Штамм "O/ARRIAH/Mya-98" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке и изготовлении средств диагностики, специфической профилактики ящура, вызванного изолятами, родственными штамму «О/ARRIAH/Mya-98» и для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Вирус ящура (FMDV) относится к семейству Picornaviridae и является патогеном, вызывающим одно из самых разрушительных и высококонтагиозных заболеваний животных в мире [1]. Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК (ssRNA(+)) положительной полярности с длиной около 8400-8500 н.о., кодирует 12 белков, включая четыре структурных белка (VP₁, VP₂, VP₃, VP₄) и восемь неструктурных белков (L^pro, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C и 3D) [2]. Неструктурные белки FMDV вместе с некоторыми белками хозяина образуют сайты репликации вируса. Белок 3A благодаря своему гидрофобному мотиву закрепляется на внутриклеточной мембране клетки-хозяина [3, 4]. Данный белок является важным компонентом для формирования комплекса репликации вируса ящура и опосредует локализацию комплекса репликации вируса в структуре клеточной мембраны. Белок 3A является одним из вирусных белков, влияющих на вирулентность вируса ящура, но при этом основные механизмы данного процесса остаются неясными.

Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: O, А, Азия-1, C и SAT-1, SAT-2, SAT-3, один из самых распространенных является тип О [1, 5, 6]. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии (для некоторых штаммов ограничиваются только топотипом, поскольку для них более глубокого разделения не существует на сегодняшний день). Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [3, 4].

В пределах одного генотипа имеет место явление мутационной изменчивости, что приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура даже в рамках одной генетической линии.

Белок VP₁ вируса ящура является наиболее вариабельным, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой изменчивостью, поскольку участвует в распознавании рецепторов клетки-хозяина [5, 6]. Филогенетический анализ на основе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁) широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения возбудителя вируса ящура [5].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием поверхностных вирусных белков и факторов клеток-хозяев [4-7].

Серотип О вируса ящура является наиболее изученным и распространенным во всем мире. Данный серотип разделен на 11 топотипов: EAST AFRICA 1 - 4 (Восточная Африка) (EA-1-4), SOUTHEAST ASIA (Юго-Восточная Азия) (SEA), EUROPE-SOUTH AMERICA (Европа-Южная Америка) (EURO-SA), INDONESIA-1 и 2 (Индонезия-1 и 2) (ISA-1 и ISA-2), CATHAY (Китай), MIDDLE EAST-SOUTH ASIA (ME-SA) (Ближний Восток-Южная Азия) и WEST AFRICA (Западная Африка) (WA) [1, 6. 8]. Высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа О и, в частности, штамма «O/ARRIAH/Mya-98», представители которого распространены на территории Южной Америки и за ее пределами, где вспышки данного представителя вируса ящура имеют спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи со странами этого региона, в частности, Бразилией, Аргентиной, Чили, Венесуэлой и др. Имеются риски заноса возбудителя, имеющего высокую степень генетического родства с представленными штаммами на территорию Российской Федерации. Это обстоятельство является угрожающим фактором в отношении распространения данного представителя вируса ящура на территории нашей страны и требует исследования штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа О, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «О №1715/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94),

- штамм «О №2212/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм «О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм «О №2008/Саудовская Аравия/2008» (генотип O/ME-SA/PanAsia2),

- штамм «О №2311/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001d).

Изолят вируса ящура был выделен в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, отобранного от крупного рогатого скота на территории Федеративной Республики Бразилия в 1994 году. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» изолят был охарактеризован и получил название - штамм «О/ARRIAH/Mya-98» [9].

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу O/SEA/Mya-98 вируса ящура и значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа О, в частности, штамма «О №2212/Приморский/2014».

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа О, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура.

Штамм вируса ящура «O/ARRIAH/Mya-98» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №488 - деп / 23-38 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР₁;

Фиг. 2. - Данные гель-электрофореза очищенного препарата антигена вируса ящура штамма «O/ARRIAH/Mya-98». Примечание: А - белковый маркер молекулярного веса, Б - исследуемый образец антигена вируса ящура указанного штамма.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР₁ штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура.

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип О, генотип O/SEA/Mya-98.

Штамм обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 24 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура принадлежит к генотипу O/SEA/Mya-98 (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура изучено в РМН, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа О, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [10-12].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящемся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «O/ARRIAH/Mya-98» составили r₁ от 0,17 до 0,28, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа О (табл. 1).

Генно- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,83×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г.

Плавучая плотность 1,42 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,45-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильнощелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,1°С).

Дополнительные признаки и свойства штамма вируса ящура

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях.

При выделении изолята вируса ящура, из которого получили штамм «O/ARRIAH/Mya-98» с целью наработки его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [10].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию вируса ящура к ним.

Выделение вируса ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 33%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хэнкса с 0,5% гидролизата лактальбумина по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором трихлорметана. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37±0,5°C во флаконы вносили по 5,0 см³ поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37±0,1°C до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация представленного эпизоотического изолята к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности определяли с помощью разработанной ранее методики [13].

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности представленного изолята вируса ящура к использованным клеточным линиям.

В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 12 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,82±0,09 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 18 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,24±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 18 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,35±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 5 раз. В итоге получен штамм «О/ARRIAH/Mya-98» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Оценка биологических свойств штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура на КРС проводили в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе 2 пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения в 1/15 М фосфатном буферном растворе (ФБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учёт результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «О/ARRIAH/Mya-98». Титр инфекционной активности на КРС данного штамма вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «О/ARRIAH/Mya-98» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура на свиньях вели в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт 2 пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учёт результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,25 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,45-7,50. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,1°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 95%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ) с помощью ранее разработанных методик [14, 15]. Полученные суспензии были стерильными. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 3,46±0,18 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура отражены в таблице 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, равной 4,02±0,10 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/клетку и продолжительности репродукции вируса 6,55±0,28 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 10,16±0,25 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [14]. Содержание данного компонента составило 75,16±0,46 % (2,60±0,13 мкг/см³).

Пример 5. Оценка типовой специфичности и активности штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура

Оценку типовой специфичности и активности штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК).

К полученному антигену штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37±0,1°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37±0,1°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «О/ARRIAH/Mya-98» (предлагаемое изобретение), «О №2147/Приморский/2012» «А/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/SAU 7/2000», комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН = 7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «О/ARRIAH/Mya-98», «О №2147/Приморский/2012» «А/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/SAU 7/2000».

Результаты исследования отражены в таблице 4, из которой следует, что штамм «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа О и активен в РСК в разведении 1:64.

Пример 6. Получение, контроль качества и применение антигена штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура.

Для получения антигена штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура как компонента биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4±2°С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA) или аналоге. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натрия (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 22±1 ч. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин, осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 100 раз (1/100 от первоначального объёма).

К полученному преципитату добавляли 50% трихлорметана, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

Для получения очищенного антигена штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Инактивированную суспензию вируса ящура наливали по 10 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-ного и заканчивая 50%-ным раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Опалесцирующий слой, содержащий очищенный антиген вируса ящура, располагается приблизительно в 30%-ным слое сахарозы. Данную фракцию переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 40 000 об/мин и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура представлены в таблице 5. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для 6-12 фракции с максимальными значениями для 8-10 пиков.

Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для отобранной фракции. Полученные результаты отражены на фиг. 2, из которой видно, что полученный очищенный антиген вируса ящура.

С помощью реакции связывания комплемента определили концентрацию 146S компонента в полученном антигене, которая составила 260,54±0,57 мкг/см³ (n=3, p<0,005), что вполне достаточно для использования при изготовлении диагностических наборов для выявления антигена и антител против вируса ящура, а также изготовления специфических препаратов для профилактики данного заболевания.

Таким образом, проведены получение и контроль качества антигена штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура.

Полученный антиген использовали в качестве биопрепарата для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «О/ARRIAH/Mya-98» в исследуемых пробах при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 752 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 752 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 200 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 200 заявленных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа, определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,51-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,17-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,61-100,00%. Таким образом, полученный антиген штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура применим для использования в качестве биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура.

Пример 7. Получение, контроль качества и применение сывороток крови кролика против антигена штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура как биопрепарата для диагностики ящура.

Для получения сыворотки крови кролика против антигена штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура применяли 20 клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса ящура, полученный как описано в примере 6, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG (в соотношении адъювант/антиген = 60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую антитела против антигена штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.

Полученные 20 сывороток крови кроликов проверяли в реакции связывания комплемента и определили, что их активность составила 1:11000-1:12000. Данные показатели являются высокими и достаточными для изготовления диагностических наборов по выявлению антигена и антител против вируса ящура.

Изготовленные сыворотки крови объединили в общий пул, провели лиофильную сушку и, таким образом, получили биопрепарат, который использовали для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «О/ARRIAH/Mya-98».

Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 659 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 659 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 198 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 198 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,44-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,15-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,57-100,00%.

Таким образом, полученный антиген вируса ящура штамма «О/ARRIAH/Mya-98» применим для иммунизации животных как биопрепарат. Проведены получение и контроль качества сывороток крови кролика против антигена штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура, а также показано применение полученной сыворотки как биопрепарата для диагностики ящура.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура».

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, 2018. - Ch. 3.1.8.

2. Beard CW, Mason PW. 2000. Genetic determinants of altered virulence of Taiwanese foot-and-mouth disease virus. J Virol 74:987-991.

3. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

4. Pacheco JM, Gladue DP, Holinka LG, Arzt J, Bishop E, Smoliga G, Pauszek SJ, Bracht AJ, O9Donnell V, Fernandez-Sainz I, Fletcher P, Piccone ME, Rodriguez LL, Borca MV. 2013. A partial deletion in non-structural protein 3A can attenuate foot-and-mouth disease virus in cattle. Virology 446: 260-267.

5. Gao H, Wang J, Zhao G, Zhu M, He Y, Xin A. 2020. Substitution 3A protein of foot-and-mouth disease virus of attenuated ZB strain rescued the viral replication and infection in bovine cells. Res Vet Sci 128:145-152.

6. Liu Y, Zhu Z, Zhang M, Zheng H. 2015. Multifunctional roles of leader protein of foot-and-mouth disease viruses in suppressing host antiviral responses. Vet Res 46:127.

7. Жильцова М.В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф… дис. кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.

8. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

9. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В. П. Семакина, Т. П. Акимова, В. А. Мищенко, А. К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - № 11. - С. 16-20.

10. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А. А. Гусев, В. М. Захаров, Ж. А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.

11. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С. Р. Кременчугская, М. В. Жильцова, Т. К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2012. - 36 с.

12. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А. В. Мищенко, В. А. Мищенко, В. В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - № 11. - С. 20-24.

13. Патент № 2674076 C1 Российская Федерация, МПК А61K 39/135, С12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: № 2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

14. Патент № 2712769 C1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: № 2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

15. Европейская фармакопея. Версия 11.0. Стерильность. Раздел 2.6.1 - 2023 г. URL: https://www.webofpharma.com/ (дата обращения: 23.06.2023).

Таблица 1
Антигенное соответствие (r₁) штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура с производственными штаммами вируса ящура серотипа О в реакции микронейтрализации Исследуемые штаммы вируса ящура Значения показателя r₁ в реакции микронейтрализации с производственными штаммами вируса ящура для штамма «O/ARRIAH/Mya-98» «О №2212/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98) (прототип) 0,28 «О №1715/Тайвань/1997»
(генотип O/CATHAY/CAM 94) 0,13 «О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia) 0,23 «О №2008/Саудовская Аравия/2008» (генотип O/ME-SA/PanAsia2) 0,20 «О №2311/Забайкальский/2016»
(генотип O/ME-SA/Ind-2001d) 0,17

Таблица 2
Биологические свойства штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура при культивировании в клеточных линиях
(n=5, p<0,005) Наименование клеточной линии Время проявления биологической активности, ч Количество адаптационных пассажей Характеристика адаптированного материала Активность в РСК Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД₅₀/см³ ПСГК-30 12 5 1:32 7,82±0,09 IB-RS-2 18 5 1:16 7,24±0,10 ВНК-21 18 5 1:16 7,35±0,10

Таблица 3
Оценка стабильности репродукции штамма «О/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH (n=10, p<0,01) № п/п Концентрация клеток, млн/см³ Доза заражения, ТЦД₅₀/кл. Длительность репродукции, ч Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД₅₀/см³ Концент-рация ОВБ, мкг/см³ Концентрация 146S компонента, мкг/см³ Содержание 146S компонента, % 1 4,0 0,005 6,5 10,25 3,42 2,57 75,2 2 4,0 0,005 6,5 10,24 3,42 2,60 75,9 3 4,0 0,005 6,5 10,02 3,48 2,60 74,6 4 4,2 0,005 7,0 10,53 3,71 2,78 75,0 5 4,0 0,005 6,5 10,05 3,44 2,59 75,2 6 4,0 0,005 6,5 10,00 3,41 2,57 75,3 7 3,9 0,005 6,5 9,97 3,30 2,50 75,9 8 3,9 0,005 6,0 9,74 3,19 2,38 74,5 9 4,2 0,005 7,0 10,52 3,80 2,85 75,0 10 4,0 0,005 6,5 10,29 3,43 2,57 75,0 M±m 4,02±0,10 0,005 6,55±0,28 10,16±0,25 3,46±0,18 2,60±0,13 75,16±0,46 Примечание: ОВБ - общий вирусный белок,
146S - иммуногенный компонент,
ТЦД - тканевая цитопатическая доза.

Таблица 5
Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура (n = 3, p<0,005) № фракции п/п Значение оптической плотности (ОП), у.е. 1 0,010±0,001 2 0,119±0,001 3 0,653±0,001 4 1,456±0,002 5 1,756±0,001 6 2,387±0,001 7 2,755±0,002 8 3,002±0,002 9 3,369±0,001 10 3,007±0,001 11 2,715±0,001 12 1,656±0,002 13 0,954±0,001 14 0,013±0,001

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/SEA/Mya-98, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №488 - деп / 23-38 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В перевиваемой суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 6,55±0,28 часов инкубирования концентрация 146S компонента штамма «O/ARRIAH/Mya-98» вируса ящура имеет средние значения 2,60±0,13 мкг/см³ (75,16±0,46%), сохраняя исходные характеристики при пассировании в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Представленный штамм «O/ARRIAH/Mya-98» может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/SEA/Mya-98 и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 2 ил., 5 табл., 7 пр.

Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae «O/ARRIAH/Mya-98», депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №488 - деп / 23-38 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/SEA/Mya-98.