По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США 61/968437, поданной 21 марта 2014 г. Содержание вышеупомянутой заявки включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Биспецифические антигенсвязывающие полипептиды, такие как антитела и антителоподобные молекулы, весьма перспективны в качестве терапевтических средств из-за их способности направленно связываться с множественными антигенами одновременно. Тем не менее, получение этих молекул является сложной задачей. В случае биспецифических антител в процессе получения часто имеет место неправильное спаривание как тяжелых, так и легких цепей, что снижает выход биспецифических антител и делает очистку сложной задачей.
Для преодоления проблем, связанных с получением биспецифических антител, были предприняты попытки комплексного создания константной или вариабельной области в антителе. Например, были получены биспецифические антитела, в которых VH и VL индивидуальных антител генетически соединены через линкер (см., например, патент US2010/0254989A1). В другом подходе получали индивидуальные антитела с мутациями в остатках Fc IgG4 человека, ответственного за обмен Fab (см., например, Van der Neut et al., Science (2007) 317: 1554). При еще одном подходе для генерации биспецифических антител использовали квадромы мыши. При таком подходе антитела мыши и крысы образуют преимущественно исходные пары VH/VL, и биспецифическое антитело состоит из Fc крысы и мыши (см., например, Lindhofer et al., J Immunol. (1995) 155: 1246-1252). Наконец, созданы биспецифические антитела, которые используют одну общую легкую цепь, которая не вносит вклад в связывание антигена (см., например, Merchant et al., Nature Biotechnology (1998) 16: 677-681). Тем не менее, несмотря на эти значительные попытки конструирования антител, биспецифические антитела продолжают характеризоваться плохой стабильностью и низкими выходами функциональной экспрессии.
Соответственно, в данной области техники существует потребность в новых антигенсвязывающих полипептидах, которые экспрессируются на высоком уровне и легко подвергаются очистке.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к биспецифическим антигенсвязывающим полипептидам, которые экспрессируются на высоком уровне, легко поддаются очистке, высоко устойчивы и обладают высоким сродством к их антигенам-мишеням. В некоторых вариантах осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды связываются как с PDGFRβ, так и с HER2 с высокой степенью сродства и обладают антагонистической активностью в отношении как PDGFRβ, так и HER2. В некоторых вариантах осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды связываются как с PDGFRβ, так и с VEGF с высокой степенью сродства и обладают антагонистической активностью в отношении как PDGFRβ, так и VEGF. Настоящее изобретение также относится к новым антигенсвязывающим полипептидам (например, доменам VH), которые специфически связываются с HER2 и обладают антагонистической активностью в отношении HER2. Такие антигенсвязывающие полипептиды являются особенно полезными для лечения рака. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антигенсвязывающие полипептиды, к рекомбинантным экспрессионным векторам и клеткам-хозяевам для получения таких антигенсвязывающих полипептидов. Настоящим изобретением также охватываются способы применения антигенсвязывающих полипептидов согласно изобретению для лечения заболевания (например, рака).
Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к выделенному биспецифическому антигенсвязывающему полипептиду, включающему тяжелую цепь антитела, включающую первый домен VH, который специфически связывается с первым антигеном, связанный с C-конца со вторым доменом VH, который специфически связывается со вторым антигеном, где полипептид лишен легких цепей антитела.
В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь антитела генетически связана со вторым доменом VH через аминокислотный линкер. В одном конкретном варианте осуществления линкер включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No: 23.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий полипептид дополнительно включает легкую цепь антитела, причем легкая цепь включает домен VL, который специфически связывается с антигеном, где тяжелая и легкая цепи образуют пары естественным образом. В одном конкретном варианте осуществления домен VL связывается с первым антигеном. В одном конкретном варианте осуществления домен VL связывается с третьим антигеном. В одном конкретном варианте осуществления первый и третий антигены находятся в разных областях одной и той же молекулы. В одном конкретном варианте осуществления первый и третий антигены находятся в различных молекулах.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антигенсвязывающему полипептиду, включающему димер двух антигенсвязывающих полипептидов, раскрытых в данном описании, причем два антигенсвязывающих полипептида димеризуются естественным образом через константные области тяжелых цепей. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигены различны. В одном конкретном варианте осуществления первый и второй антигены находятся в разных областях одной и той же молекулы. В одном конкретном варианте осуществления первый и второй антигены находятся в различных молекулах.
В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой PDGFRβ или HER2 человека. В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой PDGFRβ или HER2 человека.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий полипептид включает домен VH, который специфически связывается с HER2 человека и включает HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1, 4, 7 и 10. В некоторых вариантах осуществления домен VH дополнительно включает HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 2, 5, 8 или 11. В некоторых вариантах осуществления домен VH дополнительно включает HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 3, 6, 9 или 12. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность домена VH характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью домена VH, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 13, 14, 15 и 16. В некоторых вариантах осуществления домен VH включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 13, 14, 15 и 16.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий полипептид включает домен VH, который специфически связывается с PDGFRβ человека и включает HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления домен VH дополнительно включает HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления домен VH дополнительно включает HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления домен VH включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий полипептид включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NOs: 18 или 20.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий полипептид включает домен VL, который специфически связывается с PDGFRβ человека и включает LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления домен VL дополнительно включает LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления домен VL дополнительно включает LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления домен VL включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий полипептид включает легкую цепь антитела, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному антигенсвязывающему полипептиду, который специфически связывается с HER2, включающему CDR3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1, 4, 7 и 10.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий полипептид включает домен VH, включающий CDR3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1, 4, 7 и 10. В некоторых вариантах осуществления домен VH дополнительно включает CDR2, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 2, 5, 8 или 11. В некоторых вариантах осуществления домен VH дополнительно включает CDR1, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 3, 6, 9 или 12. В некоторых вариантах осуществления домен VH включает аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 13, 14, 15 и 16. В некоторых вариантах осуществления домен VH включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 13, 14, 15 и 16.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антигенсвязывающему полипептиду, который связывается с тем же эпитопом на HER2, что и домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 13, 14, 15 и 16. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий полипептид включает домен VH.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антигенсвязывающему полипептиду, который конкурирует за связывание с HER2, с доменом VH, имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 13, 14, 15 и 16. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий полипептид включает домен VH.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей антигенсвязывающий полипептид по настоящему изобретению.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному экспрессионному вектору, включающему выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенсвязывающий полипептид по настоящему изобретению.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, экспрессирующей антигенсвязывающий полипептид по настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антигенсвязывающего полипептида по настоящему изобретению, включающему культивирование клетки-хозяина, способной экспрессировать связывающий полипептид согласно изобретению, в таких условиях, что антигенсвязывающий полипептид продуцируется клеткой-хозяином.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей антигенсвязывающий полипептид по изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения, включающему введение пациенту фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение представляет собой рак (например, рак молочной железы и рак яичников).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 представляет собой схематическое изображение иллюстративного биспецифического антигенсвязывающего полипептида согласно изобретению.
Фигура 2 представляет собой схематическое изображение иллюстративного биспецифического антигенсвязывающего полипептида согласно изобретению.
Фигура 3 представляет собой схематическое изображение иллюстративного биспецифического антигенсвязывающего полипептида согласно изобретению.
Фигура 4 представляет собой схематическое изображение иллюстративного биспецифического антигенсвязывающего полипептида согласно изобретению.
На фигуре 5 показан гель-электрофорез SDS-PAGE иллюстративного биспецифического антигенсвязывающего полипептида согласно изобретению в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.
На фигуре 6 показаны результаты анализа ELISA, детектирующего экспрессию биспецифического антигенсвязывающего полипептида HER2/PDGFRβ в надосадочной жидкости клеточной культуры HEK293.
На фигуре 7 показаны результаты анализа ELISA при измерении одновременного связывания биспецифического антигенсвязывающего полипептида HER2/PDGFRβ с HER2 и PDGFRβ.
На фигуре 8 показаны результаты связывающего анализа на основе FACS при измерении одновременного связывания биспецифического антигенсвязывающего полипептида HER2/PDGFRβ с HER2 и PDGFRβ, экспрессирующихся на клеточной поверхности.
На фигуре 9 представлены результаты анализа Biacore и FACS иллюстративного домена VH против HER2, раскрытого в настоящем описании.
На фигуре 10 представлены результаты анализа Biacore и FACS иллюстративного домена VH против HER2 и производного scFv, раскрытых в настоящем описании.
На фигуре 11 представлены результаты анализа пролиферации клеток MTS при измерении влияния VH антитела B12 против HER2, трастузумаба, пертузумаба и их сочетаний на пролиферацию клеток SK-BR-3.
Фигура 12 представляет собой схематическое изображение иллюстративного биспецифического антигенсвязывающего полипептида против HER2 согласно изобретению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к биспецифическим антигенсвязывающим полипептидам, которые экспрессируются на высоком уровне, легко подвергаются очистке, чрезвычайно устойчивы и обладают высоким сродством к их антигенам-мишеням. В некоторых вариантах осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды связываются как с PDGFRβ, так и с HER2 с высокой степенью сродства и обладают антагонистической активностью в отношении как PDGFRβ, так и HER2. В некоторых вариантах осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды связываются как с PDGFRβ, так и с VEGF с высокой степенью сродства и обладают антагонистической активностью в отношении как PDGFRβ, так и VEGF. Настоящее изобретение также относится к новым антигенсвязывающим полипептидам (например, доменам VH), которые специфически связываются с HER2 и обладают антагонистической активностью в отношении HER2. Такие антигенсвязывающие полипептиды являются особенно полезными для лечения рака. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антигенсвязывающие полипептиды, к рекомбинантным экспрессионным векторам и клеткам-хозяевам для получения таких антигенсвязывающих полипептидов. Настоящим изобретением также охватываются способы применения антигенсвязывающих полипептидов согласно изобретению для лечения заболевания (например, рака).
I. Определения
Для возможности более легкого понимания настоящего изобретения первоначально дается определение некоторых терминов.
Используемый в настоящем описании термин «PDGFRβ» относится к рецептору бета фактора роста тромбоцитов. Нуклеотидные и полипептидные последовательности PDGFRβ хорошо известны в данной области техники. Иллюстративная аминокислотная последовательность PDGFRβ человека представлена в GenBank, депозит GI:4505683 и иллюстративная аминокислотная последовательность PDGFRβ мыши представлена в GenBank, депозит GI:226371752.
Используемый в настоящем описании термин «HER2» относится к рецепторной тирозинкиназной протеинкиназе ErbB-2. Нуклеотидные и полипептидные последовательности HER2 хорошо известны в данной области техники. Иллюстративная аминокислотная последовательность HER2 человека представлена в GenBank, депозит GI:54792096 и иллюстративная аминокислотная последовательность HER2 мыши представлена в GenBank, депозит GI:54873610.
Используемый в настоящем описании термин «VEGF» относится ко всем членам семейства фактора роста сосудистого эндотелия, включая VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, их белковые и сплайсинговые варианты, включая VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189 и VEGF206. Нуклеотидные и полипептидные последовательности VEGF хорошо известны в данной области техники. Иллюстративная аминокислотная последовательность VEGF человека представлена в GenBank, депозит GI:32699990 и иллюстративная аминокислотная последовательность VEGF мыши представлена в GenBank, депозит GI:160358815.
Используемый в настоящем описании термин «биспецифический антигенсвязывающий полипептид» относится к антигенсвязывающему полипептиду, который может специфически связываться с двумя или более различными антигенами одновременно.
Используемый в настоящем описании термин «антиген» относится к связываемому сайту или эпитопу, узнаваемому антигенсвязывающим полипептидом.
Используемый в настоящем описании термин «антитело» относится к молекулам иммуноглобулина, включающим четыре полипептидные цепи, две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, а также к их мультимерам (например, IgM). Каждая тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи включает три домена, CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь включает вариабельную область легкой цепи (сокращенно VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи включает один домен (CL1). Области VH и VL могут дополнительно подразделяться на области гипервариабельности, обозначаемые как области, определяющие комплементарность (CDRs), перемежающиеся областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR).
Используемый в настоящем описании термин «антигенсвязывающая часть» антитела включает любой встречающийся в природе, ферментативно получаемый, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, который специфически связывается с антигеном с образованием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антитела могут быть получены, например, из полноразмерных молекул антител с использованием любых подходящих стандартных методов, таких как протеолитическое расщепление или методы рекомбинантной генной инженерии, включая манипуляции c ДНК и экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и необязательно константные домены антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих частей включают: (i) Fab-фрагменты; (ii) F(аb')2-фрагменты; (iii) Fd-фрагменты; (iv) Fv-фрагменты; (v) одноцепочечные Fv (scFv) молекулы; (vi) Dab-фрагменты; и (vii) минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенную область, определяющую комплементарность (CDR)). Другие сконструированные молекулы, такие как диатела, триатела, тетратела и минитела также охватываются выражением «антигенсвязывающая часть».
Используемые в настоящем описании термины «домен VH» и «домен VL» относятся к единичным вариабельным тяжелым и легким доменам антитела, соответственно, включающим FR (каркасные области) 1, 2, 3 и 4 и CDR (области, определяющие комплементарность) 1, 2 и 3 (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH Publication No. 91-3242, Bethesda).
Используемый в настоящем описании термин «естественным образом димеризованные» относится к димерам антигенсвязывающих полипептидов, у которых константные области тяжелых цепей связаны таким же образом, что и в природной, тетрамерной молекуле антитела.
Используемый в настоящем описании термин «естественным образом спаренные» относится к парам тяжелой и легкой цепи антитела, которые связаны через природную поверхность взаимодействия тяжелой цепи/легкой цепи таким же образом, что и в природной тетрамерной молекуле антитела.
Используемый в настоящем описании термин «CDR» или «область, определяющая комплементарность» означает несмежные антигенсвязывающие сайты, найденные в пределах вариабельной области полипептидов как тяжелой, так и легкой цепи. Эти конкретные области были описаны в статьях Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977), Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), и MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) (каждая из которых включена в данное описание в качестве ссылки в полном объеме), где определения включают перекрывающиеся аминокислотные остатки или их подгруппы при сравнении относительно друг друга. Аминокислотные остатки, которые охватываются CDRs, как определяется каждой из указанных выше цитируемых ссылок, приводятся для сравнения. Предпочтительно термин «CDR» представляет собой CDR, как определено по Kabat, на основании сравнений последовательностей.
Используемый в настоящем описании термин «аминокислотные остатки каркаса (FR)» относится к аминокислотам в каркасной области иммуноглобулиновой цепи. Термин «каркасная область» или «область FR», используемый в настоящем описании, включает аминокислотные остатки, которые являются частью вариабельной области, но не являются частью CDRs (например, при использовании определения CDRs по Kabat).
Используемый в настоящем описании термин «генетически соединенный» относится к соединению двух или более полипептидов с использованием методов рекомбинантной ДНК. В некоторых вариантах осуществления это включает получение химерного гена, кодирующего гибрид из двух или более полипептидов.
Используемый в настоящем описании термин «специфически связывается с» относится к способности связывающего полипептида связываться с антигеном с Kd по меньшей мере приблизительно 1×10-6 М, 1×10-7 М, 1×10-8 М, 1×10-9 М, 1×10-10 М, 1×10-11 М, 1×10-12 М или более, и/или связываться с антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза выше его аффинности к неспецифическому антигену. Должно быть понятно, однако, что связывающий полипептид способен специфически связываться с двумя или более антигенами, которые родственны по последовательности. Например, связывающие полипептиды согласно изобретению могут специфически связываться как с антигеном человека, так и с ортологом этого антигена, происходящим не от человека.
Используемый в настоящем описании термин «вектор» предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Один тип вектора представляет собой «плазмиду», которой обозначается кольцевая петля двухцепочечной ДНК, в которую могут быть вставлены лигированием дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы обозначаются в настоящем описании как «рекомбинантные экспрессионные векторы» (или просто «экспрессионные векторы»). В общем случае экспрессионные векторы, используемые в методах рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. Термины «плазмида» и «вектор» могут быть использованы взаимозаменяемо. Тем не менее, настоящее изобретение предназначено для включения других таких форм экспрессионных векторов, таких как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Используемый в настоящем описании термин «клетка-хозяин» предназначен для обозначения клетки, в которую был введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что этот термин предназначен для обозначения не только конкретной исследуемой клетки, но и потомства такой клетки. Поскольку определенные модификации могут происходить в последующих поколениях вследствие либо мутации, либо воздействий окружающей среды, такое потомство может на самом деле не быть идентичным родительской клетке, но все еще включается в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем описании.
Используемый в настоящем описании термин «заболевание или нарушение, связанное с PDGFRβ», включает состояния, заболевания и/или симптомы, связанные с активностью PDGFRβ. Иллюстративные заболевания или нарушения, связанные с PDGFRβ, включают, но не ограничиваются этим, связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна (AMD) и рак.
Используемый в настоящем описании термин «заболевание или нарушение, связанное с HER2», включает состояния, заболевания и/или симптомы, связанные с активностью HER2. Иллюстративные заболевания или нарушения, связанные с HER2, включают, но не ограничиваются этим, рак (например, рак молочной железы и рак яичников).
Используемый в настоящем описании термин «заболевание или нарушение, связанное с VEGF», включает состояния, заболевания и/или симптомы, связанные с активностью VEGF. Иллюстративные заболевания или нарушения, связанные с VEGF, включают, но не ограничиваются этим, состояния, связанные с неоваскуляризацией, например, связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна (AMD) и рак.
Используемые в настоящем описании термины «лечить», «проводить лечение» и «лечение» относятся к терапевтическим или профилактическим мерам, описанным в настоящем документе. В методах «лечения» используется введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению индивидууму, например, индивидууму, страдающему заболеванием или нарушением (например, раком) или предрасположенному к развитию заболевания или нарушения, для предотвращения, излечения, задержки, снижения тяжести или ослабления одного или более симптомов заболевания или нарушения или рецидивирующего заболевания или нарушения, или для того, чтобы продлить жизнь индивидуума выше ожидаемой при отсутствии такого лечения.
Используемый в настоящем описании термин «эффективное количество» относится к такому количеству связывающего полипептида, которое является достаточным для осуществления лечения, прогнозирования или диагностики заболевания или нарушения при введении индивидууму. Терапевтически эффективное количество должно варьироваться в зависимости от индивидуума и патологического состояния, подлежащего лечению, массы и возраста индивидуума, тяжести патологического состояния, способа введения и тому подобного, что легко может быть определено обычным специалистом в данной области техники. Дозы для введения могут находиться в диапазоне, например, от приблизительно 1 нг до приблизительно 10000 мг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 1000 мг или от приблизительно 10 мг до приблизительно 100 мг связывающего полипептида в соответствии с изобретением. Схемы дозирования можно регулировать для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Эффективное количество представляет собой также количество, при котором любые токсические или вредные эффекты (т.е. побочные эффекты) связывающего полипептида сведены к минимуму и/или перевешиваются благоприятными эффектами.
Используемый в настоящем описании термин «индивидуум» включает любого человека или животного, не являющегося человеком.
II. Антигенсвязывающие полипептиды против HER2
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим полипептидам (например, к биспецифическим антигенсвязывающим полипептидам, антителам или их антигенсвязывающим фрагментам), которые специфически связываются с HER2 и ингибируют активность HER2. Такие связывающие полипептиды являются особенно полезными для лечения заболеваний или нарушений, связанных с HER2 (например, типов рака, таких как рак молочной железы и рак яичников).
В целом антигенсвязывающие полипептиды против HER2 согласно изобретению включают аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), которая специфически связывается с HER2. Неограничивающие последовательности HCDR3, пригодные для использования в связывающих полипептидах по настоящему изобретению включают аминокислотные последовательности HCDR3, представленные в настоящем описании в SEQ ID NOs: 1, 4, 7 или 10. В других вариантах осуществления последовательность HCDR3 представляет собой вариант SEQ ID NOs: 1, 4, 7 или 10, который включает по меньшей мере одну (например, одну, две, три и т.д.) консервативные аминокислотные замены по сравнению с SEQ ID NOs: 1, 4, 7 или 10.
Любой полипептид, который может включать последовательности HCDR3, связывающие HER2, раскрытые в настоящем описании, может быть использован для получения антигенсвязывающих полипептидов согласно изобретению, включая без ограничения антитела или их фрагменты (например, домены VH) и иммуноглобулинподобные домены. Подходящие иммуноглобулинподобные домены включают без ограничения фибронектиновые домены (см., например, статью Koide et al. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95-109, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), DARPin (см., например, статью Stumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), Z домены белка А (см. статью Nygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668-76, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), липокалин (см., например, статью Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677-83, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), аффилины (см., например, статью Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85, которая включена в настоящее описании в качестве ссылки в полном объеме), аффитины (см., например, статью Krehenbrink et al. (2008). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-68, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), авимеры (см., например, статью Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), финомеры (см., например, статью Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196-3204, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), а также пептиды домена Kunitz (см., например, статью Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8, которая включена в данное описание в качестве ссылки в полном объеме).
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 включают антитела или фрагменты антител, включающие домен VH. Иллюстративные аминокислотные последовательности доменов CDR и VH, пригодные для использования в настоящем изобретении, приведены в таблице 1 и 2 настоящего документа.
Таблица 1. Аминокислотные последовательности CDR иллюстративных доменов VH против HER2.
Таблица 2. Аминокислотные последовательности иллюстративных доменов VH против HER2.
В некоторых вариантах осуществления домен VH антитела против HER2 включает аминокислотную последовательность HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 1, 4, 7 или 10, совместно с последовательностью HCDR2 и/или HCDR1, независимо друг от друга выбранных из любой из аминокислотных последовательностей тяжелых цепей HCDR2 или HCDR1, представленных в таблице 1.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 включают аминокислотные последовательности HCDR3, HCDR2 и HCDR1, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2 и 3; 4, 5 и 6; 7, 8 и 9; и 10, 11 и 12, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 включают по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей VH, представленных в SEQ ID NO: 13, 14, 15 или 16.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 включают одну или более аминокислотных последовательностей CDR, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-12, где одна или более аминокислотных последовательностей области CDR включает по меньшей мере одну или более консервативных замен аминокислот (например, 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных замен аминокислот). Консервативные аминокислотные замены включают замену аминокислоты в одном классе аминокислотой того же класса, где класс определяется общими физико-химическими свойствами боковых цепей аминокислот и высокой частотой замен в гомологичных белках, обнаруженных в природе, как это определяется, например, с помощью стандартной матрицы Дейхофф частоты замен или матрицы BLOSUM. Шесть общих классов боковых цепей аминокислот разделены на категории и включают: класс I (Cys); класс II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); класс III (Asn, Asp, Gln, Glu); класс IV (His, Arg, Lys); класс V (Ile, Leu, Val, Met); и класс VI (Phe, Tyr, Trp). Например, замещение Asp другим остатком класса III, таким как Asn, Gln или Glu, представляет собой консервативную замену. Таким образом, предсказанный остаток заменимой аминокислоты в антителе против PDGFRβ предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из того же класса. Методы идентификации консервативных аминокислотных замен, которые не препятствуют связыванию антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, статьи Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997), каждая из которых включена в данное описание в качестве ссылки в полном объеме).
В определенном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим полипептидам против HER2, которые включают аминокислотную последовательность области VH и/или VL с идентичностью аминокислотной последовательности приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13, 14, 15 или 16.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 связываются с HER2 с Kd 1,2 нМ. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 связываются с HER2 со скоростью ассоциации 1,3×105 М-1сек-1. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 связываются с HER2 со скоростью диссоциации 1,67×104 сек-1. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 связываются с HER2 с Kd 0,87 нМ при использовании в виде молекулы scFv.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 связываются с другим эпитопом на HER2, чем трастузумаб (CAS# 180288-69-1) и/или пертузумаб (CAS# 380610-27-5). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 связываются с тем же эпитопом на HER2, что и трастузумаб и/или пертузумаб. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2 конкурируют с трастузумабом и/или пертузумабом за связывание с HER2.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против HER2, раскрытые в настоящем описании, интернализуются после связывания с HER2. В одном конкретном варианте осуществления интернализирующийся антигенсвязывающий полипептид против HER2 соединяют с цитотоксической частью (например, с противораковым агентом). Подходящие неограничивающие цитотоксические части раскрыты в настоящем описании.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим полипептидам против HER2, которые связываются с тем же эпитопом на HER2 и/или перекрестно конкурируют с антигенсвязывающим полипептидом, включающим аминокислотную последовательность домена VH, представленную в SEQ ID NO: 13, 14, 15 или 16. Такие антитела могут быть идентифицированы с использованием общепринятых методов конкурентного связывающего анализа, включая, например, конкурентные анализы на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
III. Биспецифические антигенсвязывающие полипептиды
В другом аспекте настоящее изобретение относится к биспецифическим антигенсвязывающим полипептидам, которые специфически связываются с первым и вторым антигенами-мишенями. Любые два антигена могут быть мишенями при использовании биспецифических антигенсвязывающих полипептидов согласно изобретению. В общем случае биспецифические антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению включают тяжелую цепь антитела, причем тяжелая цепь включает первый домен VH, который специфически связывается с первым антигеном, где тяжелая цепь связана со вторым доменом VH, который специфически связывается со вторым антигеном.
Тяжелая цепь антитела может быть связана со вторым доменом VH с использованием известных в данной области техники способов (химических и/или генетических). В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь антитела и второй домен VH связаны генетически. В одном варианте осуществления С-концевая аминокислота тяжелой цепи антитела связана с N-концевой аминокислотой второго домена VH. Эта связь может быть либо прямой, либо через линкер. В одном варианте осуществления изобретения тяжелая цепь антитела связана с N-концевой аминокислотой второго домена VH через аминокислотный линкер, включающий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды представляют собой димеры двух тяжелых цепей антитела, причем каждая тяжелая цепь антитела включает первый домен VH, который специфически связывается с первым антигеном, и где каждая тяжелая цепь антитела связана со вторым доменом VH, который специфически связывается со вторым антигеном. Две тяжелые цепи антитела в димере связаны через поверхность димеризации природной тяжелой цепи таким же образом, что и в случае возникновения связывания в природной молекуле тетрамерного антитела. Иллюстративные биспецифические антигенсвязывающие полипептиды, имеющие эту структуру, изображены в настоящем документе на фигурах 2 и 3.
В некоторых вариантах осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды дополнительно включают легкую цепь антитела. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь образует природную пару с тяжелой цепью через природную поверхность димеризации легкой цепи/тяжелой цепи, таким же образом, что и в случае если образование пары происходит в природной молекуле тетрамерного антитела. Иллюстративные биспецифические антигенсвязывающие полипептиды, имеющие эту структуру, изображены в настоящем документе на фигурах 1 и 4.
Первый и второй антигены могут быть одинаковыми или разными. Если антигены различны, они могут находиться в разных областях одной и той же молекулы или в различных молекулах. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигены представляют собой рецепторы клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой PDGFRβ или HER2 (например, PDGFRβ или HER2 человека). В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой PDGFRβ или HER2 (например, PDGFRβ или HER2 человека). В одном конкретном варианте осуществления первый антиген представляет собой PDGFRβ, а второй антиген представляет собой HER2. В другом конкретном варианте осуществления первый антиген представляет собой HER2, а второй антиген представляет собой PDGFRβ.
В некоторых вариантах осуществления один антиген (первый или второй антиген) представляет собой рецептор клеточной поверхности, и один антиген (первый или второй) представляет собой лиганд (например, фактор роста, такой как VEGF, PDGF или EGF). В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой PDGFRβ или VEGF (например, PDGFRβ или VEGF человека). В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой PDGFRβ или VEGF (например, PDGFRβ или VEGF человека). В одном конкретном варианте осуществления первый антиген представляет собой PDGFRβ, а второй антиген представляет собой VEGF. В другом конкретном варианте осуществления первый антиген представляет собой VEGF, а второй антиген представляет собой PDGFRβ. Такие биспецифические антигенсвязывающие полипептиды являются особенно полезными для лечения заболеваний, связанных с PDGFRβ и связанных с VEGF, таких как AMD и рак.
Первый и третий антигены могут быть в разных областях одной и той же молекулы или в различных молекулах. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь связывается с первым антигеном, и тяжелые и легкие цепи взаимодействуют для создания единого сайта связывания для второго антигена. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь связывается с третьим антигеном. Следует отметить, что если первый, второй и третий антигены различны, то это позволяет получать антигенсвязывающие полипептиды с тремя специфичностями. Такие молекулы также охватываются настоящим изобретением.
Любая тяжелая цепь, легкая цепь, домен VH, домен VL или аминокислотная последовательность CDR антитела может быть использована в антигенсвязывающих полипептидах по настоящему изобретению. Иллюстративные тяжелая цепь, легкая цепь, домен VH, домена VL и аминокислотные последовательности CDR антитела приведены в настоящем описании в таблицах 1-4.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифический антигенсвязывающий полипептид включает домен VH против PDGFRβ, раскрытый в настоящем описании (например, как указано в SEQ ID No: 24) и домены VH и VL антитела, которые связываются с семейством белковых рецепторов EGFR (например, EGFR, HER2, HER3, и/или HER4). Подходящие терапевтические антитела, из которых могут быть получены домены VH и VL, включают без ограничения трастузумаб (CAS# 180288-69-1), пертузумаб (CAS# 380610-27-5) и цетуксимаб (CAS# 205923-56-4). В одном конкретном варианте осуществления биспецифический антигенсвязывающий полипептид создан, как указано на фигуре 4.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифический антигенсвязывающий полипептид включает домен VH против HER2, раскрытый в настоящем описании (например, как указано в SEQ ID Nos: 13-16), и домены VH и VL антитела, которые связываются с членами семейства EGFR (например, EGFR, HER2, HER3, и/или HER4). Подходящие терапевтические антитела, из которых могут быть получены домены VH и VL, включают без ограничения трастузумаб (CAS# 180288-69-1), пертузумаб (CAS# 380610-27-5) и цетуксимаб (CAS# 205923-56-4). В одном конкретном варианте осуществления биспецифический антигенсвязывающий полипептид создан, как указано на фигуре 12.
Таблица 3. Аминокислотные последовательности CDR, VH и VL иллюстративных доменов VH и VL против PDGFRβ.
Таблица 4. Аминокислотные последовательности тяжелых цепей и легких цепей иллюстративных биспецифических антигенсвязывающих полипептидов.
(Сигнальная последовательность подчеркнута)
минус сигнальная последовательность
минус сигнальная последовательность
минус сигнальная последовательность
В некоторых вариантах осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению включают первый домен VH и/или второй домен VH, который специфически связывается с HER2 человека. В некоторых вариантах осуществления домен VH против HER2 включает аминокислотную последовательность HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 1, 4, 7 или 10, совместно с последовательностью HCDR2 и/или HCDR1, выбранных независимо друг от друга из любой из аминокислотных последовательностей HCDR2 или HCDR1 тяжелой цепи, указанных в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления домен VH против HER2 включает аминокислотные последовательности HCDR3, HCDR2 и HCDR1, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2 и 3; 4, 5 и 6; 7, 8 и 9; и 10, 11 и 12, соответственно. В некоторых вариантах осуществления домен VH против HER2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, 14, 15 или 16.
В некоторых вариантах осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению включают первый домен VH и/или второй домен VH, который специфически связывается с PDGFRβ человека. Любой домен VH, который связывается с PDGFRβ, может быть использован в способах по настоящему изобретению. Подходящие домены VH включают домены, указанные в заявке США No.: 13/705978, поданной 5 декабря 2012 г., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления домен VH против PDGFRβ включает аминокислотную последовательность HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления домен VH против PDGFRβ включает аминокислотные последовательности HCDR3, HCDR2 и HCDR1, указанные в SEQ ID NO: 25, 26 и 27, соответственно. В некоторых вариантах осуществления домен VH против PDGFRβ включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению включают домен VL, который специфически связывается с PDGFRβ человека. Любой домен VL, который связывается с PDGFRβ, может быть использован в способах по настоящему изобретению. Подходящие домены VL включают домены, которые представлены в заявке США No.: 13/705978, поданной 5 декабря 2012 г. В некоторых вариантах осуществления домен VH против PDGFRβ включает аминокислотную последовательность HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления домен VL против PDGFRβ включает аминокислотные последовательности HCDR3, HCDR2 и HCDR1, указанные в SEQ ID NO: 29, 30 и 31, соответственно. В некоторых вариантах осуществления домен VL против PDGFRβ включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28.
В одном конкретном варианте осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению включают тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 18 или 20.
В одном конкретном варианте осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению включают легкую цепь антитела, представленную в SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления биспецифические антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению включают одну или более CDR, домен VH, домен VL, тяжелую цепь или легкую цепь, включающую по меньшей мере одну или более консервативных аминокислотных замен (например, 1, 2, 3, 4, 5 и т.д. консервативных аминокислотных замен). Консервативные аминокислотные замены включают замену аминокислоты в одном классе аминокислотой того же класса, где класс определяется общими физико-химическими свойствами боковых цепей аминокислот и высокой частотой замен в гомологичных белках, обнаруженных в природе, как это определяется, например, с помощью стандартной матрицы Дейхофф частоты замен или матрицы BLOSUM. Шесть общих классов боковых цепей аминокислот разделены на категории и включают: класс I (Cys); класс II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); класс III (Asn, Asp, Gln, Glu); класс IV (His, Arg, Lys); класс V (Ile, Leu, Val, Met); и класс VI (Phe, Tyr, Trp). Например, замещение Asp другим остатком класса III, таким как Asn, Gln, или Glu, представляет собой консервативную замену. Таким образом, предсказанный остаток заменимой аминокислоты в антителе против PDGFRβ предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из того же класса. Методы идентификации консервативных аминокислотных замен, которые не препятствуют связыванию антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, статьи Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997), каждая из которых включена в данное описание в качестве ссылки в полном объеме).
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическим антигенсвязывающим полипептидам, которые включают CDR, домен VH, домен VL, аминокислотные последовательности тяжелой цепи или легкой цепи с идентичностью аминокислотных последовательностей приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотными последовательностями CDR, домена VH, домена VL, тяжелой или легкой цепи, описанными в настоящем описании.
IV. Модифицированные антигенсвязывающие полипептиды
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут включать одну или более модификаций. Модифицированные формы антигенсвязывающих полипептидов по настоящему изобретению могут быть получены с использованием любых методов, известных в данной области техники.
i) Снижение иммуногенности
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды (например, биспецифические антигенсвязывающие полипептиды, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты) согласно изобретению модифицированы с целью снижения их иммуногенности с использованием способов, известных в данной области техники. Например, антитела или их фрагменты, могут быть химеризированы, гуманизированы и/или деиммунизированы.
В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению могут быть химерными. Химерное антитело представляет собой антитело, в котором различные части антитела происходят от различных видов животных, такое как антитело, имеющее вариабельную область, происходящую от мышиного моноклонального антитела, и константную область иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител или их фрагментов известны в данной области техники. См., например, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); патенты США Nos. 5807715; 4816567 и 4816397, которые включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. Методы, разработанные для получения «химерных антител» (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)), могут быть использованы для синтеза указанных молекул. Например, генетическая последовательность, кодирующая специфичность связывания молекулы антитела против PDGFRβ мыши, может быть соединена с последовательностью из молекулы антитела человека с соответствующей биологической активностью. Используемый в настоящем описании термин химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части происходят от разных видов животных, например, молекулу, которая имеет вариабельную область, происходящую от мышиного моноклонального антитела, и константную область иммуноглобулина человека, примером являются гуманизированные антитела.
В другом варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению является гуманизированным. Гуманизированные антитела обладают специфичностью связывания за счет включения одной или более областей, определяющих комплементарность (CDR), из антитела, происходящего не от человека, и каркасных областей от молекулы антитела человека. Часто остатки каркаса в каркасных областях от человека могут быть заменены соответствующим остатком из CDR донорского антитела для изменения и предпочтительно улучшения связывания антигена. Эти замены в каркасе идентифицируют способами, хорошо известными в данной области техники, например, путем моделирования взаимодействий CDR и остатков каркаса для идентификации остатков каркаса, важных для связывания антигена, и сравнения последовательностей для идентификации необычных остатков каркаса в определенных положениях. (См., например, Queen et al., патент США No. 5585089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), которые включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме). Антитела могут быть гуманизированы с использованием различных методов, известных в данной области техники, включая, например, пересадку CDR (патент EP 239400; публикации РСТ WO 91/09967; патенты США Nos. 5225539; 5530101 и 5585089, которые включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме), венирование или изменение поверхности (патенты ЕР 592106, ЕР 519596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994), которые включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме), и перетасовку цепей (патент США № 5565332, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме).
В некоторых вариантах осуществления деиммунизация может быть использована для уменьшения иммуногенности антигенсвязывающих полипептидов против PDGFRβ (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента). Используемый в настоящем описании термин «деиммунизация» включает изменение полипептида (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента) для модификации Т-клеточных эпитопов (см., например, патенты W09852976A1, WO0034317A2, которые включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме). Например, могут быть проанализированы последовательности VH и VL из исходного антитела, специфичного для PDGFRβ, или из его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению, и может быть создана «карта» Т-клеточных эпитопов человека из каждой области V, на которой показано расположение эпитопов относительно областей, определяющих комплементарность (CDRs), и других ключевых остатков в последовательности. Индивидуальные Т-клеточные эпитопы из карты Т-клеточных эпитопов анализируются с целью идентификации альтернативных замен аминокислот с низким риском изменения активности конечного антитела. Создан диапазон альтернативных последовательностей VH и VL, включающий сочетания аминокислотных замен, и эти последовательности впоследствии включены в диапазон антигенсвязывающих полипептидов для использования в диагностических методах и методах лечения, раскрытых в настоящем описании, которые затем тестируют на функциональную активность. Полные гены тяжелых и легких цепей, включающие модифицированные области V и C человека, затем клонируют в экспрессионные векторы, и полученные плазмиды вводят в клеточные линии для получения полного антитела. Антитела затем сравниваются в соответствующих биохимических и биологических анализах, и идентифицируется оптимальный вариант.
ii) Эффекторные функции и модификации Fc
Антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению обычно включают константную область антитела (например, константную область IgG, например, константную область IgG человека, например, константную область IgGl, 2, 3 или 4 человека), которая опосредует одну или более эффекторных функций. Например, связывание компонента C1 комплемента с константной областью антитела может активировать систему комплемента. Активация комплемента играет важную роль в опсонизации и лизисе клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительную реакцию, а также может быть вовлечена в аутоиммунную гиперчувствительность. Кроме того, антитела связываются с рецепторами на различных клетках через область Fc, причем сайт Fc связывания с рецептором в области Fc антитела связывается с рецептором Fc (FcR) на клетке. Есть целый ряд рецепторов Fc, которые являются специфическими для различных классов антител, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эпсилон-рецепторы), IgA (альфа-рецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с рецепторами Fc на клеточной поверхности запускает ряд важных и разнообразных биологических реакций, включая поглощение и уничтожение частиц, покрытых антителами, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клеток-мишеней с помощью клеток-киллеров (так называемая зависимая от антител опосредуемая клетками цитотоксичность или ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, перенос через плаценту и контроль продукции иммуноглобулинов. В предпочтительных вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды (например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты) по изобретению связываются с Fc-гамма-рецептором. В альтернативных вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут включать константную область, которая лишена одной или более эффекторных функций (например, активности ADCC) и/или не способна связывать рецептор Fcγ.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают антигенсвязывающие полипептиды, в которых по меньшей мере одна аминокислота в одном или более доменах константной области удалена или иным образом изменена таким образом, чтобы обеспечить желаемые биохимические характеристики, такие как снижение или повышение эффекторных функций, способность к нековалентной димеризации, повышенная способность к локализации в месте опухоли, уменьшение времени полужизни в сыворотке или увеличение времени полужизни в сыворотке по сравнению с полным, неизмененным антителом приблизительно той же иммуногенности. Например, некоторые антитела или их фрагменты для использования в диагностических методах и методах лечения, описанных в настоящем описании, представляют собой антитела с делецией домена, которые включают полипептидную цепь, сходную с тяжелой цепью иммуноглобулина, но у которых отсутствует по меньшей мере часть одного или более доменов тяжелой цепи. Например, в некоторых антителах может быть удален один полный домен константной области модифицированного антитела, например, весь или часть домена CH2 может быть удалена.
В некоторых других вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды включают константные области, происходящие от различных изотипов антител (например, константные области из двух или более IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека). В других вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды включают химерный шарнир (т.е. шарнир, включающий шарнирные части, происходящие из шарнирных доменов различных изотипов антител, например, верхний шарнирный домен от молекулы IgG4 и средний шарнирный домен от IgGl). В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающие полипептиды включают область Fc или ее часть от молекулы IgG4 человека и мутацию Ser228Pro (по нумерации EU) в каркасе шарнирной области молекулы.
В некоторых вариантах осуществления часть Fc может быть мутирована для увеличения или уменьшения эффекторной функции с использованием способов, известных в данной области техники. Например, делеция или инактивация (с помощью точечных мутаций или других способов) домена константной области может привести к снижению связывания рецептором Fc циркулирующего модифицированного антитела, тем самым увеличивая его локализацию в опухоли. В других случаях это могут быть модификации константной области, согласующиеся с умеренным связыванием комплемента по настоящему изобретению, и, таким образом, снижающие период полужизни в сыворотке и неспецифическое связывание конъюгированного цитотоксина. Еще одни модификации константной области могут быть использованы для модификации дисульфидных мостиков или частей олигосахаридов, что позволяет усилить локализацию благодаря повышенной специфичности или гибкости антигена. Полученный в результате физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические эффекты этих модификаций, такие как локализация в опухоли, биораспределение и период полужизни в сыворотке, легко могут быть измерены и количественно оценены с использованием хорошо известных иммунологических методов без излишнего экспериментирования.
В некоторых вариантах осуществления домен Fc, используемый в антителе согласно изобретению, представляет собой вариант Fc. Используемый в настоящем описании термин «вариант Fc» относится к домену Fc, имеющему по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с доменом Fc дикого типа, от которого произошел указанный домен Fc. Например, когда домен Fc является производным антитела IgGl человека, вариант Fc указанного домена Fc IgGl человека включает по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с указанным доменом Fc.
Аминокислотная(ные) замена(ы) в варианте Fc могут быть расположены в любом положении (т.е. в любом положении аминокислоты по нумерации EU) в пределах домена Fc. В одном из вариантов осуществления вариант Fc включает замену в положении аминокислоты, расположенной в области шарнира или его части. В другом варианте осуществления изобретения вариант Fc включает замену в положении аминокислоты, расположенной в домене CH2 или его части. В другом варианте осуществления изобретения вариант Fc включает замену в положении аминокислоты, расположенной в домене CH3 или его части. В другом варианте осуществления изобретения вариант Fc включает замену в положении аминокислоты, расположенной в домене СН4 или его части.
Антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут использовать любой вариант Fc, известный в данной области техники, который, как известно, придает улучшенные свойства эффекторной функции (например, ее уменьшение или увеличение) и/или улучшает связывание FcR. Варианты Fc могут включать, например, любую из аминокислотных замен, раскрытых в международных публикациях РСТ WO88/07089A1, W096/14339A1, WO98/05787A1, W098/23289A1, W099/51642A1, W099/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 и WO06/085967A2 или в патентах США Nos. 5648260; 5739277; 5834250; 5869046; 6096871; 6121022; 6194551; 6242195; 6277375; 6528624; 6538124; 6737056; 6821505; 6998253 и 7083784, каждый из которых включен в данное описание и качестве ссылки в полном объеме. В одном иллюстративном варианте осуществления связывающий полипептид по изобретению может включать вариант Fc, включающий аминокислотную замену в положении 268 по нумерации EU (например, H268D или H268E). В другом иллюстративном варианте осуществления связывающий полипептид по изобретению может включать аминокислотную замену в положении 239 по нумерации EU (например, S239D или S239E) и/или в положении ЕС 332 (например, I332D или I332Q).
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий полипептид по изобретению может включать вариант Fc, включающий аминокислотную замену, изменяющую антигеннезависимые эффекторные функции антитела, в частности, период полужизни связывающего полипептида в кровотоке. Такие антигенсвязывающие полипептиды характеризуются либо повышенным, либо или пониженным связыванием с FcRn по сравнению с антигенсвязывающими полипептидами, не имеющими этих замен, следовательно, имеют повышенный или пониженный период полужизни в сыворотке крови, соответственно. Варианты Fc с улучшенной аффинностью к FcRn, как ожидается, имеют более длинные периоды полужизни в сыворотке, и такие молекулы имеют полезное применение в способах лечения млекопитающих, где требуется длительный период полужизни вводимого антигенсвязывающего полипептида, например, для лечения хронических заболеваний или нарушений. В отличие от этого, варианты Fc с пониженной аффинностью связывания с FcRn, как ожидается, имеют более короткие периоды полужизни, и такие молекулы могут быть также использованы, например, для введения млекопитающему, когда может быть предпочтительно укороченное время в циркуляции, например, для диагностической визуализации in vivo или в ситуациях, когда исходное антитело имеет токсические побочные эффекты, если оно присутствует в кровотоке в течение продолжительного периода времени. Варианты Fc с пониженной аффинностью связывания с FcRn также менее вероятно преодолеют плацентарный барьер и, таким образом, также полезны при лечении заболеваний или нарушений у беременных женщин. Кроме того, другие варианты применения, при которых сниженная аффинность связывания FcRn может быть желательна, включают те варианты применения, при которых желательна локализация в мозге, почке и/или печени. В одном иллюстративном варианте осуществления измененные антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению демонстрируют сниженный транспорт через эпителий почечных клубочков из сосудистой сети. В другом варианте осуществления измененные антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению демонстрируют сниженный транспорт через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) из головного мозга в сосудистое пространство. В одном из вариантов осуществления антитело с измененным связыванием FcRn включает домен Fc, имеющий одну или более аминокислотных замен в пределах «связывающей петли FcRn» домена Fc. Связывающая петля FcRn состоит из аминокислотных остатков 280-299 (согласно нумерации EU). Примеры аминокислотных замен, изменяющих связывающую активность FcRn, раскрыты в публикации международной заявки PCT No. WO05/047327, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению включают домен Fc, имеющий одну или более из следующих замен: V284E, H285E, N286D, K290E и S304D (по нумерации EU).
В других вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды для применения в способах диагностики и лечения, описанных в настоящем документе, имеют константную область, например, константную область тяжелой цепи IgGl, которая изменена для снижения или устранения гликозилирования. Например, антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут также включать вариант Fc, включающий аминокислотную замену, которая изменяет гликозилирование Fc антитела. Например, указанный вариант Fc может иметь пониженное гликозилирование (например, N- или O-связанное гликозилирование). В иллюстративных вариантах осуществления вариант Fc включает пониженное гликозилирование N-связанного гликана, обычно находящегося в положении аминокислоты 297 (по нумерации EU). В другом варианте осуществления антигенсвязывающий полипептид имеет аминокислотную замену вблизи или в пределах мотива гликозилирования, например, мотива N-связанного гликозилирования, который содержит аминокислотную последовательность NXT или NXS. В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий полипептид включает вариант Fc с аминокислотной заменой в положении аминокислоты 228 или 299 (по нумерации EU). В более конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающий полипептид включает константную область IgGl или IgG4, включающую мутацию S228P и T299A (по нумерации EU).
Примеры аминокислотных замен, которые придают пониженное или измененное гликозилирование, раскрыты в публикации международной заявки PCT No. WO05/018572, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В предпочтительных вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению модифицированы для устранения гликозилирования. Такие антигенсвязывающие полипептиды могут быть обозначены как «agly» антигенсвязывающие полипептиды. Не ограничиваясь теорией, полагают, что «agly» антигенсвязывающие полипептиды могут характеризоваться улучшенными безопасностью и профилем стабильности in vivo. Примеры agly антигенсвязывающих полипептидов включают агликозилированную область Fc антитела IgG4, которая лишена эффекторной функции Fc, тем самым устраняя возможность опосредованной Fc токсичности в отношении нормальных жизненно важных органов, которые экспрессируют PDGFRβ. В других вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению включают измененный гликан. Например, антигенсвязывающий полипептид может иметь уменьшенное количество остатков фукозы на N-гликане у Asn297 области Fc, т.е. являться афукозильным. В другом варианте осуществления антигенсвязывающий полипептид может иметь измененное количество остатков сиаловой кислоты на N-гликане у Asn297 области Fc.
III) Ковалентное присоединение
Антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть модифицированы, например, путем ковалентного присоединения молекулы к связывающему полипептиду таким образом, что ковалентное присоединение не препятствует связывающему полипептиду специфически связываться с распознаваемым эпитопом. Например, но не в качестве ограничения, антигенсвязывающий полипептид по изобретению может быть модифицирован путем гликозилирования, ацетилирования, пэгирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или с другим белком и т.д. Любая из многочисленных химических модификаций может быть осуществлена известными методами, включая, но, не ограничиваясь этим, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование и т.д. Кроме того, производное может содержать одну или более неклассических аминокислот.
Антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть дополнительно рекомбинантно соединены с гетерологичным полипептидом на N- или С-конце или химически конъюгированы (включая ковалентную и нековалентную конъюгацию) с полипептидами или другими композициями. Например, антигенсвязывающие полипептиды могут быть соединены рекомбинантным способом или конъюгированы с молекулами, пригодными в качестве меток в методах детекции, и с эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарства, радионуклиды или токсины. См., например, публикации РСТ WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент США No. 5314995; и ЕР 396387, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Антигенсвязывающие полипептиды могут быть соединены с гетерологичными полипептидами для увеличения периода полужизни in vivo или для использования в иммунологических анализах с использованием методов, известных в данной области техники. Например, в одном варианте осуществления ПЭГ может быть конъюгирован с антигенсвязывающими полипептидами по настоящему изобретению для увеличения их периода полужизни in vivo (см. статьи Leong, S. R., et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); или Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002), которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Кроме того, антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть соединены с маркерными последовательностями, например, с пептидом, для облегчения их очистки или обнаружения. В предпочтительных вариантах осуществления маркерная аминокислотная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как, в частности, метка, представленная в векторе pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), многие маркеры являются коммерчески доступными. Как описано в статье Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989) (которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), например, гексагистидин обеспечивает удобную очистку гибридного белка. Другие пептидные метки, используемые для очистки, включают, но не ограничиваются этим, метку «HA», которая соответствует эпитопу, происходящему от белка гемагглютинина вируса гриппа (статья Wilson et al., Cell 37:767 (1984), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), и метку «флаг».
Антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть использованы в неконъюгированной форме или могут быть конъюгированы с по меньшей мере одной из множества молекул, например, для улучшения терапевтических свойств молекулы, облегчения обнаружения мишени или для визуализации или лечения больного. Антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть помечены или конъюгированы либо до, либо после очистки, когда очистка осуществляется. В частности, антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть конъюгированы с терапевтическими агентами, пролекарствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологической реакции, фармацевтическими агентами или ПЭГ.
Настоящее изобретение дополнительно охватывает антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению, конъюгированные с диагностическим или терапевтическим агентом. Антигенсвязывающие полипептиды могут быть использованы диагностически, например, для мониторинга развития или прогрессии заболевания иммунных клеток (например, CLL) в виде части клинической процедуры тестирования, например, для определения эффективности данного лечения и/или режима профилактики. Обнаружение может быть облегчено путем соединения антигенсвязывающих полипептидов с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные соединения, люминесцентные соединения, биолюминесцентные соединения, радиоактивные соединения, испускающие позитроны металлы при использовании различных типов позитронно-эмиссионной томографии, и ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов. См., например, патент США No. 4741900 (который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) для ионов металлов, которые могут быть конъюгированы с антителами, для использования в качестве диагностических средств в соответствии с настоящим изобретением. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных соединений включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, флуоресцеина дихлортриазиниламин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного соединения включает люминол; примеры биолюминесцентных соединений включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры подходящего радиоактивного соединения включают 125I, 131I, 111In или 99Тс.
Антигенсвязывающие полипептиды для использования в диагностических методах и методах лечения, раскрытых в настоящем описании, могут быть конъюгированы с цитотоксинами (такими как радиоизотопы, цитотоксические лекарства или токсины), терапевтическими агентами, цитостатиками, биологическими токсинами, пролекарствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами модификаторами биологического ответа, фармацевтическими агентами, иммунологически активными лигандами (например, с лимфокинами или с другими антителами, когда полученная молекула связывается как с неопластической клеткой, так и с эффекторной клеткой, такой как Т-клетка) или с ПЭГ.
В другом варианте осуществления антигенсвязывающие полипептиды для использования в диагностических методах и методах лечения, раскрытых в настоящем описании, могут быть конъюгированы с молекулой, которая уменьшает рост опухолевых клеток. В других вариантах осуществления раскрытые композиции могут включать антитела или их фрагменты, соединенные с лекарствами или пролекарствами. Еще одни варианты осуществления настоящего изобретения включают применение антигенсвязывающих полипептидов, конъюгированных со специфическими биотоксинами или их цитотоксическими фрагментами, такими как рицин, гелонин, экзотоксин Pseudomonas или дифтерийный токсин. Выбор использования конъюгированного или неконъюгированного антитела должен зависеть от типа и стадии рака, использования адъювантного лечения (например, химиотерапии или внешнего облучения) и состояния больного. Следует понимать, что специалист в данной области техники легко может сделать такой выбор с помощью представленных в настоящем описании указаний.
Следует принимать во внимание, что в предыдущих исследованиях противоопухолевые антитела, меченные изотопами, были успешно использованы для разрушения опухолевых клеток в моделях на животных, а также в некоторых случаях в организме человека. Примеры радиоизотопов включают: 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re и 188Re. Радионуклиды действуют в результате продукции ионизирующего излучения, которое вызывает множественные разрывы цепи в ядерной ДНК, что приводит к гибели клеток. Изотопы, используемые для получения терапевтических конъюгатов, обычно продуцируют высокую энергию альфа- или бета-частиц, которые имеют короткую длину пути. Такие радионуклиды уничтожают те клетки, которые находятся в непосредственной близости от них, например, опухолевые клетки, к которым присоединяется конъюгат или в которые он вошел. Они оказывают мало или вообще не оказывает влияния на клетки с другой локализацией. Радионуклиды являются в основном неиммуногенными.
V. Экспрессия антигенсвязывающих полипептидов
После манипуляций с выделенным генетическим материалом для получения антигенсвязывающих полипептидов согласно изобретению, как указано выше, гены обычно вставляют в экспрессионный вектор для введения в клетки-хозяева, которые могут быть использованы для получения желаемого количества антигенсвязывающих полипептидов.
Термин «вектор» или «экспрессионный вектор» используется в настоящем описании в целях описания и формулы изобретения для обозначения векторов, используемых в соответствии с настоящим изобретением в качестве носителей для введения в клетку и экспрессии в ней нужного гена. Как известно специалистам в данной области техники, такие векторы легко могут быть выбраны из группы, состоящей из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. В общем случае, векторы, совместимые с настоящим изобретением, должны включать маркер селекции, соответствующие сайты рестрикции для облегчения клонирования нужного гена и способности входить и/или реплицироваться в эукариотных или прокариотных клетках.
Многочисленные системы экспрессионных векторов могут быть использованы для целей настоящего изобретения. Например, один класс векторов использует элементы ДНК, которые происходят от вирусов животных, таких как бычий вирус папилломы, вирус полиомы, аденовирус, вирус коровьей оспы, бакуловирус, ретровирусы (RSV, MMTV или MOMLV) или вирус SV40. Другие включают использование полицистронных систем с внутренними сайтами связывания рибосом. Кроме того, клетки, которые интегрируют ДНК в свои хромосомы, могут быть выбраны путем введения одного или более маркеров, позволяющих проводить селекцию трансфецированных клеток-хозяев. Маркер может обеспечивать прототрофию ауксотрофному хозяину, биоцидную устойчивость (например, к антибиотикам) или устойчивость к тяжелым металлам, таким как медь. Ген маркера селекции может быть либо непосредственно связан с последовательностями ДНК, предназначенными для экспрессии, либо введен в ту же клетку путем котрансформации. Могут быть также необходимы дополнительные элементы для оптимального синтеза мРНК. Эти элементы могут включать сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, промоторы транскрипции, энхансеры и сигналы терминации. В особенно предпочтительных вариантах осуществления клонированные гены вариабельных областей вставляют в экспрессионный вектор вместе с генами константной области тяжелой и легкой цепи (предпочтительно человека), синтезированными, как обсуждалось выше.
В других предпочтительных вариантах осуществления антигенсвязывающий полипептид согласно изобретению может быть экспрессирован с помощью полицистронных конструктов. В таких системах экспрессии из одного полицистронного конструкта могут быть получены множественные генные продукты, представляющие интерес, такие как тяжелые и легкие цепи антител. Эти системы преимущественно используют внутренний сайт вхождения рибосом (IRES) для обеспечения относительно высоких уровней экспрессии полипептидов согласно изобретению в эукариотных клетках-хозяевах. Совместимые последовательности IRES описаны в патенте США No. 6193980, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что такие экспрессионные системы могут быть использованы для эффективного получения полного спектра полипептидов, раскрытых в настоящей заявке.
В более общем случае, как только вектор или последовательность ДНК, кодирующая антитело или его фрагмент, были получены, экспрессионный вектор может быть введен в соответствующую клетку-хозяина. Это значит, что клетки-хозяева могут быть трансформированы. Введение плазмиды в клетку-хозяина может быть осуществлено различными методами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Они включают, но не ограничиваются этим, трансфекцию (включая электрофорез и электропорацию), слияние протопластов, осаждение фосфатом кальция, слияние клетки с ДНК в оболочке, микроинъекцию и инфицирование интактным вирусом. См. книгу Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988), которая включена в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. Наиболее предпочтительным введением плазмиды в клетку-хозяина является введение с помощью электропорации. Трансформированные клетки выращивают в условиях, подходящих для продукции легких цепей и тяжелых цепей, и анализируют на синтез белков тяжелых и/или легких цепей. Типичные методы анализа включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или анализ с помощью сортировки флуоресцентно активированных клеток (FACS), иммуногистохимию и тому подобное.
Используемый в настоящем описании термин «трансформация» используется в широком смысле для обозначения введения ДНК в реципиентную клетку-хозяина, изменяющего ее генотип и затем приводящего к изменениям в реципиентной клетке.
По тем же причинам «клетки-хозяева» относится к клеткам, которые были трансформированы векторами, сконструированными с использованием методов рекомбинантных ДНК, и которые кодируют по меньшей мере один гетерологичный ген. При описаниях способов выделения полипептидов из рекомбинантных хозяев термины «клетка» и «культура клеток» используются как взаимозаменяемые для обозначения источника антитела, если ясно не указано иное. Другими словами, выделение полипептида из «клеток» может означать либо выделение путем центрифугирования целых клеток, либо выделение из клеточной культуры, содержащей как среду, так и суспендированные клетки.
В одном из вариантов осуществления линия клеток-хозяев, используемая для экспрессии антигенсвязывающего полипептида, происходит от млекопитающих; специалисты в данной области техники могут определить конкретные линии клеток-хозяев, которые лучше всего подходят для желаемого генного продукта, подлежащего экспрессии в них. Иллюстративные линий клеток-хозяев включают, но не ограничиваются этим, DG44 и DUXB11 (линии яичника китайского хомячка, DHFR-минус), HeLa (карциному шейки матки человека), CVI (линию почки обезьяны), COS (производное CVI с Т-антигеном SV40), R1610 (фибробласты китайского хомячка) BALBC/3T3 (фибробласты мыши), HAK (линию почек хомячка), SP2/O (миелому мыши), BFA-lclBPT (бычьи эндотелиальные клетки), RAJI (лимфоциты человека), 293 (почки человека). В одном из вариантов осуществления линия клеток предусматривает измененное гликозилирование, например, афукозилирование экспрессируемого в ней антитела (например, PER.C6.RTM. (Crucell) клеточные линии CHO с нокаутом FUT8 (Potelligent.RTM. Cells) (Biowa, Princeton, N.J.)). В одном из вариантов осуществления могут быть использованы клетки NS0. Особенно предпочтительными являются клетки CHO. Линии клеток-хозяев обычно доступны из коммерческих источников, американской коллекции типов культур или из опубликованной литературы.
Продукция in vitro позволяет расширить масштабы с получением больших количеств требуемых полипептидов. Методы культивирования клеток млекопитающих в условиях тканевых культур известны в данной области техники и включают гомогенную суспензионную культуру, например, в аэролифтном реакторе или в реакторе с постоянным перемешиванием, или иммобилизованные клеточные культуры или клеточные культуры, захваченные, например, в полые волокна, микрокапсулы, иммобилизованные на агарозных микрогранулах или керамических картриджах. Если это необходимо и/или желательно, растворы полипептидов могут быть очищены обычными методами хроматографии, например, гель-фильтрацией, ионообменной хроматографией, хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и/или (иммуно-)аффинной хроматографией.
Гены, кодирующие антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению, можно также экспрессировать в клетках не от млекопитающих, таких как бактерии или дрожжи, или клетки растений. В связи с этим следует понимать, что различные одноклеточные микроорганизмы, не относящиеся к млекопитающим, такие как бактерии, также могут быть трансформированы; т.е. микроорганизмы, которые можно вырастить в культурах или с помощью ферментации. Бактерии, которые восприимчивы к трансформации, включают членов Enterobacteriaceae, таких как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, таких как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Следует также иметь в виду, что при экспрессии в бактериях, полипептиды могут стать частью телец включения. Полипептиды должны быть выделены, очищены и затем собраны в функциональные молекулы.
Кроме прокариот могут быть также использованы эукариотные микроорганизмы. Среди эукариотных микроорганизмов наиболее часто используются Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи, хотя обычно доступен ряд других штаммов. Для экспрессии в Saccharomyces обычно используют, например, плазмиду YRp7 (статьи Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980), каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Эта плазмида уже включает ген TRP1, который обеспечивает маркером селекции мутантный штамм дрожжей, лишенный способности расти на триптофане, например АТСС No. 44076 или PEP4-1 (статья Jones, Genetics, 85:12 (1977), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Наличие повреждения trpl в качестве характеристики клеточного генома дрожжей-хозяев затем создает эффективную среду для обнаружения трансформации по росту в отсутствие триптофана.
VI. Фармацевтические составы и способы введения антигенсвязывающих полипептидов.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим антигенсвязывающие полипептиды, описанные в данном документе.
Способы получения и введения индивидууму антигенсвязывающих полипептидов согласно изобретению хорошо известны специалистам в данной области техники или могут быть легко определены ими. Путь введения антигенсвязывающих полипептидов по настоящему изобретению может быть пероральным, парентеральным, ингаляционным или местным. Термин парентеральный, используемый в настоящем описании, включает внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Внутривенная, внутриартериальная, подкожная и внутримышечная формы парентерального введения обычно являются предпочтительными. В то время как все эти формы введения четко рассматриваются как входящие в объем настоящего изобретения, форма для введения должна представлять собой раствор для инъекций, в частности, для внутривенной или внутриартериальной инъекции или для капельного введения. Как правило, подходящая фармацевтическая композиция для инъекций может включать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизатор (например, альбумин человека) и т.д. Тем не менее, в других методах, совместимых с указаниями настоящего описания, антигенсвязывающие полипептиды могут быть доставлены непосредственно к месту неблагоприятной клеточной популяции, тем самым увеличивая экспозицию пораженной ткани с терапевтическим агентом.
Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые и буферные среды. В соответствии с настоящим изобретением фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются этим, 0,01-0,1 M и предпочтительно 0,05 М фосфатный буфер или 0,8% физиологический раствора. Другие обычные парентеральные носители включают растворы фосфата натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или жирные масла. Внутривенные носители включают жидкие и биогенные наполнители, электролитные наполнители, такие как на основе декстрозы Рингера и тому подобное. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы и тому подобное. Более конкретно, фармацевтические композиции, подходящие для применения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы (при растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного приема. В таких случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы легко набираться шприцем. Она должна быть стабильной в условиях получения и хранения и должна быть предпочтительно защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и с помощью использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. Во многих случаях должно быть предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, например, сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может быть осуществлено путем включения в композицию агента, который задерживает всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.
В любом случае стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения активного соединения (например, антитела самого по себе или в сочетании с другими активными агентами) в требуемом количестве в соответствующем растворителе одного или в сочетании с ингредиентами, перечисленными в настоящем описании, в соответствии с требованиями, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, что дает порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерилизованного фильтрацией раствора. Препараты для инъекций обрабатывают, разливают в контейнеры, такие как ампулы, мешки, бутылки, шприцы или флаконы, и запаивают в асептических условиях, в соответствии со способами, известными в данной области техники. Кроме того, препараты могут быть упакованы и проданы в форме набора, такого как набор, описанный в одновременно находящейся на рассмотрении заявке США Ser. No. 09/259337 и заявке США Ser. No. 09/259338, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Такие промышленные изделия предпочтительно должны иметь этикетки или вкладыши в упаковку, указывающие на то, что объединенные композиции пригодны для лечения больного, страдающего аутоиммунными или неопластическими нарушениями или предрасположенного к ним.
Эффективные дозы стабилизированных антигенсвязывающих полипептидов по настоящему изобретению для лечения описанных выше состояний, варьируются в зависимости от множества различных факторов, включая способы введения, область-мишень, физиологическое состояние больного, является ли больной человеком или животным, введения других лекарственных препаратов, и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Как правило, больной является человеком, но также можно лечить не относящихся к человеку млекопитающих, включая трансгенных млекопитающих. Лечебные дозировки могут титроваться с использованием обычных методов, известных специалистам в этой области техники, с целью оптимизации безопасности и эффективности.
Для пассивной иммунизации антителом по изобретению доза может находиться в диапазоне, например, приблизительно от 0,0001 до 100 мг/кг, и более обычно от 0,01 до 5 мг/кг (например, 0,02 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,75 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, и т.д.), на массу тела индивидуума. Например, дозы могут составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в диапазоне 1-10 мг/кг, предпочтительно, по меньшей мере 1 мг/кг. Промежуточные дозы в указанных диапазонах также рассматриваются как включенные в объем настоящего изобретения.
Индивидуумам можно вводить такие дозы ежедневно, через день, еженедельно или в соответствии с любым другим графиком, определенным с помощью эмпирического анализа. Иллюстративное лечение включает введение множественных доз в течение длительного периода времени, например, по меньшей мере шести месяцев. Дополнительные схемы иллюстративного лечения включают введение один раз каждые две недели или один раз в месяц или один раз каждые от 3 до 6 месяцев. Примеры схем дозирования включают 1-10 мг/кг или 15 мг/кг в последовательные дни, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг еженедельно. В некоторых методах два или более антигенсвязывающих полипептида с различной специфичностью связывания вводят одновременно, в этом случае доза каждого вводимого антитела может находиться в пределах указанных диапазонов.
Антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению можно вводить множество раз. Интервалы между отдельными дозами могут представлять собой, например, ежедневное, еженедельное, ежемесячное или ежегодное введение. Интервалы могут быть также нерегулярными по показаниям измерений уровней в крови полипептида или молекулы-мишени в организме больного. В некоторых способах доза корректируется для достижения определенной концентрации антитела или токсина в плазме, например, 1-1000 мкг/мл или 25-300 мкг/мл. В качестве альтернативы, антигенсвязывающие полипептиды можно вводить в виде композиции с замедленным высвобождением, в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируются в зависимости от периода полужизни антигенсвязывающего полипептида в организме больного. В целом гуманизированные антигенсвязывающие полипептиды показывают самый длинный период полужизни, за ними следуют химерные антигенсвязывающие полипептиды и антигенсвязывающий полипептид не от человека. В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть введены в неконъюгированной форме. В другом варианте осуществления антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть введены в конъюгированной форме множество раз. В еще одном варианте осуществления антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть введены в неконъюгированной форме, затем в конъюгированной форме или наоборот.
Дозировка и частота введения могут варьироваться в зависимости от того является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении композиции, включающие антитела по настоящему изобретению или их смесь, вводят больному, еще не находящемуся в состоянии заболевания, с целью повышения устойчивости больного. Такое количество определяется как количество, являющееся «профилактически эффективной дозой». При этом варианте применения точные количества также зависят от состояния здоровья больного и общего иммунитета, но обычно находятся в диапазоне от 0,1 до 25 мг на дозу, предпочтительно от 0,5 до 2,5 мг на дозу. Относительно низкую дозу вводят при относительно нечастых интервалах в течение длительного периода времени. Некоторые больные продолжают получать лечение всю их оставшуюся жизнь.
При терапевтическом применении относительно высокие дозы (например, от приблизительно 1 до 400 мг/кг антитела на дозу, причем дозы от 5 до 25 мг являются более широко используемыми для радиоиммуноконъюгатов, а более высокие дозы для молекул конъюгированных препаратов цитотоксин-лекарство) при относительно коротких интервалах иногда требуются до того, как произойдет снижение или прекращение прогрессии заболевания и, предпочтительно, до тех пор, пока у больного не выявится частичное или полное облегчение симптомов заболевания. После этого введение больному может проводиться по профилактической схеме.
В одном из вариантов осуществления индивидуума можно лечить молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по настоящему изобретению (например, в векторе). Дозы нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, находятся в диапазоне приблизительно от 10 нг до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг или 30-300 мкг ДНК на одного больного. Дозы для инфекционных вирусных векторов варьируются от 10-100 или более вирионов на дозу.
Терапевтические агенты могут быть введены путем парентерального, местного, внутривенного, перорального, подкожного, внутриартериального, внутричерепного, внутрибрюшинного, интраназального или внутримышечного способа для профилактического и/или терапевтического лечения. Внутримышечная инъекция или внутривенная инфузия являются предпочтительными для введения антитела по изобретению. В некоторых методах терапевтические антитела или их фрагменты вводят непосредственно в черепную коробку. В некоторых методах антитела или их фрагменты вводят в виде композиции или устройства, такого как устройство Medipad™, с замедленным высвобождением.
Антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению необязательно могут быть введены в сочетании с другими агентами, которые эффективны для лечения нарушения или состояния, нуждающегося в лечении (например, профилактическом или терапевтическом). Предпочтительными дополнительными агентами являются агенты, которые признаны в данной области техники и стандартно вводятся при конкретном нарушении.
Эффективные дозы (т.е. терапевтически эффективные количества) для однократного лечения антителами, меченными 90Y, согласно изобретению, находятся в диапазоне от приблизительно 185 до приблизительно 2775 МБк, более предпочтительно от приблизительно 370 до приблизительно 1480 МБк. Эффективные дозы без абляционной необходимости пересадки костного мозга для однократного лечения антигенсвязывающими полипептидами, меченными 131I, находятся в диапазоне от приблизительно 185 до приблизительно 2590 МБк, более предпочтительно от приблизительно 185 до приблизительно 1480 МБк. Эффективные абляционные дозы (т.е. с возможной необходимостью пересадки аутологичного костного мозга) для однократного лечения антителами, меченными 131I, находятся в диапазоне от приблизительно 1110 до приблизительно 22200 МБк, более предпочтительно от приблизительно 1850 и менее приблизительно 18500 МБк.
Несмотря на то, что большой клинический опыт был накоплен с 131I и 90Y, другие радиоактивные метки известны в данной области техники и используются для аналогичных целей. Еще одни радиоизотопы используются для визуализации. Например, дополнительные радиоизотопы, которые совместимы с объемом настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются этим, 123I, 125I, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 203Pb, 206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac, 211A и 213Bi. В этом отношении альфа-, гамма- и бета-излучатели все совместимы с данным изобретением. Кроме того, с точки зрения настоящего раскрытия представляется, что специалист в данной области техники может легко определить, какие радионуклиды совместимы с выбранным курсом лечения без излишнего экспериментирования. В этой связи дополнительные радионуклиды, которые уже используются в клинической диагностике, включают 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, а также 111In. Антитела также метят различными радионуклидами для возможного использования в направленной иммунотерапии (статья Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987), которая включена в данное описание в качестве ссылки в полном объеме). Эти радионуклиды включают 188Re и 186Re, а также в меньшей степени 199Au и 67Cu. В патенте США No. 5460785 предоставлены дополнительные данные относительно таких радиоизотопов, и он включен в данное описание в качестве ссылки в полном объеме.
Как обсуждалось выше, антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть введены в фармацевтически эффективном количестве для лечения in vivo нарушений у млекопитающих. В связи с этим следует понимать, что раскрытые антигенсвязывающие полипептиды должны быть составлены таким образом, чтобы облегчить введение и способствовать стабильности активного агента. Предпочтительно, фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением включают фармацевтически приемлемый, нетоксичный, стерильный носитель, такой как физиологический солевой раствор, нетоксичные буферы, консерванты и тому подобное. Для целей настоящей заявки фармацевтически эффективное количество антигенсвязывающего полипептида согласно изобретению, конъюгированного или неконъюгированного с терапевтическим агентом, должно соответствовать значению количества, достаточного для достижения эффективного связывания с мишенью и для достижения преимущества, например, для облегчения симптомов заболевания или нарушения, или для обнаружения вещества или клетки. В случае опухолевых клеток полипептид предпочтительно должен обладать способностью взаимодействовать с выбранными иммунореактивными антигенами на неопластических или иммунореактивных клетках и обеспечивать повышение гибели этих клеток. Конечно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть введены в виде одной или множественных доз для обеспечения фармацевтически эффективного количества полипептида.
В соответствии с объемом настоящего раскрытия антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть введены человеку или другому животному в соответствии с вышеупомянутыми способами лечения в количестве, достаточном для получения терапевтического или профилактического эффекта. Антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть введены такому человеку или другому животному в обычной лекарственной форме дозирования, полученной путем объединения антитела согласно изобретению с обычным фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем в соответствии с известными методами. Специалистам в данной области техники следует принимать во внимание, что форма и характер фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя диктуется количеством активного ингредиента, с которым они должны быть объединены, путем введения и другими хорошо известными переменными. Специалистам в данной области техники также должно быть понятно, что смесь, включающая один или более видов полипептидов в соответствии с настоящим изобретением, может оказаться особенно эффективной.
VII. Способы лечения заболеваний или нарушений
Антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению могут быть использованы как антагонисты активности рецепторов клеточной поверхности, таких как HER2 и/или PDGFRβ. Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения заболеваний или нарушений, связанных с PDGFRβ и/или HER2, путем введения пациенту фармацевтической композиции, включающей один или более антигенсвязывающих полипептидов по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие полипептиды против PDGFRβ , против HER2 и/или биспецифические антигенсвязывающие полипептиды, раскрытые в настоящем описании (например, полипептиды, представленные в SEQ ID Nos: 13-16, 17-22, и/или 24), вводят в сочетании с дополнительными терапевтическими агентами. Подходящие терапевтические молекулы включают без ограничения ингибиторы рецепторной активности семейства EGFR (например, трастузумаб (CAS# 180288-69-1), пертузумаб (CAS# 380610-27-5), цетуксимаб (CAS# 205923-56-4) и эрлотиниб (CAS# 183321-74-6). В одном конкретном варианте осуществления биспецифический антигенсвязывающий полипептид против PDGFRβ/против HER2 вводят в сочетании с трастузумабом и/или пертузумабом. В одном конкретном варианте осуществления моноспецифический антигенсвязывающий полипептид против HER2 вводят в сочетании с трастузумабом и/или пертузумабом.
Заболевания или нарушения, поддающиеся лечению, включают без ограничения рак, например, рак молочной железы и рак яичников.
Специалист в данной области техники с помощью обычных экспериментов должен быть в состоянии определить, какое эффективное, нетоксичное количество антитела (или дополнительного терапевтического агента) должно использоваться для лечения заболевания или нарушения, связанного с PDGFRβ и/или HER2. Например, терапевтически активное количество полипептида может варьироваться в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания (например, стадия I по сравнению со стадией IV), возраст, пол, медицинские осложнения (например, состояние иммуносупрессии или заболевание) и масса индивидуума, а также способность антитела вызывать желаемый ответ у индивидуума. Режим дозирования лекарства можно корректировать для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, несколько дробных доз можно вводить ежедневно, или доза может быть пропорционально снижена по показаниям остроты терапевтической ситуации. В целом, однако, эффективная доза, как ожидается, находится в диапазоне от приблизительно 0,05 до 100 миллиграмм на килограмм массы тела в день и более предпочтительно от приблизительно 0,5 до 10 миллиграмм на килограмм массы тела в день.
VIII. ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не должны быть истолкованы как дальнейшее ограничение. Содержание перечня последовательностей, фигур и все ссылки, патенты и опубликованные патентные заявки, цитируемые в данной заявке, включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Пример 1. Получение биспецифических антигенсвязывающих полипептидов против HER2/PDGFRβ
Гены, кодирующие различные форматы биспецифических антигенсвязывающих полипептидов против HER2/PDGFRβ, синтезировали и клонировали в экспрессионные векторы млекопитающих. Конструкции затем трансфецировали в клетки НЕК293 в соответствии со стандартным протоколом. Супернатант собирали и тестировали на экспрессию. Гель SDS-PAGE экспрессируемого димера биспецифического формата 2 (SEQ ID No 18 в таблице 4) приведен на фигуре 5. Гель показывает, что в невосстанавливающих условиях экспрессируется полипептид ожидаемого размера 125 Да (дорожка 2), и что он диссоциирует на мономеры ожидаемого размера 62,5 кДа в восстанавливающих условиях (дорожка 1).
Пример 2. Оценка экспрессии биспецифических антигенсвязывающих полипептидов против HER2/PDGFRβ с помощью ELISA
Метод ELISA был разработан для анализа экспрессии биспецифических антигенсвязывающих полипептидов против HER2/PDGFRβ в супернатанте клеток. В кратком изложении 2 мкг/мл антитела против Fc человека иммобилизовывали на планшете Maxisorp Immulon в течение ночи и блокировали с помощью суперблока. Супернатант серийно разводили и наносили на планшет. Культуральные среды разводили сходным образом и наносили в параллельных пробах в качестве отрицательного контроля. Биспецифический антигенсвязывающий полипептид детектировали с помощью специфических антител против Fab человека, меченных HRP. Результаты, представленные на фигуре 6, показывают, что с помощью анализа ELISA можно обнаружить биспецифический антигенсвязывающий полипептид в супернатанте клеток HEK293.
Пример 3. Определение одновременного связывания антигенов биспецифическими антигенсвязывающими полипептидами против HER2/PDGFRβ с помощью ELISA
Анализ ELISA был разработан для обнаружения одновременного связывания биспецифическими антигенсвязывающими полипептидами против HER2/PDGFRβ HER2 и PDGFRβ. В кратком изложении 2 мкг/мл гибридного белка Her2-Fc человека (без эпитопной метки His) иммобилизовывали на планшете Maxisorp Immulon в течение ночи и блокировали с помощью суперблока. Супернатант клеток НЕК293, содержащий биспецифический антигенсвязывающий полипептид, серийно разводили и наносили на планшет. После инкубации в течение одного часа планшет промывали, и 100 нМ гибридного белка PDGFRβ-Fc человека (с эпитопной меткой His) наносили на планшет и инкубировали в течение одного часа. Связывание биспецифического Ab против HER2 и PDGFRβ определяли с помощью антитела против His, меченного HRP. Результаты, представленные на фигуре 7, показывают, что биспецифический антигенсвязывающий полипептид может одновременно связываться как с HER2, так и с PDGFRβ.
Пример 4. Анализ связывания биспецифических антигенсвязывающих полипептидов против HER2/PDGFRβ на основе FACS
Разработан анализ связывания на основе FACS для определения одновременного связывания биспецифических антигенсвязывающих полипептидов против HER2/PDGFRβ с HER2 и PDGFRβ при их экспрессии на поверхности клеток. Конкретно 200 мкл клеток НЕК293, конститутивно гиперэкспрессирующих HER2, или клеток НЕК293, временно гиперэкспрессирующих PDGFRβ, или контрольных ложнотрансфецированных клеток высевали в количестве один миллион клеток на мл свежеприготовленного 96-луночного планшета. Клетки поддерживали при 4°С во избежание интернализации рецептора. Супернатанты клеток HEK293, содержащие биспецифические антигенсвязывающие полипептиды против HER2/PDGFRβ формата-2 или формата-3 (см. таблицу 4 и фигуры 2 и 3), инкубировали с 25 нМ рекомбинантного PDGFRβ-CF647 человека или рекомбинантного HER2-CF647 человека для возможности образования комплексов биспецифические антитела/меченые белковые комплексы. После инкубации 100 мкл каждого супернатанта добавляли к соответствующим HER2-экспрессирующим, PDGFRβ-экспрессирующим или контрольным клеткам и инкубировали при встряхивании при температуре 4°С в течение двух часов для возможности связывания комплексов биспецифические антитела/меченые белки с HER2 и PDGFRβ на клеточной поверхности. После инкубации клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 4 мин, промывали один раз 200 мкл свежих полных сред и ресуспендировали в конечном объеме 200 мкл в свежих полных средах. Связывание флуоресцентно-меченного PDGFRβ-CF647 или HER2-CF647 с клетками определяли с использованием проточного цитометра Guava (Millipore). Положительный сдвиг по оси X считался признаком связывания меченого PDGFRβ-CF647 или HER2-CF647 с клетками.
В этих экспериментах антитело против PDGFRβ или антитело против HER2, только среды и CF647-меченный рецептор использовали в качестве отрицательного контроля. 25 нМ CF647-меченого антитела против HER2 или 50 нМ CF647-меченного антитела против PDGFRβ использовали в качестве положительного контроля на клетки, экспрессирующие HER2 и PDGFRβ, соответственно.
Результаты этих экспериментов приведены на фигуре 8. Эти данные показывают, что как формат-2 так и формат-3 биспецифических антигенсвязывающих полипептидов против HER2/PDGFRβ способен связываться одновременно с HER2 и PDGFRβ клеточной поверхности.
Пример 4. Анализ связывания иллюстративного домена VH антитела против HER2 с HER2.
Кинетику связывания домена VH антитела B8 против HER2 (SEQ ID NO: 13) с HER2 анализировали с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса (Biacore). Как показано на фигуре 9, домен VH антитела B8 характеризуется Kd 1,2 нМ, скоростью ассоциации 1,39×l05 M-1сек-1 и скоростью диссоциации 1,67×l04 сек-1.
Способность домена VH антитела В8 конкурировать за связывание с трастузумабом и/или пертузумабом анализировали с использованием анализа на основе FACS. Результаты, представленные на фигуре 9, продемонстрировали, что домен VH антитела В8 может связываться с HER2 одновременно с трастузумабом и пертузумабом. Эти данные показывают, что домен VH антитела против HER2 связывается с другим эпитопом на HER2, чем как трастузумаб, так и пертузумаб.
Домен VH антитела B8 переформатировали в scFv и определяли сродство связывания к HER2. Результаты, представленные на фигуре 10, показывают, что scFv антитела B8 характеризуется Kd 0,87 нМ.
Пример 5. Анализ клеточной пролиферации
Способность домена VH антитела В12 против HER2 (SEQ ID NO: 14), трастузумаба или пертузумаба, либо по отдельности, либо в сочетании, ингибировать пролиферацию клеток SK-BR-3 определяли с помощью анализа на пролиферацию клеток МТС. Результаты, приведенные на фигуре 11, показали, что сочетание VH антитела B12, трастузумаба и пертузумаба привело к более высокому ингибированию пролиферации клеток, чем при использовании каждого агента по отдельности или при сочетании только трастузумаба и пертузумаба. Эти данные свидетельствуют о том, что домен VH антитела В12 может быть использован для усиления ингибирования пролиферации клеток трастузумабом и пертузумабом.
--->
SEQUENCE LISTING
<110> X-BODY, INC.
<120> BI-SPECIFIC ANTIGEN-BINDING POLYPEPTIDES
<130> 566843: XBI-006PC
<140> PCT/US15/21668
<141> 2015-03-20
<150> 61/968,437
<151> 2014-03-21
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 1
Trp Ala Arg Gly Ser Thr Ser Pro His Gly Leu Asp Val
1 5 10
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 2
Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Lys Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Gln
1 5 10 15
Lys Phe Gln Gly
20
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 3
Gly Asn Tyr Met His
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 4
Asp Pro Arg Ala Ala Thr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 5
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 6
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 7
Gly Tyr Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 8
Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 9
Asp Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 10
Gly Phe Gly Gly Asn Gly Ser Tyr Thr Thr Pro Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 11
Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 12
Asp Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 13
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Asn
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Lys Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ala Arg Gly Ser Thr Ser Pro His Gly Leu Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Arg Ala Ala Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Phe Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Gly Gly Asn Gly Ser Tyr Thr Thr Pro Leu Arg Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 608
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Ser Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
35 40 45
Phe Ser Arg His Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Leu Pro Ile Leu Lys Thr Pro Asn Tyr
65 70 75 80
Ala Gln Arg Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Asn Ala Asp Glu Ser Thr
85 90 95
Ser Thr Val Tyr Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Thr His Gly Gly Asp Arg Ser Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
465 470 475 480
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu
485 490 495
Val Lys Glu Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly
500 505 510
Tyr Ser Phe Thr Gly Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
515 520 525
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Lys Ser Gly Gly Thr
530 535 540
Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr
545 550 555 560
Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp
565 570 575
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Arg Gly Ser Thr Ser Pro
580 585 590
His Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
595 600 605
<210> 18
<211> 588
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg His
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Leu Pro Ile Leu Lys Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Asn Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Gly Gly Asp Arg Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro
465 470 475 480
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
485 490 495
Gly Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
500 505 510
Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Lys Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Gln
515 520 525
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Ile Ser Thr
530 535 540
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr
545 550 555 560
Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Arg Gly Ser Thr Ser Pro His Gly Leu Asp
565 570 575
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585
<210> 19
<211> 608
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 19
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Glu Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Ser
35 40 45
Phe Thr Gly Asn Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Lys Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Arg Gly Ser Thr Ser Pro His Gly
115 120 125
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
145 150 155 160
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
210 215 220
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225 230 235 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
485 490 495
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Arg Val
500 505 510
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg His Ala Ile Ser Trp
515 520 525
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Leu
530 535 540
Pro Ile Leu Lys Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Gln Gly Arg Val
545 550 555 560
Thr Ile Asn Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Met Ser
565 570 575
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr His Gly
580 585 590
Gly Asp Arg Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
595 600 605
<210> 20
<211> 588
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Asn
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Lys Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ala Arg Gly Ser Thr Ser Pro His Gly Leu Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
465 470 475 480
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala
485 490 495
Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg His Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala
500 505 510
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Leu Pro Ile Leu Lys
515 520 525
Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Asn Ala
530 535 540
Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser
545 550 555 560
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr His Gly Gly Asp Arg Ser
565 570 575
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585
<210> 21
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 21
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Trp Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn
100 105 110
Asn Val Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 22
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Val Leu Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 24
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg His
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Leu Pro Ile Leu Lys Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Asn Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Gly Gly Asp Arg Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 25
His Gly Gly Asp Arg Ser Tyr
1 5
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 26
Gly Ile Leu Pro Ile Leu Lys Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 27
Arg His Ala Ile Ser
1 5
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 28
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Val Leu Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 29
Gln Gln Tyr Asn Asn Val Leu Arg Thr
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 30
Glu Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 31
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Trp Leu Asn
1 5 10
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 32
His His His His His His
1 5
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| HER-2-НАПРАВЛЕННЫЕ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, СОДЕРЖАЩИЕ 4-1BBL | 2019 |
|
RU2815451C2 |
| СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩЕЙ КОНСТРУКЦИИ, НАЦЕЛЕННОЙ НА HER2, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ ЖЕЛЧНЫХ ПРОТОКОВ | 2019 |
|
RU2819802C2 |
| АНТИТЕЛО К РЕЦЕПТОРУ ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА (PDGF) И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2778023C1 |
| БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ 2+1 КОНТОРСТЕЛА | 2018 |
|
RU2797305C2 |
| БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИ-FAP КЛОН 212 | 2019 |
|
RU2799429C2 |
| БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С PD1 И LAG3 | 2018 |
|
RU2778805C2 |
| АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С GPRC5D | 2019 |
|
RU2797268C2 |
| БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ КОНСТРУКЦИИ ПРОТИВ HER2 | 2014 |
|
RU2737882C2 |
| БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К CCL2 | 2020 |
|
RU2819613C1 |
| АНТИТЕЛО ПРОТИВ СТОЛБНЯЧНОГО ТОКСИНА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2815280C1 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены биспецифические антигенсвязывающие полипептиды, которые специфически связываются с PDGFRβ человека и HER2 человека. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антигенсвязывающие полипептиды, рекомбинантным экспрессионным векторам и клеткам-хозяевам для получения таких антигенсвязывающих полипептидов. Способы применения антигенсвязывающих полипептидов по настоящему изобретению для лечения заболевания (например, рака) также охватываются настоящим изобретением. Изобретение обеспечивает связывание с PDGFRβ и HER2 с высокой степенью сродства. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 12 ил., 4 табл., 6 пр.
1. Выделенный биспецифический антигенсвязывающий полипептид, включающий тяжелую цепь антитела, включающую первый домен VH, который специфически связывается с первым антигеном, причем указанная тяжелая цепь антитела связана на C-конце со вторым доменом VH, который специфически связывается со вторым антигеном,
где первый антиген представляет собой PDGFRβ человека, и второй антиген представляет собой HER2 человека, или где первый антиген представляет собой HER2 человека, и второй антиген представляет собой PDGFRβ человека;
причем домен VH, который специфически связывается с HER2 человека, включает аминокислотные последовательности HCDR3, HCDR2 и HCDR1, представленные в SEQ ID NOs: 1, 2 и 3; 4, 5 и 6; 7, 8 и 9; или 10, 11 и 12, соответственно;
где домен VH, который специфически связывается с PDGFRβ человека, включает HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26, и HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27; и
причем полипептид лишен легких цепей антитела.
2. Антигенсвязывающий полипептид по п.1, где тяжелая цепь антитела генетически связана со вторым доменом VH через аминокислотный линкер.
3. Антигенсвязывающий полипептид по п.2, где линкер включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No: 23.
4. Антигенсвязывающий полипептид по любому из пп. 1-3, дополнительно включающий легкую цепь антитела, причем легкая цепь включает домен VL, который специфически связывается с антигеном, где тяжелые и легкие цепи образуют пары естественным образом.
5. Антигенсвязывающий полипептид по п.4, где домен VL связывается с первым антигеном.
6. Антигенсвязывающий полипептид, включающий димер двух антигенсвязывающих полипептидов по любому из пп. 1-5, причем два антигенсвязывающих полипептида естественным образом димеризованы через константные области тяжелых цепей.
7. Антигенсвязывающий полипептид по любому из пп. 1-6, где домен VH, который специфически связывается с HER2 человека,включает аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 13, 14, 15 и 16.
8. Антигенсвязывающий полипептид по любому из пп. 1-7, где домен VH, который специфически связывается с HER2 человека, включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 13, 14, 15 и 16.
9. Антигенсвязывающий полипептид по любому из пп. 1-8, где домен VH который специфически связывается с PDGFRβ человека, включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24.
10. Антигенсвязывающий полипептид по любому из пп. 1-9, включающий тяжелую цепь атитела, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18 или 20.
11. Антигенсвязывающий полипептид по любому из пп. 4-10, включающий или дополнительно включающий домен VL, который специфически связывается с PDGFRβ человека и включает LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30, и LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31.
12. Антигенсвязывающий полипептид по п.11, где домен VL который специфически связывается с PDGFRβ человека, включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28.
13. Антигенсвязывающий полипептид по п.11, включающий легкую цепь антитела, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22.
14. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антигенсвязывающий полипептид по любому из пп. 1-13.
15. Рекомбинантный экспрессионный вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.14.
16. Клетка-хозяин, включающая рекомбинантный экспрессионный вектор по п.15, для получения антигенсвязывающего полипептида по любому из пп. 1-13.
17. Способ получения антигенсвязывающего полипептида, включающего тяжелую цепь антитела, включающую первый домен VH, который специфически связывается с первым антигеном, связанную на C-конце со вторым доменом VH, который специфически связывается со вторым антигеном, где первый антиген представляет собой PDGFRβ человека, и второй антиген представляет собой HER2 человека, или где первый антиген представляет собой HER2 человека, и второй антиген представляет собой PDGFRβ человека, включающий культивирование клетки-хозяина по п.16 в таких условиях, что клеткой-хозяином продуцируется антигенсвязывающий полипептид.
18. Фармацевтическая композиция для лечения рака, включающая эффективное количество антигенсвязывающего полипептида по любому из пп. 1-13 и один или более фармацевтически приемлемых носителей.
19. Способ лечения рака, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п.18.
| KONTERMANN R | |||
| Dual targeting strategies with bispecific antibodies, mAbs, 2012, Vol.4, Issue 2, pp.182-197 | |||
| LAVENTIE B.J | |||
| et al | |||
| Heavy chain-only antibodies and tetravalent bispecific antibody neutralizing Staphylococcus aureus leukotoxins, Proc Natl Acad Sci, 2011, vol.108, no.39, pp.16404-16409 | |||
| US 20130177572 A1, 11.07.2013 | |||
| КОМПОЗИЦИЯ АНТИТЕЛ К HER2 | 2005 |
|
RU2361880C2 |
