Область техники

Настоящее изобретение относится к новым биспецифическим антителам (contorsbodies - конторстелам), состоящим из двух гибридизированных полипептидов, содержащих два антигенсвязывающих домена, способных к специфическому связыванию с первой мишенью, и один антигенсвязывающий домен, способный к специфическому связыванию со второй мишенью, к способам получения этих молекул и к способам их применения.

Предшествующий уровень техники

Со времени разработки в 1974 году Koehler и Milstein первых моноклональных антител, много усилий было направлено на разработку антител, пригодных для лечения людей. Первые доступные моноклональные антитела были разработаны в организмах мышей и крыс. Эти антитела при лечении людей вызывают нежелательные побочные эффекты из-за выработки антител против антител грызунов. Много усилий было предпринято для снижения проявления таких нежелательных побочных эффектов или даже их устранения. В последние годы на рынке появились моноклональные антитела человека или гуманизированные моноклональные антитела, количество которых постоянно возрастает.

Биспецифические антитела представляют все больший интерес для диагностических и терапевтических целей. Хотя природные антитела являются моноспецифическими, биспецифические антитела распознают два разных эпитопа либо на одном, либо на разных антигенах. За последние годы было разработано множество форматов новых антител. Применение сложного молекулярного дизайна и генной инженерии решило многие технические проблемы, связанные с созданием биспецифических антител, например, такие как стабильность, растворимость и другие свойства, которые необходимы лекарственным препаратам и которые в целом обобщают под понятием «необходимые свойства для разработки». Кроме того, для придания различных необходимых свойств разрабатываемому биспецифическому антителу (то есть профили целевого продукта) необходим доступ к разнообразным панелям форматов антител. Эти форматы могут варьировать по размеру, геометрии связывающих модулей, валентности, гибкости, а также по фармакокинетическим свойствам (Brinkmann U., Kontermann R.E., MABS, 9(2), 2017, 182-212).

Тем не менее, предполагают, что не существует единого наилучшего формата, соответствующего всем потребностям, и что по-прежнему имеется потенциал для оптимизации форматов антител, полученных из четырех-цепочечного формата Y-образных антител дикого типа. Для применения в качестве фармацевтического продукта биспецифические антитела необходимо получать в больших количествах воспроизводимым способом, предпочтительно с высоким выходом. Более сложный состав (например, 3-4 цепи в отличие от 2-цепочечных IgG) часто требует более экстенсивной оптимизации систем экспрессии. Кроме того, наличие или отсутствие нежелательных побочных продуктов может иметь большое значение.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, состоящим из двух цепей, хотя они содержат три антигенсвязывающих домена. Антитела по настоящему изобретению отличаются по пространственной ориентации антигенсвязывающего домена от классических антител в формате IgG.

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, состоящему из двух гибридизированных полипептидов и содержащему два антигенсвязывающих домена, способных специфически связываться с первой мишенью, и один антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться со второй мишенью, в котором

(а) первый гибридизированный полипептид содержит первую часть первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, спейсерный домен, вторую часть первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, и первую часть антигенсвязывающего домена, способную к специфическому связыванию со второй мишенью, в котором

- спейсерный домен является полипептидом и содержит по меньшей мере 25 аминокислотных остатков,

- первая часть первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, гибридизирована или непосредственно, или через первый пептидный линкер, с N-концом спейсерного домена,

- вторая часть первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, гибридизирована или непосредственно, или через второй пептидный линкер, с С-концом спейсерного домена, и

- первая часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, гибридизирована или непосредственно, или через третий пептидный линкер с С-концом второй части первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, или гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с N-концом первой части первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, и

(б) второй гибридизированный полипептид, содержащий первую часть второго антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, спейсерный домен, вторую часть второго антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, и вторую часть антигенсвязывающего домена, способную к специфическому связыванию со второй мишенью, в котором

спейсерный домен является полипептидом и содержит по меньшей мере 25 аминокислотных остатков,

- первая часть второго антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через первый пептидный линкер с N-концом спейсерного домена,

- вторая часть второго антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию с первой мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через второй пептидный линкер с С-концом спейсерного домена, и

- вторая часть антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с С-концом второй части второго антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию с первой мишенью, или гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с N-концом первой части второго антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью,

где первая часть и вторая часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, связаны друг с другом с формированием антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, причем первая часть и вторая часть первого и второго антигенсвязывающих доменов, способных специфически связываться с первой мишенью, связаны друг с другом с образованием кольцевого гибридного полипептида, и

где спейсерный домен первого гибридизированного полипептида и спейсерный домен второго гибридизированного полипептида ковалентно связаны друг с другом дисульфидной связью и содержат модификации, способствующие ассоциации первого и второго гибридизированных полипептидов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, описанное выше в настоящем описании, в котором в первом гибридизированном полипептиде первая часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с С-концом второй части первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, и в котором во втором гибридизированном полипептиде вторая часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с С-концом второй части первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, описанное выше в настоящем описании, в котором в первом гибридизированном полипептиде первая часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с N-концом первой части первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, и в котором во втором гибридизированном полипептиде вторая часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с N-концом первой части первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, описанное выше в настоящем описании, в котором третий пептидный линкер, соединяющий первую часть или вторую часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, включает, по меньшей мере, 15 аминокислот. В другом варианте осуществления настоящего изобретения третий пептидный линкер, соединяющий первую часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, и третий пептидный линкер, соединяющий вторую часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, являются идентичными. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают третий пептидный линкер, включающий от 15 до 25 аминокислот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:84.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, описанное выше в настоящем описании, в котором в первый гибридизированный полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, и второй гибридизированный полипептид содержит вариабельный домен легкой цепи антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, или наоборот. В другом варианте осуществления настоящего изобретения первая часть антигенсвязывающего домена является фрагментом Fab тяжелой цепи антитела, и вторая часть антигенсвязывающего домена является фрагментом Fab легкой цепи антитела, или наоборот. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения первая часть антигенсвязывающего домена и вторая часть антигенсвязывающего домена ковалентно связаны друг с другом дисульфидной связью.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая часть антигенсвязывающего домена является фрагментом Fab тяжелой цепи антитела (VH-CH1), и вторая часть антигенсвязывающего домена является фрагментом Fab легкой цепи антитела (VL-Ckappa). В другом варианте осуществления настоящего изобретения первая часть антигенсвязывающего домена является фрагментом Fab легкой цепи антитела, и вторая часть антигенсвязывающего домена является фрагментом Fab тяжелой цепи антитела. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая часть антигенсвязывающего домена является фрагментом Fab перекрестного антитела, содержащего VH-Ckappa, и вторая часть антигенсвязывающего домена является кросс-Fab фрагментом антитела, содержащим VL-CH1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения первая часть антигенсвязывающего домена является кросс-Fab фрагментом антитела, содержащим VL-CH1, и вторая часть антигенсвязывающего домена является кросс-Fab фрагментом антитела, содержащим VH-Ckappa.

Выше описано, что биспецифическое антитело состоит из первого и второго гибридизированных полипептидов, которые оба содержат спейсерный домен, причем спейсерный домен первого гибридизированного полипептида и спейсерный домен второго гибридизированного полипептида ковалентно связаны друг с другом посредством дисульфидной связи и содержат модификации, способствующие ассоциации первого и второго гибридизированных полипептидов. Спейсерный домен содержит, по меньшей мере, 25 аминокислот.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения спейсерный домен содержит шарнирную область антитела или его (С-концевой) фрагмент и домен СН2 антитела или его (N-концевой) фрагмент. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения спейсерный домен содержит шарнирную область антитела или ее фрагмент, домен СН2 антитела и домен СН3 антитела или их фрагмент. Кроме того, спейсерный домен первого гибридизированного полипептида и спейсерный домен второго гибридизированного полипептида содержат модификации, способствующие ассоциации первого и второго гибридизированных полипептидов. В одном из вариантов настоящего изобретения спейсерный домен первого гибридизированного полипептида содержит впадины, а спейсерный домен второго гибридизированного полипептида содержит выступы в соответствии с принципом «выступ-во-впадину». В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, в котором спейсерный домен содержит шарнирную область антитела или его фрагмент и домен Fc IgG1. В частности, домен Fc IgG1 включает одно или несколько аминокислотных замещений, которые уменьшают связывание с рецептором Fc, в частности, с рецептором Fcγ. Точнее, домен Fc IgG1 содержит аминокислотные замещения L234A, L235A и P329G (нумерация по EU индексу Kabat).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, в котором один антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться со второй мишенью, является антигенсвязывающий доменом, способным специфически связываться с опухолеассоциированным антигеном (tumor associated antigen - ТАА). В частности, опухолеассоциированный антиген является белком активации фибробластов (Fibroblast Activation Protein - FAP). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, в котором антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться со второй мишенью, является антигенсвязывающим доменом, способным специфически связываться с белком активации фибробластов (FAP).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с FAP, содержит

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VHFAP), содержащую (i) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, (ii) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и (iii) CDR-Н3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 и вариабельную область легкой цепи (VLFAP), содержащую (iv) CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, (v) CDR-L2, включающую аминокислотная последовательность SEQ ID NO:5 и (vi) CDR-L3, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, или

(б) вариабельную область тяжелой цепи (VHFAP), содержащую (i) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, (ii) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, и (iii) CDR-Н3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, и вариабельную область легкой цепи (VLFAP), содержащую (iv) CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, (v) CDR-L2, включающую аминокислотная последовательность SEQ ID NO:13 и (vi) CDR-L3, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.

Точнее, антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с FAP, содержит

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VHFAP), содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7, и вариабельную область легкой цепи (VLFAP), содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8, или

(б) вариабельную область тяжелой цепи (VHFAP), содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:15, и вариабельную область легкой цепи (VLFAP), содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, в котором антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с первой мишенью, является антигенсвязывающим доменом, способным специфически связываться с рецептором TNF, в частности костимулирующим рецептором TNF. В частности, костимулирующим рецептором TNF является ОХ40. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, в котором антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с первой мишенью, является антигенсвязывающим доменом, способным специфически связываться с ОХ40. В частности, биспецифическое антитело по настоящему изобретению содержит два антигенсвязывающих домена, способных специфически связываться с ОХ40.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с ОХ40, включает

(а) вариабельную область тяжелой цепи (V_HOX40), включающую (i) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ii) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, и (iii) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22, и вариабельную область легкой цепи (V_LOX40), включающую (iv) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, (v) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31, и (vi) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35, или

(б) вариабельную область тяжелой цепи (V_HOX40), включающую (i) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ii) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, и (iii) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21, и вариабельную область легкой цепи (V_LOX40), включающую (iv) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, (v) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31, и (vi) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34, или

(в) вариабельную область тяжелой цепи (V_HOX40), включающую (i) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ii) CDR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, и (iii) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23, и вариабельную область легкой цепи (V_LOX40), включающую (iv) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, (v) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31, и (vi) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:36, или

(г) вариабельную область тяжелой цепи (V_HOX40), включающую (i) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ii) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, и (iii) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24, и вариабельную область легкой цепи (V_LOX40), включающую (iv) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, (v) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31, и (vi) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37, или

(д) вариабельную область тяжелой цепи (V_HOX40), включающую (i) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, (ii) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20, и (iii) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и вариабельную область легкой цепи (V_LOX40), включающую (iv) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29, (v) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32, и (vi) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38, или

(е) вариабельную область тяжелой цепи (V_HOX40), включающую (i) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, (ii) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20, и (iii) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, и вариабельную область легкой цепи (V_LOX40), включающую (iv) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29, (v) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32, и (vi) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38, или

(ж) вариабельную область тяжелой цепи (V_HOX40), включающую (i) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, (ii) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20, и (iii) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27, и вариабельную область легкой цепи (V_LOX40), включающую (iv) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30, (v) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33, и (vi) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:39.

В частности, антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с ОХ40, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VHOX40), включающую (i) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, (ii) CDR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19 и (iii) CDR-H3, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22, и вариабельную область легкой цепи (VLOX40), содержащую (iv) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28, (v) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31, и (vi) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с ОХ40, содержит

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VHOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40, и вариабельную область легкой цепи (VLOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:41, или

(б) вариабельную область тяжелой цепи (VHOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:42, и вариабельную область легкой цепи (VLOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:43, или

(в) вариабельную область тяжелой цепи (VHOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:44, и вариабельную область легкой цепи (VLOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:45, или

(г) вариабельную область тяжелой цепи (VHOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:46, и вариабельную область легкой цепи (VLOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47, или

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VHOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:48, и вариабельную область легкой цепи (VLOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:49, или

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VHOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:50, и вариабельную область легкой цепи (VLOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:51, или

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VHOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:52, и вариабельную область легкой цепи (VLOX40), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:53.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с ОХ40, содержит

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VHOX40), содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:40, и вариабельную область легкой цепи (VLOX40), содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:41.

В частности, настоящее изобретение предусматривает биспецифическое антитело, которое содержит

(а) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:54, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:55,

(б) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:56, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:57,

(в) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:58, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:59,

(г) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:60, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:61,

(д) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:62, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:63,

(е) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:64, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:65, или

(ж) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:66, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:67.

Кроме того, настоящее изобретение предусматривает биспецифическое антитело, которое содержит

(а) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:116, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:117,

(б) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:118, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:119,

(в) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:120, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:121,

(г) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:122, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:123,

(д) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:124, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:125,

(е) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:126, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:128,

(ж) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:129, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:130,

(з) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:131, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:132, или

(и) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:133, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:134.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, в котором костимулирующим рецептором TNF является 4-1ВВ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, в котором антигенсвязывающий домен, способный к специфическому связыванию с первой мишенью, представляет собой антигенсвязывающий домен, способный к специфическому связыванию с 4-1ВВ. В частности, биспецифическое антитело по настоящему изобретению содержит два антигенсвязывающих домена, способных специфически связываться с 4-1ВВ.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с 4-1ВВ, вариабельной области тяжелой цепи (VH4-1BB), включает (i) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:135, (ii) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:136, и (iii) CDR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:137, и вариабельную область легкой цепи (Vl4-1BB), включающую (iv) CDR-L1, содержащую аминокислотную SEQ ID NO:138, (v) CDR-L2, содержащую аминокислотную SEQ ID NO:139, и (vi) CDR-L3, содержащую аминокислотную SEQ ID NO:140. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с 4-1ВВ, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH4-1BB), включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:141, и вариабельную область легкой цепи (VL4-1ВВ), содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:142.

В частности, настоящее изобретение предусматривает биспецифическое антитело, которое содержит

(а) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:143, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:144, или

(б) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:145, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:146.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, в котором костимулирующим рецептором TNF является CD40. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, в котором антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с первой мишенью, является антигенсвязывающий доменом, способным специфически связываться с CD40. В частности, биспецифическое антитело по настоящему изобретению содержит два антигенсвязывающих домена, способных специфически связываться с CD40.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с CD40, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VHCD40), включающую (i) CDR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:147, (ii) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:148, и (iii) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:149, и вариабельную область легкой цепи (VLCD40), включающую (iv) CDR-L1, содержащую аминокислотную SEQ ID NO:150, (v) CDR-L2, содержащую аминокислотную SEQ ID NO:151, и (vi) CDR-L3, содержащую аминокислотную SEQ ID NO:152. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с CD40, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VHCD40), включающую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:153, и вариабельную область легкой цепи (VLCD40), содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:154.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с первой мишенью, является антигенсвязывающим доменом, способным специфически связываться с CD40, и содержит

(i) вариабельную область тяжелой цепи (VHCD40), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:169 и SEQ ID NO:170, и вариабельную область легкой цепи (VLCD40), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:171, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:173 и SEQ ID NO:174, или

(ii) вариабельную область тяжелой цепи (VHCD40), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:179 и SEQ ID NO:180, и вариабельную область легкой цепи (VLCD40), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:183 и SEQ ID NO:184.

В частности, настоящее изобретение предусматривает биспецифическое антитело, которое содержит

(а) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:155, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:156,

(б) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:157, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:158,

(в) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:159, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:160, или

(г) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:161, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:162, или

(д) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:163, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:164, или

(е) гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:165, и гибридизированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:166.

Настоящее изобретение также предусматривает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую биспецифическое антитело по настоящему изобретению. Также предусматривают вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, и, кроме того, клетку-хозяина, содержащую выделенную нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии по настоящему изобретению. Также предусмотрен метод получения биспецифического антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, пригодных для экспрессии биспецифического антитела. Этот метод также может включать стадию выделения биспецифического антитела.

Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую биспецифическое антитело по настоящему изобретению и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый эксципиент.

Настоящее изобретение также предусматривает биспецифическое антитело по настоящему изобретению или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Более конкретно, также в настоящем изобретении предусматривают биспецифическое антитело по настоящему изобретению для лечения рака или инфекционных заболеваний. В частности, предложено биспецифическое антитело по настоящему изобретению для применения при лечении рака.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают применение биспецифического антитела по настоящему изобретению или фармацевической композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства, предназначенного для

(i) стимулирования ответа Т-клеток,

(ii) поддержки выживаемости активированных Т-клеток,

(iii) лечения инфекций,

(iv) лечения рака,

(v) задержки прогрессирования рака, или

(vi) продления выживаемости пациента, больного раком.

Настоящее изобретение также предусматривает метод лечения индивидуума, больного раком или инфекционным заболеванием, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также предусматривает применение биспецифического антитела по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для усиления или продления цитотоксической активности Т-клеток. Также предусмотрен метод усиления или продления цитотоксической активности Т-клеток у больного раком индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в соответствии с различными аспектами настоящего изобретения индивидуумом является млекопитающее, в частности человек.

Краткое описание фигур

На фигурах 1А, 1Б, 1В и 1Г показывают примеры того, как могут быть составлены конторстела настоящего изобретения. На фиг. 1А конторстело состоит из первого гибридизированного полипептида, содержащего первую половину Fab, способного к специфическому связыванию с первой мишенью (Fab тяжелой цепи), связанной через пептидный линкер (черная линия) со второй половиной Fab, способной специфически связываться с первой мишенью (Fab легкой цепи), которая дополнительно связана с первой половиной перекрестного Fab, способного специфически связываться со второй мишенью (VH-Ckappa) (в направлении от N к С), и второго гибридизированного полипептида, содержащего первую половину Fab, способного к специфическому связыванию с первой мишенью (Fab тяжелой цепи), связанной через пептидный линкер (черная линия) со второй половиной Fab, способной специфически связываться с первой мишенью (Fab легкой цепи), которая дополнительно связана с первой половиной перекрестного Fab, способного специфически связываться со второй мишенью (VL-CH1) (в направлении от N к С). Два спейсерных домена отличаются друг от друга и содержат модификации, способствующие ассоциации первого и второго гибридизируемых полипептидов. Примером конторстела такого типа является CD134-0093 (см. пример 2.1). На фиг. 1Б конторстело состоит из первого гибридизированного полипептида, содержащего первую половину перекрестного Fab, способного к специфическому связыванию с первой мишенью (VH-Ckappa), связанного через пептидный линкер (черная линия) со спейсерным доменом, связанным через пептидный линкер (черная линия) со второй половиной перекрестного Fab, способного специфически связываться с первой мишенью (VL-CH1), которая дополнительно связана с первой половиной Fab, способной специфически связываться со второй мишенью (Fab легкой цепи) (в направлении от N к С), и второго гибридизированного полипептида, содержащего первую половину перекрестного Fab, способного к специфическому связыванию с первой мишенью (VH-Ckappa), связанной через пептидный линкер (черная линия) со спейсерным доменом, связанным через пептидный линкер (черная линия) со второй половиной перекрестного Fab, способного специфически связываться с первой мишенью (VL-CH1), которая дополнительно связана со второй половиной Fab, способной специфически связываться со второй мишенью (Fab тяжелой цепи) (в направлении от N к С). Два спейсерных домена отличаются друг от друга и содержат модификации, способствующие ассоциации первого и второго гибридизируемых полипептидов. Примером конторстела такого типа является CD134-0094 (см. пример 2.2). На фиг. 1В конторстело состоит из первого гибридизированного полипептида, содержащего первую половину Fab, способную к специфическому связыванию с первой мишенью (VL-Ckappa), связанного через пептидный линкер (черная линия) со спейсерным доменом, связанным через пептидный линкер (черная линия) со второй половиной Fab, способной специфически связываться с первой мишенью (VH-CH1), которая дополнительно связана с первой половиной перекрестного Fab, способной специфически связываться со второй мишенью (VH-Ckappa) (в направлении от N к С), и второго гибридизированного полипептида, содержащего первую половину Fab, способную к специфическому связыванию с первой мишенью (VL-Ckappa), связанную через пептидный линкер (черная линия) со спейсерным доменом, связанным через пептидный линкер (черная линия) со второй половиной Fab, способной специфически связываться с первой мишенью (VH-СН1), которая дополнительно связана со второй половиной перекрестного Fab, способной специфически связываться со второй мишенью (VL-CH1) (в направлении от N к С). Два спейсерных домена отличаются друг от друга и содержат модификации, способствующие ассоциации первого и второго гибридизируемых полипептидов. Примером конторстела такого типа является Р1АЕ0821 (см. пример 2.7). На фиг. 1Г конторстело состоит из первого гибридизированного полипептида, содержащего первую половину перекрестного Fab, способную специфически связываться со второй мишенью (VH-Ckappa), связанную через пептидный линкер (черная линия) с первой половиной перекрестного Fab, способного специфически связываться с первой мишенью (VH- Скарра), которая дополнительно связана через пептидный линкер (черная линия) со спейсерным доменом, связанным через пептидный линкер (черная линия) со второй половиной перекрестного Fab, способной специфически связываться с первой мишенью (VH-CH1) (в направлении от N к С), из второго гибридизированного полипептида, содержащего первую половину перекрестного Fab, способную специфически связываться со второй мишенью (VH-CH1), связанной через пептидный линкер (черная линия) с первой половиной перекрестного Fab, способной специфически связываться с первой мишенью (VH-Ckappa), которая дополнительно связана через пептидный линкер (черная линия) со спейсерным доменом, связанным через пептидный линкер (черная линия) со второй половиной перекрестного Fab, способной специфически связываться с первой мишенью (VL-CH1) (в направлении от N к С). Два спейсерных домена отличаются друг от друга и содержат модификации, способствующие ассоциации первого и второго гибридизируемых полипептидов. Примером конторстела такого типа является Р1АЕ2735 (см. пример 2.14).

Фиг. 1Д представляет схему собранной структуры конторстела CD134-0093 (пример 2.1).

Фиг. 1Е представляет схему собранной структуры конторстела CD134-0094 (пример 2.2).

Фиг. 1Ж представляет схему собранной структуры конторстел Р1АЕ0085 и Р1АЕ0086 (примеры 2.3 и 2.4). Антигенсвязывающий домен, способный к специфическому связыванию со второй мишенью (перекрестный Fab), связан через удлиненный пептидный линкер, который изменяет геометрию молекулы.

Фиг. 13 представляет схему собранной структуры конторстела Р1АЕ0087 (пример 2.5) и конторстела Р1АЕ0839 (пример 2.6). В этом случае антигенсвязывающий домен, способный к специфическому связыванию со второй мишенью, является Fab, и оба антигенсвязывающих домена, способных специфически связываться с первой мишенью, являются перекрестными Fab.

Фиг. 1И представляет схему собранной структуры конторстела Р1АЕ0821 (конторстело 11, пример 2.7).

Фиг. 1К представляет схему собранной структуры конторстела Р1АЕ1122 (конторстело 1, пример 2.8).

Фиг. 1Л представляет схему собранной структуры конторстела Р1АЕ1887 (конторстело 3, пример 2.10).

Фиг. 1М представляет схему собранной структуры конторстела Р1АЕ2254 (конторстело 5, пример 2.12). В СН и Ckappa, гибридизированных с VL и VH в ОХ40, соответственно, аминокислотные мутации (так называемые заряженные остатки) интродуцируют для предупреждения образования белков Бен-Джонса и для дополнительного облегчения и корректировки спаривания.

Фиг. 1Н представляет схему собранной структуры конторстела Р1АЕ2340 (конторстело 6, пример 2.13). В этом примере молекула состоит из двух гибридизированных белков и легкой цепи.

Фиг. 1O представляет схему собранной структуры конторстела Р1АЕ2735 (конторстело 8, пример 2.14).

Фиг. 1П представляет схему биспецифического антитела 2+1 ОХ40 х FAP с бивалентным связыванием с ОХ40 и моновалентным связыванием с FAP (молекула положительного контроля). Была получена молекула отрицательного контроля с такой же структурой, в которой FAP-связывающий домен заменен зародышевой линией DP47 (антитело 2+1 ОХ40 х DP47).

Фиг. 1Р представляет схему биспецифического антитела 4+1 ОХ40 х FAP с тетравалентным связыванием ОХ40 и моновалентным связыванием FAP. Эти контрольные молекулы подробно описаны в примере 2.18.

Фиг. 2А, 2Б, 2В и 2Г показывают связывание биспецифических антител ОХ40 х FAP с активированными CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетками (фиг. 2А и 2В, соответственно) и покоящимися CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетками (фиг. 2Б и 2Г, соответственно). Тетравалентное биспецифическое антитело 4+1 ОХ40 х FAP (4В9) показало наиболее сильное связывание с CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетками. 2+1 форматы 2+1 ОХ40 (49В4) х FAP (28Н1) и 2+1 ОХ40 (49В4) х DP47 показали промежуточное связывание. Конторстело CD134-0093 показало более сильное связывание, чем форматы 2+1, тогда как конторстело CD 134-0094 связывалось слабее. Связывание с CD4⁺ Т-клетками было гораздо сильнее, чем с CD8⁺ Т-клетками. Отрицательный контроль DP47 hu IgG1 P329G LALA не связывался с CD4⁺ или CD8⁺ Т-клетками. Ни одна из молекул не связана с покоящимися CD4⁺ или CD8⁺ Т-клетками (фиг. 2Б и 2Г).

Фиг. 2Д, 2Е, 2Ж и 2З представляют результаты, полученные с конторстелами Р1АЕ0085, Р1АЕ0086 и Р1АЕ0087. Все 2+1 форматы ОХ40 (49В4) х FAP (28Н1), ОХ40 (49В4) х FAP (4В9) и ОХ40 (49В4) х DP47 продемонстрировали схожее хорошее связывание с активированными CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетками (фиг. 2Д и 2Ж, соответственно), тогда как связывание с ОХ40 было частично ослаблено для молекул конторстел, особенно для конторстела Р1АЕ0087. DP47 hu IgG1 P329G LALA не связывалось с CD4⁺ или CD8⁺ Т-клетками, как ожидалось. Не обнаружено связывания с покоящимися CD4⁺ или CD8⁺ Т-клетками (фиг. 2Е и 2З, соответственно) для каких-либо исследованных молекул.

Связывание с опухолевыми клетками, экспрессирующими FAP человека, показано на фиг. 3А, 3Б, 3В и 3Г. В первом эксперименте конторстела CD134-0093 и CD134-0094 сравнивают с контрольными молекулами. Связывание с WM266-4 (FAP⁺ положительными) и A549NLR (FAP^- отрицательными) опухолевыми клетками показано на фиг. 3А и 3Б, соответственно. Все биспецифические антитела ОХ40 х FAP связывались эффективно с клетками-мишенями, экспрессирующими FAP человека. Тетравалентное 4+1 ОХ40 х FAP (4 В9, высокое сродство с FAP) биспецифическое антитело связывается наиболее сильно с FAP⁺ клетками, затем конторстело CD134-0093, конторстело CD1334-0094 и 2+1 ОХ40 (49В4) х FAP (28Н1) биспецифическое антитело. Не нацеленное 2+1 ОХ40 (49 В4) х DP47 и отрицательный контроль (DP47 hu IgG1 P329G LALA) не связываются с какими-либо клетками FAP⁺. Фиг. 3В и 3Г демонстрируют связывание конторстел Р1АЕ0085, Р1АЕ0086 и Р1АЕ0087 с NIH/3T3huFAP клоном 19 (FAP) (фиг. 3В) и опухолевыми клетками A549NLR (FAP^-) (фиг. 3Г). Все FAP-нацеленные анти-ОХ40 антитела связываются эффективно с клетками-мишенями, экспрессирующими FAP человека. Связывание молекул конторстел несколько ослаблено по сравнению с соответствующими контролями. К тому же не нацеленное 2+1 ОХ40 (49В4) х DP47 и отрицательный контроль (DP47 hu IgG1 P329G LALA) не проявляют связывания с клетками FAP⁺.

На фиг. 4А, 4Б, 4В, 4Г, 4Д и 4Е показывают NFκB активацию с разными типами перекрестного связывания. Используя FAP-экспрессирующие клетки (NIH/3T3 huFAP клон 19) в качестве перекрестных связующих, FAP-нацеленная 2+1 ОХ40 (49 В4) х FAP (28Н1) конструкция индуцирует самую сильную активацию NFκB, за которой следуют конторстела CD134-0093 и CD134-0094, хотя CD134-0094 немного более сильную активацию, чем CD134-0093. Не нацеленные и, следовательно, не перекрестно сшивающие 2 не нацеленных 2+1 ОХ40 (49В4) х DP47 индуцируют слабую активацию NFκB (фиг. 4А). При использовании вторичного анти-IgG1 человека Fcγ-специфического антитела в качестве перекрестного связующего, две 2+1 конструкции ОХ40 (49В4) х FAP (28Н1) и ОХ40 (49В4) х DP47 действуют схожим образом. Конторстела CD134-0093 и CD134-0094 также действует аналогично, но на более низком уровне, чем конструкции 2+1 (фиг. 4Б). Наименьшую активацию NFκB наблюдают без применения перекрестных сшивающих агентов. 2+1 конструкции ОХ40 (49В4) х FAP (28Н1) и ОХ40 (49В4) х DP47 показывают умеренную активацию NFκB, за ними следуют еще менее активные конторстела CD134-0093 и CD134-0094. DP47 hu IgG1 P329G LALA не индуцирует какой-либо активации NFκB (фиг. 4В). Способность конторстел Р1АЕ0085, Р1АЕ0086 и Р1АЕ0087 индуцировать активацию NFκB с разными типами перекрестного связывания показана на фиг. 4Г-4Е. В отсутствие перекрестного связывания может быть обнаружен только самый слабый сигнал при самой высокой концентрации антител (фиг. 4Г). Три молекулы конторстела индуцируют весьма схожую активацию NFκB относительно FAP-нацеленных 2+1 форматов ОХ40 (49В4) х FAP (28Н1) и ОХ40 (49В4) х FAP (4В9) при перекрестном сшивании FAP-экспрессирующими клетками человека (фиг. 4Д). При перекрестном сшивании вторичного антитела все три молекулы конторстел проявляют несколько заниженную активацию NFκB по сравнению с 2+1 контрольными молекулами (фиг. 4Е). DP47 hu IgG1 P329G LALA не индуцирует какой-либо активации NFκB.

ОХ40-опосредованная костимуляция субоптимально TCR-стимулированных покоящихся МКПК человека и гипер-перекрестное сшивание FAP на поверхности клеток показаны на фиг. 5А, 5Б, 5В, 5Г, 5Д и 5Е. Фиг. 5А и 5Б показывают FSC-A ("area" of a Forward Side Scatter область прямого светорассеяния; (FSC) импульс), соответственно, размер CD4 и CD8 Т-клеток, соответственно, после субоптимальной CD3 стимуляции измеренный как интенсивность света, рассеянного под малыми углами, с помощью анализа FACS. Нацеленная на FAP 2+1 конструкция ОХ40 (49В4) х FAP (28Н1) показывает промежуточное повышение размера, тогда как конторстело CD134-0093 показывает более сильное повышение. Не нацеленные 2+1 ОХ40 (49В4) х DP47, конторстело CD134-0094 и отрицательный контроль (DP47 hu IgG1 P329G LALA) не меняют размер ни CD4, ни CD8 Т-клеток. Фиг. 5В и 5Г показывают активацию CD4 и CD8 Т-клеток, используя поверхностный маркер CD25. В отношении CD4 Т-клеток (фиг. 5В) конторстела CD134-0093 и CD134-0094 проявляют наивысшую активацию, за ними следует несколько слабее нацеливающееся 2+1 ОХ40 (49 В4) х FAP (28Н1). Не нацеленное ОХ40 (49 В4) х DP47 и отрицательный контроль не показывают какой-либо активации после поправки концентрации по нулевому уровню. В отношении CD8 Т-клеток (фиг. 5Г) конторстело CD134-0094 проявляет повышенную активацию по сравнению с 2+1 ОХ40 (49В4) х FAP (28Н1) и CD134-0093. Фиг. 5Д и 5Е показывают при активации пониженную регуляцию IL-7Rα (CD127). Конторстело CD134-0093 проявляет самое сильное снижение регуляции CD127 для CD4 и CD8 Т-клеток, за ним следует гацеленная конструкция 2+1 ОХ40 (49В4) х FAP (28Н1) и конторстело CD134-0094.

Фиг. 6 показывает величины нормализованной площади под кривой (area under the curve, AUC) для FSA-A и CD25 на CD4 и CD8 Т-клетках. Заштрихованные обозначения относятся к CD4 Т-клеткам, незаштрихованные к CD8 Т-клеткам. Все значения нормализованы по верхним значениям AUC для конторстела CD134-0093 (= 100%). Не нацеленная конструкция 2+1 ОХ40 (49В4) x DP47 проявляет только минимальную активацию на CD4 и CD8 Т-клетках, а FAP нацеленная конструкция 2+1 ОХ40 (49В4) х FAP (28Н1) проявляет повышенную активность (нормализованные значения между 60 и 100 относительно FSC-A и CD25 на CD4 и CD8 Т-клетках, но меньше по сравнению с CD134-0093. Для конторстела CD134-0094 только значения среднекратного прироста (mean fold increase, MFI) CD25 AUC для CD4 и CD8 Т-клеток показывают сходную активацию по сравнению с CD134-0093.

Влияние конторстел Р1АЕ0085, Р1АЕ0086 и Р1АЕ0087 на ОХ40-опосредованную костимуляцию субоптимально запускаемых TCR МКПК и гипер-перекрестное сшивание FAP на клеточной поверхности показаны на фиг. 7А, 7Б, 7В и 7Г. Фиг. 7А и 7Б показывают FSC-A, соответственно, размер CD4 и CD8 Т-клеток после субоптимальной стимуляции CD3. Фиг. 7В и 7Г показывают активацию CD4 и CD8 Т-клеток, соответственно, с использованием экспрессии на клеточной поверхности маркера CD25. Все молекулы, нацеленные на FAP (контроля и все три молекулы конторстел), индуцируют дозозависимое увеличение зоны прямого светорассеяния и экспрессию CD25 как на CD4, так и на CD8 Т-клетках. Не нацеленная 2+1 конструкция ОХ40 (49В4) х DP47 и отрицательный контроль (DP47 hu IgG1 P329G LALA) не проявляют какой-либо активации после базовой коррекции.

Фиг. 8А, 8Б, 8В и 8Г показывают связывание различных ОХ40 х FAP конторстел с активированными CD4⁺ Т-клетками. Не нацеленную 2+1 конструкцию ОХ40 (49В4) х DP47 применяют в качестве положительного контроля и DP47 hu IgG1 P329G LALA в качестве отрицательного контроля. Фиг. 8А показывает связывание конторстела 1 (Р1АЕ1122), конторстела 2 (Р1АЕ1942) и конторстела 3 (Р1АЕ1887), а фиг. 8Б показывает связывание конторстела 4 (Р1АЕ1888), конторстела 5 (Р1АЕ2254) и конторстела 6 (Р1АЕ2340). Связывание конторстела 7 (Р1АЕ0086) и конторстела 8 (Р1АЕ2735) показано на фиг. 8В, и связывание конторстела 9 (Р1АЕ2743) и конторстела 10 (Р1АЕ2762) показаны на фиг. 8Г. На фиг. 9А, 9Б, 9В и 9Г, соответственно, показывают, что ни одно из исследованных конторстел не связывается с покоящимися CD4 Т-клетками. На фигурах 10А, 10Б, 10В и 10Г показывают связывание тех же ОХ40 х FAP конторстел с активированными CD8⁺ Т-клетками. Не нацеленную 2+1 конструкцию ОХ40 (49В4) х DP47 применяют в качестве положительного контроля и DP47 hu IgG1 P329G LALA в качестве отрицательного контроля. На фиг. фиг. 11А, 11Б, 11В и 11Г, соответственно, показывают, что ни одно из исследованных конторстел не связывается с покоящимися CD8 Т-клетками. Сумма значений площадей под кривыми как показатель связывания с активированными или покоящимися CD4⁺ Т-клетками показана на фиг. 12А, а связывания с активированными или покоящимися CD8⁺ Т-клетками показана на фиг. 12Б.

Связывание с опухолевыми клетками, экспрессирующими FAP человека, конторстел с 1 по 10 показано на фиг. 13А, 13Б, 13В и 13Г и фиг. 14А, 14Б, 14В и 14Г, соответственно. Связывание с NIH/3T3-huFAP клон 19 (FAP⁺) опухолевыми клетками (FAP⁺ положительными) показано на фиг. с 12А по 12Г, соответственно. На фиг. 13А показано связывание конторстела 1 (Р1АЕ1122), конторстела 2 (Р1АЕ1942) и конторстела 3 (Р1АЕ1887) и фиг. 13Б демонстрирует связывание конторстела 4 (Р1АЕ1888), конторстела 5 (Р1АЕ2254) и конторстела 6 (Р1АЕ2340). Связывание конторстела 7 (Р1АЕ0086) и конторстела 8 (Р1АЕ2735) показано на фиг. 13В, а связывание конторстела 9 (Р1АЕ2743) и конторстела 10 (Р1АЕ2762) показано на фиг. 13Г. Все ОХ40 х FAP биспецифические антитела эффективно связывают целевые клетки, экспрессирующие FAP человека. Контортело 8 (фиг. 12В) связывается наиболее крепко с FAP⁺ клетками, затем следует конторстело 10 (фиг. 12Г) и контортело 6 (фиг. 12Б), намного сильнее, чем 2+1 биспецифическое антитело ОХ40 (49В4) х FAP (4В9). Не нацеленную 2+1 конструкция ОХ40 (49В4) х DP47 и отрицательный контроль (DP47 hu IgG1 P329G LALA) не связываются с какими-либо FAP⁺ клетками. Соответствующее связывание контортел с 1 по 10 с A549NLR (FAP" отрицательными) опухолевыми клетками показано на фигурах с 14А по 14Г. Ни одна из FAP-нацеленных молекул (конторстел с 1 по 10 или 2+1 биспецифическое антитело ОХ40 (49В4) х FAP (4В9)) не может связываться с FAP^- целевыми клетками.

На фигурах 15А, 15Б, 15В и 15Г показана NFκB активация конторстел с 1 по 11 с перекрестным связыванием. При использовании FAP-экспрессирующих клеток (NIH/3T3 huFAP клон 19) в качестве перекрестных связующих, активация NFκB сопоставима со всеми конторстелами, причем с контортелом 11 (Р1АЕ0821) активация самая слабая. Не нацеленное и следовательно не перекрестно связанное 2 не нацеленное 2+1 ОХ40 (49В4) х DP47 антитело (7718) индуцируют слабую NFκB активацию, тогда как биспецифическое ОХ40 (49В4) х FAP (4В9) антитело (7719) вызывает наивысшую активацию NFκB. DP47 hu IgG1 P329G LALA (8105) не индуцирует какой-либо активации NFκB. NFκB активация без перекрестного связывания FAP показана на фигурах 16А, 16Б, 16В и 16Г. В отсутствие перекрестного связывания только слабый сигнал может быть обнаружен при повышенных концентрациях антитела. Не нацеленное 2+1 ОХ40 (49 В4) х DP47 антитело (7718) показывает умеренную активацию NFκB, за ним следует конторстело 7 (фиг. 16В). Другие конторстела индуцируют минорные или нулевые уровни. Отрицательный контроль (8105) не индуцирует какой-либо активации NFκB. Значения нормализованных площадей под кривой для активации NFκB в клетках HeLa с/без перекрестного сшивания с FAP⁺ клетками суммированы на фиг. 17. Отрицательный контроль (8105) не индуцирует какой-либо NFκB активации в обоих случаях, хотя не нацеленное 2+1 ОХ40 (49В4) х DP47 антитело (7718) показывает только минимальную активацию в обоих случаях. Биспецифическое ОХ40 (49В4) х FAP (4В9) антитело (7719) проявляет повышенные уровни активации, за которым следуют конторстела 8, 9 и 10. Пониженные уровни наблюдают для конторстела 11 (Р1АЕ0821).

ОХ40 опосредует ко-стимуляцию суб-оптимально TCR-стимулированных покоящихся МКПК человека и гипер-перекрестное сшивание поверхностным FAP контортел 7, 8, 9 и 10, что показано на фиг. 18А, 18Б, 18В и 18Г. Фигуры 18А и 18Б показывают активацию CD4 Т-клеток, а фигуры 18В и 18Г показывают активацию CD8 Т-клеток, используя поверхностный маркер CD25 после субоптимальной CD3 стимуляции. Для CD4 Т-клеток (фигуры 18А и 18Б) биспецифическое ОХ40 (49В4) х FAP (4В9) антитело (7719) проявляет наивысшую активацию, за ним следует конторстело 8 с минимально меньшей активностью. 8. Не нацеленные 2+1 ОХ40 (49В4) х DP47 антитела (7718) и отрицательный контроль (8105) не показывают какой-либо активации после поправки концентрации по нулевому уровню. Для CD8 Т-клеток (фигуры 18В и 18Г), конторстела 7, 8 и 9, а также биспецифическое ОХ40 (49В4) х FAP (4В9) антитело (7719) показывает более сильную активацию по сравнению с конторстелом 10. Фигуры 19А, 19Б, 19В и 19Г показывают FSC-A, соответственно, размер CD4 (фигуры 19А и 19Б) и CD8 Т-клеток (фигуры 19В и 19Г) после субоптимальной CD3 стимуляции. Все конторстела показывают сопоставимые средние показатели увеличения. Добавление не нацеленной 2+1 анти-ОХ40 молекулы (7718) и отрицательного контроля (8105) не изменяет размера ни CD4, ни CD8 Т-клеток. Фигуры 20А, 20Б, 20В и 20Г показывают уровни eFluor 670, соответственно, пролиферацию CD4 (фигуры 20А и 20Б) и CD8 Т-клеток (фигуры 20В и 20Г) после субоптимальной CD3 стимуляции. В CD4 субпопуляциях конторстела 8 и 10 показывают значительное снижение уровней eFluor 670, что свидетельствует об усиленной пролиферации. В CD8 субпопуляциях конторстела 7 и 9 показывает большее снижение уровней eFluor 670. Не нацеленная 2+1 анти-ОХ40 молекула (7718) и отрицательный контроль (8105) показывают лишь незначительное снижение во всех субпопуляциях. Фигуры 21А, 21Б, 21В и 21Г показывают после активации подавление IL-7Rα (CD127). Биспецифическое ОХ40 (49В4) х FAP (4В9) антитело (7719) показывает самое сильное подавление CD4 и CD8 Т-клеток, за ним следует конторстело 10. Большее снижение регуляции CD127 наблюдают в субпопуляциях клеток CD4, а не CD8. Величины нормализованных областей под кривой для CD25 (фиг. 22А), FSC-A (фиг. 22Б), eFluor 670 (фиг. 22В) и CD127 (фиг. 22Г) на CD4 и CD8 Т-клетках суммированы на фигурах 22А, 22Б, 22В и 22Г. Не нацеленная 2+1 анти-ОХ40 молекула (7718) проявляет лишь минимальную активацию на CD4 и CD8 Т-клетках, тогда как биспецифическое ОХ40 (49В4) х FAP (4В9) антитело (7719) показывает повышенную активность, касающуюся eFluor 679 и CD127 на CD4 и CD8 Т-клетках по сравнению с конторстелами. CD25 и FSC-A указывают на одинаковые уровни активации как в молекуле 7719, так и в конторстелах в субпопуляциях CD4 и CD8.

Фигуры 23А и 23Б показывают NFκB-опосредованную активность по экспрессии люциферазы в 4-1ВВ экспрессирующих репортерных клетках линии Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2. Для определения функциональности инкубируют молекулы 2+1 анти-4-1ВВ (20Н4.9) х анти-РАР(4В9) конторстел в сравнении с 2+1 анти-4-1ВВ (20Н4.9) х анти-FAP (4В9) антигенсвязывающими молекулами и с контролями. Концентрации антигенсвязывающих молекул или их контролей для сравнения наносят против единиц высвобожденного света (released light units, RLU), измеренных через 6 ч инкубации. Для всех показателей вносят поправки концентраций по нулевому уровню (например, без добавления антител). На фиг. 23А показана FAP-мишень-независимая 4-1ВВ активация, посредством которой 4-1ВВ-связывание индуцирует NFκB-контролируемую экспрессию люциферазы в линии репортерных клеток без какого-либо FAP-опосредованного перекрестного связывания. На фигуре 23Б добавлена FAP-экспрессирующая на высоком уровне линия клеток NIH/3T3-huFAP клон 19 (линия клеток FAP-человека-трансгенных фибробластов мыши). FAP-экспрессирующие опухолевые клетки приводят к перекрестному скрещиванию биспецифических 4-1ВВ (20Н4.9) х FAP (4В9) антигенсвязывающих молекул и сильно повышают их потенциал по индукции NFκB-индуцированной /люциферазной активации в 4-1 ВВ-экспрессирующей репортерной клеточной линии. Биспецифические 2+1 анти-4-1ВВ (20Н4.9) х анти-FAP(4B9) антигенсвязывающие молекулы (черные звездочка и линия) показывают немного лучшую активацию (пониженные значения ЕС50) по сравнению с конторстелами. Тем не менее, активация, вызванная контортелами, намного выше, чем активация, проявляемая не нацеленными 4-1 ВВ антителами.

На фиг. 24А, 24Б, 24В, 24Г, 24Д, 24Е, 24Ж и 243 показывают активацию in vitro В-клеток человека бивалентными анти-CD40 человека х FAP конторстелами в присутствии гранул Dynabeads® с покрытием FAP (фиг. 24А, 24В, 24Д и 24Ж) или без покрытия (фиг. 24Б, 24Г, 24Е и 24 и 243) после двух суток инкубирования. По сравнению с FAP-независимым повышением активации CD69, CD80, CD86 и HLA-DR, индуцированной перекрестно связанным SGN40, повышение активации таких маркеров активации, индуцированных FAP-зависимыми биспецифическими антигенсвязывающими молекулами в присутствии гранул, покрытых FAP, было несколько ниже. В отсутствие FAP (гранулы без покрытия) не наблюдают увеличения экспрессии CD69, CD80, CD86 или HLA-DR с нацеленными на FAP анти-CD-40 конторстелами, хотя перекрестно связанное антитело SGN40 положительного контроля индуцирует повышенную регуляцию таких маркеров активации. Показан процент CD69, CD80, CD86 или HLA-DR-положительных живых В-клеток после двухдневной инкубации с указанными оттитрованными конторстелами или контрольным антителом. XL обозначает перекрестное связывание с F (ab')₂ фрагментом козы анти-IgG FGγ-фрагмента человека. На оси абсцисс показана концентрация конструкций конторстел или контрольного антитела.

Подробное описание изобретения

Определения

Если не указано иное, технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют то же значение, которое обычно используют в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Для целей понимания данного описания будут применяться следующие определения, и при необходимости термины, используемые в единственном числе, будут также подразумевать множественное число и наоборот.

В контексте настоящего изобретения понятие «антигенсвязывающая молекула» относится к в самом широком смысле к молекуле, которая специфически связывает антигенную детерминанту. Примерами антигенсвязывающих молекул являются антитела, фрагменты антител и каркасные антигенсвязывающие белки.

Понятие «антигенсвязывающий домен» относится к части антигенсвязывающей молекулы, которая специфически связывается с антигенной детерминантой. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен способен активировать передачу сигнала через соответствующий антиген клетки-мишени. Антигенсвязывающие домены включают область или фрагмент антитела, который специфически связывается и является комплементарным части антигена или целому антигену. Кроме того, антигенсвязывающие домены содержат каркасные антигенсвязывающие белки, как дополнительно определено в настоящем изобретении, например, связывающие домены, которые основаны на сконструированных повторяющихся белках или сконструированных повторяющихся доменах (см., например, WO 2002/020565). В частности, антигенсвязывающий домен состоит из первой части и второй части, где первая часть содержит вариабельную область легкой цепи антитела (VL), а вторая часть содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH), или наоборот.

Понятие «антитело» в описании настоящего изобретения используют в самом широком смысле, и оно охватывает различные структуры антител, включая, но ими не ограничиваясь, моноклональные антитела, поликлональные антитела, моноспецифические и мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют требуемую антигенсвязывающая активность.

Понятие «моноклональное антитело» в описании настоящего изобретения относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих природные мутации или возникающие во время получения препарата моноклонального антитела, такие варианты обычно содержатся в популяции в небольших количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене.

Понятие «моноспецифическое» антитело в контексте настоящего изобретения обозначает антитело, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. Понятие «биспецифический» означает, что антигенсвязывающая молекула способна специфически связываться, по меньшей мере, с двумя разными антигенными детерминантами. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит, по меньшей мере, два антигенсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для определенного антигенного детерминанта. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна одновременно связывать два антигенных детерминанта, в частности два антигенных детерминанта, экспрессированных на двух разных клетках. Например, антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению являются биспецифическими, содержащими антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с первой мишенью, и антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться со второй мишенью. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению содержит антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с ОХ40, и антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с FAP. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению содержит антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с 4-1ВВ, и антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с FAP. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению содержит антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с CD40, и антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с FAP.

Понятие «валентность», используемое в настоящем изобретении, означает наличие определенного числа сайтов связывания в антигенсвязывающей молекуле. Таким образом, понятия «двухвалентная», «четырехвалентная» и «шестивалентная» означают наличие двух антигенсвязывающих сайтов, четырех антигенсвязывающих сайтов, шести антигенсвязывающих сайтов, соответственно, в молекуле. Валентность антигенсвязывающей молекулы также может быть выражена по отношению к числу сайтов связывания для определенного антигенного детерминанта. Например, биспецифические антитела по настоящему изобретению являются двухвалентными по отношению к первой мишени и одновалентными по отношению ко второй мишени.

Понятия «антитело полной длины», «интактное антитело» и «цельное антитело» в настоящем изобретении применяют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, которая весьма сходна со структурой нативного антитела. «Нативные антитела» относятся к природным молекулам иммуноглобулина разной структуры. Например, нативными антителами класса IgG являются гетеротетрамерные гликопротеины размером, примерно, 150000 Да, состоящие из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, которые связаны дисульфидной связью. От N- до С-конца каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также называемую вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следуют три константных домена (CH1, СН2 и СН3), также называемые константной областью тяжелой цепи. Сходным образом, от N- до С-конца каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также называемую вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL), также называемый константной областью легкой цепью. Тяжелая цепь антитела может быть отнесена к одному из пяти типов, называемых α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) или μ (IgM), некоторые из которых могут быть дополнительно разделены на подтипы, например γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) и α2 (IgA2). Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности ее константного домена.

Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличающейся от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. К примерам фрагментов антител относятся, но ими перечень не ограничивается, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела, триатела, тетратела, кросс-Fab-фрагменты; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и однодоменные антитела. См. обзор по некоторым фрагментам антител в публикации Hudson с соавт., Nat Med 9, 2003, 129-134. По фрагментам scFv см. обзор в кн. «The Pharmacology of Monoclonal Antibodies» под ред. Rosenburg и Moore, изд. Springer-Verlag, том 113, 1994, 269-315; также см. WO 93/16185 и US 5571894 и US 5587458. Обсуждение фрагментов Fab и F(ab')₂, включающих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и обладающих повышенной полужизнью in vivo, см. в US 5869046. Диатела и фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть бивалентными или биспецифичными, описаны, например, в ЕР 404097, WO 1993/01161, Hudson с соавт., Nat Med 9, 2003, 129-134, и Hollinger с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 90, 1993, 6444-6448. Триатела и тетратела также описаны в публикации Hudson с соавт., Nat Med 9, 2003, 129-134. Однодоменные антитела являются фрагментами антител, включающими целиком или частично вариабельный домен тяжелой цепи, или целиком или частично вариабельный домен легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения однодоменным антителом является однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Уолтем, Массачусетс; см., например, US 6248516 В1). Фрагменты антитела могут быть получены разными методами, в том числе, например, ограничением протеолитического расщепления интактного антитела, а также выработкой с применением рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е. coli или фагов), согласно описанному в настоящем изобретении.

Расщепление папаином интактных антител приводит к формированию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых «Fab-фрагментами», каждый из которых содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, а также константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. В настоящем изобретении понятие «Fab-фрагмент» относится к фрагменту антитела, содержащему фрагмент легкой цепи, содержащий VL и константный домен легкой цепи (CL), а также VH и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на С-конце домена СН1 тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH-фрагменты относятся к Fab'-фрагментам, в которых остаток (остатки) цистеина константного домена несут свободную тиольную группу. В результате обработки пепсином образуется фрагмент F(ab')₂, который содержит два антигенсвязывающих сайта (два фрагмента Fab) и часть области Fc. Согласно настоящему изобретению, понятие «Fab-фрагмент» также включает «кросс-Fab-фрагменты» или «перекрестные Fab-фрагменты», что подробно представлено ниже.

Понятие «Kpocc-Fab-фрагмент», или «xFab-фрагмент», или «перекрестный Fab-фрагмент» относится к фрагменту Fab, в котором заменены либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи. Возможны две разные композиции цепей молекулы кросс-Fab, которые входят в состав биспецифических антител по настоящему изобретению. С одной стороны, обмениваются вариабельные области тяжелой и легкой цепей Fab, т.е. перекрестная молекула Fab содержит пептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области тяжелой цепи (СН1), и пептидную цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL). Такая перекрестная молекула Fab также называется кросс-Fab (VLVH). С другой стороны, когда константные области тяжелой и легкой цепи Fab обмениваются, перекрестная молекула Fab содержит пептидную цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL), и пептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области тяжелой цепи (СН1). Такая перекрестная молекула Fab также называется CrossFab (CLCH1).

«Одноцепочечный Fab-фрагмент» или «scFab (single chain Fab fragment)» является полипептидом, состоящим из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 антитела (СН1), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), константного домена легкой цепи антитела (CL) и линкера, где указанные домены антитела и указанный линкер расположены одним из следующих образов в направлении от N-конца к С-концу: a) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер -VH-CH1, в) VH-CL-линкер-VL-СН1 или г) VL-CH1-линкер-VH-CL; причем указанный линкер является полипептидом, состоящим, по меньшей мере, из 30 аминокислот, предпочтительно из 32-50 аминокислот. Указанные одноцепочечные Fab-фрагменты стабилизируются за счет естественной дисульфидной связи между доменом CL и доменом СН1. Кроме того, эти одноцепочечные молекулы Fab могут быть дополнительно стабилизированы путем формирования межцепочечных дисульфидных связей вставки из остатков цистеина (например, в положении 44 в вариабельной тяжелой цепи и в положении 100 в вариабельной легкой цепи согласно нумерации Kabat).

«Перекрестный одноцепочечный Fab-фрагмент» или «х-scFab» является полипептидом, состоящим из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 антитела (СН1), вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), константного домена легкой цепи (CL) антитела и линкера, где указанные домены антитела и указанный линкер расположены одним из следующих образов в направлении от N-конца к С-концу: а) VH-CL-линкер-VL-СН1 и б) VL-CH1-линкер-VH-CL; где VH и VL вместе образуют антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с антигеном, и где указанный линкер является полипептидом, состоящим, по меньшей мере, из 30 аминокислот. Кроме того, молекулы x-scFab могут быть дополнительно стабилизированы путем формирования межцепочечных дисульфидных связей за счет вставки из остатков цистеина (например, в положении 44 в вариабельной тяжелой цепи и в положении 100 в вариабельной легкой цепи согласно нумерации Kabat).

«Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)» является гибридизированным белком, сформированным за счет слияния вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей антитела, связанных коротким пептидным линкером из 10-25 аминокислот. Линкер обычно обогащен глицином для гибкости, а также серином или треонином для растворимости, и может либо соединять N-конец VH с С-концом VL, либо наоборот. Этот белок сохраняет специфичность исходного антитела, несмотря на удаление константных областей и введение линкера. Антитела scFv описаны, например, в публикации Houston J.S., Methods in Enzymol. 203, 1991, 46-96. Кроме того, фрагменты антител содержат одноцепочечные полипептиды, имеющие свойства VH, а именно, способность соединяться с VL, или VL, а именно, способность соединяться с VH, с функциональным антигенсвязывающим сайтом, тем самым обеспечивая антигенсвязывающую способность полноразмерных антител.

«Каркасные антигенсвязывающие белки» известны в данной области, например, фибронектин и разработанные белки с анкириновым повтором (DARPin designed ankyrin repeat protein), используют в качестве альтернативных каркасов для антигенсвязывающих доменов, см., например, публикацию Gebauer и Skerra, Curr Opin Chem Biol 13, 2009, 245-255, а также Stumpp с соавт., Drug Discovery Today 13, 2008, 695-701. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения каркасный антигенсвязывающий белок выбран из группы, включающей CTLA-4 (Evibody), липокалины (Anticalin), белок А-производные молекулы, например, Z-домен белка A (Affibody), А-домен (Avimer/Maxibody), трансферин сыворотки (trans-тело); разработанный белок с анкириновым повтором (DARPin), вариабельный домен легкой цепи или тяжелой цепи антитела (однодоменное антитело, single-domain antibody - sdAb), вариабельный домен тяжелой цепи антитела (нанотело, aVH), V_NAR-фрагменты, фибронектин (AdNectin), лектиновый домен С-типа (тетранектин); вариабельный домен нового рецептора антигена бета-лактамазы (V_NAR-фрагменты), гамма-кристаллин человека или убиквитин (молекулы Affilin); домен типа Куница ингибиторов протеазы человека, микротела, например, белки из семейства ноттина, пептидные аптамеры и фибронектин (аднектин). CTLA-4 (Cytotoxic Т Lymphocyte-associated Antigen 4 - антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами) относится к семейству рецепторов CD28 и экспрессируется в основном на CD4⁺ Т-клетках. Его внеклеточный домен имеет подобную вариабельному домену Ig складчатость. Петли, соответствующие CDR антител, могут быть замещены гетерологичной последовательностью для придания различных связывающих свойств. Молекулы CTLA-4, сконструированные так, чтобы иметь различную специфичность связывания, также известны как эвитела (Evibodies), например, описанные в US 7166697 B1. Эвитела имеют примерно тот же размер, что и выделенная вариабельная область антитела (например, доменного антитела). Для получения дополнительной подробной информации см. публикацию Journal of Immunological Methods 248(1-2), 2001, 31-45. Липокалины составляют семейство внеклеточных белков, которые транспортируют небольшие гидрофобные молекулы, такие как стероиды, билины, ретиноиды и липиды. Они имеют жесткую бета-складчатую вторичную структуру с несколькими петлями на открытом конце конической структуры и могут быть сконструированы для связывания с различными целевыми антигенами. Антикалины состоят из 160-180 аминокислот и являются производными липокалинов. Подробнее информацию можно почерпнуть из Biochim Biophys Acta 1482, 2000, 337-350, US 7250297 B1 и US 20070224633. Аффитело - это каркас, производный от белка A Staphylococcus aureus, который может быть сконструирован для связывания с антигеном. Домен состоит из трехспирального пучка приблизительно из 58 аминокислот. Библиотеки были получены путем рандомизации поверхностных остатков. Для получения дополнительной подробной информации см. Protein Eng. Des. Sel. 17, 2004, 455-462 и ЕР 1641818 А1. Авимеры это мультидоменные белки, производные от семейства А-доменных каркасов. Нативные домены, состоящие приблизительно из 35 аминокислот, принимают определенную структуру, связанную дисульфидной связью. Разнообразие создается за счет перетасовки естественных вариаций, свойственных представителям семейства А-доменов. Для получения дополнительной подробной информации см. Nature Biotechnology 23(12), 2005, 1556 - 1561 и Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 2007, 909-917. Трансферин является мономерным сывороточным транспортным гликопротеином. Трансферины могут быть сконструированы для связывания разных целевых антигенов путем инсерции пептидных последовательностей в пермиссивной петле на поверхности. К примерам сконструированных каркасов относят транс-тело. Для получения дополнительной подробной информации см. J. Biol. Chem 274, 1999, 24066-24073. Разработанные белки с анкириновым повтором (DARPin) получены из анкирина, относящегося к семейству белков, которые обеспечивают прикрепление интегральных мембранных белков к цитоскелету. Один анкириновый повтор представляет собой мотив из 33 остатков, состоящий из двух альфа-спиралей и бета-изгиба. Они могут быть сконструированы так, чтобы связывать различные целевые антигены путем рандомизации остатков в первой альфа-спирали и бета-изгибе каждого повтора. Их интерфейс связывания может быть увеличен путем увеличения числа модулей (метод созревания аффинности). Для получения дополнительной подробной информации см. J. Mol. Biol. 332, 2003, 489-503; PNAS 100(4), 2003, 1700-1705; J. Mol. Biol. 369, 2007, 1015-1028; US 20040132028 A1. Однодоменное антитело является фрагментом антитела, состоящий из одного мономерного вариабельного домена антитела. Первые единичные домены были получены из вариабельного домена тяжелой цепи антитела верблюдов (нанотела или фрагменты V_HH). Кроме того, термин однодоменное антитело включает автономный вариабельный домен тяжелой цепи человека (aVH) или фрагменты V_NAR, полученные из акул. Фибронектин представляет собой каркас, который может быть сконструирован для связывания с антигеном. Аднектины в своей основе состоят из природной аминокислотной последовательности 10-го домена из 15 повторяющихся звеньев человеческого фибронектина типа III (FN3). Три петли на одном конце бета-сэндвича могут быть сконструированы так, чтобы позволить аднектину специфически распознавать терапевтическую мишень, представляющую интерес. Для получения дополнительной подробной информации см. Protein Eng. Des. Sel. 18, 2005, 435- 444; US 20080139791; WO 2005056764 и US 6818418 B1. Пептидные аптамеры являются молекулами комбинаторного распознавания, которые состоят из белка с постоянным каркасом, обычно тиоредоксина (TrxA), содержащего ограниченную вариабельную пептидную петлю, инсертированную в активный сайт. Для получения дополнительной подробной информации см. Expert Opin. Biol. Ther. 5, 2005, 783-797. Микротела производны от встречающихся в природе микропротеинов размером 25-50 аминокислот, которые содержат 3-4 цистеиновых мостика. К примерам микропротеинов относят Kalata BI, конотоксин и ноттины. Микропротеины имеют петлю, которая может содержать до 25 аминокислот, в целом не затрагивая складку микропротеина. Для получения дополнительной подробной информации см. конструирование доменов ноттина в WO 2008098796.

Понятие «антигенсвязывающая молекула, которая связывается с тем же эпитопом», что и эталонная молекула, относится к антигенсвязывающей молекуле, которая блокирует связывание эталонной молекулы с ее антигеном в конкурентном анализе на 50% или более, и наоборот, эталонная молекула блокирует связывание антигенсвязывающей молекулы с ее антигеном в конкурентном анализе на 50% или более.

В контексте настоящего изобретения понятие «антигенный детерминант» является синонимом понятий «антиген» и «эпитоп» и относится к сайту (например, непрерывному участку аминокислот или конформационной конфигурации, состоящей из различных областей несмежных аминокислот) на макромолекуле полипептида, с которой связывается антигенсвязывающий фрагмент, образуя комплекс антигенсвязывающий фрагмент-антиген. Полезные антигенные детерминанты могут быть обнаружены, например, на поверхностях опухолевых клеток, на поверхностях инфицированных вирусом клеток, на поверхностях других клеток с признаками болезни, на поверхности иммунных клеток, в свободном состоянии в сыворотке крови и/или на внеклеточном матриксе (extracellular matrix ЕСМ). В настоящем изобретении белки, используемые в качестве антигенов, могут представлять собой какую-либо нативную форму белков из какого-либо позвоночного, включая млекопитающих, например, приматов (например, людей) и грызунов (например, мышей и крыс), если не указано иное. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигеном является белок человека. Если имеют ввиду конкретный белок, понятие охватывает «полноразмерный» нативный белок, а также какую-либо форму белка, которая возникает в результате процессинга в клетке. Это понятие также охватывает встречающиеся в природе варианты белка, например сплайс-варианты или аллельные варианты.

Понятие «паратоп» относится к той части молекулы данного антитела, которая необходима для специфического связывания мишени и сайта связывания. Паратоп может быть непрерывным, то есть образованным соседними аминокислотными остатками, присутствующими в сайте связывания, или прерывистым, то есть сформированным аминокислотными остатками, которые находятся в разных положениях в первичной последовательности аминокислотных остатков, например в аминокислотной последовательности CDR, но в непосредственной близости в трехмерной структуре, которую принимает сайт связывания.

Понятие «специфическое связывание» означает, что связывание является селективным для антигена и его следует отличать от нежелательных или неспецифических взаимодействий. Способность антигенсвязывающей молекулы связываться с определенным антигеном может быть измерена либо с помощью иммуноферментного анализа (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), либо с помощью других методов, известных специалистам в данной области, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (Surface Plasmon Resonance, SPR; измерение на приборе BIAcore) (Liljeblad с соавт., Glyco J 17, 2000, 323-329), а также традиционными методами определения связывания (Heeley, Endocr Res 28, 2002, 217-229). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения степень связывания антигенсвязывающей молекулы с неродственным белком составляет менее чем примерно 10% от связывания антигенсвязывающей молекулы с антигеном, что может быть измерено, например, с помощью SPR. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения константа диссоциации (Kd) молекулы, которая связывается с антигеном, составляет ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0.1 нМ, ≤ 0.01 нМ или ≤ 0.001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М).

«Аффинность» или «связывающее сродство» относится к совокупной силе нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его связывающим партнером (например, антигеном). Если не указано иначе, в настоящем изобретении «связывающее сродство» относится к внутренней аффинности, которая отражает взаимодействие 1:1 между составляющими связывающейся пары (например, между антителом и антигеном). Аффинность молекулы X с ее партнером Y обычно может быть представлено константой диссоциации (Kd), которая является соотношением констант диссоциации и ассоциации (соответственно, koff и kon). Таким образом, эквивалентные аффинности могут содержать разные константы до тех пор, пока соотношение констант остается неизменным. Сродство может быть измерено общепринятыми методами, известными в данной области, в том числе описанными в настоящем изобретении. Одним из признанных методов определения аффинности является поверхностный плазмонный резонанс (SPR).

Антитело с «созревшей аффинностью» относится к антителу с одним или несколькими изменениями в одной или нескольких гипервариабельных областях (hypervariable region, HVR) по сравнению с исходным антителом, которое не обладает такими изменениями, такие изменения приводят к улучшению аффинности антитела по отношению к антигену.

В настоящем изобретении понятие «опухолеассоциированный антиген» относится к антигенному детерминанту на поверхности клетки-мишени, которая является клеткой опухоли, например, раковой клеткой, клеткой стромы опухоли или В-клеткой. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения опухолеассоциированный антиген является белком активации фибробластов (Fibroblast Activation Protein, FAP).

Понятие «способная к специфическому связыванию с белком активации фибробластов (FAP)» относится к антигенсвязывающей молекуле, которая способна связывать FAP с достаточной степенью аффинности таким образом, что антигенсвязывающая молекула может быть применима в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на FAP. К антигенсвязывающий молекулам относят, но ими перечень не ограничивается, антитела, молекулы Fab, перекрестные молекулы Fab, одноцепочечные молекулы Fab, молекулы Fv, молекулы scFv, однодоменные антитела, а также VH и каркасный антигенсвязывающий белок. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения степень связывания анти-FAP антигенсвязывающей молекулы с неродственным, не являющимся FAP белком, составляет примерно менее 10% от связывания антигенсвязывающей молекулы с FAP, согласно измерению, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). В частности, антигенсвязывающая молекула, которая способна специфически связываться с FAP, имеет константу диссоциации (Kd) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001. нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-FAP антигенсвязывающая молекула связывается с FAP из разных видов. В частности, анти-FAP антигенсвязывающая молекула связывается с FAP человека, макака крабоеда и мыши.

Понятие «белок активации фибробластов (Fibroblast activation protein, FAP)», также известный как пролилэндопептидаза FAP или сепраза (ЕС 3.4.21), относится к какому-либо нативному FAP из какого-либо позвоночного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди), приматы, отличные от человека (например, макаки-крабоеды) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Понятие охватывает «полноразмерный» не подвергавшийся обработке FAP, а также какую-либо форму FAP, образующуюся в клетке. Это понятие также относится к встречающимся в природе вариантам FAP, например, сплайс-вариантам или аллельным вариантам. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению способна специфически связываться с FAP человека, мыши и/или макаки-крабоеда. Аминокислотная последовательность FAP человека показана в UniProt (www.uniprot.org) номер доступа Q12884 (версия 149, SEQ ID NO:97) или NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2. Внеклеточный домен (ECD) FAP человека расположен от аминокислоты в положении 26 до аминокислоты в положении 761. Предпочтительно, анти-FAP-связывающая молекула по настоящему изобретению связывается с внеклеточным доменом FAP. Примеры анти-FAP-связывающих молекул описаны в WO 2012/020006 А2.

Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антигенсвязывающей молекулы с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (framework region, FR) и три гипервариабельные области (hypervariable region, HVR). См., например, Kindt с соавт., Kuby Immunology, 6е изд., 2007, W.H. Freeman and Co., стр. 91. Одного VH или VL может быть достаточно для придания антигенсвязывающей специфичности.

Понятие «гипервариабельные области (hypervariable region, HVR)» в настоящем изобретении относится к каждой области вариабельного домена антитела, которая гипервариабельна по своей последовательности («область, определяющая комплементарность; complementarity determining region, CDR»), и/или формирует петли определенной структуры («гипервариабельные петли») и/или содержит антиген-контактирующие остатки («антигенные контакты»). Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Примеры HVR в настоящем изобретении включают:

(а) гипервариабельные петли, имеющиеся в аминокислотных остатках 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, 901-917);

(б) CDR имеющиеся в аминокислотных остатках 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) (Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5e изд., 1991, Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд);

(в) антигенные контакты, имеющиеся в аминокислотных остатках 27 с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum с соавт. J. Mol. Biol. 262, 1996, 732-745); и

(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если не указано иначе, нумерацию остатков HVR (например, CDR) и других остатков в вариабельном домене (например, остатков FR) в настоящем изобретении осуществляют по Kabat с соавт. (см. ссылку выше).

Kabat с соавт. также разработали систему нумерации для последовательностей вариабельных областей, которая применима к какому-либо антителу. Специалист в данной области техники может применить систему «нумерации по Kabat» к любой последовательности вариабельной области, не полагаясь на какие-либо экспериментальные данные, достаточно самой последовательности. Применяемая в настоящем изобретении «нумарация Kabat) является системой нумерации, установленной Kabat с соавт., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Если не указано иначе, ссылки на нумерацию определенных положений аминокислотных остатков в вариабельной области антитела соответствуют системе нумерации Kabat.

В настоящем изобретении понятие «зрелая аффинность» в контексте антигенсвязывающих молекул (например, антител) относится к антигенсвязывающей молекуле, которая получена из эталонной антигенсвязывающей молекулы, например, путем мутации, связывается с тем же антигеном, предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что и контрольное антитело; имеет более высокое сродство к антигену, чем у эталонной антигенсвязывающей молекулы. Созревание аффинности обычно включает модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков в одной или нескольких CDR антигенсвязывающей молекулы. Обычно антигенсвязывающая молекула со зрелой аффинностью связывается с тем же эпитопом, что и исходная контрольная антигенсвязывающая молекула.

«Каркас (Framework, FR)» относится к остаткам вариабельного домена, отличающимся от остатков гипервариабельной области (hypervariable region, HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно появляются в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

В контексте настоящего изобретения понятие «акцепторный каркас человека» означает каркас, включающий аминокислотную последовательность каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), которые являются производными каркаса иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркаса человека, как показано ниже. Акцепторный каркас человека, «производный от» каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека, может содержать ту же самую аминокислотную последовательность или может содержать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения число замещений аминокислот составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность VL акцепторного каркаса человека идентична последовательности VL каркаса иммуноглобулина человека или конценсусной последовательности каркаса человека

Понятие «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи является производной от определенного источника или вида, тогда как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит от другого источника или вида.

«Класс» антитела определяют по типу константного домена или константной области его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть далее разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Понятие «гуманизированное» антитело означает химерное антитело, содержащее аминокислотные остатки HVR, происходящие не от человека, и аминокислотные остатки от FR человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело может включать, по существу, все из, по меньшей мере, одного, обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все HVR (например, CDR) соответствуют доменам антитела, не являющегося антителом человека, и все или практически все FR соответствуют FR антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно может содержать, по меньшей мере, часть константной области антитела, производную от антитела человека. «Гуманизированная форма» антитела, например, антитела, не являющегося антителом человека и подвергшегося гуманизации. Другими формами «гуманизированных антител», охватываемых настоящим изобретением, являются те, в которых константная область дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с формой исходного антитела для придания свойств, описанных в настоящем изобретении, особенно касающихся связывания с C1q и/или Fc рецептором (FcR).

«Антитело человека» является антителом, которое обладает аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, продуцируемого человеком или клеткой человека или полученного из другого источника, не от человека, в котором используют популяционный спектр антител человека или другие последовательности, кодирующие антитела человека. Это определение антитела человека конкретно исключает гуманизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие остатки, происходящие не от человека.

Понятие «домен СН1» означает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая расположена примерно от положения EU 118 до положения EU 215 (нумерация по Kabat, индекс EU). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен СН1 имеет аминокислотную последовательность ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALT SGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV(SEQ ID NO:94). Обычно сегмент, имеющий аминокислотную последовательность EPKSC (SEQ ID NO:99), следует для связывания домена СН1 с шарнирной областью.

Понятие «шарнирная область» означает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая соединяет в тяжелой цепи антитела дикого типа домен СН1 и домен СН2, т.е. примерно от положения 216 примерно до положения 230 по системе нумерации EU по Kabat, или примерно от положения 226 до примерно положения 230 по системе нумерации EU по Kabat. Шарнирные области других подклассов IgG могут быть определены путем выравнивания с остатками цистеина шарнирной области последовательности подкласса IgG1. Шарнирная область обычно является димерной молекулой, состоящей из двух полипептидов с идентичной аминокислотной последовательностью. Шарнирная область обычно содержит до 25 аминокислотных остатков и является гибкой, позволяя связанным с мишенью сайтам связывания перемещаться независимо. Шарнирная область может быть подразделена на три домена: верхний, средний и нижний шарнирный домен (см., например Roux, с соавт., J. Immunol. 161, 1998, 4083).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения шарнирная область имеет аминокислотную последовательность DKTHTCPXCP (SEQ ID NO:100), в которой X означает S или Р. В другом варианте осуществления настоящего изобретения шарнирная область имеет аминокислотную последовательность НТСРХСР (SEQ ID NO:101), в которой X означает S или Р. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения шарнирная область имеет аминокислотную последовательность СРХСР (SEQ ID NO:102), в которой X означает S или Р.

Понятие «домен Fc» или «область Fc» в настоящем изобретении используют для определения С-концевой области тяжелой цепи антитела, которая содержит, по меньшей мере, часть константной области. Понятие включает области Fc нативной последовательностью и варианты областей Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Fc-домен тяжелой цепи IgG человека расположен от Cys226, или от Pro230, или от Ala231 до С конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может быть или не быть. Область Fc IgG содержит домен СН2 IgG и домен СН3 IgG.

«Домен СН2» Fc-области IgG человека обычно располагается от аминокислотного остатка примерно в положении EU 231 до аминокислотного остатка примерно в положении EU 340 (нумерация по Kabat, индекс EU). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен СН2 имеет аминокислотную последовательность APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTI SKAK (SEQ ID NO:95). Домен СН2 уникален тем, что он не тесно спарен с другим доменом. Скорее, две N-связанные разветвленные углеводные цепи расположены между двумя доменами СН2 интактной нативной Fc-области. Предполагают, что углевод может быть заменой парного сочленения домен-домен и стабилизировать домен СН2. Burton, Mol. Immunol. 22, 1985, 161-206. В одном варианте осуществления настоящего изобретения углеводная цепь присоединена к домену СН2. В настоящем изобретении домен СН2 может быть нативной последовательностью домена СН2 с или вариантом домена СН2.

«Домен СН3» включает участок остатков с С-конца к домену СН2 в области Fc, обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая локализована приблизительно от положения EU 341 до положения EU 446 (нумерация по Kabat, индекс EU). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен СН3 имеет аминокислотную последовательность GQPRE PQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO:96). Область СН3 в настоящем изобретении может быть нативной последовательностью домена СН3 или вариантом домена СН3 (например, доменом СН3 с индуцированной «выпуклостью» («выступом») в одной его цепи и соответствующей «полостью» («впадиной») в другой его цепи; см. патент US 5821333, включенный в настоящее описание в виде ссылки). Такой вариант доменов СН3 может применяться для индукции гетеродимеризации двух идентичных тяжелых цепей антитела, согласно описанному в настоящем изобретении. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения область Fc тяжелой цепи IgG имеет протяженность от Cys226 или Pro230 до карбокси-конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) в области Fc может быть, или может отсутствовать. Если в настоящем изобретении не указано иначе, нумерация аминокислотных остатков в области Fc или в константной области дана в соответствии с системой нумерации EU, также называемой индексом EU и описанной в публикации Kabat с соавт. в кн.: «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5e изд., 1991, Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд.

Метод «выступ-во-впадину» описан, например, в US 5731168, US 7695936, Ridgway с соавт., Prot Eng 9, 1996, 617-621, Carter, J Immunol Meth 248, 2001, 7-15. Обычно метод включает введение выпуклости («выступа») на границе раздела первого полипептида и соответствующей полости («впадины») на границе раздела второго полипептида так, что выпуклость может быть расположена в полости таким образом, чтобы способствовать образованию гетеродимера и препятствовать образованию гомодимера. Выпуклости конструируют путем замены небольших аминокислотных боковых цепей на границе первого полипептида более крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). Компенсаторные полости идентичного или сходного размера с выпуклостями создаются на границе раздела второго полипептида путем замены больших боковых цепей аминокислот более мелкими (например, аланином или треонином). Выпуклость и полость могут быть получены путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, например, путем сайт-специфического мутагенеза или пептидного синтеза. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модификация выступа включает аминокислотное замещение T366W в одной из двух субъединиц домена Fc, и модификация впадины включает аминокислотные замещения T366S, L368A и Y407V в другой из двух субъединиц домена Fc. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения субъединица домена Fc, содержащая модификацию выступа, дополнительно включает аминокислотное замещение S354C, а субъединица домена Fc, содержащая модификацию впадины, дополнительно включает аминокислотное замещение Y349C. Интродукция этих двух остатков цистеина приводит к формированию дисульфидного мостика между двумя субъединицами области Fc, таким образом дополнительно стабилизируя димер (Carter, J Immunol Methods 248, 2001, 7-15). Нумерация соответствует индексу EU по Kabat с соавт. в кн.: «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5e изд., 1991, Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд).

«Область, эквивалентную области Fc иммуноглобулина» предназначена для того, чтобы включить природные аллельные варианты области Fc иммуноглобулина, а также варианты, имеющие изменения, которые вызывают замещения, инсерции или делеции, но которые существенно не снижают способность иммуноглобулин для опосредования эффекторных функций (таких как антитело-зависимая клеточная цитотоксичность). Например, одна или несколько аминокислот могут быть делетированы с N-конца или С-конца Fc-области иммуноглобулина без существенной потери биологической функции. Такие варианты могут быть выбраны в соответствии с общими правилами, известными в данной области, таким образом, чтобы оказывать минимальное влияние на активность (см., например, Bowie J.U. с соавт., Science 247, 1990, 1306-1310).

Понятие «домен Fc дикого типа» означает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природного Fc-домена. К Fc-доменам человека дикого типа относят нативную Fc-область IgG1 человека (не аллотипы не-А и А), нативную Fc-область IgG2 человека, нативную Fc-область IgG3 человека и нативную Fc-область IgG4 человека, а также встречающиеся в природе их варианты. Fc-области дикого типа обозначены как SEQ ID NO:102 (IgG1, кавказский аллотип), SEQ ID NO:103 (IgG1, афроамериканский аллотип), SEQ ID NO:104 (IgG2), SEQ ID NO:105 (IgG3) и SEQ ID NO:106 (IgG4).

Понятие «вариант Fc-домена (человека)» означает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности Fc-домена «дикого типа» (человека) домена из-за, по меньшей мере, одной «аминокислотной мутации». В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариант Fc-области имеет, по меньшей мере, одну аминокислотную мутацию по сравнению с нативной Fc-областью, например, от одной до десяти аминокислотных мутаций, и в одном варианте осуществления настоящего изобретения примерно от одной до примерно пяти аминокислотных мутаций в нативной Fc-области. В другом варианте осуществления настоящего изобретения Fc-область (вариант) имеет, по меньшей мере, примерно 95% гомологии с Fc-областью дикого типа.

Понятие «эффекторные функции» относится к тем биологическим активностям, которые вязаны с областью Fc антитела, которые варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антител являются: связывание C1q и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), связывание с Fc-рецептором, антителозависимая клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), секреция цитокинов, опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, снижение регуляции рецепторов на поверхности клеток (например, рецептора В-клеток) и активация В-клеток.

Зависящие от рецепторов Fc эффекторные функции могут быть опосредованы взаимодействием Fc-области антитела с рецепторами Fc (FcR), которые являются специализированными рецепторами клеточной поверхности клеток кроветворения. Fc-рецепторы принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов и, как было показано, опосредуют как удаление покрытых антителами патогенов путем фагоцитоза иммунных комплексов, так и лизис эритроцитов и различных других клеточных мишеней (например, опухолевых клеток), покрытых соответствующим антителом, через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (antibody dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC) (см., например Van de Winkel J.G., Anderson C.L., J. Leukoc. Biol. 49, 1991, 511-524). FcR определяются по специфичностью в отношении изотипов иммуноглобулина: Fc-рецепторы для антител IgG обозначаются как FcγR. Связывание с Fc-рецептором описано, например, в публикациях Ravetch J.V., Kinet J.P., Annu. Rev. Immunol. 9, 1991, 457-492; Capel P.J. с соавт., Immunomethods 4, 1994, 25-34; de Haas M. с соавт., J. Lab. Clin. Med. 126, 1995, 330-341; Gessner J.E. с соавт., Ann. Hematol. 76, 1998, 231-248.

Перекрестное связывание рецепторов для Fc-области антител IgG (FcγR) запускает широкий спектр эффекторных функций, включая фагоцитоз, антителозависимую клеточную цитотоксичность и высвобождение медиаторов воспаления, а также клиренс иммунных комплексов и регуляцию выработки антител. У людей описаны три класса FcγR, а именно:

- FcγRI (CD64) связывает мономерный IgG с высокой аффинностью и экспрессируется на макрофагах, моноцитах, нейтрофилах и эозинофилах. Модификация в Fc-области IgG по меньшей мере по одному из аминокислотных остатков E233-G236, Р238, D265, N297, А327 и Р329 (нумерация по Kabat, индекс EU) уменьшает связывание с FcγRI. Остатки IgG2 в положениях 233-236, замещенные на IgG1 и IgG4, снижают связывание с FcγRI в 10³ раз и устраняют ответ моноцитов человека на сенсибилизированные антителами эритроциты (Armour K.L. с соавт., Eur. J. Immunol. 29, 1999, 2613 2624).

- FcγRII (CD32) связывает комплексный IgG со средним или низким сродством и широко экспрессируется. Этот рецептор можно разделить на два подтипа, FcγRIIA и FcγRIIB. FcγRIIA выявляют во многих клетках, участвующих в уничтожении (например, макрофагах, моноцитов, нейтрофилов) и, по-видимому, способен активировать процесс уничтожения. FcγRIIB, по-видимому, играет роль в процессах ингибирования и обнаруживается на В-клетках, макрофагах, тучных клетках и эозинофилах. На В-клетках он, по-видимому, подавляет дальнейшую выработку иммуноглобулина и переключение изотипа, например, на класс IgE. На макрофагах FcγRIIB действует, ингибируя фагоцитоз, что опосредуется через FcγRIIA. На эозинофилах и тучных клетках В-форма может помочь подавить активацию этих клеток через связывание IgE с соответствующим рецептором. Пониженное связывание с FcγRIIA установлено, например, для антител, содержащих IgG Fc-область с мутациями по меньшей мере одного аминокислотного остатка из E233-G236, Р238, D265, N297, А327, Р329, D270, Q295, А327, R292 и К414 (нумерация по Kabat, индекс EU).

- FcγRIII (CD16) связывает IgG со средним или низким сродством и существует в виде двух типов. FcγRIIIA обнаруживается на клетках NK, макрофагах, эозинофилах и некоторых моноцитах и Т-клетках и опосредует ADCC. FcγRIIIB на высоком уровне экспрессируется на нейтрофилах. Пониженное связывание с FcγRIIIA обнаружено, например, для антител, содержащих Fc-область IgG с мутацией по меньшей мере в одном из аминокислотных остатков E233-G236, Р238, D265, N297, А327, Р329, D270, Q295, А327, S239, Е269, Е293, Y296, V303, А327, K338 и D376 (нумерация по Kabat, индекс EU).

Картирование сайтов связывания на IgG1 человека для Fc-рецепторов, указанные выше сайты мутаций и методы измерения связывания с FcγRI и FcγRIIA описаны в публикации Shields R.L., с соавт. J. Biol. Chem. 276, 2001, 6591-6604.

Понятие «антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)» означает функцию, опосредованную связыванием Fc-рецептора, и относится к лизису клеток-мишеней антителом, согласно описанному в настоящем изобретении, в присутствии эффекторных клеток. Способность антитела индуцировать начальные стадии, опосредующие ADCC, исследуют путем измерения их связывания с Fcγ-рецепторами, экспрессируемыми клетками, например, клетками, рекомбинантно экспрессирующими FcγRI, и/или FcγRIIA, или NK (экспрессирующими по существу FcγRIIIA). В частности, измеряют связывание FcγR с клетками NK.

«Активирующий Fc-рецептор» является Fc-рецептором, который после захвата антитела Fc-областью вызывает сигнальные события, которые стимулируют несущую рецептор клетку к выполнению эффекторных функций. Активирующие Fc-рецепторы включают FcγRIIIa (CD 16а), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) и FcaRI (CD89). Примером активирующего Fc-рецептора является FcγRIIIa человека (см. UniProt no. Р08637, версия 141).

«Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей» или «суперсемейство TNF (Necrosis factor receptor, TNF)» в настоящее время состоит из 27 рецепторов. Это группа цитокиновых рецепторов, характеризующаяся способностью связывать факторы некроза опухоли (TNF) через внеклеточный домен, богатый цистеином (extracellular cysteine-rich domain, CRD). Эти псевдоповторы определяются внутрицепочечными дисульфидами, образованными высококонсервативными остатками цистеина в цепях рецепторов. За исключением фактора роста нервов (nerve growth factor, NGF), все TNF гомологичны архетипическому TNF-альфа. В активной форме большинство рецепторов TNF образуют тримерные комплексы в плазматической мембране. Соответственно, большинство рецепторов TNF содержит трансмембранные домены (transmembrane domain, TMD). Некоторые из этих рецепторов также содержат внутриклеточные домены смерти (death domain, DD), которые рекрутируют взаимодействующие с каспазой белки с последующим связывание лиганда для инициации внешнего метаболического пути активации каспазы. Другие рецепторы суперсемейства TNF, у которых отсутствуют домены смерти, связывают ассоциированные с TNF-рецептором факторы и активируют внутриклеточные сигнальные метаболические пути, которые могут привести к пролиферации или дифференциации. Эти рецепторы также могут инициировать апоптоз, но через непрямые механизмы. Помимо регуляции апоптоза, некоторые рецепторы суперсемейства TNF участвуют в регуляции функций иммунных клеток, таких как гомеостаз и активация В-клеток, активация природных клеток-киллеров и костимуляция Т-клеток. Некоторые другие регулируют ответы, специфичные для клеток определенного типа, например, развитие развитие волосяного фолликула и развитие остеокластов. Представителями суперсемейства TNF-рецепторов являются: рецептор фактора некроза опухоли 1 (1А) (TNFRSF1A, CD120a), рецептор фактора некроза опухоли 2 (1В) (TNFRSF1B, CD120b), рецептор бета-лимфотоксина (LTBR, CD18), ОХ40 (TNFRSF4, CD134), CD40 (Вр50), Fas-рецептор (Аро-1, CD95, FAS), рецептор-ловушка 3 (TR6, М68, TNFRSF6B), CD27 (S152, Тр55), CD30 (Ki-1, TNFRSF8), 4-1 ВВ (CD137, TNFRSF9), DR4 (TRAILR1, Аро-2, CD261, TNFRSF10A), DR5 (TRAILR2, CD262, TNFRSF10B), рецептор-ловушка 1 (TRAILR3, CD263, TNFRSF10C), рецептор-ловушка 2 (TRAILR4, CD264, TNFRSF10D), RANK (CD265, TNFRSF11A), остеопротегерин (OCIF, TR1, TNFRSF11B), рецептор TWEAK (Fn14, CD266, TNFRSF12A), TACI (CD267, TNFRSF13B), рецептор BAFF (CD268, TNFRSF13C), медиатор проникновения вируса герпеса (HVEM, TR2, CD270, TNFRSF14), рецептор фактора роста нервов (p75NTR, CD271, NGFR), антиген созревания В-клеток (CD269, TNFRSF17), глюкокортикоид-индуцированный TNFR-связанный (GITR, AITR, CD357, TNFRSF18), TROY (TNFRSF19), DR6 (CD358, TNFRSF21), DR3 (Аро-3, TRAMP, WS-1, TNFRSF25) и рецептор эктодисплазина А2 (XEDAR, EDA2R).

Несколько представителей семейства рецепторов фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor receptor, TNFR) функционируют после начальной активации Т-клеток, чтобы поддерживать Т-клеточные ответы. Понятие «представитель семейства костимулирующих рецепторов TNF» или «рецептор семейства костимулирующих TNF» относится к подгруппе представителей семейства рецепторов TNF, которые способны костимулировать пролиферацию и выработку цитокинов Т-клетками. Понятие относится к какому-либо природному рецептору семейства TNF от какого-либо позвоночного животного, включая млекопитающих, например, приматов (например, людей), приматов, но не от людей (например, от макак крабоедов) и грызунов (например, от мышей и крыс), если не указано иное. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представители семейства костимулирующих рецепторов TNF выбраны из группы, состоящей из ОХ40 (CD134), 4-1ВВ (CD 137), CD40, CD27, HVEM (CD270), CD30 и GITR, которые все могут иметь костимулирующее воздействие на Т-клетки. Точнее, антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, фрагмент, способный специфически связываться с членом семейства костимуляторных рецепторов ОХ40.

Дополнительная информация, в частности последовательности, касающаяся представителей семейства рецепторов TNF, может быть получена из общедоступных баз данных, таких как Uniprot (www.uniprot.org). Например, костимулирующие рецепторы TNF человека имеют следующие аминокислотные последовательности: ОХ40 человека (UniProt номер в каталоге Р43489, SEQ ID NO:108), 4-1 ВВ человека (UniProt номер в каталоге Q07011, SEQ ID NO:109), CD27 человека (UniProt номер в каталоге Р26842, SEQ ID NO:110), HVEM человека (UniProt номер в каталоге Q92956, SEQ ID NO:111), CD30 человека (UniProt номер в каталоге Р28908, SEQ ID NO:112), GITR человека (UniProt accession no. Q9Y5U5, SEQ ID NO:113) и CD40 человека (UniProt номер в каталоге Р25942, SEQ ID NO:115).

В настоящем изобретении понятие «ОХ40» относится к какому-либо нативному ОХ40 от какого-либо позвоночного животного, включая млекопитающих, например приматов (например, людей) и грызунов (например, мышей и крыс), если не указано иное. Понятие охватывает не подвергшийся изменениям ОХ40 «полной длины», а также какую-либо форму ОХ40, полученную в результате протекающих в клетке процессов. Понятие также охватывает встречающиеся в природе варианты ОХ40, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность примера ОХ40 человека представлена последовательностью SEQ ID NO:107 (Uniprot Р43489, версия 112), а аминокислотная последовательность примера ОХ40 мыши представлена последовательностью SEQ ID NO:113 (Uniprot Р47741, версия 101).

Среди нескольких костимулирующих молекул представитель семейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNF) ОХ40 (CD134) играет ключевую роль в выживании и гомеостазе эффекторных Т-клеток и Т-клеток памяти (Croft М. с соавт., Immunological Reviews 229, 2009, 173-191). ОХ40 (CD134) экспрессируется в клетках нескольких типов и регулирует иммунные ответы против инфекций, опухолей и аутоантигенов, причем его экспрессия продемонстрирована на поверхности Т-клеток, NKT-клеток и NK-клеток, а также нейтрофилов (Baumann R. с соавт., Eur. J. Immunol. 34, 2004, 2268-2275), и показано, что он строго индуцибелен или сильно активирован в ответ на различные стимулирующие сигналы. Функциональная активность молекулы продемонстрирована на клетках каждого типа, экспрессирующих ОХ40, что предполагает сложную регуляцию активности, опосредованную ОХ40, in vivo. В сочетании с запуском рецептора Т-клеток, зацепление ОХ40 на Т-клетках с помощью его природного лиганда или агонистических антител приводит к синергетической активации сигнальных путей PI3K и NFkB (Song J. с соавт., J. Immunology 180(11), 2008, 7240-7248). В свою очередь, это приводит к повышенной пролиферации, увеличению цитокиновых рецепторов и выработки цитокинов, а также лучшей выживаемости активированных Т-клеток. Недавно было показано, что помимо костостимулирующей активности в эффекторных CD4+ или CD8+ Т-клетках, запуск ОХ40 ингибирует развитие и иммуносупрессорную функцию регуляторных Т-клеток. Этот эффект, вероятно, ответственен, по крайней мере частично, за усиление активности ОХ40 в отношении противоопухолевых или антимикробных иммунных ответов. Учитывая, что вовлечение ОХ40 может приводить к возрастанию популяции Т-клеток, стимуляции секреции цитокинов и поддержке Т-клеток памяти, агонисты, включая антитела и растворимые формы лиганда OX40L, были успешно использованы на различных моделях доклинических опухолей (Weinberg с соавт., J. Immunol. 164, 2000, 2160-2169).

Понятия «анти-ОХ40 антитело», «анти-ОХ40», «антитело ОХ40» и «антитело, которое специфически связывается с ОХ40» относятся к антителу, которое способно связывать ОХ40 с достаточной аффинностью таким образом, что антитело может быть использовано в качестве диагностического средства и/или терапевтического агента для нацеливания на ОХ40. В одном варианте осуществления настоящего изобретения степень связывания анти-ОХ40-антитела с неродственным белком, не являющимся ОХ40, составляет приблизительно менее чем 10% от связывания антитела с ОХ40, что измерено, например, с помощью жидкостной цитометрии (FACS). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело, связывающееся с ОХ40, имеет константу диссоциации (K_D) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-6 М или менее, например, от 10^-68 М до 10^-13 М, например, от 10^-8 М до 10^-10 М).

Понятие «4-1 ВВ» или «CD137», используемое в настоящем изобретении, относится к какому-либо нативному 4-1 ВВ от какого-либо позвоночного животного, включая млекопитающих, например, приматов (например, людей), и грызунов (например, мышей и крыс), если не указано иное. Понятие охватывает «полной длины» не подвергшийся обработке рецептор 4-1 ВВ, а также любую форму 4-1 ВВ, полученную в результате процессинга в клетке. Понятие также охватывает встречающиеся в природе варианты 4-1 ВВ, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность примера 4-1 ВВ человека представлена последовательностью SEQ ID NO:109 (Uniprot номер в каталоге Q07011).

Понятия «анти-4-1 ВВ-антитело», «анти-4-1 ВВ», «антитело 4-1 ВВ» и «антитело, которое специфически связывается с 4-1 ВВ» относятся к антителу, которое способно связывать 4-1 ВВ с достаточной аффинностью таким образом, что антитело может быть использовано в качестве диагностического средства и/или терапевтического агента для нацеливания на 4-1 ВВ. В одном варианте осуществления настоящего изобретения степень связывания анти-4-1 ВВ-антитела с неродственным белком, не являющимся 4-1 ВВ, составляет приблизительно менее чем 10% от связывания антитела с 4-1 ВВ, что измерено, например, методом радиоиммунного анализа (RIA) или с помощью жидкостной цитометрии (FACS). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело, связывающееся с 4-1 ВВ, имеет константу диссоциации (K_D)≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-6 М или менее, например, от 10^-68 М до 10^-13 М, например, от 10^-8 М до 10^-10 М). В частности, анти-4-1 ВВ антитела является клон 20Н4.9, описанный в US 7288638.

В настоящем изобретении понятие «CD40» относится к какому-либо нативному CD40 от какого-либо позвоночного животного, включая млекопитающих, например, приматов (например, людей), и грызунов (например, мышей и крыс), если не указано иное. Понятие охватывает «полной длины» не подвергшийся обработке рецептор CD40, а также какую-либо форму CD40, полученную в результате процессинга в клетке. Понятие также охватывает встречающиеся в природе варианты CD40, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность примера CD40 человека представлена последовательностью SEQ ID NO:115 (Uniprot номер в каталоге Р25942, version 200). Антиген CD40 представляет собой гликопротеин массой 50 кДа на поверхности клеток, который принадлежит к семейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNF-R). (Stamenkovic с соавт., EMBO J. 8, 1989, 1403-1410). CD40 экспрессируется во многих здоровых и опухолевых типах клеток, включая В-лимфоциты, дендритные клетки, моноциты, макрофаги, эпителий тимуса, эндотелиальные клетки, фибробласты и клетки гладких мышц. CD40 экспрессируется во всех В-лимфомах и в 70% всех солидных опухолей и активируется в антигенпрезентирующих клетках (antigen presenting cell, АРС) сигналами созревания, такими как IFN-гамма и GM-CSF. Активация CD40 также индуцирует дифференциацию моноцитов в функциональные дендритные клетки (DC) и усиливает цитолитическую активность клеток NK через APC-CD40 индуцированные цитокины. Таким образом, CD40 играет существенную роль в инициации и усилении иммунных ответов, индуцируя созревание АРС, секрецию цитокинов-хэлперов, активацию костимулирующих молекул и усиление эффекторных функций.

В настоящем изобретении понятие «агонист CD40» означает какой-либо фрагмент, который агонизирует взаимодействие CD40/CD40L. Используемый в данном контексте CD40 относится предпочтительно к CD40 человека, таким образом, агонист CD40 предпочтительно является агонистом CD40 человека. Как правило, часть молекулы может быть агонистическим CD40 антителом или фрагментом антитела.

Понятия «анти-CD40 антитело», «анти-CD40», «CD40 антитело» и «антитело, которое специфически связывается с CD40» относятся к антителу, которое способно связывать CD40 с достаточной аффинностью таким образом, что антитело может быть использовано в качестве диагностического и/или терапевтического агента для нацеливания на CD40. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения степень связывания анти-CD40-антитела с неродственным, не-CD40-белком, составляет менее чем примерно 10% от связывания антитела с CD40 по данным измерений, например, методом радиоиммуноанализа (radioimmunoassay, RIA) или жидкостной цитометрии (FACS). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антитело, которое связывается с CD40, имеет константу диссоциации (KD)<1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0.1 нМ, ≤0.01 нМ или<0.001 нМ (например 10^-6 М или менее, например, от 10^-68 М до 10^-13 М, например, от 10^-8 М до 10^-10 М).

Понятие «пептидный линкер» относится к пептиду, содержащему один или несколько аминокислот, обычно от 2 до 20 аминокислот. Пептидные линкеры известны в данной области, а также описаны в настоящем изобретении. Пригодными не иммуногенными пептидными линкерами являются, например, пептидные линкеры (G₄S)_n, (SG₄)_n или G₄(SG₄)_n, в которых «n» обычно означают число от 1 до 10, обычно от 1 до 4, особенно 2, то есть пептиды, выбранные из группы, включающей GGGGS (SEQ ID NO:77), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:78), SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:79), GGGGGSGGGGSSGGGGS (SEQ ID NO:80), (G4S)3 or GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:81), GGGGSGGGGSGGGG or G4(SG4)2 (SEQ ID NO:82), (G4S)4 or GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:83) и GGGGSGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:84), а также последовательности GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:85), GSGSGSGS (SEQ ID NO:86), GSGSGNGS (SEQ ID NO:87), GGSGSGSG (SEQ ID NO:88), GGSGSG (SEQ ID NO:89), GGSG (SEQ ID NO:90), GGSGNGSG (SEQ ID NO:91), GGNGSGSG (SEQ ID NO:92) и GGNGSG (SEQ ID NO:93). Пептидными линкерами, представляющими особый интерес, являются (G₄S)₂ или GGGGS GGGGS (SEQ ID NO:78) и GGGGSGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:84).

В настоящем изобретении понятие «спейсерный домен» означает полипептид, образующий структурный домен после укладки. Таким образом, спейсерный домен может быть меньше, чем 100 аминокислотных остатков, но должен быть структурно ограничен, чтобы фиксировать мотивы связывания. Примерами спейсерных доменов являются пентамерные суперспирали, шарнирные области антител, или области Fc антитела, или их фрагменты. Спейсерный домен является доменом димеризации, т.е. спейсерный домен содержит аминокислоты, которые способны обеспечивать функциональность димеризации.

Понятие «аминокислота», используемое в настоящем изобретении, означает группу природных карбокси-α-аминокислот, включающую аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gin, Q), глутаминовую кислоту (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (Ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, К), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серии (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Понятие «гибридизированный» или «присоединенный» означает, что компоненты (например, тяжелая цепь антитела и фрагмент Fab) связаны пептидными связями либо непосредственно, либо через один или несколько пептидных линкеров.

В настоящем изобретении понятие «гибридизированный полипептид» или «полипептид слияния» относится к одноцепочечному полипептиду, состоящему из различных компонентов, таких как эктодомен представителя семейства лигандов TNF, которые гибридизированы либо непосредственно, либо через пептидный линкер. Понятие «гибридизированный» или «присоединенный» означает, что компоненты (например, полипептид и эктодомен указанного представителя семейства лигандов TNF) связаны пептидными связями либо напрямую, либо через один или несколько пептидных линкеров.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» в отношении контрольной полипептидной (белковой) последовательности определяют в виде процента аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в контрольной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и введения гэпов в случае необходимости для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривая какие-либо консервативные замещения как часть идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, которые известны специалисту в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN. SAWI или Megalign (DNASTAR). Специалист в данной области может определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая какие-либо алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения процент идентичности аминокислотной последовательности получают с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана фирмой Genentech, Inc., а программный код был подан вместе с документацией пользователя в Бюро по охране авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где она зарегистрирована под номером регистрации авторского права США № TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна от фирмы Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или может быть скомпилирована из программного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для использования в операционной системе UNIX, включая цифровую UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не меняются. В ситуациях, когда ALIGN-2 используют для сравнений аминокислотных последовательностей, процент идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А с или против данной аминокислотной последовательности Б (которая в другом варианте может быть определена как заданная аминокислотная последовательность А, которая имеет или включает определенный процент идентичности аминокислотной последовательности с или против данной аминокислотной последовательности Б), рассчитывают следующим образом:

100 раз фракция X/Y,

где X - количество аминокислотных остатков, которые оценены программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 как идентичные совпадения при выравнивании А и Б, и где Y - общее количество аминокислотных остатков в Б. Учитывая, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, процент идентичности аминокислотной последовательности А относительно Б не будет равен проценту идентичности аминокислотной последовательности от Б относительно А. Если специально не указано иное, все проценты аминокислотной идентичности в настоящем описании получают согласно описанию, приведенному непосредственно в предшествующем абзаце с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают варианты аминокислотных последовательностей антигенсвязывающих молекул. Например, может потребоваться улучшение аффинности и/или других биологических свойств антигенсвязывающих молекул. Варианты аминокислотных последовательностей антигенсвязывающих молекул могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулы, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции, и или замещения остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Какая-либо комбинация делеции, вставки и замещения может быть сделана для достижения итоговой конструкции, при условии, что итоговая конструкция обладает желаемыми характеристиками, например, антигенсвязывающим свойством. Сайты, представляющие интерес для замещающего мутагенеза, включают HVR и каркас (FR). Консервативные замещения представлены в таблице Б под заголовком «Предпочтительные замещения» и дополнительно описаны ниже со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот (1)-(6). Аминокислотные замещения могут быть интродуцированы в интересующую молекулу, после чего проводят скрининг на требуемую активность, например, сохраненное/улучшенное связывание антигена, пониженную иммуногенность или улучшенные ADCC или CDC.

Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии с общими свойствами боковой цепи:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Тгр, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены вызовут замену члена одного из этих классов на представителя другого класса.

Понятие «варианты аминокислотной последовательности» включает существенные варианты, в которых имеются аминокислотные замещения в одном или нескольких остатках гипервариабельной области исходной антигенсвязывающей молекулы (например, гуманизированного антитела или антитела человека). В целом, итоговый вариант (варианты), выбранные для дальнейшего изучения, могут иметь модификации (например, улучшения) в определенных биологических свойствах (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) по отношению к родительской антигенсвязывающей молекуле и/или будут по существу сохранять определенные биологические свойства исходной антигенсвязывающей молекулы. Примером вариантом замещения является антитело со зрелой аффинностью, которое может быть обычным образом получено, например, с использованием метода созревания аффинности на основе фагового дисплея, например, по описания в настоящем изобретении. Вкратце, один или несколько остатков HVR мутируют, и вариантные антигенсвязывающие молекулы представляют на фаге и подвергают скринингу для выявления определенной биологической активности (например, аффинности). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения замещения, инсерции или делеции могут происходить в одной или нескольких гипервариабельных областях (HVR) до тех пор, пока такие изменения существенно не снижают способности антигенсвязывающей молекулы связывать антиген. Например, консервативные изменения (например, консервативные замены, представленные в настоящем изобретении), которые существенно не снижают аффинность, могут быть сделаны в HVR. Полезный метод идентификации остатков или областей антитела, на которые может быть нацелен мутагенез, называется «аланин-сканирующим мутагенезом», как описано Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. В этом методе остаток или группа целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином) для того, чтобы определить затрагивается ли взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замещения могут быть интродуцированы в положениях аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к исходным замещениям. В другом варианте или дополнительно рассматривают кристаллическую структуру комплекса антиген-антигенсвязывающая молекула для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут быть предметом нацеливания или могут быть исключены из числа кандидатов на замещение. Варианты могут быть просканированы, чтобы определить, содержат ли они требуемые свойства.

Инсерции аминокислотных последовательностей включают гибридизацию с амино- и/или карбоксильного конца с последовательностями разной длины, от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерции внутри последовательности одного или многих аминокислотных остатков. Примеры концевых инсерции включают биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекулы включают гибридизацию с N- или С-конца с полипептидом, что увеличивает период полужизни в сыворотке биспецифических антигенсвязывающих молекул.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые изменены для повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Варианты гликозилирования молекул несложно получить путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, что один или несколько сайтов гликозилирования создают или удаляют. Если биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит Fc-область, присоединенный к ней углевод может быть изменен. Нативные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, обычно содержат разветвленный биантенарный олигосахарид, который обычно присоединен через N-связь к Asn297 домена СН2 области Fc. См., например, Wright с соавт. TIBTECH 15, 1997, 26-32. К олигосахаридам могут относить различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (N-acetyl glucosamine, GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стволовой» части биантенарной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения модификации олигосахарида в антигенсвязывающей молекуле могут быть разработаны для создания вариантов с определенными улучшенными свойствами. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагают варианты биспецифических антигенсвязывающих молекул или антител по настоящему изобретению, которые имеют углеводную структуру без фукозы, присоединенную (прямо или опосредованно) к области Fc. Такие варианты фукозилирования могут иметь улучшенную функцию ADCC, см., например, US 2003/0157108 или US 2004/0093621. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают варианты биспецифических антигенсвязывающих молекул или антител по настоящему изобретению обеспечивают двурассеченными олигосахаридами, например, в которых биантенарные олигосахариды, присоединенные к области Fc, разделены на две части GlcNAc. Такие варианты могут иметь пониженное фукозилирование и/или улучшенную функцию ADCC, см. например, WO 2003/011878; US 6602684; US 2005/0123546. Также предусматривают варианты по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к области Fc. Такие варианты антител могут иметь улучшенную функцию CDC и описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964; WO 1999/22764.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения может быть желательным создание цистеин-сконструированных вариантов биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, например, молекул «thioMAb», в которых один или несколько остатков молекулы замещены остатками цистеина. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения замещенные остатки встречаются в доступных сайтах молекулы. При замещении этих остатков цистеином реакционноспособные тиоловые группы позиционируются в доступных сайтах антитела и могут использоваться для конъюгирования антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты лекарственного средства или фрагменты лекарственного средства-линкера, для создания иммуноконъюгата. В других вариантах осуществления настоящего изобретения какой-либо один или несколько из следующих остатков могут быть замещены цистеином: V205 (нумерация по Kabat) в легкой цепи; А118 (EU нумерация) в тяжелой цепи; S400 (EU нумерация) в Fc области тяжелой цепи. Цистеин-сконструированные антигенсвязывающие молекулы могут быть получены согласно описанию, например, в US 7521541.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, которое может быть дополнительно модифицировано для содержания дополнительных небелковых частей молекулы, которые известны в данной области и доступны. К фрагментам, пригодным для дериватизации антитела, относятся водорастворимые полимеры, но не только они. Примерами водорастворимых полимеров являются, но ими перечень не ограничивается, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликоль-пропионовый альдегид может иметь преимущества при получении из-за его стабильности в воде. Полимер может иметь какую-либо молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и если присоединено более одного полимера, то они могут быть одинаковыми или разными молекулами. В общем, число и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, могут быть определены на основании свойств и функций улучшаемого антитела, но ими анализ не ограничивается, независимо от того, будет ли производное биспецифического антитела использоваться в терапии при определенных условиях и т.д. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые можно избирательно нагревать при облучении. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения небелковым фрагментом является углеродная нанотрубка (Kam N.W. с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, 11600-11605). Облучение может иметь какую-либо длины волны и включает длины волн (но ими не ограничиваются), которые не наносят вреда обычным клеткам, но нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой клетки, проксимальные по отношению к небелковому фрагменту антитела, уничтожаются.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают иммуноконъюгаты биспецифических антител. Понятие «иммуноконъюгат» означает антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичными молекулами, включая, но не ограничиваясь им, цитотоксический агент.

Понятие «нуклеиновая кислота» относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например, мессенджер-РНК (мРНК), вирусной РНК или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать обычную фосфодиэфирную связь или необычную связь (например, амидную связь, такую как найденная в пептидных нуклеиновых кислотах (peptide nucleic acid, PNA). Понятие «молекула нуклеиновой кислоты» относится к какому-либо одному или нескольким сегментам нуклеиновой кислоты, например ДНК или фрагментов РНК, присутствующих в полинуклеотиде.

Под «выделенной» молекулой нуклеиновой кислоты или полинуклеотидом подразумевают молекулу нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была удалена из естественной для нее среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащийся в векторе, является выделенным для целей настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или в высокой степени) полинуклеотиды в растворе. Выделенный полинуклеотид включает полинуклеотидную молекулу, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат полинуклеотидную молекулу, но полинуклеотидная молекула присутствует внехромосомно или при хромосомной локализации отличаются от ее естественного хромосомного расположения. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro транскрипты РНК по настоящему изобретению, а также формы положительных и отрицательных цепей и двухцепочечные формы. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетически. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут быть или могут включать регуляторный элемент, например промотор, сайт связывания рибосомы или терминатор транскрипции.

Под нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, например, на 95% «идентичную» контрольной нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, подразумевают, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична контрольной последовательности, при условии, что полинуклеотидная последовательность может включать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов контрольной нуклеотидной последовательности. Иначе говоря, для получения полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную контрольной нуклеотидной последовательности, до 5% нуклеотидов в контрольной последовательности может быть делетировано или замещено другими нуклеотидами или числом нуклеотидов до 5% от общего количества нуклеотидов в контрольной последовательности может быть инсертировано в контрольную последовательность. Эти изменения контрольной последовательности могут происходить в 5'- или 3'-концевых положениях контрольной нуклеотидной последовательности или в каком-либо положении между этими концевыми положениями, перемежаясь либо индивидуально среди остатков в контрольной последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп внутри контрольной последовательности. На практике, является ли какая-либо конкретная полинуклеотидная последовательность, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, можно определить обычным путем, используя известные компьютерные программы, такие как обсуждаемые выше для полипептидов (например, ALIGN-2).

Понятие «кассета экспрессии» относится к полинуклеотиду, получаемому рекомбинантно или синтетически, с серией определенных элементов нуклеиновой кислоты, которые допускают транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантная кассета экспрессии может быть включена в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Как правило, рекомбинантная часть кассеты экспрессии вектора экспрессии включает, помимо других последовательностей, последовательности нуклеиновой кислоты для транскрибирования и промотора. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения кассета экспрессии содержит полинуклеотидные последовательности, которые кодируют биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению или их фрагменты.

Понятие «вектор» или «вектор экспрессии» является синонимом «конструкции экспрессии» и относится к молекуле ДНК, которую используют для введения и направления экспрессии конкретного гена, с которым он функционально связан в клетке-мишени. Это понятие включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он был интродуцирован. Вектор экспрессии по настоящему изобретению содержит кассету экспрессии. Векторы экспрессии допускают транскрипцию больших количеств стабильных мРНК. Когда вектор экспрессии находится внутри клетки-мишени, молекула рибонуклеиновой кислоты или белок, который кодируется этим геном, продуцируется в результате клеточной транскрипции и/или трансляции. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии по настоящему изобретению содержит кассету экспрессии, которая содержит полинуклеотидные последовательности, кодирующие биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению или их фрагменты.

Понятия «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используют и их относят к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформантов» и «трансформированные клетки», которые включают первичные трансформированные клетку и их потомство, независимо от количества пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным по содержанию нуклеиновой кислоты родительской клетке и может содержать мутации. Мутантное потомство, которое имеет ту же функцию или биологическую активность, что и скрининг или отбор для первоначально трансформированной клетки, включено в рамки охвата настоящего изобретения. Клетка-хозяин является клеточной системой какого-либо типа, которая может быть применена для выработки биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например культивируемые клетки млекопитающих, такие как клетки СНО, клетки ВНК, клетки NS0, клетки SP2/0, клетки миеломы YO, клетки миеломы мыши РЗХ63, клетки PER, клетки PER.C6 или клетки гибридомы, клетки дрожжей, клетки насекомых и растительные клетки, если перечислить только несколько клеток, но также клетки, содержащиеся в трансгенном животном, трансгенном растении или в культивируемых растительных или животных тканях.

«Эффективное количество» агента означает такое количество, которое необходимо для того, чтобы привести к физиологическим изменениям в клетке или ткани, которым этот агент вводят.

«Терапевтически эффективное количество» агента, например фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата. Терапевтически эффективное количество средства, например, устраняет, уменьшает, задерживает, минимизирует или предотвращает неблагоприятные воздействия заболевания.

Понятия «индивидуум» или «субъект» относится к млекопитающему. Млекопитающие включают, но ими перечень не ограничивают, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и других приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В особенности, индивидуумом или субъектом является человек.

Понятие «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, которая позволяет проявить эффективность биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому предназначено введение композиции.

«Фармацевтически приемлемый эксципиент» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый эксципиент включает, но ими перечень не ограничивают, буфер, стабилизатор или консервант.

Понятие «вкладыш в упаковку» означает инструкции, обычно включаемые в коммерческие упаковки терапевтических продуктов и содержащие информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях относительно использования таких терапевтических продуктов.

В настоящем изобретении понятие «лечение» (и его грамматические производные, например «лечить» или «лечиться») относится к клиническому вмешательству и попытке изменить естественное состояние подвергаемого лечению индивидуума, и может осуществляться либо для профилактики, либо во время курса клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но ими перечень не ограничивают, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, ослабление симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или смягчение болезненного состояния, ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления молекулы по настоящему изобретению используют для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

В настоящем изобретении понятие «рак» означает пролиферативные заболевания, например лимфомы, карциномы, лимфомы, бластомы, саркомы, лейкозы, лимфолейкозы, рак легких, немелкоклеточный рак легких (non-small cell lung, NSCL), бронхиолоальвиолярный клеточный рак легких, рак костей, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или интраокулярную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, колоректальный рак (colorectal cancer, CRC), рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак молочной железы с тройным негативным фенотипом, рак матки, карциному маточных труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, рак влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак полового члена, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечноклеточный рак, рак почечной лоханки, мезотелиому, гепатоцеллюлярный рак, рак желчных путей, новообразования центральной нервной системы (ЦНС), опухоли спинного мозга, глиому ствола головного мозга, мультиформную глиобластому, астроцитому, шваномы, эпендимоны, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточный рак, аденому гипофиза и саркому Юинга, меланому, множественную миелому, В-клеточный рак (лимфому), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластный лейкоз, включая невосприимчивые версии какого-либо из вышеуказанных видов рака или комбинацию одного или нескольких из указанных видов рака.

Биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению

Настоящее изобретение предусматривает новые биспецифические антитела с особенно полезными свойствами, такими как продуктивность, стабильность, аффинность, биологическая активность, эффективность нацеливания и пониженная токсичность. Новые биспецифические антитела состоят из двух гибридизированных полипептидов, содержащих два антигенсвязывающих домена, способных к специфическому связыванию с первой мишенью, и один антигенсвязывающий домен, способный к специфическому связыванию со второй мишенью. Удивительно, но эти два гибридизированных полипептида сконструированы таким образом, что три антигенсвязывающих домена могут собираться должным образом и что биспецифическое связывание является полностью функциональным.

Для молекулы, предназначенной для клинического применения, следует избегать агрегатов функционально активных молекул, что означает, что чистота и стабильность сборки различных гибридизированных полипептидов, образующих антигенсвязывающую молекулу, критически важны. Важно отметить, что в биспецифических антителах по настоящему изобретению все три антигенсвязывающих домена гибридизированы таким образом, чтобы обеспечить правильную сборку трех антигенсвязывающих доменов. Все три антигенсвязывающих домена расположены таким образом, что каждый антигенсвязывающий домен может связываться с их соответствующими мишенями. Новые биспецифичные антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, кроме того, состоят только из двух гибридизированных полипептидов и не содержат каких-либо легких цепей. Таким образом, можно избежать проблемы неправильного спаривания между тяжелой и легкой цепями. Также важно отметить, что конструкции могут экспрессироваться с достаточно хорошими титрами и вырабатывают хорошую долю требуемого продукта. Антитело-подобная архитектура, содержащая спейсерный домен для димеризации, является стабильной по сравнению с другими белками; их экспрессия также в высокой степени устойчива при использовании различных линий клеток.

Новые биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению называются 2+1 конторстелами.

Таким образом, 2+1 конторстело является биспецифическим антителом, состоящим из двух гибридизированных полипептидов и содержащим два антигенсвязывающих домена, способных специфически связываться с первой мишенью, и один антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться со второй мишенью, где

(а) первый гибридизированный полипептид содержит первую часть первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, спейсерный домен, вторую часть первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, и первую часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, где

- спейсерный домен является полипептидом и содержит, по меньшей мере, 25 аминокислотных остатков,

- первая часть первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через первый пептидный линкер с N-концом спейсерного домена,

- вторая часть первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через второй пептидный линкер с С-концом спейсерного домена, и

- первая часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с С-концом второй части первого антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию с первой мишенью, или гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с N-концом первой части первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, и

(б) второй гибридизированный полипептид содержит первую часть второго антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, спейсерный домен, вторую часть второго антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, и вторую часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, где

- спейсерный домен является полипептидом и содержит, по меньшей мере, 25 аминокислотных остатков,

- первая часть второго антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через первый пептидный линкер с N-концом спейсерного домена,

- вторая часть второго антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через второй пептидный линкер с С-концом спейсерного домена, и

- вторая часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с С-концом второй части второго антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью, или гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с N-концом первой части второго антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью,

где первая часть и вторая часть антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию со второй мишенью, связаны друг с другом с образованием антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию со второй мишенью, причем первая часть и вторая часть первого и второго антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию с первой мишенью, связаны друг с другом с образованием циклического гибридизированного полипептида, причем спейсерный домен первого гибридизированного полипептида и спейсерный домен второго гибридизированного полипептида ковалентно связаны друг с другом дисульфидной связью и содержат модификации, способствующие ассоциации первого и второго гибридизированного полипептида.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, согласно описанному выше, в котором в первом гибридизированном полипептиде первая часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с С-концом второй части первого антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию с первой мишенью, и во втором гибридизированном полипептиде вторая часть антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третью пептидный линкер с С-концом второй части первого антигенсвязывающего домена, способного к специфически связываться с первой мишенью.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, согласно описанному выше, в котором в первом гибридизированном полипептиде первая часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третий пептидный линкер с N-концом первой части первого антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию с первой мишенью, и во втором гибридизированном полипептиде вторая часть антигенсвязывающего домена, способного к специфическому связыванию со второй мишенью, гибридизирована либо непосредственно, либо через третью пептидный линкер с N-концом первой части первого антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться с первой мишенью.

Таким образом, в биспецифическом антителе, согласно описанному выше, исходные домены антитела гибридизированы гибкими пептидными линкерами. Эти линкеры обеспечивают правильную ассоциацию домена в молекуле Конторстела, а также правильную складчатость антитела. Эта новая топология цепей приводит к пространственной ориентации плечей Fab и части Fc, которая отличается от классического формата IgG1. Из-за параллельной ориентации своих антигенсвязывающих сайтов, Конторстело является в высокой степени пригодным форматом антител для агонистических механизмов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают описанное выше антитело, в котором третий пептидный линкер, соединяющий первую часть или вторую часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, содержащей, по меньшей мере, 15 аминокислот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий пептидный линкер, соединяющий первую часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, и третий пептидный линкер, соединяющий вторую часть антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, являются идентичными. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий пептидный линкер содержит от 15 до 25 аминокислот. В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения третий пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:84. Точнее, третий пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:84. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения третий пептидный линкер (в обоих гибридизированных полипептидах) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:83 или SEQ ID NO:84, a первый и второй пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:78.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, согласно описанному выше, в котором первый гибридизированный полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи антгенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, и второй гибридизированный полипептид содержит вариабельный домен легкой цепи антитела антигенвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, или наоборот.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическое антитело, согласно описанному выше, в котором первый гибридизированный полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи антигенсвязывающего домена, способного специфически связываться со второй мишенью, и второй гибридизированный полипептид содержит вариабельный домен легкой цепи антитела антигенсвязывающего домена, способный специфически связываться со второй мишенью, или наоборот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая часть антигенсвязывающего домена является Fab-фрагментом тяжелой цепи антитела, и вторая часть антигенсвязывающего домена является Fab-фрагментом легкой цепи антитела, или наоборот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая часть антигенсвязывающего домена и вторая часть антигенсвязывающего домена ковалентно связаны друг с другом дисульфидной связью.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело, состоящее из двух гибридизированных полипептидов и содержащее два антигенсвязывающих домена, способных к специфическому связыванию с первой мишенью, и один антигенсвязывающий домен, способный к специфическому связыванию со второй мишенью, где