкубацию на 20-30 минут при комнатной температуре (25 градусов Цельсия), а затем их возвращают в инкубатор, где поддерживается температура 36-38 градусов Цельсия, на 3,5 часа.

5. В течение 3 минут добавляйте 3,5-4 миллилитра забуференного Hepes солевого раствора, содержащего 15% глицерин, затем промойте клетку модифицированной по способу Дульбекко средой Игла (DMEM)+10% FBS х2.

6. Снова добавьте DMEM+10% FBS и инкубируйте клетки в течение 20 часов при 37 градусах Цельсия.

7. Удалите и профильтруйте среду, содержащую терапевтические вирусные частицы.

Лишний супернатант с вирусными компонентами сразу помещают на хранение или концентрируют и хранят при -80 градусах Цельсия. Супернатант может храниться с 5-8 микрограммами полибрена для увеличения эффективности инфицирования клетки-мишени. В ином случае полибрен может быть исключен или добавлен непосредственно перед инфицированием.

8. Устойчивые линии клеток-продуцентов можно создать посредством разделения пакующих линий клеток 1 на 20 или 1 на 40 и затем инкубированием этих клеток в течение до 10 дней (меняя питательную среду каждые три дня) в среде, содержащей лекарственные средства для отбора (например, определенные антибиотики, соответствующие трансфицированным генам устойчивости).

9. Через 10 дней отдельные колонии собирают, делят на аликвоты и замораживают для хранения.

Исследование инфективности/титра ретровируса выполняют нанесением определенного объема супернатанта с вирусными компонентами на слой конфлюэнтных "тестовых" клеток, таких как клетки NIH 3Т3, высеянных с конфлюэнтностью 20%. После 2-3 делений клеток (24-36 часов для клеток NIH 3Т3) производят подсчет колоний "тестовых" клеток, инкубированных при 37 градусах в среде, содержащей антибиотик. Титр супернатанта рассчитывают на основе этого подсчета колонии с помощью следующей формулы:

Колониеобразующие единицы/мл = идентифицированные колонии × 0,5 (фактор разделения) / объем вируса (мл)

Точность этого расчета возрастает, если производится тестирование больших объемов супернатанта по многим чашкам «тестовых» клеток.

Нанесение супернатанта с компонентами терапевтического вируса на клетки-мишени можно выполнить различными средствами, в зависимости от клинической ситуации.

Пример 5: Ростовая среда для выбранных клеток

Выбранные клетки можно наращивать/выращивать в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной глютамином, бета-меркаптоэтанолом, 10% (по объему) лошадиной сывороткой и человеческим рекомбинантным фактором, ингибирующим лейкоз (LIF). LIF устраняет необходимость поддержания выбранных клеток на фидерных слоях клеток (которые также можно использовать) и является важным для поддержания выбранных клеток в недифференцированном, мультипотентном или плюрипотентном состоянии, такие клетки можно поддерживать в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной глютамином, бета-меркаптоетанолом, 10% (по объему) лошадиной сывороткой и человеческим рекомбинантным фактором, ингибирующим лейкоз (LIF). LIF устраняет необходимость поддержания клеток на фидерных слоях клеток (которые также можно использовать) и является необходимым для поддержания клеток в недифференцированном состоянии (в соответствии с патентом США 6432711).

Чтобы инициировать дифференцировку выбранных клеток в нейроны, клетки трипсинизируют, и отмывают от LIF, и помещают в DMEM, дополненную 10% FBS (эмбриональная бычья сыворотка). После ресуспендирования в DMEM и 10% FBS 1×10⁶ клеток высеивают в 5 мл DMEM, 10% FBS, 0,5 микроМ ретиноевую кислоту в 60-миллиметровых бактериологических чашках Петри Fisher, где клетки, как ожидается, сформируют небольшие агрегаты. Агрегация способствует надлежащей дифференцировке клеток. Высокоэффективную трансфекцию соответствующими нейрональными транскрипционными факторами можно осуществить до или после высеивания в DMEM, FBS и ретиноевую кислоту. (Подробнее см. патенты США 6432711 и 5453357).

Пример 6: Соответствие HLA. Выбранные клетки (например, пуповинная кровь или клетки из любого другого подходящего источника и/или их потомство) можно подвергнуть скринингу, генетически модифицировать (факультативно), нарастить и индуцировать для начала дифференцировки в требуемый тип (требуемые типы) клеток (факультативно). Затем клетки трансплантируют согласно стандартным протоколам трансплантации стволовых клеток. В определенных случаях клетки можно трансплантировать пациентам без соответствия HLA.

Пример 7: В некоторых редких случаях может потребоваться ввести пациентам векторы, кодирующие трансген, чтобы стимулировать или ингибировать клеточное деление или клеточную дифференцировку in vivo.

Пример 8: Генетическая модификация выбранных клеток.

Генетическую модификацию in vitro экзогенных или эндогенных клеток пациента можно выполнить согласно любому опубликованному или неопубликованному способу, известному в данной области техники (например, патенты США №№6432711, 05593875, 05783566, 5928944, 05910488, 05824547 и т.д.), или другими общепринятыми средствами. Подходящие способы трансформации клеток-хозяев можно найти у Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) и в других лабораторных пособиях.

Успешно трансфицированные клетки идентифицируют по протоколам отбора с вовлечением маркеров, таких как гены устойчивости к антибиотикам, в дополнение к исследованию экспрессии РНК и морфологическим анализам. Клоны от успешно трансфицированных клеток, экспрессирующие соответствующую экзогенную ДНК на соответствующих уровнях, могут быть сохранены как линии клеток посредством криоконсервирования (с использованием любого соответствующего способа криоконсервации, известного в данной области техники).

Селектируемые маркеры (например, гены устойчивости к антибиотикам) могут включать гены, придающие устойчивость к таким лекарственным средствам, как G418, гигромицин и метотрексат. Клетки, содержащие интересующий ген, могут быть идентифицированы посредством отбора при помощи лекарственного средства, при котором клетки, включившие селектируемый маркерный ген, выживают, а другие погибают.

Данное изобретение раскрывает выбор генетически модифицированных клеток как "выбранные клетки" данного изобретения. Выражение генетическая модификация относится к изменению клеточного генотипа посредством введения природных или искусственных нуклеиновых кислот в выбранные клетки и/или их потомство или иммортализованные линии клеток и/или их потомство с помощью любых известных в данном области техники средств. В качестве альтернативы, условия культивирования, которые индуцируют устойчивые изменения в паттернах генной экспрессии, как описывается в данном документе, представляют собой генетическую модификацию. Модификация стволовых клеток, независимо от того, получены ли они из мозга хозяина, эндогенных донорских источников, экзогенных донорских источников или линий клеток, представляет собой возможный подход для лечения определенных заболеваний человека, особенно заболеваний нервной системы человека.

Генетические модификации, на которые распространяется данное раскрытие, включают, но не ограничиваются следующим: генетические модификации, выполненные in vivo; модификации, изменяющие активность или количество метаболических ферментов, экспрессируемых эндогенными или экзогенными выбранными клетками и/или их потомством; модификации, изменяющие активность, количество или антигенность клеточных белков; модификации, изменяющие активность или количество белков, вовлеченных в проводящие пути сигнальной трансдукции; модификации, изменяющие HLA-тип; модификации, изменяющие клеточную дифференцировку; модификации, изменяющие неопластический потенциал; модификации, изменяющие клеточную дифференцировку; модификации, изменяющие количество или активность структурных белков; модификации, изменяющие количество или активность связанных с мембраной белков (структурных или ферментных); модификации, изменяющие активность или количество белков, вовлеченных в репарацию ДНК и обслуживание хромосом; модификации, изменяющие активность или количество белков, вовлеченных в клеточный транспорт; модификации, изменяющие активность или количество ферментов; модификации, изменяющие активность или количество белков, вовлеченных в формирование и обслуживание синапса; модификации, изменяющие активность или количество белков, вовлеченных в разрастание нейрита или разрастание и формирование аксона; модификации, изменяющие количество или активность ферментов, продуцирующих антиоксиданты, в пределах клетки; модификации, приводящие к измененной посттрансляционной модификации клеточных белков; модификации, изменяющие активность или количество белков, вовлеченных в другие аспекты клеточной репарации, и изменения, которые увеличивают продолжительность жизни клетки (например, продуцирование теломеразы). Такие белки, как те, что упомянуты выше, могут кодироваться посредством ДНК или РНК, происходящей от генома человека или других геномов животных, растений, вирусов или бактерий. Данное изобретение также распространяется на de novo разработанные последовательности.

Кроме того, данное изобретение имеет отношение к in situ генетической модификации выбранных клеток и/или их клеток-потомков для лечения заболевания. Эндогенные стволовые клетки можно модифицировать in situ посредством прямой инъекции или введением ДНК- или РНК-векторов, включая вирусы, ретровирусы, липосомы и т.д. в вещество ткани или в соответствующую часть желудочковой системы мозга. С 1992 года мы таким образом модифицировали тысячи стволовых клеток/клеток-предшественников и множество тысяч клеток-потомков. Наши данные показывают, что данный способ модификации клеток-предшественников дает в результате огромное разнообразие модифицированных типов клеток по всей нервной системе, и этот способ никогда не приводил к отрицательным последствиям.

Пример 9: Введение генетических векторов в хозяина

В предпочтительном варианте осуществления эндогенные клетки трансфицируют in vivo векторами, такими как те, что описаны в данном документе, посредством введения терапевтического вектора (терапевтических векторов) в кровь, ткани, нервную систему, костный мозг и т.д. хозяина. Самый лучший результат может быть достигнут путем модификации большого количества эндогенных клеток-мишеней. Это может быть достигнуто при использовании устройства наподобие катетера соответствующего размера или иглы для введения терапевтического вектора (терапевтических векторов) в систему венозного или артериального кровообращения, в определенную ткань, например мышечную ткань, или в нервную систему. В предпочтительном варианте осуществления вирус псевдотипируют гликопротеидом VSV-G оболочки и нативными белками env ВИЧ-1.

Пример 10: Инъекция в нервную систему

Трансплантация выбранных клеток (из ростовой среды или среды для дифференцировки) в эмбриональную нервную систему или генетическая модификация эндогенных эмбриональных клеток с помощью генетических векторов может быть выполнена следующим образом: в стерильных условиях матку и плоды визуализируют ультразвуком или другим радиологическим устройством. В качестве альтернативы матка может быть подвергнута хирургическому воздействию с целью облегчения прямой идентификации эмбриональных опознавательных точек черепа. Выбранные клетки можно затем ввести с помощью инъекции (с использованием катетера или иглы соответствующего размера) в желудочковую систему, герминативную зону (герминативные зоны) или в вещество нервной системы. Инъекции могут быть выполнены в определенных случаях через брюшную стенку матери, маточную стенку и плодные оболочки в плод. Точность инъекции контролируют прямым наблюдением, ультразвуком, контрастом, способами, основанными на применении радиационных изотопов, или любыми другими известными средствами рентгенологического контроля.

В соответствующих стерильных условиях прямую идентификацию эмбриональных ориентиров черепа осуществляют визуально, а также посредством физического осмотра и пальпации вместе со стереотаксическим наведением и наведением по излучению. После культивирования клеток соответствующее количество выбранных или дифференцирующихся клеток можно ввести путем инъекции или другими средствами в желудочковую систему, герминативные зоны или в вещество нервной системы. Точность инъекции контролируют прямым наблюдением, ультразвуком или другим рентгенологическим контролем.

При определенных неврологических заболеваниях нервной системы у взрослых, таких как болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона, избирательно затрагиваются клетки определенной части мозга. В случае болезни Паркинсона - это допаминергические клетки черной субстанции. При таких специфичных для определенного места заболеваниях, поражающих взрослых, локализованную трансплантацию клеток можно осуществить с помощью трансплантации под рентгенологическим контролем дифференцирующихся клеток в стерильных условиях. Рентгенологический контроль может включать использование КТ (компьютерная томография) и/или МРТ (магнитно-резонансная томография), и можно воспользоваться методиками, основанными на контрасте или на применении радиоактивных изотопов, для отслеживания вводимых материалов.

При определенных неврологических заболеваниях, таких как некоторые нарушения, связанные с накоплением метаболитов, затрагиваются клетки, находящиеся в разных областях нервной системы, и самый лучший результат может быть достигнут с помощью генетического модифицирования эндогенных клеток или посредством введения выбранных клеток настоящего изобретения (или из культуральных ростовых сред, или из среды для дифференцировки) в ткань в больших количествах диффузным способом. В нервной системе эти заболевания можно лучше всего лечить внутрижелудочковыми инъекциями (с использованием устройства типа катетер или иглы соответствующего размера) (особенно на ранних стадиях развития), которые делают возможной диффузную модификацию эндогенных клеток или диффузное приживление выбранных клеток, выделенных из ростовых сред и/или сред для дифференцировки. Тем не менее, это распространяется также и на инъекцию клеток в кровеносную систему с той же целью. Однако, что касается любого нарушения, затрагивающего несколько органов или диффузно организм (например, нарушения, связанные с накоплением лизосом, гемоглобинопатии, мышечная дистрофия), то клетки, выделенные из ростовой среды и/или среды для дифференцировки, можно также предпочтительно ввести непосредственно в кровоток и/или висцеральные органы, такие как печень, почки, кишечник, селезенка, надпочечники, поджелудочная железа, легкие и тимус, с помощью эндоскопического контроля и любого подобного катетеру устройства соответствующего размера, что делает возможным диффузное приживление клеток во всем организме, а также специфическое введение и инфильтрацию клеток в выбранные органы.

Пример 11: Доставка клеток с помощью инъекции в кровяной ток и органы кровообращения.

Заболевания одной системы органов можно лечить с помощью генетически модифицированных клеток из другой системы органов. Также, в некоторых случаях может стать очевидным, что выбранные клетки могут интегрироваться и дифференцироваться самостоятельно in vivo в достаточных количествах, если они введены в артериальный, венозный или печеночный кровяной ток после культивирования в ростовых средах и/или средах для дифференцировки. Настоящее изобретение распространяется и на этот подход. При лечении диффузных нарушений мышц (например, мышечные дистрофии), органов, тканей или крови (например, наследственный сфероцитоз, серповидноклеточная анемия, другие гемоглобинопатии и т.д.) можно, например, использовать инъекцию клеток, выделенных из ростовых сред или сред для дифференцировки, в пациента, в частности, в систему кровообращения пациента. Полагают, что этот подход также облегчает ишемические повреждения, такие как инфаркт миокарда, инсульт и т.д., а также травматические повреждения мозга и других тканей. Для практического осуществления настоящего изобретения подходит инъекция таких клеток, полученных в соответствии с данным изобретением, непосредственно в систему кровообращения с помощью иглы или катетера так, чтобы клетки были способны к «хоумингу» в костный мозг, мышцу, почки, легкие и/или любую другую систему органов, а также инъекция непосредственно в пространство костного мозга. Аналогично, инъекции клеток непосредственно в участок поражения при рентгенологическом, ультразвуковом или флуороскопическом контроле, или без него, также подходят для осуществления на практике настоящего изобретения.

Способы выделения выбранных клеток, пригодные для настоящего изобретения, включают описанные Zhao et al., 2006.

В предпочтительном варианте осуществления генетические векторы, кодирующие изоформы numb и/или numblike, включают регулируемые промоторы, функционально связанные с трансгенами Numb или numblike.

В другом предпочтительном варианте осуществления метод трансфекции можно выбрать из таких методов трансфекции, которые предусматривают временную, а не постоянную экспрессию изоформ numb и numblike.

Пример 12. Генетические модификации, служащие в качестве примера

Предполагается, что сотни болезней и клинических состояний можно излечить и/или облегчить с помощью способов настоящего изобретения, включая болезнь Канавана (ASP); болезнь Тея-Сакса (HEXA); синдром Леш-Нихана (HRPT); болезнь Хантингтона (HTT); мукополисахаридоз VII типа; болезнь Ниманна-Пика типа А и типа В; болезнь Сандгоффа (HEXB); болезнь Фабри (GLA); болезнь Ниманна-Пика типа С (NPC1); болезнь Гоше (GBA); болезнь Паркинсона (PARK2 и т.д.); болезнь фон Гиппеля-Линдау, серповидноклеточную анемию (HBB) и другие талассемии, а также подобные заболевания, но не ограничиваясь ими. Эти трансгены могут представлять собой кодирующий участок или части кодирующего участка нормальных генов.

Тем не менее, следует понимать, что объем данного изобретения не нужно ограничивать описанными выше конкретными вариантами осуществления и примерами. Данное изобретение можно осуществлять на практике не только так, как конкретно описано, и оно все так же будет оставаться в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

Пример 13: Служащая в качестве примера последовательность вектора, способного превратить клетки в плюропотентные и экспрессирующие последовательности нуклеиновой кислоты длинной изоформы Numb, Oct-4, Sox-2 и EmGFP под контролем чувствительных к тетрациклину промоторов, представляет собой (SEQ ID NO: 2):

Схематическая карта, соответствующая векторной последовательности, приведенной выше, показана на Фигуре 1.

Вектор можно полностью построить с помощью синтеза гена de novo или частично с помощью клонирования последовательностей кДНК Numb, Sox и OCT3/4 в положение, занимаемое LacZ в векторе pcDNA4tolacZ от Invitrogen. Точно так же помещают ген tetR в вектор Invitrogen pcDNA6/TR. Кодирующие последовательности упоминаемых генов также подходят для клонирования в вектор pcDNA4lacZ.

В качестве альтернативы, ген tetR можно трансфицировать в клетки-мишени отдельно с помощью вектора pcDNA6/TR в комбинации с вектором, включающим в себя приведенную здесь последовательность минус ген tetR и его PCMV-промотор.

Аналогично, можно использовать множество векторов до тех пор, пока не станут присутствовать элементы, подобные элементам, включенным в вышеупомянутую последовательность. Это может уменьшить вероятность конкуренции промоторов. Понятно, что вместо промоторов, чувствительных к тетрациклину можно использовать другие промоторные элементы, зависящие от условий.

Пример 14. Ожидается, что внутривенное и другое введение плюрипотентных стволовых клеток, полученных согласно описанным в данном документе способам (или другим опубликованным способам), один или несколько раз могут обеспечить организму клетки для замены, и что результатом такого введения может стать увеличение продолжительности жизни или улучшение здоровья пациента, страдающего от возрастного старения.

Пример 15. Получение половых клеток.

Данное изобретение распространяется на получение половых клеток из мультипотентных, плюрипотентных и/или самообновляющихся стволовых клеток, полученных согласно описанным в данном документе способам (или согласно другим опубликованным способам). Получение таких половых клеток может быть полезным для лечения бесплодия и получения эмбрионов in vitro (например, Hubner et al., 2003; Kehler et al., 2005; Nayernia et al., 2006a; Nayernia et al., 2006b; Drusenheimer et al., 2007; Moore et al., 2007 и т.д.)

Пример 16: Создание трансгенных животных.

Настоящее изобретение распространяется на создание трансгенных животных. Как и в случае других плюрипотентных клеток, плюрипотентные клетки, полученные по описанным в данном документе способам (или другим опубликованным способам), можно использовать для получения трансгенных животных любым известным в данной области техники способом.

Пример 17: Построение терапевтических векторов

Примеры векторов на основе ретровирусов, которые можно использовать, включают векторы, полученные на основе вируса лейкоза мышей Молони, вируса саркомы мышей Молони, вируса саркомы Рауса, FIV и ВИЧ, но не ограничиваются ими. Соответствующие векторы экспрессии - это векторы, которые можно использовать для трансфекции ДНК или РНК в эукариотические клетки. Такие векторы включают, но не ограничиваются ими, прокариотические векторы, например, бактериальные векторы; эукариотические векторы, например, дрожжевые векторы и векторы на основе грибов; векторы на основе вирусов, такие как (не ограничиваются ими) векторы на основе лентивирусов, векторы на основе аденовирусов, векторы на основе аденоассоциированных вирусов, и векторы на основе ретровирусов.

Неспособные к репликации векторы pcDNA 6.2 GW/miR и pcDNA 6.2/EmGFP-Bsd/V5-DEST являются примерами подходящих векторов экспрессии (Invitrogen) и позволяют экспрессировать искусственные олигонуклеотиды (например, микроРНК), у которых есть способность расщеплять целевые последовательности. Эти векторы включают в себя фланкирующие последовательности и петельные последовательности из эндогенной микроРНК, управляющие вырезанием сконструированной микроРНК из более длинного транскрипта PolII (пре-микроРНК).

В качестве альтернативы включение psi-последовательности ВИЧ позволяет терапевтическому вектору конкурировать с геномом природного ВИЧ за упаковку в вирусные частицы, также ингибируя передачу ВИЧ.

Благодаря комбинированию множества последовательностей микроРНК, направленных против единственной мишени, увеличивается вероятность успеха в ослаблении экспрессии последовательности-мишени. Последовательности микроРНК могут быть функционально связаны с тканеспецифичными промоторами, такими как промотор EF-1 альфа, специфический для любых Т-клеток промотор или специфический для макрофагов промотор, с обеспечением экспрессии в требуемых типах клеток.

При использовании векторов доставки (DEST) на основе лентивирусов от Invitrogen для генной экспрессии получаемый (получаемые) в результате терапевтический вектор (терапевтические векторы) становится (становятся) способным (способными) к устойчивой трансфекции как делящихся, так и неделящихся типов клеток.

В предпочтительном варианте осуществления терапевтический вектор (терапевтические векторы) содержит (содержат) множественные последовательности искусственных олигонуклеотидов, находящиеся под управлением одного или нескольких промоторов для уменьшения экспрессии CXCR4, CCR5 и/или любого другого клеточного белка, который, как известно, играет роль корецептора для ВИЧ-инфекции у клеток-мишеней.

В одном терапевтическом векторе (созданном в 2006 г.) четыре последовательности микроРНК, целенаправленно воздействующие на корецепторы CXCR4 и CCR5, клонировали в вектор pcDNA 6.2 GW/miR наряду с последовательностями РНК-ловушек, которые целенаправленно взаимодействуют с TAR и RRE ВИЧ-2.

Генетические конструкты могут включать основную часть вектора и трансактиватор, который регулирует промотор, функционально связанный с гетерологичными последовательностями нуклеиновой кислоты.

Другой пример подходящего вектора - вектор на основе ретровируса. Ретровирусы - это РНК-вирусы, которые содержат РНК-геном. Гены gag, pol и env фланкируются последовательностями длинных терминальных повторов (LTR). 5' и 3' LTR-последовательности способствуют транскрипции и полиаденилированию иРНК.

В качестве альтернативы множество последовательностей могут экспрессироваться под контролем множества промоторов. Наконец, вектор на основе ретровируса может содержать действующие в цис-положении последовательности, необходимые для обратной транскрипции и интеграции. При инфицировании происходит обратная транскрипция РНК в ДНК, которая эффективно интегрируется в геном хозяина. Рекомбинантный ретровирус данного изобретения генетически модифицирован таким образом, чтобы некоторые из ретровирусных, инфекционных генов природного вируса были удалены и в некоторых вариантах осуществления заменены целевой последовательностью нуклеиновой кислоты для генетической модификации клетки. Последовательности могут быть экзогенной ДНК или РНК в ее природной или измененной форме.

Пример 18: Способы создания терапевтического вектора, служащие в качестве примера.

Способы создания терапевтического вектора (терапевтических векторов) включают способы, представленные в Viral Power Lentiviral Expression Systems Manual от Invitrogen (включенном по ссылке в данный документ). Вкратце, кассету EmGFP-bsd клонируют как фрагмент PmlI-BlpI в вектор pLenti6/R4R2/V5-DEST, в то время как кассету miR-ловушки одновременно переносят BP-реакцией в pDONR221. Затем промотор EF1a и miR-ловушку скрещивают Multisite LR реакцией в модифицированный вектор pLenti6/EmGFP-bsd/R4R2-DEST.

Последовательность вектора pLenti6/R4R2/V5-DEST (SEQ ID NO: 1):

Служащая в качестве примера последовательность кассеты miR-ловушки (SEQ ID NO: 3):

Пример 19: Способы размножения/пролиферации стволовых клеток/клеток-предшественников in vivo.

В целях получения больших количеств клеток-мишеней, относительно устойчивых к 1) инфицированию ВИЧ, и/или 2) репликации ВИЧ, и/или 3) транскрипции ВИЧ, клетки-предшественники/стволовые клетки можно вырастить в модифицированной по способу Дульбекко минимальной необходимой среде (DMEM), дополненной глютамином, бета-меркаптоэтанолом, 10% (по объему) лошадиной сывороткой и человеческим рекомбинантным фактором, ингибирующим лейкоз (LIF). LIF устраняет необходимость в поддержании клеток-предшественников/стволовых клеток на фидерных слоях клеток (которые также можно использовать) и является необходимым для поддержания клеток-предшественников/стволовых клеток в недифференцированном состоянии.

Пример 20: Стволовые клетки собирают от особей, клетки трансфицируют терапевтическими векторами, затем готовят для трансплантации стандартными способами, с HLA-типированием и соответствием или без него.

Пример 21: Образцы пуповинной крови получают из банка пуповинной крови. Затем клетки трансфицируют терапевтическим вектором с полезными последовательностями, затем готовят для трансплантации стандартными способами, с HLA-типированием и соответствием или без него.

Пример 22: Примеры последовательностей искусственных олигонуклеотидов, подходящих для включения в терапевтический вектор.

Настоящее изобретение распространяется на любые последовательности искусственных олигонуклеотидов, успешно уменьшающие белковую экспрессию целевых последовательностей >70%.

Настоящее изобретение также распространяется на любые последовательности искусственных олигонуклеотидов, успешно уменьшающие способность клеток-мишеней поддерживать репликацию ВИЧ на >70% или в меньшей, но терапевтической степени, или вирусную активность ВИЧ на >70% или в меньшей, но терапевтической степени.

Примеры последовательностей микроРНК включают последовательности микроРНК, полученные с помощью алгоритма IVGN (Invitrogen). Последовательности микроРНК, целенаправленно воздействующие на ген CXCR4, включают верхнюю цепь: 5'-TGCTGATACCAGGCAGGATAAGGCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGCCTTACTGCCTGGTAT-3' (SEQ ID NO: 4) и нижнюю цепь: 5'-CCTGATACCAGGCAGTAAGGCCAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTGGCCTTATCCTGCCTGGTATC-3' (SEQ ID NO: 5); а также верхнюю цепь: 5'-TGCTGTGACCAGGATGACCAATCCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGGATTGCATCCTGGTCA-3' (SEQ ID NO: 6) и нижнюю цепь: 5'-CCTGTGACCAGGATGCAATCCATGTCAGTCAGTGGCCAAAACATGGATTGGTCATCCTGGTCAC-3' (SEQ ID NO: 7).

Точно так же последовательности микроРНК, целенаправленно воздействующие на ген CCR5, включают верхнюю цепь: 5'-TGCTGATCGGGTGTAAACTGAGCTTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAAGCTCATTACACCCGAT-3' (SEQ ID NO: 8) и нижнюю цепь: 5'-CCTGATCGGGTGTAATGAGCTTGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCAAGCTCAGTTTACACCCGATC-3' (SEQ ID NO: 9); а также верхнюю цепь 5'-TGCTGATAGCTTGGTCCAACCTGTTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAACAGGTGACCAAGCTAT-3' (SEQ ID NO: 10) и нижнюю цепь: 5'-CCTGATAGCTTGGTCACCTGTTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAACAGGTTGGACCAAGCTATC-3' (SEQ ID NO: 11).

Пример 23: Примеры РНК-ловушки, подходящей для включения в терапевтический вектор. Настоящее изобретение также распространяется на любые последовательности ловушек, успешно уменьшающие способность клеток-мишеней поддерживать репликацию ВИЧ на >70% или в меньшей, но терапевтической степени, или вирусную активность ВИЧ на >70% или в меньшей, но терапевтической степени.

Примерной последовательностью TAR-ловушки является (SEQ ID NO: 12)

gtcgctctgcggagaggctggcagattgagccctgggaggttctctccagcactagcaggtagagcctgggtgttccctgctagactctcaccagtgcttggccggcactgggcagacggctccacgcttgcttgcttaaagacctcttaataaagctgc (Browning et al., 1999)

Примерной последовательностью RRE-ловушки является (SEQ ID NO: 13)

tgctagggttcttgggttttctcgcaacagcaggttctgcaatgggcgcggcgtccctgaccgtgtcggctcagtcccggactttactggccgggatagtgcagcaacagcaacagctgttggacgtggtcaagagacaacaagaactgttgcgactgaccgtctggggaacgaaaaacctccaggcaagagtcactgctatagagaagtacctacaggaccaggcgcggctaaattcatggggatg (Dillon et al., 1990).

Пример 24: Фланкирующие последовательности, обеспечивающие стабильность РНК-ловушек.

Ниже приведены примеры подходящих фланкирующих последовательностей для РНК ловушек:

GUGCUCGCUUCGGCAGCACGTCGAC ---ПОСЛ. TAR-ЛОВУШКИ --- (SEQ ID NO: 14) UCUAGAGCGGACUUCGGUCCGCUUUU (SEQ ID NO: 15)

GUGCUCGCUUCGGCAGCACGTCGAC ---ПОСЛ. RRE-ЛОВУШКИ --- (SEQ ID NO: 16) UCUAGAGCGGACUUCGGUCCGCUUUU (SEQ ID NO: 17)

Ранее было продемонстрировано, что последовательности-ловушки, фланкированные шпильками с обеих сторон, 19 нуклеотидами (ntds) РНК U6 с 5' стороны, а также 3'-стеблем, непосредственно предшествующим терминатору поли-U для POLIII, отличаются более высокой стабильностью. Ожидается, что такая схема защитит от 3'-5' эндонуклеазной атаки и уменьшит возможности взаимодействия 3'-трейлера с петлей РНК-вставки. Поскольку присутствуют только первые 3/4 последовательности тРНК, то 5' конец вставки должен быть защищен, а экспорт из ядра должен быть предотвращен (Good et al., 1997).

Пример 25: Введение терапевтического вектора хозяину

В предпочтительном варианте осуществления стволовые клетки/клетки-предшественники крови и клетки-мишени трансфицируют терапевтическим вектором (терапевтическими векторами) (или связанным терапевтическим вирусом) in vivo посредством введения терапевтического вектора (терапевтических векторов) в кровь, ткани или костный мозг хозяина и т.д. Наилучший результат может быть достигнут путем модификации большого количества эндогенных клеток-мишеней и стволовых клеток/клеток-предшественников. Это может быть осуществлено с помощью устройства соответствующего размера, подобного катетеру, или иглы для введения терапевтического вектора (терапевтических векторов) в систему венозного или артериального кровообращения. В предпочтительном варианте осуществления вирус псевдотипирован гликопротеином оболочки VSV-G и белками env природного ВИЧ-1.

Пример 26: Введение генетически модифицированных клеток в хозяина

Гемоциты, такие как зрелые Т-лимфоциты периферической крови, моноциты, макрофаги, предшественники Т-клеток, клетки-предшественники макрофагов-моноцитов и/или плюрипотентные стволовые кроветворные клетки (например, обнаруживаемые в пуповинной крови и занимающие участки костного мозга), а также другие стволовые клетки/клетки-предшественники можно трансфицировать с использованием терапевтического вектора (терапевтических векторов) in vitro. Соответствующие концентрации терапевтического вектора (терапевтических векторов) могут быть концентрациями в соответствии с Browning et al., 1999. Затем, клетки наращивают (размножают) in vitro и затем переносят в хозяина посредством введения клеток в систему венозного или артериального кровообращения с помощью внутривенной иглы или катетера. В дальнейшем клетки, трансфицированные терапевтическими векторами, способны к «хоумингу» в костный мозг и другие ткани.

Понятно, что описанные в данном документе примеры и варианты осуществления представлены исключительно в иллюстративных целях, и что в их свете квалифицированными специалистами в данной области будут предложены различные модификации или изменения, и они должны включаться в сущность и область охвата данной заявки и объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в данном документе, таким образом включаются ссылкой в их полном объеме во всех отношениях.

Пример 27: Примеры экспрессируемых или целевых трансгенов, используемых в настоящем изобретении.

Любые последовательности трансгенов, эффективные при осуществлении настоящего изобретения, подходят для применения в настоящем изобретении. Подходящие нуклеотидные последовательности можно выбирать из любых разновидностей до тех пор, пока не будут получены требуемые клетки или не будет достигнуто требуемое поведение. Подобным образом, способ обозначения таких последовательностей - буквами или нижнего, или верхнего регистра - не подразумевает конкретную разновидность. Следующие последовательности, хранящиеся в базе данных NCBI (приведены в соответствии с номером доступа), представляют собой примеры последовательностей, на которые ссылаются выше в настоящей заявке. Они также являются примерами последовательностей, кодирующих специфический трансген (cds), пригодных для применения в настоящем изобретении, но ни в коем случае не ограничивают практическое осуществление данного изобретения:

кардиотрофин1:U43030 (SEQ ID NO: 18):

CNTF:BC074964 (SEQ ID NO: 19):

GP130:NM_175767 (SEQ ID NO: 20):

IL6:BC015511 (SEQ ID NO: 21):

HOXB4:NM_024015 (SEQ ID NO: 22):

IL6R:NM_000565 (SEQ ID NO: 23):

IL11:NM_133519 (SEQ ID NO: 24):

LIF:NM_002309 (SEQ ID NO: 25):

LIFR:NM_002310 (SEQ ID NO: 26):

STAT3:NM_003150 (SEQ ID NO: 27):

NUMB:AF171938 (SEQ ID NO: 28):

AF171939 (SEQ ID NO: 29):

AF171940 (SEQ ID NO: 30):

AF171941 (SEQ ID NO: 31):

Numblike:NM_00475 (SEQ ID NO: 32):

NANOG:NM_024865 (SEQ ID NO: 33):

ОнкостатинM (OSM):NM_020530 (SEQ ID NO: 34):

OSMR:NM_003999 (SEQ ID NO: 35):

OCT3/4(POU5F1):NM_203289 (SEQ ID NO: 36):

NM_002701 (SEQ ID NO: 37):

SOX2:NM_003106 (SEQ ID NO: 38):

FGF4:NM_002007 (SEQ ID NO: 39):

Gata2:NM_032638 (SEQ ID NO: 40):

Gata3:NM_001002295 (SEQ ID NO: 41):

Gata4:BC101580 (SEQ ID NO: 42):

Gata5:BC117356 (SEQ ID NO: 43):

Gata6:NM_005257 (SEQ ID NO: 44):

HNF1:NM_000458 (SEQ ID NO: 45):

NM_012669 (SEQ ID NO: 46):

HNF3:X74936 (SEQ ID NO: 47):

HNF3gammaX74938M (SEQ ID NO: 48):

HNF3betaX74937 (SEQ ID NO: 49):

HNF3G:AH008133 (SEQ ID NO: 50):

HNF3A:AH008132 (SEQ ID NO: 51):

HNF4alpha:NM_008261 (SEQ ID NO: 52):

HNF4a:NM_022180 (SEQ ID NO: 53):

HNF6:U95945 (SEQ ID NO: 54):

HLXB9:NM_001096823 (SEQ ID NO: 55):

(SEQ ID NO: 56)

NM_005515 (SEQ ID NO: 57):

Lbx1:NM_006562 (SEQ ID NO: 58):

Lmx1b (SEQ ID NO: 59):

Нейрогенин (NEUROG1):NM_006161 (SEQ ID NO: 60):

Нейрогенин2 (NEUROG2):NM_024019 (SEQ ID NO: 61):

Нейрогенин3 (NEUROG3) (SEQ ID NO: 62):

MASH1:NM_004316 (SEQ ID NO: 63):

MyoD:NM_010866 (SEQ ID NO: 64):

Myf5:NM_005593 (SEQ ID NO: 66):

Myf6:NM_002469 (SEQ ID NO: 67):

Ifrd1:NM_001007245 (SEQ ID NO: 68):

Mef2A:NM_013172 (SEQ ID NO: 69):

Миогенин:NM_002479 (SEQ ID NO: 70):

Nkx2.2:NM_002509 (SEQ ID NO: 71):

Notch

Notch1:NM_017617 (SEQ ID NO: 72):

NOTCH2:NM_024408; NM_010928.

NOTCH3:NM_000435 (SEQ ID NO: 73):

Nurr1:NM_006186 (SEQ ID NO: 74):

NOV (CCN3):NM_002514 (SEQ ID NO: 75):

OLIG1:NM_138983 (SEQ ID NO: 76):

OLIG2:NM_005806 (SEQ ID NO: 77):

Pdx1:NM_000209 (SEQ ID NO: 78):

Pet1 (FEV):BC138435; NM_017521 (SEQ ID NO: 79):

Phox2a:NM_005169 (SEQ ID NO: 80):

Phox2b:NM_003924 (SEQ ID NO: 81):

Pit1:NM_000306 (SEQ ID NO: 82):

PITX3:NM_005029 (SEQ ID NO: 83):

RUNX1:NM_001001890 (SEQ ID NO: 84):

Runx2:NM_001015051 (SEQ ID NO: 85):

Shh:NM_000193 (SEQ ID NO: 86):

Sox9:NM_000346 (SEQ ID NO: 87):

Sox17:NM_022454 (SEQ ID NO: 88):

DLX2:NM_004405 (SEQ ID NO: 89):

DLX5:NM_005221 (SEQ ID NO: 90):

HES1:NM_005524 (SEQ ID NO: 91):

FGF8:NM_006119 (SEQ ID NO: 92):

PITX2:NM_000325 (SEQ ID NO: 93):

REST4:DQ644039 (SEQ ID NO: 94):

CREB-связывающий_белок:NM_134442 (SEQ ID NO: 95):

Zfp488:NM_001013777 (SEQ ID NO: 96):

Foxa2:NM_021784 (SEQ ID NO: 97):

Rnx

REN:NM_000537 (SEQ ID NO: 98):

dHAND (HAND2):NM_021973 (SEQ ID NO: 99):

аспартоацилаза (болезнь Канавана) (ASPA):NM_000049 (SEQ ID NO: 100);

гексозаминидазаА (HEXA):NM_000520 (SEQ ID NO: 101):

синдром_Леш-Нихана (HRPT):NM_000194 (SEQ ID NO: 102):

Хантингтин; NM_010414;

GUSB; NM_000181 (SEQ ID NO: 103):

NPC1:NM_000271; NM_006432.

гексозаминидазаВ:NM_000521 (SEQ ID NO: 104);

галактозидаза, альфа (GLA):NM_000169 (SEQ ID NO: 105):

кислая_бета-глюкозидаза (GBA):NM_000157 (SEQ ID NO: 106):

супрессор_опухоли фон Гиппеля-Ландау (VHL):NM_000551 (SEQ ID NO: 107):

Бета_глобин (HBB):NM_000518 (SEQ ID NO: 108):

PARK2:NM_013988 (SEQ ID NO: 109):

Содержания всех упоминаемых в скобках публикаций и следующих патентов США отмечены и включены в качестве ссылки во всей их полноте: 7211247, 5677139, 6432711 и 5453357, 05593875, 05783566, 5928944, 05910488, 05824547.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> РЕЙД, КРИСТОФЕР Б.

<120> СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ПОПУЛЯЦИЙ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ

И ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК, УСТОЙЧИВЫХ К ЗАБОЛЕВАНИЯМ И

СПОСОБНЫХ К ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ

<130> CBR-002PCT

<140> PCT/US2008/065007

<141> 2008-05-28

<150> 61/064,761

<151> 2008-03-25

<150> 61/006,449

<151> 2008-01-14

<150> 60/933,670

<151> 2007-06-08

<150> 60/933,133

<151> 2007-06-05

<150> 60/932,020

<151> 2007-05-29

<160> 109

<170> PatentIn версия 3.3

<210> 1

<211> 8069

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: искусственный

полинуклеотид

<400> 1

aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60

tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120

tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180

gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240

gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300

tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360

taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 420

aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 480

gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540

actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600

attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660

aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720

gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780

tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840

atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900

aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960

caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020

acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080

tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140

gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200

ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260

ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320

ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380

atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560

ttggctgtgg tatataaдat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620

agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680

tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740

tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcgatg 1800

tcgacgttaa cgctagtgat atcaactttg tatagaaaag ttgaacgaga aacgtaaaat 1860

gatataaata tcaatatatt aaattagatt ttgcataaaa aacagactac ataatactgt 1920

aaaacacaac atatccagtc actatggcgg ccgcattagg caccccaggc tttacacttt 1980

atgcttccgg ctcgtataat gtgtggattt tgagttagga tccgtcgaga ttttcaggag 2040

ctaaggaagc taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat atatcccaat 2100

ggcatcgtaa agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc tataaccaga 2160

ccgttcagct ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag cacaagtttt 2220

atccggcctt tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa ttccgtatgg 2280

caatgaaaga cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac accgttttcc 2340

atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt 2400

ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc tatttcccta 2460

aagggtttat tgagaatatg tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt 2520

ttgatttaaa cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat 2580

attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt 2640

gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc 2700

agggcggggc gtaaagatct ggatccggct tactaaaagc cagataacag tatgcgtatt 2760

tgcgcgctga tttttgcggt ataagaatat atactgatat gtatacccga agtatgtcaa 2820

aaagaggtat gctatgaagc agcgtattac agtgacagtt gacagcgaca gctatcagtt 2880

gctcaaggca tatatgatgt caatatctcc ggtctggtaa gcacaaccat gcagaatgaa 2940

gcccgtcgtc tgcgtgccga acgctggaaa gcggaaaatc aggaagggat ggctgaggtc 3000

gcccggttta ttgaaatgaa cggctctttt gctgacgaga acagggactg gtgaaatgca 3060

gtttaaggtt tacacctata aaagagagag ccgttatcgt ctgtttgtgg atgtacagag 3120

tgatattatt gacacgcccg ggcgacggat ggtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct 3180

gtcagataaa gtctcccgtg aactttaccc ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg 3240

catgatgacc accgatatgg ccagtgtgcc ggtctccgtt atcggggaag aagtggctga 3300

tctcagccac cgcgaaaatg acatcaaaaa cgccattaac ctgatgttct ggggaatata 3360

aatgtcaggc tccgttatac acagccagtc tgcaggtcga ccatagtgac tggatatgtt 3420

gtgttttaca gtattatgta gtctgttttt tatgcaaaat ctaatttaat atattgatat 3480

ttatatcatt ttacgtttct cgttcagctt tcttgtacaa agtggttgat atccagcaca 3540

gtggcggccg ctcgagtcta gagggcccgc ggttcgaagg taagcctatc cctaaccctc 3600

tcctcggtct cgattctacg cgtaccggtt agtaatgagt ttggaattaa ttctgtggaa 3660

tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 3720

catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag 3780

aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc 3840

catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt 3900

ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg 3960

aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgta tatccatttt 4020

cggatctgat cagcacgtgt tgacaattaa tcatcggcat agtatatcgg catagtataa 4080

tacgacaagg tgaggaacta aaccatggcc aagcctttgt ctcaagaaga atccaccctc 4140

attgaaagag caacggctac aatcaacagc atccccatct ctgaagacta cagcgtcgcc 4200

agcgcagctc tctctagcga cggccgcatc ttcactggtg tcaatgtata tcattttact 4260

gggggacctt gtgcagaact cgtggtgctg ggcactgctg ctgctgcggc agctggcaac 4320

ctgacttgta tcgtcgcgat cggaaatgag aacaggggca tcttgagccc ctgcggacgg 4380

tgccgacagg tgcttctcga tctgcatcct gggatcaaag ccatagtgaa ggacagtgat 4440

ggacagccga cggcagttgg gattcgtgaa ttgctgccct ctggttatgt gtgggagggc 4500

taagcacaat tcgagctcgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct 4560

tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca 4620

agatctgctt tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct 4680

ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca 4740

agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta 4800

gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc agtatttata 4860

acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag cttataatgg 4920

ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 4980

tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct agctatcccg 5040

cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 5100

ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 5160

cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctagggacgt acccaattcg ccctatagtg 5220

agtcgtatta cgcgcgctca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 5280

gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 5340

aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg 5400

cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 5460

cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 5520

tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 5580

ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 5640

cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 5700

tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 5760

ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 5820

cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 5880

cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 5940

ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 6000

ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 6060

aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 6120

actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 6180

gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 6240

agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 6300

cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 6360

catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 6420

aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 6480

gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 6540

aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 6600

agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 6660

ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 6720

actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 6780

aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 6840

gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 6900

atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 6960

tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 7020

tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 7080

ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 7140

agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 7200

ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 7260

tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 7320

gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 7380

cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 7440

ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 7500

agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 7560

tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 7620

ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 7680

ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 7740

ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa 7800

accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 7860

ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 7920

ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 7980

atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta 8040

aagggaacaa aagctggagc tgcaagctt 8069

<210> 2

<211> 22460

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: искусственный

полинуклеотид

<400> 2